KR102245938B1 - 진단 분석에 사용하기 위한 개선된 rep 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, (a) 서열번호 11 또는 12로 나타낸 아미노산 서열; (b) 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 11 또는 12의 단편; 또는 (c) (a) 또는 (b)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 가진 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 아미노산 서열을 포함하는, DNA-복제 관련 (Rep) 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MS 또는 MS 소인의 진단 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

진단 분석에 사용하기 위한 개선된 REP 단백질
본 발명은 예를 들어, 다발성 경화증 (MS)과 같은 신경퇴행성 질환을 진단하는데 사용하기 위한 DNA-복제-관련 (Rep) 단백질의 검출 및 정량 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 MSBI1 게놈-코딩된 Rep 단백질 돌연변이에 관한 것이다.
다발성 경화증 (MS)의 병인은 해명되지 않았다. 따라서, MS를 진단하거나 및/또는 MS 또는 MS의 치료를 모니터링하거나 또는 MS의 소인을 평가하는데 사용될 수 있는, MS 바이오마커가 요구되고 있다.
다발성 경화증 (MS)은 뇌 및 척수에서 신경 세포를 손상시키는 MS 병변의 탈수초화 (demyelinization)를 특징으로 한다. MS 증상은 갑작스러운 악화 (재발, 악화, 발작 (bout), 공격 (attack)) 또는 시간에 따른 점진적인 악화 (진행형) 에피소드로서 나타난다. 탈수초화는 T 세포를 촉발시키고, 사이토카인과 항체의 분비를 촉발하는 염증성 과정으로 개시된다. MS 진단에는, 특히 신경촬영 (neuroimaging), 뇌척수액 분석 및 유발 전위 (evoked potential)가 이용된다.
여러가지 검사 물질 (다발성 경화증 (MS) 뇌 조직, 보바인 혈청, 밀크)에서 부분적으로 관련있는 다양한 DNA 분자들 17종이 분리되었다 (Funk, Gunst et al. 2014, Gunst, Zur Hausen et al. 2014, Lamberto, Gunst et al. 2014, Whitley, Gunst et al. 2014).
이들 분리물들 중에서도 전파성 해면상 뇌증 (transmissible spongiform encephalophaty, TSE)-관련 분리물 Sphinx 1.76 (1,758 bp; 등재번호 HQ444404, (Manuelidis L. 2011))과 관련성이 매우 높은 2종의 DNA 분자가 MS 환자의 뇌 조직으로부터 분리되었다. 이 분리물은 MSBI1.176 (MSBI, 다발성 경화증 뇌 분리물) (1,766 bp)과 MSBI2.176 (1,766 bp)으로, 각각 "MSBI1 게놈" 및 "MSBI2 게놈"으로 표시된다. MSBI1,176은 Sphinx 1.76과 98%의 뉴클레오티드 서열 유사성을 공유하고 있다. 이들 분리물의 거대 오픈 리딩 프래임 (ORF)은 상호 높은 유사성을 공유한 추정의 DNA 복제 단백질을 코딩한다. 또 다른 일반적인 특징은 iteron-유사 탠덤 리피트가 존재하는 것이다. 이 리피트 영역을 정렬하면 단일 뉴클레오티드의 코어 변형이 확인된다. iteron-유사 리피트는 Rep 단백질에 대한 결합부를 구성할 수 있다. 분리물의 서열은 EMBL Databank에 등재번호 LK931491 (MSBI1.176) 및 LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C. et al. 2014)으로 등록되어 있으며, WO 2016/005064에 정렬 및 기술되어 있다.
Funk, M., et al. (2014). "Isolation of protein-associated circular DNA from healthy cattle serum". Genome Announc 2(4) Giraldo, R., et al. (2011). "RepA-WH1 prionoid: a synthetic amyloid proteinopathy in a minimalist host." Prion 5(2):60-64 Giraldo, R. (2007). "Defined DNA sequences promote the assembly of a bacterial protein into distinct amyloid nanostructures." Proc Natl Acad Sci U S A 104(44): 17388-17393. Gunst, K., et al. (2014). "Isolation of bacterial plasmid-related replication-associated cirular DNA from a serum sample of a multiple sclerosis patient." Genome Announc 2(4). Lamberto, I., et al. (2014). "Mycovirus-like DNA virus sequences from cattle serum and human brain and serum samples from multiple sclerosis patients." Genome Announc 2(4). Linding, R., J. Schymkowitz, F. Rousseau, F. Diella and L. Serrano (2004). "A comparative study of the relationship between protein structure and beta-aggregation in globular and intrinsically disordered proteins." J Mol Biol 342(1): 345-353. Manuelidis L., 2011. "Nuclease resistant circular DNAs co-purify with infectivity in scrapie and CJD". J. Neurovirol. 17:131-145. Rousseau, F., J. Schymkowitz and L. Serrano (2006). "Protein aggregation and amyloidosis: confusion of the kinds?" Curr Opin Struct Biol 16(1): 118-126. Torreira, E., et al. (2015). "Amyloidogenesis of bacterial prionoid RepA-WH1 recaptiulates dimer to monomer transitions of RepA in DNA replication initiation." Structure 23(1):183-189 Whitley, C., et al. (2014). "Novel replication-competent cirulara DNA molecules from healthy cattle serum and milk and multiple sclerosis-affected human brain tissue." Genome Announc 2(4).
본 발명자들은, 야생형 MSBI1 게놈이 전사 RNA을 현저하게 만들고, MSBI1 게놈-코딩된 Rep 단백질이 인간 세포에서 발현된다는 것을, 최근 알게 되었다. 또한, 야생형 MSBI1 및 MSBI2 게놈-코딩된 Rep 단백질 (MSBI1 Rep 및 MSBI2 Rep)이 병원성 스크리닝 분석의 바이오마커라는 것을 알게 되었다. DNA-복제-관련 단백질 (RepB)로서, Rep 단백질은 DNA 결합 활성을 가지고 있으며, 에피좀 또는 바이러스 DNA 분자의 복제 개시에 필수적일 수 있다. 그러나, 야생형 MSBI1 및 MSBI2 게놈-코딩된 Rep와 구조적으로 유사한 Rep 단백질은 자기-올리고머화 응집 가능성이 상당하다.
진단 스크리닝 분석에서는, 야생형 Rep 단백질 항원인 MSBI1 Rep 및 MSBI2 Rep를 정제한 다음, 단백질에 대한 응집 또는 분해 효과를 최소화하기 위해 변성 및 환원 조건 하에 둔다. 공교롭게도, 본 발명자들은, 야생형 MSBI1 Rep 단백질을 비-변성 조건에서 미리 정제하였을 때, 실제 상당한 가시적인 단백질 응집이 나타나 명백하게도 Rep 단백질을 친화성 정제에 이용할 수 없게 됨을 관찰하였다. 잔류물인 매우 소량의 정제된 Rep 단백질은 매우 짧은 시간에 (수시간내) 응집되어, 단백질을 추가적인 진단 분석에 이용하기에 부적절하게 만든다. 이는 Rep 단백질의 응집이 MSBI1 Rep와 비슷하다는 이전의 실험들과 일치한다 (Giraldo 2007, Torreira, Moreno-Del Alamo et al. 2015).
진단 스크리닝 분석에서, 혈액 샘플 내 항원-결합성 항체를 검출하기 위해 사용되는 단백질 항원의 안정성 및 완전성은, 민감성 실험의 재현성 및 신뢰성에 있어 가장 중요하다. 이와 관련해, 장기 보관시 단백질 항원의 유효 기간 (shelf-life) 동안, 그리고 진단 스크리닝 분석 자체 (코팅, 차단, 세척, 검출 항체 인큐베이션 단계) 중에, 생물리학적 거동이 성공적인 분석에 매우 중요하다. 이에, 야생형 Rep 단백질 (MSBI1 Rep 및 MSBI2 Rep)에서 관찰된 응집 거동에 비추어, 야생형 Rep와 같은 응집 및 자기-올리고머화 특성이 없는 개선된 Rep 단백질이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은, 돌연변이 단백질에 의해 전술한 부정적인 특성을 회피할 수 있다는 것을 알게 되었다. 본 발명은, 해당 야생형 단백질과 비교해 2 이상의 점 돌연변이를 가지며; 병원성 스크리닝 분석에서 바이오마커인, MSBI1 Rep 및 MSBI2 Rep 단백질 돌연변이를 제공한다. 합성 MSBI1 및 MSBI2 Rep 단백질은, 서열번호 1 (MSBI1.176) 및 서열번호 8 (MSBI 2.176)로 표시되는 야생형 (wt) MSBI1 및 MSBI2 게놈-코딩된 Rep 단백질로부터 유래된 돌연변이이다. 합성 돌연변이 MSBI1 및 MSBI2 Rep 단백질은 우레아 함유 보관 완충제 내에서 시험관내 조건에서 Rep 단백질의 보다 우수한 안정성 및 보다 낮은 응집성을 가진다. 합성 돌연변이 MSBI1 및 MSBI2 Rep 단백질은 진단 스크리닝 분석에 사용하는 경우\시 야생형 MSBI1 및 MSBI2 Rep 단백질 보다 더 안정적인 항원이다.
