JPH04252954A - タンパクの測定方法、試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はタンパクの測定方法、試
薬及びキットに関するものである。更に詳しくは、アル
ツハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ７５１、及び
ＡＰＰ７７０に含まれるＫＰＩ配列を認識する抗体を少
なくともその組み合わせの一方に用いることを特徴とす
るサンドイッチＥＬＩＳＡ法による、ＫＰＩ配列を含む
アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又はその断片の
免疫学的測定方法、試薬及びキットに関するものである
。

【０００２】

【従来の技術】近年、人口構成の高齢化に伴い、老人性
痴呆症をはじめとする、脳神経系の疾病が社会問題化し
つつある。これらの疾病の中には発症の原因や簡便な診
断法、治療法の確立されていない疾病も多く、その研究
開発が強く望まれている。このような病気には、アルツ
ハイマー型老人性痴呆症及びアルツハイマー病（以下こ
の２つを併せて、ＡＤと略す）が含まれる。ＡＤ患者の
脳には、老人斑アミロイドβ蛋白（以下老人斑アミロイ
ドと略す）を主要構成成分とする老人斑と呼ばれる構造
体が、正常人に比し、多く沈着することから老人斑アミ
ロイドとＡＤ発症の関係が注目されてきた。Ｋａｎｇら
により、老人斑アミロイドには前駆体（以下ＡＰＰと略
す）が存在すること（以下Ｋａｎｇらにより発見された
ＡＰＰをＡＰＰ６９５と略す）が報告され（Ｋａｎｇら
、Ｎａｔｕｒｅ　　３２５　　７３３−７３６　　１９
８７、特開昭６３−２２２６９３号公報参照）、さらに
本発明者らの研究等により、ＡＰＰには少なくとも３種
類（ＡＰＰ６９５に加えてＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７
０）存在することが明らかになった（Ｐｏｎｔｅら、Ｎ
ａｔｕｒｅ　　３３１　　５２５−５２７　　１９８８
、Ｔａｎｚｉら、Ｎａｔｕｒｅ　　３３１　　５２８−
５３０　　１９８８、Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ　　３３１　　５３０−５３２　　１９８８、欧州
特許公開番号０３０４０１３号公報）。更に、７１４ア
ミノ酸からなるアルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白
ＡＰＰ７１４（Ｇｏｌｄｅら、Ｎｅｕｒｏｎ　　４　　
２５３−２６７　　１９９０）、及び老人斑アミロイド
部分はもたない、５６３アミノ酸からなるＡＰＰ５６３
（ｄｅ　　Ｓａｕｖａｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２４
５　　６５１−６５３　　１９８９）もマイナー成分な
がらその存在が知られている（図１）。ＡＰＰ７５１及
びＡＰＰ７７０にはＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒ
ビターと高い相同性を有する領域が存在すること、及び
実際にプロテアーゼインヒビター活性が存在することが
明らかになった（図１）。ＡＤ患者における老人斑アミ
ロイドの脳内沈着を、プロテアーゼインヒビターによる
脳内の代謝阻害、ＡＰＰの不完全分解の結果と考えるな
らば、プロテアーゼインヒビター活性を有するＡＰＰの
過剰発現がＡＤの発症に何らかの役割をはたしている可
能性が考えられる。この見地から、本発明者らは、３種
類のＡＰＰメッセンジャーＲＮＡの発現量をＡＤ患者と
正常人の脳について検討したところ、ＡＤ患者において
ＡＰＰ７７０メッセンジャーＲＮＡの発現量が２倍程高
いという結果を得た。またＡＰＰ７５１メッセンジャー
ＲＮＡもＡＤ患者で対照に比べ１．１倍から１．３倍高
いという結果を得ている（Ｔａｎａｋａら、Ｂ．Ｂ．Ｒ
．Ｃ．１５７　　４７２−４７９　　１９８８及びＢ．
Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６５　　１４０６−１４１４　　１９９
０）。またヒト髄液を被検体としてプロテアーゼインヒ
ビター（ＫＰＩ）領域を含むＡＰＰタンパクまたはその
断片量をトリプシンＥＬＩＳＡ法（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉ
ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６６１４５３−１４５９　　１
９９０及び特願平１−２１４１１８、特願平２−２２０
８８９）により測定した結果、ＡＤ群は脳血管性痴呆群
に比し、有意に高値を示すという結果がえられている（
Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．１６６１４５
３−１４５９　　１９９０、及び、第３１回日本神経学
会総会抄録集２４１ページＩＩ−Ｊ−０５　　１９９０
年）。この結果は、ＡＰＰ７７０及びＡＰＰ７５１中に
共通に存在するプロテアーゼインヒビター（ＫＰＩ；こ
こでＫＰＩとはＡＰＰ７７０およびＡＰＰ７５１のＮ末
端側から数えて２８９番目のＧｌｕから３４４番目のＡ
ｌａまでの５６残基を指し、種々のプロテアーゼに対し
て阻害活性を有する）領域を認識するウサギ抗血清と、
トリプシン（このプロテアーゼインヒビター領域と強く
結合する）とを用いたトリプシンＥＬＩＳＡ法により得
られたものである。（但しＥＬＩＳＡとは、Ｅｎｚｙｍ
ｅ　　Ｌｉｎｋｅｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　
　Ａｓｓａｙの略である）。しかしながら、例えば、血
清や血漿を被検体とし、且つトリプシンを固相に結合し
て第１抗体の代わりに用いる場合には、血液中のトリプ
シンインヒビターとトリプシンが結合してしまうため、
アッセイプレート固相への被検体タンパク（即ちＡＰＰ
）の結合量が充分でない場合がある。そこで、トリプシ
ンＥＬＩＳＡ法に代わるＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０
タンパクの高感度検出方法が望まれている。