항-Rep 항체는 분리된 DNA (예, MSBI1)의 병원성과 Rep 단백질 발현 간의 연관성으로 인해 병원성 마커로서 사용된다. 항-Rep 항체가 양적으로 증가된 환자 혈청은, 이 환자가 Rep-관련 단백질에 확실히 노출되었거나 또는 Rep 특이 면역 반응을 개시하기에 충분한 기간 동안 자체 Rep를 발현하였다는 것을, 의미한다. 인간 항체에 대한 타겟으로서 Rep 단백질이 항원으로서 사용된다. 항 Rep 항체의 양 측정에 기반하여, 급성 MS 뿐 아니라 MS 소인을 진단 또는 모니터링할 수 있다. 샘플에서 수득되는 항-Rep 항체 또는 발현된 Rep 단백질의 양적 증가는 MS의 개시 및/또는 MS 상태를 의미하고, 양적으로 증가된 항-Rep 항체 및 Rep 단백질은 MS를 진단하기 위한 병원성 바이오마커로서 각각 활용될 수 있다.
유익하게는, MS의 병원성 바이오마커는 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플에서 검출할 수 있으며, 샘플을 반드시 뇌척수액으로부터 채집하지 않아도 된다.
이에, 본 발명은,
(i) 서열번호 11로 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 11로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 11의 단편; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며 서열번호 11로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 아미노산 서열
을 포함하는, DNA-복제-관련 (Rep) 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은,
(i) 서열번호 12로 나타낸 아미노산 서열;
(ii) 서열번호 12로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 서열번호 12의 단편; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지며 서열번호 12로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 아미노산 서열
을 포함하는, DNA-복제-관련 (Rep) 단백질을 제공한다.
본 발명의 Rep 단백질은 항체 또는 세포-매개 면역 반응을 검출하기 위해 공지된 항원을 이용하는 사실상 임의의 분석 포맷으로 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Rep 단백질에 대한 세포-매개, 예를 들어 T 세포 면역 반응을 검출하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 아래 단계를 포함하는 개체에서 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법을 제공한다:
(a) 개체로부터 유래된 샘플을 전술한 Rep 단백질과 인큐베이션하는 단계;
(b) 개체로부터 유래된 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
(c) Rep 단백질에 결합된 항체의 양을, 대조군 샘플에서의 양과 비교해, 신경퇴행성 질환의 진단과 연관시키는 단계.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체에서 MS 진단 방법을 제공한다:
(a) 개체 유래 샘플을 Rep 단백질과 인큐베이션하는 단계;
(b) 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
(c) Rep 단백질에 결합된 항체의 양을, 대조군 샘플에서의 양과 비교해, MS의 진단과 연관시키는 단계.
대조군 샘플 내 항-Rep 항체와 비교해, 개체 유래 샘플 내 항-Rep 항체의 양적 증가는 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단과 연관성을 가지며, 즉 MS의 지표이다. 특정 구현예에서, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단, 또는 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 소인에 대한 진단은, 대조군 샘플과 비교해, 항-Rep 항체의 2배 이상의 양적 증가에 의해 확인된다.
특정 구현예에서, Rep 단백질을 고정하고, 예를 들어 지지체 또는 담체에 부착한 다음, 고정된 Rep 단백질을 개체 유래 샘플과 인큐베이션한다.
다른 구현예에서, Rep 단백질을 세포에서 발현시킨 후 세포를 개체 유래 샘플과 인큐베이션한다.
특정 구현예에서, Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양은, 면역학적 복합체의 항-Rep 항체에 결합할 수 있는 신호 발생 화합물, 예를 들어 검출가능하게 표지된 2차 항체, 바람직하게는 항-인간 항체에 커플링된 부가적인 결합제에 의해 정량한다.
다른 구현예에서, 개체 유래 샘플 내 항체를 고정한 다음 지정된 양의 Rep 단백질과 인큐베이션한다.
바람직하게는, 개체 유래 샘플과 대조군 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플과 같은 혈액 샘플이다.
또한, 본 발명자들은 서열번호 1 또는 11의 1-136, 137-229 및 230-324번 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 내에 위치한 에피토프에 결합하는 항-Rep 항체를 제작하였으며, 예를 들어 항체는 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 에피토프에 결합한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은, (a) Rep 단백질 MSBI1 Rep 27/154E 또는 MSBI2 Rep 27/154E, (b) 신호 발생 화합물과 커플링된 부가적인 결합제, 예를 들어, 본 발명에 따른 항-Rep 항체에 결합할 수 있으며 검출가능한 표지물질과 커플링된 항-인간 항체, 및 (c) (a)에 따른 Rep 단백질 또는 항-Rep 항체를 고정하는데 적합한 고체 매트릭스를 포함하며, 보조 (aid) 항체가 샘플, 특히 혈청 또는 혈장 샘플에서 의심되는, MS 진단에 사용하기 위한 키트를 제공한다.
특정 구현예에서, 키트는, 예를 들어, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성 면역분석 (RIA), 효소 면역 분석 (EIA), 형광 면역분석 (FIA), 발광 면역분석 (LIA) 및 스트립 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역분석에 사용하기 위해 제작된다.
도 1 MSBI1 Rep 야생형 (WT) 또는 돌연변이 MSBI1 Rep 27/154E를 코딩하는 pcDNA3.1(-) 플라스미드를 HEK293TT에 일시적으로 형질감염시켜 72시간 동안 Rep 단백질을 과다발현시켰다. 세포에 트립신을 처리하고, PBS에서 세척한 다음 세포용해 완충제 (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 1,5% Triton X-100, 5 mM 이미다졸, 5 mM β-머캅토에탄올, 1x 프로테이나제 저해제 믹스) 중에 초음파 처리하였다. 인큐베이션 (30분, 4℃) 및 원심분리 (30분, 10,000 g, 4℃) 후, 단백질을 평형화된 Ni-NTA 비드 (Clontech) 1 mL에 결합시키고, 컬럼 부피의 10배의 세척 완충제 (55 mM 이미다졸을 함유한 세포용해 완충제)로 세척한 다음 용출 (300 mM 이미다졸을 함유한 세포용해 완충제)시켜, 비-변성 단백질을 정제하였다. NanoDrop 및 Bradford로 단백질을 정량한 후, 동량의 단백질 (500 ng/레인)을 5 mM β-머캅토에탄올 첨가 (환원) 또는 무첨가 (산화) Lammli 완충제 내에서 끓인 다음, SDS-PAGE로 분석 후 항-Rep 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
도 2 Rep 단백질을 상기한 비-변성 조건에서 정제하였다. Rep 단백질 2000 ng을 BN-PAGE (Serva)로 전기영동한 다음 항-Rep 면역겸출 또는 단백질 은 염색에 의해 염색하였다.
도 3 Rep 단백질을 변성 조건 (아래 프로토콜 참조) 하에 E. coli로부터 정제하였다. 정제된 MSBI1 Rep wt 또는 돌연변이 MSBI1 Rep 27/154E 2 ㎍ (웨스턴 블롯) 또는 5 ㎍ (코마시 염색)을 SDS-PAGE 후 항-Rep 면역검출 또는 코마시 단백질 염색에 의해 특징을 규명하였다.
도 4 Rep 단백질을 변성 조건 (아래 프로토콜 참조) 하에 E. coli로부터 정제하였다. MSBI1 Rep wt 또는 돌연변이 MSBI1 Rep 27/154E 5 ㎍을 BN-PAGE 및 항-Rep 면역검출에 사용하였다.
도 5 ELISA 플레이트 (Maxisorp, Thermo Fisher Scientific)를, 정제된 변성 MSBI1 Rep wt 또는 돌연변이 MSBI1 Rep 27/154E로, 1xPBS/8 M 우레아 (200 ng 단백질/웰) 1:1 희석물 중에서, 4℃에서 밤새 코팅하였으며, 3세트로 사용하였다. 2시간 동안 RT에서 여러가지 분석 완충제 (카세인, 슈퍼블럭 (superblock), 1% BSA/PBS) 내에서 차단을 수행하였다. 1차 항체로서 마우스 단일클론 항-Rep 항체 3종 (1:500 희석, N-말단, 중앙- 및 C-말단 Rep 도메인에 위치한 에피토프 사용)으로 구성된 풀과 반응시킨 다음, HRP-커플링된 염소 항-마우스 2차 항체 (1:5000 희석, 각각 37℃에서 1시간, PBS 0.1% Tween으로 세척, Thermo Fisher Scientific 사의 TMB ELISA 기판, 450 nm에서 판독)와 인큐베이션하여, 코팅된 단백질을 정량하였다. 원 (raw) 신호 세기를 나타낸다.
도 6 ELISA 플레이트 (Maxisorp, Thermo Fisher Scientific)를, 정제된 변성 MSBI1 Rep wt 또는 돌연변이 MSBI1 Rep 27/154E로, 1xPBS/8 M 우레아 (200 ng 단백질/웰) 1:1 희석물 중에서, 4℃에서 밤새 코팅하였다. 2시간 동안 RT에서 슈퍼블럭 분석 완충제 내에서 차단을 수행하였다. 37℃에서 1시간 동안 혈청 인큐베이션 (슈퍼블럭 완충제 내에서 1:500)을 수행하였다. Rep-결합된 인간 IgG 항체를 듀플리케이트 분석으로 HRP-커플링된 염소 항-인간 2차 항체 (1:5000 희석, 37℃에서 1시간)를 사용해 정량하였다 (PBS 0.1% Tween으로 세척, Thermo Fisher Scientific 사의 TMB ELISA 기판, 450 nm에서 판독, 신호는 BSA 대조군에 대해 표준화함).
본 발명은 돌연변이 Rep 단백질과, 병원성 마커로서 항-Rep 항체의 존재에 대한 진단 스크리닝 분석을 제공한다. 항-Rep 항체를 증가된 양으로 함유한 샘플은, 해당 개체가 명백하게도 Rep-관련 단백질에 노출되었거나 또는 Rep 단백질 특이적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 기간 동안 Rep 단백질을 자체 발현하였다는 것을, 의미한다. 이러한 스크리닝 분석으로, 항-Rep 항체의 정량화에 기초한 MS 진단, 예후 예측 및 모니터링을 수행할 수 있다.
본원에서, "Rep 단백질"은 DNA-복제-관련 단백질 (RepB)을 지칭한다. Rep 단백질은 DNA 결합 활성을 포함하며, 에피좀/바이러스 DNA 분자의 복제 개시에 필수적일 수 있다. 일반적으로, Rep 단백질은 소형 스핑크스 게놈 (Small Sphinx Genome) 그룹으로부터 유래된 Rep 단백질을 지칭한다 (Whitley et al., 2014). 구체적으로, Rep 단백질은 합성된 게놈-코딩된 Rep 단백질 MSBI1 Rep 27/154E 및 MSBI2 게놈-코딩된 Rep 27/154E 단백질이다. 바람직하게는, 합성 MSBI1 Rep 단백질은 서열번호 11로 나타낸 아미노산 서열을 가지며, EMBL databank에 등재 번호 LK931491로 등록된 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 가진 MSBI1.176으로부터 유래되거나, 또는 합성 Rep 단백질은 서열번호 12로 나타낸 아미노산 서열을 가지며 EMBL databank에 등재 번호 LK931492로 등록된 서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열을 가진 MSBI2.176으로부터 유래된다.
특히 바람직한 구현예에서, Rep 단백질은 서열번호 11 또는 12의 1-229번 아미노산들로 필수적으로 구성된 소형 스핑크스 게놈들에 보존된 N-말단 영역과, 서열번호 11의 230-324번 아미노산들로 필수적으로 구성된 MSBI1.176 특이적인 C-말단 가변부, 또는 서열번호 12의 230-324번 아미노산들로부터 필수적으로 구성된 MSBI2.176 특이적인 C-말단 가변부를 포함한다. N-말단의 보존된 영역은 서열번호 1, 8, 11 및 12의 1-136번 아미노산들로 필수적으로 구성된 추정의 제1 DNA 결합 도메인과, 서열번호 1, 8, 11 및 12의 137-229번 아미노산들로 필수적으로 구성된 추정의 제2 DNA 결합 도메인을 포함한다.
또한, "Rep 단백질"은, 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 단백질의 단편 및 변이체를 포괄한다. 바람직하게는, 이들 단편은, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 Rep 단백질에 대한 항-Rep 단백질 항체의 하나 이상의 에피토프를 포함하며, 바람직하게는 적어도 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 50개의 인접한 아미노산들을 포함하는, 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 가진 단백질의 면역원성 단편이다. 특정 구현예에서, 단편은 Rep 단백질의 도메인, 예를 들어, N-말단 보존된 영역, C-말단 가변부, 제1 또는 제2 DNA 결합 도메인을 포함하거나, 또는 이들로 필수적으로 구성된다. 서열번호 11 또는 12를 가진 단백질의 변이체는 서열번호 11 또는 서열번호 12와 비교해 하나 이상의 아미노산 결손, 치환 또는 삽입을 포함하며, 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 가지며, 변이체는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질에 특이적인 항-Rep 항체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 천연 또는 비-천연성의, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예, 비-천연 아미노산, 펩타이드 핵산 (PNA) 등)를 함유한 폴리펩타이드, 치환된 연결뿐 아니라 당해 기술 분야에 공지된 기타 변형을 가진 폴리펩타이드도 변이체 정의에 포함된다. 용어 Rep 단백질은 이종의 아미노산 서열, 리더 서열 또는 Tag-서열 등을 가진 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, Rep 단백질은, 예를 들어 His6-Tag (서열번호 4), T7-Tag (서열번호 5), FLAG-Tag (서열번호 6) 및 Strep-II-Tag (서열번호 7)로 이루어진 군으로부터 선택되는 Tag-서열과 융합될 수 있다.
본 발명의 합성 MSBI1 Rep 단백질 (MSBI1 Rep 27/154E) 또는 MSBI2 Rep 단백질 (MSBI2 Rep 27/154E)은, 상기와 같이 정의되는 Rep 단편 및 Rep 변이체를 포함하여, 고전적인 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 합성은 균질한 용액 또는 고상에서 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 또한 재조합 DNA 기법을 이용해 제조할 수 있다. 예를 들어, 단일한 점 돌연변이 2개를 통해, 잔기 25-31 (LLILLAII)과 잔기 151-155 (LLICW) 간의 2개의 아미노산 서열의 응집 가능성을 최소화한, MSBI1 Rep 27/154E를 제작하였다. 클로닝의 토대는, 오리지날 MSBI1 Rep 일차 아미노산 서열을 코딩하는 Rep 발현을 인간 시스템에서 코돈-최적화한, MSBI1 Rep DNA 서열이다. 아미노산 27 (L, 루신, DNA 코돈 CTA)을 코딩하는 뉴클레오티드뿐 아니라 아미노산 154 (C, 시스테인, DNA 코돈 TGT)를 코딩하는 뉴클레오티드를, 아미노산 글루탐산 (E, DNA 코돈 GAG)을 코딩하는 뉴클레오티드로 치환하여, 최종 DNA 서열 서열번호 11을 제조하였다. 이러한 Rep 이중 돌연변이의 순 응집 가능성 (net aggregation potential)은 비-응집성 경향의 다양한 단백질 범위인 스코어 141까지 최소화되었다.
실시예 (도 2 및 3)에 나타낸 바와 같이, Rep 27/154E 돌연변이에서는 야생형 Rep 단백질과 비교해 Rep 올리고머 및 거대 응집체가 현저하게 감소되었다 (>50%). 또한, 웨스턴 블롯팅에서, Rep 올리고머 및 고 분자량 응집체가 현저하게 적게 관찰되었다 (도 4). 가장 명확하게도, 모노머성 Rep 단백질의 추가적인 종들이 네이티브 (native) PAGE 조건에서 Rep 돌연변이에서만 검출되었다. 명확하게도, 고 분자량 응집체의 밀도 (intensity)는 27/154E Rep 이중 돌연변이에서 현저하게 감소된다. 일반적으로, Rep 응집체는 비-변성 조건에서 정제된 단백질에서 더 많다. 게다가, 변성 조건에서 정제 및 보관된 단백질은 매우 강력한 응집성을 나타내는데, 이런 현상이 Rep 이중 돌연변이에서 현저하게 감소되었다. ELISA 실험 셋업은 항체-항원 결합에 네이티브 조건이 필수적이기 때문에 표면-결합된 단백질 항원의 재-변성 (renaturation)에 의존하므로, 이는 특히 흥미롭다.
야생형 Rep 단백질은 고전적인 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 합성은 균질한 용액에서 또는 고상으로 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 또한 재조합 DNA 기법을 이용해 제조할 수 있다. 야생형 Rep 단백질의 제조 및 정제에 대한 일 예는 실시예 1에 기술된다.
본원에서, "개체"는 뮤라인, 소 (cattle), 예를 들어, 보바인, 유인원 및 인간 등의 포유류 개체 또는 환자를 지칭한다. 바람직하게는, 개체는 인간 환자이다.
본원에서, "샘플"은 액체 및 고체 샘플을 망라한 생물학적 샘플을 지칭한다. 액체 샘플은 예를 들어 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 액체 또는 뇌척수액 (CSF)을 포함한다. 고체 샘플은 조직 배양물 또는 생검 시료와 같은 조직 샘플을 포함한다.
본원에서, "와 연관성을 가진다"는, 예를 들어, MS의 질환 상태와 현저한 연관성을 가진 항-Rep 항체 및 Rep 단백질 각각의 양, 즉 농도 또는 역가를 나타내는 것이다. 연관성은 검사할 개체 유래 샘플 및 대조군 샘플에 존재하는 양적 차이 정도를 검출함으로써 결정된다. "대조군 샘플"은 여러가지, 즉 3개 이상의 대조군 샘플의 평균 또는 단일 샘플을 의미한다. 대조군은 MS로 진단되지 않은 건강한 개체로부터 수집된다. 다른 예로, 연관성은 검사할 개체의 샘플에 존재하는 양과 기결정된 컷오프 값과의 차이 정도를 검출함으로써 이론적으로 정할 수 있다. 컷오프 값은, 여러가지 질환 상태들 간의, 예를 들어 건강한 상태와 질병에 걸린 상태 간의 통계학적으로 유의미한 분리성을 가진, 기준 값 (reference value)이다. 컷오프 값은 병력이 있는 환자 유래 검사 샘플과 건강한 검사 그룹의 샘플로 구성된 현저하게 큰 패널을 당해 기술 분야에 공지된 통계학적 검사에 의해 통계학적으로 분석함으로써, 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 진단, 예를 들어 MS 진단은, 대조군 샘플과 비교해, 개체 유래 샘플에서 단백질, 즉 Rep 단백질 및 항-Rep-항체의 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배 이상의 양적 증가에 의해 확인된다.