【０００３】ＫＰＩ配列を認識する抗体に関しては、合
成ペプチドを抗原として作製したものが報告されている
が（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ　　Ｊｏｕｒｎａｌ
　　８３６２７−３６３２、１９８９、Ｐａｌｍｅｒｔ
ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　　４０１０２８−１０３４　
　１９９０）、これらはいずれもウェスタンブロティン
グにしか使用されておらずＥＬＩＳＡには使用されてい
ない。ウェスタンブロティング法に於いては、被検体を
濃縮、脱塩、さらに界面活性剤や還元剤による変性処理
等の操作を行った後、電気泳動によりタンパク質の分離
を行い、これに対して抗原抗体反応を行わなければなら
ない。そのため操作が煩雑で多数の検体について測定が
困難であること、被検試料に含まれるＡＰＰ以外の來雑
タンパクの量によって検出感度が著しく左右されること
等の点で問題がある。また、ＡＰＰのＣ末端側（ＡＰＰ
６９５、７５１、７７０に共通な配列。ＡＰＰ６９５で
いえば第６６７−６７６残基）に対する抗体でラジオイ
ムノアッセイ法（以下ＲＩＡと略す）によって、血清中
のＡＰＰ濃度を検討したところ、ＡＤ／対照に有為差は
なかったとする報告もある（Ｒｕｍｂｌｅら、Ｎｅｗ　
　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊ．Ｍｅｄ．３２０、１４４６−
１４５２、１９８９）。ただし髄液や血液等体液中に存
在するＡＰＰの殆どは、膜貫通領域よりＣ末端側の配列
を有していない（例えばＰａｌｍｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８６、６３３
８−６３４２、１９８９、Ｐａｌｍｅｒｔら、Ｎｅｕｒ
ｏｌｏｇｙ　　４０、１０２８−１０３４、１９９０、
ｖａｎ　　Ｎｏｓｔｒａｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　　２
４８、７４５−７４８、１９９０、Ｃｏｌｅら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７０
、２８８−２９５、１９９０など）。これらの現状に於
いて、臨床現場でのＫＰＩ配列を有するＡＰＰの特異的
かつ迅速な定量方法の確立が求められていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、測
定操作及び試料の調製が簡便であるとともに、高感度に
ＫＰＩ配列を有するＡＰＰ（ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７
７０）及びその断片を測定することのできる、測定方法
、試薬及びキットを提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明者が鋭意研究を行った結果、ＫＰＩ配列を有するＡ
ＰＰ（ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０）及びその断片の
定量方法として、ＫＰＩ配列を認識する抗体を少なくと
も１種類用いた２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法によっ
て可能となることを見いだし、さらに当該方法により、
測定操作及び試料の調製が簡便であるとともに、高感度
にこれらを定量できる試薬及びキットを作成し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】以下、本発明について詳細に説明する。サ
ンドイッチＥＬＩＳＡ法による免疫学的測定方法とは、
抗原上の２つの異なった抗体認識部位（これを抗原決定
基という）にそれぞれ結合する２種類の抗体を用いて抗
原の有無又はその量を測定する方法である。本発明にお
いて用いられる、ＫＰＩ配列を有するＡＰＰの検出のた
めの抗体としては、一方がＫＰＩ配列を特異的に認識す
る抗体であることが要件であり、他方に用いられる抗体
としてはＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、又はＡＰＰ７７
０等各種ＡＰＰを認識する抗体であれば特に限定はない
。ＫＰＩ配列を認識する抗体として例えば本発明実施例
１に記載した抗ＺｔＰＩポリクローナル抗体が挙げられ
る。