본원에서, "항-Rep 항체"는, 비-Rep 단백질에 비해 본 발명의 Rep 단백질에 대한 친화성이 더 높은 본 발명의 방법으로, Rep 단백질에 검출가능한 수준으로 결합하는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, Rep 단백질에 대한 항원 친화성은 백그라운드 결합의 적어도 2배 이상이다. 구체적으로, 항-Rep 항체는 서열번호 1 또는 11의 아미노산 서열을 가진 MSBI1 Rep, 또는 서열번호 8 또는 12의 아미노산 서열을 가진 MSBI2 Rep에 특이적이다. 특정 구현예에서, 항체는 MSBI1 Rep 또는 MSBI2 Rep에 교차-특이성을 가진다.
모든 분석에서 공통적인 특징은, Rep 단백질이 샘플에 존재하는 임의의 항체에 결합하도록 허용하는 조건에서, 항-Rep 단백질 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 Rep 단백질을 접촉시킨다는 것이다. 이러한 조건은, 전형적으로, 과량의 Rep 단백질을 이용한 생리학적 온도, pH 및 이온 강도일 것이다. Rep 단백질과 샘플을 인큐베이션한 후, 항원을 포함한 면역학적 복합체를 검출한다. 특정 구현예에서, Rep 단백질은 신호 발생 화합물과 커플링되며, 예를 들어 신호 발생 화합물과 커플링된 검출가능한 표지물질, 또는 부가적인 결합체, 예를 들어 2차 항-인간 항체를 사용해 면역학적 복합체를 검출한다.
항-Rep 항체는, 샘플에서 의심되는 포유류, 예를 들어 인간 항체에 대한 타겟으로서 이용되는 단백질 항원으로서 Rep 단백질에 기반한 분석으로 검출 및 정량할 수 있다. 바람직하게는, Rep 단백질은 (예, 실시예 1 참조) 정제된 것이며, 샘플은 예를 들어 혈청 또는 혈장 샘플일 수 있다. 본 방법은 매트릭스에 Rep 단백질을 고정한 다음 고정된 Rep 단백질을 샘플과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 마지막으로, Rep 단백질과 샘플 항체 간에 형성된 면역학적 복합체의 Rep-결합된 항체를, 신호 발생 화합물과 커플링된 검출 결합제, 예를 들어 HRP-기질 기반의 정량화 가능한 2차 HRP-(호스래디쉬 퍼옥시다제)-커플링된 검출 항체에 의해 정량한다. 신호 발생 화합물 또는 표지물질은 자체적으로 검출가능하거나, 또는 부가적인 화합물과 반응하여 검출가능한 산물을 생성할 수 있다.
다른 구현예들에서, 먼저 샘플의 항체를 매트릭스에 고정한 다음 지정된 양의 Rep 단백질과 함께 인큐베이션하되, 매트릭스 상에 고정 및 존재하는 항-Rep 항체는 단백질-샘플 액체 혼합물로부터 Rep 단백질을 포획한 다음 결합된 Rep 단백질을 정량하는, 간접적인 방식으로 항-Rep 항체를 정량한다.
다른 구현예들에서, Rep 단백질은 세포에서 발현시킬 수 있으며, 세포를 샘플과 함께 인큐베이션한다. 그런 후, 세포에 의해 발현된 Rep 단백질에 결합된 샘플 유래 항-Rep 항체를 검출 및 정량한다.
면역분석의 설계는 매우 상당한 수정을 거치며, 다수의 포맷들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 프로토콜은, 예를 들어, 고체 지지체 또는 면역침강을 이용할 수 있다. 대부분의 분석은 신호 발생 화합물이 커플링된 결합제, 예를 들어 표지된 항체 또는 표지된 Rep 단백질의 사용을 수반하며; 표지물질은 예를 들어 효소, 형광, 발광, 방사성 또는 염료 분자일 수 있다. 면역 복합체로부터 신호를 증폭시키는 분석 방법들이 공지되어 있으며; 이의 예로는 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용한 분석, 및 효소-표지된 및 효소-매개의 면역분석, 예를 들어 ELISA 분석이 있다.
면역분석은 균질 (homogeneous) 또는 비균질 포맷 (heterogeneous format)일 수 있으며, 표준 타입 또는 경쟁적인 타입일 수 있다. 비균질 포맷의 경우, 폴리펩타이드 (Rep 단백질 또는 항-Rep 항체)는, 인큐베이션 후 폴리펩타이드로부터 샘플 분리를 용이하게 하기 위해, 전형적으로 고체 매트릭스 또는 지지체 또는 담체에 결합시킨다. 사용될 수 있는 고체 지지체의 예는 니트로셀룰로스 (예, 멤브레인 또는 마이크로타이터 웰 형태), 폴리비닐 클로라이드 (예, 시트 또는 마이크로타이터 웰 형태), 폴리스티렌 라텍스 (예, 비드 또는 마이크로타이터 플레이트, 폴리비닐리딘 플루오라이드 (Immunolon이라 함), 디아조화된 페이퍼 (diazotized paper), 나일론 멤브레인, 활성화된 비드 (activated bead) 및 단백질 A 비드이다. 항원성 폴리펩타이드를 함유한 고체 지지체는 전형적으로 이를 검사 샘플로부터 분리한 후, 그리고 결합된 항-Rep 항체를 검출하기 전에, 세척한다. 표준적인 포맷 및 경쟁적인 포맷들은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
균질 포맷의 경우, 검사 샘플을 Rep 단백질과 용액 내에서 인큐베이션한다. 예를 들어, 이는 형성된 임의의 Rep 단백질-항체 복합체를 석출시키는 조건 하에 이루어질 수 있다. 이러한 분석에서 표준적인 포맷 및 경쟁적인 포맷 모두 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
표준적인 포맷에서, 항체-Rep 단백질 복합체에서 항-Rep 항체의 양을 직접 모니터링한다. 이는, 항-Rep 항체 상의 에피토프를 인지하는 (표지된) 항-이종성 (예, 항-인간) 항체가 복합체 형성으로 결합하는 지를 확인함으로써, 달성할 수 있다. 경쟁적인 포맷의 경우, 샘플 내 항-Rep 항체의 양은, 복합체에서 기지량의 표지된 항체 (또는 다른 경쟁성 리간드)의 결합에 대한 경쟁적인 효과를 모니터링함으로써, 유추한다.
항-Rep 항체 (또는 경쟁적인 분석의 경우에, 경쟁적인 항체의 양)를 포함하는 형성된 복합체는 포맷에 따라 임의의 다수의 공지된 기법으로 검출한다. 예를 들어, 복합체에서 비-표지된 항-Rep 항체는 표지물질 (예, HRP와 같은 효소 표지물질)과 복합체를 형성한 항-이종성 Ig의 접합체를 이용해 검출할 수 있다.
면역침강 또는 응집 (agglutination) 분석 포맷의 경우, Rep 단백질과 항-Rep 항체 간의 반응은 용액 또는 현탁액으로부터 석출되는 네트워크를 형성하며, 가시적인 석출물 층 또는 필름을 형성한다. 샘플에 항-Rep 항체가 존재하지 않을 경우, 가시적인 석출은 형성되지 않는다.
선택되는 고상은 폴리머 또는 유리 비드, 니트로셀룰로스, 미세입자, 반응 트레이의 마이크로웰, 시험관 및 자기 비드를 포함할 수 있다. 신호 발생 화합물은 효소, 발광 화합물, 크로모겐, 방사성 원소 및 화학발광 화합물을 포함할 수 있다. 효소의 예로는 알칼라인 포스파타제, 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 및 β-갈락토시다제 등이 있다. 인핸서 화합물의 예로는 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘 등이 있다. 멤버에 결합하는 인핸서 화합물의 예로는 바이오틴, 항-바이오틴 및 아비딘 등이 있다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은, 샘플 내 Rep 단백질의 양적 증가가 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단 또는 소인과 연관성을 가진 방법, 또는 질환, 예를 들어 MS를 모니터링하거나, 또는 질환, 예를 들어 MS의 치료를 모니터링하기 위해 사용되는 방법을 제공한다. 이러한 구현예에서, 샘플 내 Rep 단백질은 항-Rep 항체에 의해 검출한다.
이러한 방법은,
(a) 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질의 양을 항-Rep 항체로 검출하는 단계; 및
(b) 대조군 샘플에서의 양과 비교해, 단계 (a)에서 개체 유래 샘플에서 검출된 Rep 단백질의 양을, 신경퇴행성 질환, 예를 들어 MS의 진단과 연관시키는 단계를 포함한다.
혈청 또는 혈장 샘플에서 Rep 단백질을 검출하는 상기한 방법에 사용될 수 있는 분석의 예로는, 비-제한적으로, 면역침강, 면역형광, 도트 블롯팅 및 웨스턴 블롯 등이 있다.
예를 들어, 혈청 샘플은 샘플에서 Rep 단백질을 포획하기 위해 항-Rep 단백질 항체와 함께 인큐베이션한 다음 Rep 단백질의 면역침강 단계 및 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 검출 단계를 거칠할 수 있다.
추가적인 예에서, 도트 블롯 멤브레인은 혈청과 인큐베이션한 다음 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 단계를 수행할 수 있다.
추가적인 예에서, 샘플의 혈청 희석물을 SDS-PAGE에 로딩한 다음 웨스턴 블롯을 수행한다.
추가적인 구현예들에서, 면역조직화학적 방법 또는 면역형광 현미경에 의해 Rep 단백질을 조직 샘플에서 검출한다.
특정 구현예에서, 항-Rep 항체는 샘플에서 Rep 단백질을 검출 또는 포획하는데 사용된다.
용어 "항체"는, 바람직하게는, 서로 다른 에피토프 특이성을 가진 다클론 항체 풀뿐만 아니라 구분되는 단일클론 항체 조제물로 필수적으로 구성되는 항체에 관한 것이다. 본원에서, 용어 "항체"(Ab) 또는 "단일클론 항체" (Mab)는 온전한 면역글로불린 분자뿐 아니라 Rep 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편 (예, Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편에는 무손상 항체의 Fc 단편이 없으며, 순환계에서 보다 빨리 사라지며, 무손상 항체에 비해 비-특이적인 조직 결합성이 더 낮을 수 있다. 따라서, 이들 단편뿐 아니라 FAB의 산물 또는 기타 면역글로불린 발현 라이브러리가 바람직하다. 또한, 본 발명의 목적에 유용한 항체는 키메라 (chimerical), 단쇄, 다중 기능성 (예 2중 특이성) 및 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함한다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 신호 발생 화합물과 결합되며, 예를 들어 검출가능한 표지물질을 탑재한다. 항체/단편은, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소를 이용해 직접 또는 간접적으로 검출가능하게 표지될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 항체 결합에 대해 적합한 다른 표지물질들을 알 것이며, 또는 일상적인 실험을 통해 확인할 수 있을 것이다.
실시예 파트에서 확인되는 바와 같이, 신규 조작된 이중 Rep 돌연변이는 야생형 Rep 단백질과 비교해 비슷한 ELISA 코팅 성능을 나타낸다. 아울러, 27/154E Rep 이중 돌연변이를 항원으로서 사용할 경우, ELISA 분석에서 야생형 Rep와 비교해, 인간 MS 혈청에서 Rep-반응성 항체의 반응성이 평균적으로 약 40%까지 증가하였다 (도 6).
또한, 본 발명자들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 공지된 방법에 의해 서열번호 1 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 Rep 단백질 또는 이의 단편에 대해 항-Rep 항체를 생성 (구축)하였다. 이들 항-Rep 항체는 소형 스핑크스 게놈 그룹으로부터 유래된 수종 또는 모든 타입의 Rep 단백질과의 결합을 위해 사용된다 (항-Small-Sphinx-유사 Rep 항체 또는 항-SSLRep 항체). 이들 항-SSLRep 항체는 서열번호 1의 1-229번 아미노산들로부터 유래된 Rep 단백질의 보존된 N-말단 영역 내에 위치한 에피토프에 결합한다. 서열번호 2 (서열번호 1의 아미노산 32-49) 또는 서열번호 3 (서열번호 1의 아미노산 197-216) 내에 위치한 에피토프에 결합하는 항-SSLRep 타입의 항-Rep 항체가 사용된다. 서열번호 2 및 서열번호 3의 펩타이드 단편은 소형 스핑크스 게놈 그룹의 Rep 단백질들에서 고도로 보존되어 있으며, 이의 친수성 특징으로 인해 노출되는 것으로 보인다. 항-SSLRep 타입의 항-Rep 항체는, 예를 들어 마우스 또는 기니아피그를, 서열번호 2 또는 3으로 나타낸 아미노산 서열로 필수적으로 구성된 펩타이드; 또는 다른 면역원성 단편, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 1-229로부터 유래된 보존된 N-말단 Rep 단백질 영역으로부터 유래된 적어도 8-15개의 아미노산을 포함하는 다른 면역원성 단편으로 면역화함으로써, 제조할 수 있다.
이러한 항체는, 예를 들어, 마우스 또는 기니아피그와 같은 포유류를 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 전장 Rep 단백질로 면역화함으로써, 제조된다.
이들 항-Rep 항체는 예를 들어 혈액, 혈장, 척수액 또는 뇌액과 같은 다양한 유형의 체액에 최대 피코그램 내지 펨토그램 범위로 Rep 단백질을 검출할 수 있다.
특정 유형의 항-Rep 항체 또는 2 이상 타입의 항-Rep 항체의 풀이 사용될 수 있다. 여러가지 유형의 항-Rep 항체 풀을 사용하는 경우, 항-Rep 항체 풀은 Rep 단백질의 여러가지 도메인, 예컨대 특히 MSBI1 Rep 단백질의 제1 DNA 결합 도메인 (예, 서열번호 1의 1-136), 제2 DNA 결합 도메인 (예, 서열번호 2의 aa 137-229) 및/또는 가변성 도메인 (서열번호 1의 aa 230-324) 내에 위치한 여러가지 에피토프에 결합하는 여러가지 항-Rep 항체를 포함할 수 있다.
2개의 DNA 결합 도메인에 단일 점 돌연변이가 2개 존재하고 가변성 도메인과 동일한 서열을 유지한다는 점에 비추어, 이들 항체는 서열번호 11 및 12의 돌연변이 단백질들 역시 인지한다.
항-Rep 항체 방법으로 Rep 단백질을 검출할 경우, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광 현미경 또는 면역조직화학적 방법을 이용할 수 있다.
항-Rep 항체는 특정 세포 위치에서 Rep 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 항-Rep 항체는 세포질, 핵막 및 핵에서 Rep 단백질을 검출할 수 있거나, 또는 세포질에서 스패클 (speckle)을 검출할 수 있다. 항-Rep 항체의 그룹의 예들은 표 1에 나타낸다:
항체 그룹 Rep 단백질 위치 특이성 항체 DSMZ 기탁
그룹 A 세포질 + 핵막 (+핵) MSBI1 + 소형-스핑크스-유사 AB01 523-1-1
 DSM ACC3327
그룹 B 세포질 내 스패클 MSBI1 + 소형-스핑크스-유사 AB02 304-4-1
 DSM ACC3328
그룹 C 세포질 + 핵막 (+ 핵) MSBI1 특이성 MSBI1 381-6-2 DSM ACC3329
그룹 D 세포질 내 스패클 MSBI1 특이성 D1: MSBI1 961-2-2D2: MSBI1 761-5-1 DSM ACC3330
그룹 A의 항-Rep 항체는 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열 내에 (서열번호 1의 aa 198 - 217) 에피토프를 가지며, MSBI1 Rep 및 소형 스핑크스 게놈 그룹 (예, MSBI2, CMI1, CMI4)의 보존된 에피토프를 포함하는 Rep 단백질을 검출할 수 있다. 면역형광 분석에서, 이러한 항-Rep 항체는 특이적인 Rep 위치 패턴을 검출하며, 주 위치는 세포질과 핵막에 균질하게 분포되어 있는 것으로 확인되며; 약하게 균질하게 분포된 추가적인 위치는 핵에서 확인된다. 이러한 그룹 A 항체의 예는 항체 AB01 523-1-1 (DSM ACC3327)로서, 이는 실시예에서 그룹 A 항체로서 이용된다.
그룹 B의 항-Rep 항체는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열 내 (서열번호 1의 aa 33 - 50) 에피토프를 가지며, MSBI1 Rep 및 소형 스핑크스 게놈 그룹 (예, MSBI2, CMI1, CMI4)의 보존된 에피토프를 포함하는 Rep 단백질을 검출할 수 있다. 면역형광 분석에서, 이 항-Rep 항체는 (주로 핵막 주변부에서) Rep 단백질의 스패클 (세포질 응집)을 특이적으로 검출한다. 이러한 그룹 B 항체의 예는 AB02 304-4-1 (DSM ACC3328)로 명명되는 항체로서, 실시예에서 그룹 B 항체로서 이용된다.
그룹 C의 항-Rep 항체는 MSBI1 (서열번호 1)의 구조 에피토프를 특이적으로 검출한다. 면역형광 분석에서, 이러한 항-Rep 항체는 특이적인 Rep 위치 패턴을 검출하며, 주 위치는 세포질과 핵막에 균질하게 분포되어 있는 것으로 확인되며; 약하게 균질하게 분포된 추가적인 위치는 핵에서 확인된다. 이러한 그룹 C 항체의 예는 항체 MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329)로서, 이는 실시예에서 그룹 C 항체로서 이용된다.
그룹 D의 항-Rep 항체는 MSBI1 (서열번호 1)의 구조 에피토프를 특이적으로 검출하며, "D1"으로 표시된 항체 MSBI1 961-2-2는 MSBI1의 C-말단 도메인에서 서열번호 9 (aa 281-287)로 나타낸 에피토프를 검출한다. "D2"로 표시된 MSBI1 761-5-1 (DSM ACC3328)은, 생체내 조건에서만 접근가능하고 웨스턴 블롯에서는 이용할 수 없는, MSBI1의 3D 구조 에피토프를 검출한다. 면역형광 분석에서, 이러한 항-Rep 항체는 Rep 단백질의 스패클 (세포질 응집)을 (주로 핵막 주변부에서) 특이적으로 검출한다.
특정 구현예에서, 이러한 Rep 단백질 위치가 병원성 기능과 연관성이 있다면, 예를 들어 스패클이 존재한다면, 그룹 A, B, C 또는 D의 항-Rep 항체; 또는 2 이상의 서로 다른 그룹 A, B, C 또는 D의 항-Rep 항체의 조합을 사용해, 프로브에서 Rep 단백질 위치 타입을 확인한다. 특정 구현예에서, 즉, 본 발명의 방법 또는 키트에서, 그룹 A 및 B로부터 선택되는 하나 이상의 항-Rep 항체는 그룹 C 및 D로부터 선택되는 하나 이상의 항-Rep 항체와 조합된다. 특정 구현예에서, 즉, 본 발명의 방법 또는 키트에서, 그룹 A의 항-Rep 항체는 그룹 B, C 및 D로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 항-Rep 항체와 조합된다. 예를 들어, 그룹 A의 항-Rep 항체는 추가적인 그룹 C 및 D의 항-Rep 항체와 조합될 수 있다. 이러한 여러가지 그룹의 항-Rep 항체의 조합들은 진단 분석에서, 특히 MS 진단에서 구별성 (distinctness)을 증가시킨다.
아래 항체들은 2017년 9월 28일자로 Deutsche Sammlung fur Mikrooriganismen und Zellkulturen (DSMZ) [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되었다:
항체 AB01 523-1-1, 기탁번호 DSM ACC3327;
항체 AB02 304-4-1, 기탁번호 DSM ACC3328;
항체 MSBI1 381-6-2, 기탁번호 DSM ACC3329; 및
항체 MSBI1 761-5-1, 기탁번호 DSM ACC3330.
항체 MSBI1 961-2-2는 2017년 10월 6일자로 DSMZ에 기탁되었다.
바람직한 구현예에서, 그룹 A, B, C 또는 D의 항-Rep 항체; 또는 2종 이상의 서로 다른 그룹 A, B, C 또는 D의 항-Rep 항체의 조합이, 합성 MSBI1 Rep 게놈에 의해 코딩된 Rep 단백질 (MSBI1 Rep 27/154E 또는 MSBI2 Rep 27/154E))을 확인하기 위해, 사용된다.
추가적인 구현예들에서, MS 진단에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 MS 진단 분석에서 물질의 사용 설명서와 더불어 항-Rep 항체 및/또는 Rep 단백질을 검출하기 위한 물질을 포함할 수 있다. 키트는 본 발명에 따른 바이오마커, 즉 Rep 단백질 및 항-Rep 항체 각각; 신호 발생 화합물, 포획 물질을 부착하기 위한 고체 매트릭스, 샘플 희석제, 세척 완충제 중 하나 이상의 구성성분을 포함할 수 있다. 신호 발생 화합물은 본 발명의 바이오마커에 결합할 수 있는 부가적인 결합제과 커플링되거나 또는 본 발명의 바이오마커와 직접 커플링된, 검출가능한 표지물질을 지칭한다.
본 발명을 비-제한적인 예로 아래 실시예들을 들어 추가적으로 설명한다.
실시예 1:
MSBI1 Rep 단백질 정제
MSBI1 게놈에서 동정된 전장 Rep 오픈 리딩 프래임 (ORF)을 코딩하는 뉴클레오티드 분자를, E. coli 고 수율 무-세포성 시험관내 번역 시스템 (ExpresswayTM Cell-Free E. coli Expression System, Invitrogen)에 기반하여 단백질 발현을 수행할 수 있는, 발현 플라스미드 (pEXP5-CT, Invitrogen)에 클로닝하였다. 시험관내 번역 반응에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 합성 Rep 단백질에, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸이 함유된 8M 우레아 샘플 완충제 pH 8.0를 반응 부피의 20X로 첨가하여, 변성시켰다. 그런 후, Rep 단백질에 융합된 C-말단 His6-tag를 이용해, 변성 조건 (세척의 경우 20 mM 이미다졸, 단백질 용출의 경우 300 mM 이미다졸)에서, Rep 단백질을 정제하였다. 정제 품질을 코마시 단백질 염색과 항-Rep 단백질 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. Rep 단백질 순도는 농도측정으로 계산하였으며, 95% 이상이었다. 정제된 단백질은 ELISA-기반의 혈청 스크리닝에 바로 사용하거나 또는 SDS-PAGE를 실시한 다음 1D-사이즈-해리된 Rep 단백질 멤브레인 스트립을 혈청 인큐베이션하기 위해 니트로셀룰로스 멤브레인에 블롯팅으로 이동시켰다.
실시예 2:
A. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 이용한 변성 조건에서의 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 특징 규명
정제된 Rep 항원 (야생형 및 돌연변이 Rep)의 특성을 여러가지 실험 세트로 확인하였다. 인간 HEK293TT 세포주로부터 비-변성 (네이티브) 조건에서 정제한 Rep 단백질은, SDS-PAGE 및 항-Rep 웨스턴 블롯팅시 환원 및 산화 샘플 로딩 조건 둘다에서, 단일 C154E 및 이중 27/154E 돌연변이의 경우, 야생형과 비교해, Rep 올리고머 (100 kDa 밴드) 농도가 현저하게 약하고, 고 분자량 응집체가 현저하게 적게 관찰되었다 (도 1)
B. 네이티브 PAGE를 이용한 비-변성 조건에서의 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 특징 규명
블루 네이티브 PAGE에 의한 동일한 비-변성 (네이티브) Rep 단백질의 특징 규명에서, 이중 돌연변이는, 야생형과 비교해, 웨스턴 블롯팅 (WB, 항-Rep) 또는 고 민감도 총 단백질 염색 (은 염색)에 의한 검출시, 고 분자량 단백질 응집체를 현저하게 낮은 수준으로 나타내었다 (도 2). 그러나, 일반적으로, 네이티브 PAGE 조건에서, Rep (MW 약 150 kDa)의 올리고머 종들이 지배적인 Rep 단백질 종이다. 이는 모노머 Rep (이론적인 MW 38,2 kDa)의 삼량체 또는 사량체일 수 있다
C. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 이용한 변성 조건에서의 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 특징 규명
표준 ELISA 분석을 위해, Rep 단백질을 고 수율 생산 및 우수한 단백질 안정성으로 인해 E. coli로부터 변성 조건 하에 정제하였다 (아래 프로토콜 참조). 변성된 Rep WT 및 Rep MUT의 응집을 확인하기 위해, ELISA 코팅의 재-변성 및 차단 조건을 모방하기 위해 단백질을 1시간 동안 PBS 중에 완충화한 다음, 항-Rep 항체 또는 코마시 단백질 염색을 이용한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다 (도 3). 재차, Rep 돌연변이에서는 Rep 올리고머 및 큰 응집체가 야생형 Rep 단백질과 비교해 현저하게 감소되는 것으로 확인되었다 (> 50%).
D. BN -PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 이용한 변성 조건에서의 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 특징 규명
BN-PAGE 및 후속적인 항-Rep 웨스턴 블롯팅에서 동일 샘플 (각각 5 ㎍)의 특징을 규명한 바, Rep 올리고머 뿐 아니라 고 분자량 응집체가 현저하게 적게 관찰되었다 (도 4). 가장 명확한 모노머 Rep 단백질에 대한 추가적인 종들은 네이티브 PAGE 조건에서 Rep 돌연변이에서만 검출되었다.
전체 결과에서, 심지어 SDS-PAGE에서 SDS 처리를 저항하는, 매우 안정적인 Rep 올리고머 (MW ~ 110 kDa)가 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 고 분자량 범위 (120-170 kDa 이상)를 포괄하는 매우 안정적인 Rep 응집체도 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에서 검출되었다. 그러나, 명백하게도, 27/154E Rep 이중 돌연변이에서는 이러한 고 분자량 응집체의 농도가 현저하게 감소되었다. 일반적으로, Rep 응집체는 비-변성 조건에서 정제된 단백질에서 더 많다. 게다가, 변성 조건에서 정제 및 보관된 단백질은 매우 강력한 응집성을 나타내지만, Rep 이중 돌연변이에서 현저하게 감소하였다. 항체-항원 결합에는 네이티브 조건이 필수적이기에 ELISA 실험 셋업이 표면-결합된 단백질 항원의 재생 (renaturation)을 기반으로 하므로, 이는 특히 흥미로운 결과이다.
실시예 3:
A. 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 ELISA 코팅 성능
중요하게도, 신규 조작된 이중 Rep 돌연변이는, 야생형 Rep 단백질과 비교해, 비슷한 ELISA 코팅 성능을 나타내었다 (분석 완충제: 카세인 완충제, 고=슈퍼블럭 완충제, 1% BSA / PBS) (도 5).
B. 인간 MS 혈청에서 야생형 또는 돌연변이 Rep 단백질의 ELISA 성능
부가적으로, ELISA 분석에서, 항원으로서 27/154E Rep 이중 돌연변이를 사용한 경우, 야생형 Rep와 비교해, 인간 MS 혈청에서 Rep-반응성 항체의 반응성이 약 40% 증가하였다 (도 6).
실시예 4:
야생형 및 돌연변이 Rep 단백질 항원의 정제
MSBI1 게놈에서 동정된 전장 야생형 Rep 오픈 리딩 프래임 (ORF)을 코딩하는 핵산 분자 또는 Rep 이중 돌연변이 27/154E를 코딩하는 핵산 분자를, E. coli에서 단백질을 발현할 수 있는 발현 플라스미드 (pEXP5-CT, Invitrogen)에 클로닝하였다. 간략하게는, 화학적으로 처리된 컴피턴트 E. coli (SoluBl21, Genlantis)에 발현 플라스미드를 형질감염시킨 다음 암피실린이 첨가된 LB-아가에서 클론 선별을 수행하였다. 소량 예비-스크리닝으로 단백질 검사 발현에 의해 단백질 발현 수준이 높은 클론을 선별하였다. 이에, 클론 배양물을 LB Amp에서 약 10 ml로 확대하여 (37℃, 교반 장치), OD600 0.4 - 0.6에 도달하면, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG, 0,66 mM)를 첨가하여 교반 장치에서 밤새 25℃에서 유도하였다.
(Lammli SDS-PAGE 샘플 완충제 내에서 제조한) E. coli 세포용해물을 SDS-PAGE한 다음 Rep 단백질의 C-말단 6xHis tag에 반응하는 항-His 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해, 타겟 단백질 발현을 확인하였다. Rep 단백질 발현이 가장 높은 초기 E. coli 배양물을 LB Amp 1000 ml로, OD600 0.5가 될 때까지 증폭시켰다. IPTG (0.66 mM)를 첨가하여 교반 장치에서 밤새 25℃에서 단백질 발현을 유도하였다. 그런 후, 세포를 6000 g 및 4℃에서 원심분리하고, 이를 PBS로 세척 후 분액으로 나누어 -80℃에서 보관하였다 (초기 IPTG 유도된 E. coli 배양물 1000 ml 각각 100 ml씩, 분액 10개).
E. coli 발현에서 서열번호 1 (야생형) 또는 서열번호 11 (돌연변이)의 아미노산 서열을 가진 합성 Rep 단백질에, 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 5 mM 이미다졸, 5 mM β-머캅토에탄올이 함유된 8M 우레아 샘플 완충제 pH 8.0를 반응 부피의 20X로 첨가하여, 변성시켰다. 그런 후, Rep 단백질에 융합된 C-말단 His6-tag를 이용해, 변성 조건 (세척의 경우 55 mM 이미다졸, 단백질 용출의 경우 300 mM 이미다졸)에서, Rep 단백질을 정제하였다. 정제 품질을 코마시 단백질 염색과 항-Rep 단백질 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. Rep 단백질 순도는 농도측정으로 계산하였으며, 95% 이상이었다. 정제된 단백질은 ELISA-기반의 혈청 스크리닝에 바로 사용하거나 또는 SDS-PAGE를 실시한 다음 1D-사이즈-해리된 Rep 단백질 멤브레인 스트립을 혈청 인큐베이션하기 위해 니트로셀룰로스 멤브레인에 블롯팅으로 이동시켰다.
서열 요약
서열번호 서열
1 MSBI1.176 (야생형)에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLILLAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLICWRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVF
2 Rep 펩타이드 단편의 아미노산 서열
EARETGKGINANDPLTVH
3 Rep 펩타이드 단편의 아미노산 서열
KQINEHTDITASYEOHKKGRT
4 His-Tag (2개의 중성 아미노산 포함)
GAHHHHHH
5 T7-Tag
MASMTGGQQMG
6 FLAG-Tag
DYKDDDDK
7 Strep-II-Tag
WSHPQFEK
8 MSBI2.176 (야생형)에 의해 코딩된 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSKLVVKDNALMNASYNLDLVEQRLILLAIIEARESGKGINANDPLTVHAESYINQFGVHRVTAYQALKDACDNLFARQFSYQSKSEKGNIQNHRSRWVSEIIYIDTEATVKIIFAPAIVPLITRLEEQFTKYDIEQISDLSSAYAIRLYELLICWRSTGKTPIIGLGEFRNRVGVLDSEYHRIAHLKERVIEHSIKQINEHTDITATYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKPKQAEIATETPKTATNDPDTTKPLTEPQIAKYSMILCKLGSISDLSNFPDYPAFANWIGNILRNPEKADEQIAKRIFTALKTETDYSKKN
9 MSBI.1 특이 에피토프
NRLSDRF
10 MSBI1 Rep 27/154E (돌연변이 DNA)를 코딩하는 합성 돌연변이 Rep 단백질의 뉴클레오티드 서열
ATGAGCGACCTGATCGTGAAAGACAATGCCCTGATGAACGCCTCCTACAACCTGGCACTGGTCGAACAGAGACTGATTGAGCTGGCTATCATCGAGGCAAGGGAGACCGGCAAGGGCATCAACGCCAATGACCCCCTGACAGTGCACGCCAGCTCCTACATCAACCAGTTTAATGTGGAGCGCCACACCGCCTATCAGGCCCTGAAGGACGCCTGCAAGGATCTGTTTGCCCGGCAGTTCAGCTACCAGGAGAAGCGGGAGAGAGGCAGGATCAACATCACAAGCAGATGGGTGTCCCAGATCGGCTATATGGACGATACCGCCACAGTGGAGATCATCTTTGCACCAGCAGTGGTGCCTCTGATCACCAGGCTGGAGGAGCAGTTCACACAGTACGACATCGAGCAGATCTCCGGACTGTCTAGCGCCTACGCCGTGCGCATGTATGAGCTGCTGATCGAGTGGCGGTCTACCGGCAAGACACCTATCATCGAGCTGGATGAGTTCCGCAAGCGGATCGGCGTGCTGGACACCGAGTACACCAGAACAGATAACCTGAAGATGAGAGTGATCGAGCTGGCCCTGAAGCAGATCAATGAGCACACCGATATCACAGCCTCTTATGAGCAGCACAAGAAGGGCCGCGTGATCACCGGCTTCAGCTTTAAGTTCAAGCACAAGAAGCAGAACTCTGACAAGACACCAAAGAATAGCGATTCCTCTCCCCGGATCGTGAAGCACAGCCAGATCCCTACCAACATCGTGAAGCAGCCAGAGAATGCCAAGATGTCCGACCTGGAGCACAGGGCATCTAGGGTGACAGGCGAGATCATGAGAAATAGGCTGAGCGATCGGTTCAAGCAGGGCGACGAGTCCGCCATCGATATGATGAAGAGAATCCAGTCCGAGATCATCACCGACGCCATCGCCGATCAGTGGGAATCTAAACTGGAAGAGTTTGGAGTCGTGTTTGGAGCACATCACCATCATCATCACTGA
11 MSBI1 Rep 27/154E (돌연변이 단백질)에 의해 코딩되는 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSDLIVKDNALMNASYNLALVEQRLI E LAIIEARETGKGINANDPLTVHASSYINQFNVERHTAYQALKDACKDLFARQFSYQEKRERGRINITSRWVSQIGYMDDTATVEIIFAPAVVPLITRLEEQFTQYDIEQISGLSSAYAVRMYELLI E WRSTGKTPIIELDEFRKRIGVLDTEYTRTDNLKMRVIELALKQINEHTDITASYEQHKKGRVITGFSFKFKHKKQNSDKTPKNSDSSPRIVKHSQIPTNIVKQPENAKMSDLEHRASRVTGEIMRNRLSDRFKQGDESAIDMMKRIQSEIITDAIADQWESKLEEFGVVF
12 MSBI2 Rep 27/154E (돌연변이 단백질)에 의해 코딩되는 Rep 단백질의 아미노산 서열
MSKLVVKDNALMNASYNLDLVEQRLI E LAIIEARESGKGINANDPLTVHAESYINQFGVHRVTAYQALKDACDNLFARQFSYQSKSEKGNIQNHRSRWVSEIIYIDTEATVKIIFAPAIVPLITRLEEQFTKYDIEQISDLSSAYAIRLYELLI E WRSTGKTPIIGLGEFRNRVGVLDSEYHRIAHLKERVIEHSIKQINEHTDITATYEQHKKGRTITGFSFKFKQKKPKQAEIATETPKTATNDPDTTKPLTEPQIAKYSMILCKLGSISDLSNFPDYPAFANWIGNILRNPEKADEQIAKRIFTALKTETDYSKKN
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum <120> Mutantis Rep-Protein <130> K 3635EP <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg 85 90 95 Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile 100 105 110 Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly Lys 145 150 155 160 Thr Pro Ile Ile Glu Leu Asp Glu Phe Arg Lys Arg Ile Gly Val Leu 165 170 175 Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu 180 185 190 Leu Ala Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe 210 215 220 Lys His Lys Lys Gln Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser 225 230 235 240 Ser Pro Arg Ile Val Lys His Ser Gln Ile Pro Thr Asn Ile Val Lys 245 250 255 Gln Pro Glu Asn Ala Lys Met Ser Asp Leu Glu His Arg Ala Ser Arg 260 265 270 Val Thr Gly Glu Ile Met Arg Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln 275 280 285 Gly Asp Glu Ser Ala Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile 290 295 300 Ile Thr Asp Ala Ile Ala Asp Gln Trp Glu Ser Lys Leu Glu Glu Phe 305 310 315 320 Gly Val Val Phe <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Glu Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr 1 5 10 15 Val His <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr Glu Gln His 1 5 10 15 Lys Lys Gly Arg Thr 20 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> His-Tag <400> 4 Gly Ala His His His His His His 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> T7 Tag <400> 5 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Flag Tag <400> 6 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Strep II Tag <400> 7 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 8 <211> 319 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 8 Met Ser Lys Leu Val Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Asp Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Leu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Ser Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Glu Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Gly Val His Arg Val Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Asp Asn Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Ser Lys Ser Glu Lys Gly Asn Ile Gln Asn His Arg Ser 85 90 95 Arg Trp Val Ser Glu Ile Ile Tyr Ile Asp Thr Glu Ala Thr Val Lys 100 105 110 Ile Ile Phe Ala Pro Ala Ile Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu 115 120 125 Gln Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Asp Leu Ser Ser Ala 130 135 140 Tyr Ala Ile Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Cys Trp Arg Ser Thr Gly 145 150 155 160 Lys Thr Pro Ile Ile Gly Leu Gly Glu Phe Arg Asn Arg Val Gly Val 165 170 175 Leu Asp Ser Glu Tyr His Arg Ile Ala His Leu Lys Glu Arg Val Ile 180 185 190 Glu His Ser Ile Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Thr 195 200 205 Tyr Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Thr Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys 210 215 220 Phe Lys Gln Lys Lys Pro Lys Gln Ala Glu Ile Ala Thr Glu Thr Pro 225 230 235 240 Lys Thr Ala Thr Asn Asp Pro Asp Thr Thr Lys Pro Leu Thr Glu Pro 245 250 255 Gln Ile Ala Lys Tyr Ser Met Ile Leu Cys Lys Leu Gly Ser Ile Ser 260 265 270 Asp Leu Ser Asn Phe Pro Asp Tyr Pro Ala Phe Ala Asn Trp Ile Gly 275 280 285 Asn Ile Leu Arg Asn Pro Glu Lys Ala Asp Glu Gln Ile Ala Lys Arg 290 295 300 Ile Phe Thr Ala Leu Lys Thr Glu Thr Asp Tyr Ser Lys Lys Asn 305 310 315 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 9 Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe 1 5 <210> 10 <211> 999 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> MSBI1 Rep 27/154E mutant <400> 10 atgagcgacc tgatcgtgaa agacaatgcc ctgatgaacg cctcctacaa cctggcactg 60 gtcgaacaga gactgattga gctggctatc atcgaggcaa gggagaccgg caagggcatc 120 aacgccaatg accccctgac agtgcacgcc agctcctaca tcaaccagtt taatgtggag 180 cgccacaccg cctatcaggc cctgaaggac gcctgcaagg atctgtttgc ccggcagttc 240 agctaccagg agaagcggga gagaggcagg atcaacatca caagcagatg ggtgtcccag 300 atcggctata tggacgatac cgccacagtg gagatcatct ttgcaccagc agtggtgcct 360 ctgatcacca ggctggagga gcagttcaca cagtacgaca tcgagcagat ctccggactg 420 tctagcgcct acgccgtgcg catgtatgag ctgctgatcg agtggcggtc taccggcaag 480 acacctatca tcgagctgga tgagttccgc aagcggatcg gcgtgctgga caccgagtac 540 accagaacag ataacctgaa gatgagagtg atcgagctgg ccctgaagca gatcaatgag 600 cacaccgata tcacagcctc ttatgagcag cacaagaagg gccgcgtgat caccggcttc 660 agctttaagt tcaagcacaa gaagcagaac tctgacaaga caccaaagaa tagcgattcc 720 tctccccgga tcgtgaagca cagccagatc cctaccaaca tcgtgaagca gccagagaat 780 gccaagatgt ccgacctgga gcacagggca tctagggtga caggcgagat catgagaaat 840 aggctgagcg atcggttcaa gcagggcgac gagtccgcca tcgatatgat gaagagaatc 900 cagtccgaga tcatcaccga cgccatcgcc gatcagtggg aatctaaact ggaagagttt 960 ggagtcgtgt ttggagcaca tcaccatcat catcactga 999 <210> 11 <211> 324 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MSBI1 Rep 27/154E mutant <400> 11 Met Ser Asp Leu Ile Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Ala Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Glu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Thr Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Ser Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Asn Val Glu Arg His Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Lys Asp Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Glu Lys Arg Glu Arg Gly Arg Ile Asn Ile Thr Ser Arg 85 90 95 Trp Val Ser Gln Ile Gly Tyr Met Asp Asp Thr Ala Thr Val Glu Ile 100 105 110 Ile Phe Ala Pro Ala Val Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Phe Thr Gln Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Gly Leu Ser Ser Ala Tyr 130 135 140 Ala Val Arg Met Tyr Glu Leu Leu Ile Glu Trp Arg Ser Thr Gly Lys 145 150 155 160 Thr Pro Ile Ile Glu Leu Asp Glu Phe Arg Lys Arg Ile Gly Val Leu 165 170 175 Asp Thr Glu Tyr Thr Arg Thr Asp Asn Leu Lys Met Arg Val Ile Glu 180 185 190 Leu Ala Leu Lys Gln Ile Asn Glu His Thr Asp Ile Thr Ala Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln His Lys Lys Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Ser Phe Lys Phe 210 215 220 Lys His Lys Lys Gln Asn Ser Asp Lys Thr Pro Lys Asn Ser Asp Ser 225 230 235 240 Ser Pro Arg Ile Val Lys His Ser Gln Ile Pro Thr Asn Ile Val Lys 245 250 255 Gln Pro Glu Asn Ala Lys Met Ser Asp Leu Glu His Arg Ala Ser Arg 260 265 270 Val Thr Gly Glu Ile Met Arg Asn Arg Leu Ser Asp Arg Phe Lys Gln 275 280 285 Gly Asp Glu Ser Ala Ile Asp Met Met Lys Arg Ile Gln Ser Glu Ile 290 295 300 Ile Thr Asp Ala Ile Ala Asp Gln Trp Glu Ser Lys Leu Glu Glu Phe 305 310 315 320 Gly Val Val Phe <210> 12 <211> 319 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MSBI2 Rep 27/154E mutant <400> 12 Met Ser Lys Leu Val Val Lys Asp Asn Ala Leu Met Asn Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Asn Leu Asp Leu Val Glu Gln Arg Leu Ile Glu Leu Ala Ile Ile Glu 20 25 30 Ala Arg Glu Ser Gly Lys Gly Ile Asn Ala Asn Asp Pro Leu Thr Val 35 40 45 His Ala Glu Ser Tyr Ile Asn Gln Phe Gly Val His Arg Val Thr Ala 50 55 60 Tyr Gln Ala Leu Lys Asp Ala Cys Asp Asn Leu Phe Ala Arg Gln Phe 65 70 75 80 Ser Tyr Gln Ser Lys Ser Glu Lys Gly Asn Ile Gln Asn His Arg Ser 85 90 95 Arg Trp Val Ser Glu Ile Ile Tyr Ile Asp Thr Glu Ala Thr Val Lys 100 105 110 Ile Ile Phe Ala Pro Ala Ile Val Pro Leu Ile Thr Arg Leu Glu Glu 115 120 125 Gln Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Glu Gln Ile Ser Asp Leu Ser Ser Ala 130 135 140 Tyr Ala Ile Arg Leu Tyr Glu Leu Leu Ile Glu Trp Arg Ser Thr Gly 145 150 155 160 Lys Thr Pro Ile Ile Gly Leu Gly Glu Phe Arg Asn Arg Val Gly Val 165 170 175 Leu Asp Ser Glu Tyr His 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Claims (11)

  1. 서열번호 11 또는 12로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 DNA-복제-관련 (replication-associated, Rep) 단백질.
  2. 개체에서 다발성 경화증(MS)을 진단하는 시험관내 방법으로서,
    (a) 개체 유래 샘플을 제1항에 따라 정의되는 Rep 단백질과 인큐베이션하는 단계;
    (b) 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 검출하는 단계; 및
    (c) 개체 유래 샘플에서 Rep 단백질에 결합된 항체의 양을, 대조군 샘플에서의 양과 비교해, MS의 진단과 연관시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    단계 (a)에서, Rep 단백질을 고정한 다음 고정된 Rep 단백질을 개체 유래 샘플과 인큐베이션하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    단계 (a)에서, Rep 단백질을 세포에서 발현시킨 다음 세포를 개체 유래 샘플과 인큐베이션하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    단계 (b)에서, Rep 단백질과 면역학적 복합체를 형성하는 항체의 양을 신호 발생 화합물과 커플링된 결합제를 검출함으로써 정량하는, 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    단계 (a)에서, 개체 유래 샘플에서 항체를 고정한 다음 지정된 양의 Rep 단백질과 인큐베이션하는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 개체 유래 샘플이 혈청 또는 혈장 샘플인, 방법.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    다발성 경화증(MS) 또는 MS 소인(predisposition)이 대조군 샘플 대비 개체 샘플내 항-Rep 항체의 2배 이상의 양적 증가에 의해 확인되는, 방법.
  9. 다발성 경화증(MS) 진단에 사용하기 위한 키트로서,
    (a) 서열번호 11 또는 12로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 Rep 단백질,
    (b) 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 가진 단백질에 대해 특이성을 가진 항-Rep 항체에 결합할 수 있는, 검출가능한 표지물질이 커플링된 항-인간 항체, 및
    (c) (a)에 따른 Rep 단백질을 고정하기 적합한 고체 매트릭스
    를 포함하는, 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 효소 면역 분석(EIA), 형광 면역분석(FIA), 발광 면역분석(LIA) 및 스트립 분석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분석에 사용하기 위한 것인, 키트.
  11. 삭제
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