【０００７】他方に用いられる抗体としては、ＡＰＰ６
９５、ＡＰＰ７５１又はＡＰＰ７７０等各種ＡＰＰを認
識する抗体やＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１又はＡＰＰ７
７０の膜貫通領域からカルボキシル末端までを除去した
各種ＡＰＰ誘導体を認識するポリクローナル抗体やモノ
クローナル抗体等を挙げることができる。例えば、本発
明者らによって作成された、ＡＰＰ６９５のＣ末端部分
１０３アミノ酸（膜貫通領域及び細胞内部分）が欠失し
たＡＰＰ６９５誘導体であるＡＰＰ５９２（実施例参照
）を免疫して得られた、ウサギ抗ＡＰＰ５９２ポリクロ
ーナル抗体等及びマウス抗ＡＰＰ５９２モノクローナル
抗体等が挙げられる。モノクローナル抗体の例としては
、微工研菌寄第１１９４２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９
４２，モノクローナル抗体１Ｂ２を産生する）、微工研
菌寄第１１９４３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９４３，モ
ノクローナル抗体３Ｂ２を産生する）、及び微工研菌寄
第１１９４４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１９４４，モノク
ローナル抗体６Ａ３を産生する）のハイブリドーマが産
生する抗体等が挙げられる。或いは、ＫＰＩ配列上の異
なる抗原決定基を認識する抗体との組み合わせであって
も良い。このような例としては本発明者らによって作成
された抗ＺｔＰＩポリクローナル抗体が挙げられる。

【０００８】これらの抗体は完全な形の抗体のままで用
い得ることは勿論のこと、その本質的結合能が維持され
る抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、（Ｆａｂ′）
２等として用いることもできる。本発明における被検試
料としては特に限定はないが、具体的には、髄液、血液
（血漿及び血清）、尿等が挙げられる。また、脳等の組
織や細胞の抽出物を用いることもできる。

【０００９】本発明において用いられる不溶性担体とし
ては、例えはポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリエステル、フッ素樹脂、ガラス、金属及びこ
れらの組み合わせ等を例示することができる。また不溶
性担体の形状としては、例えばトレー状、球状、繊維状
、棒状、盤状、容器状、セル、試験管等の種々の形状で
本発明を実施することができる。多数の被検試料を同時
に測定できる点では、９６穴マイクロプレート等が好ま
しい。

【００１０】本発明に於いては第２抗体として用いられ
る抗体を直接、酵素や放射性同位元素或いはＦＩＴＣ等
の蛍光物質で標識してもよい。或いは、かかる第２抗体
に対する抗体を標識したものを第３抗体として用いても
よい。或いは第２抗体を、ビオチン等のマーカー化合物
で標識し、このマーカー化合物に特異的に結合する物質
（ビオチンの場合、ストレプトアビジンやアビジン）を
、酵素や蛍光色素、放射性同位元素等で標識したものを
接合させるという方法も用いられる。

【００１１】本発明に於いては最終的な検出手段は特に
限定せず、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０に共通な配列を
認識する１組の２種類の抗体の一方として、これらのＡ
ＰＰに含まれるＫＰＩ配列を認識する抗体を用いること
が要件であり、かかる組み合わせにより認識固定された
後の検出手段は如何なるものでも構わない。しかしなが
ら、本発明に用いることができる代表的検出法を例示す
ると、第２抗体を酵素、放射性同位元素、蛍光物質或い
は他の結合物質で標識したものを用いる検出方法となる
。

【００１２】酵素を用いる検出方法では、酵素としては
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラ
ディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホ
スファターゼ（ＡＰ）等があり、それぞれの酵素に対応
する比色基質、或いは蛍光基質を加え、比色計、または
蛍光光度計を用いて生成物を定量する。上記酵素に対す
る代表的基質としては、β−Ｇａｌの基質として、ｏ−
ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（比色基質）、
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（
蛍光基質）等、ＨＲＰの基質としてｏ−フェニレンジア
ミン（比色基質）等、ＡＰの基質として、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸（比色基質）等を挙げることができる。放
射性同位元素を用いる検出方法としては、１２５−Ｉ等
で標識された第２抗体を用い、γ−ウェルカウンター等
を用いて放射活性を測定する。また、第２抗体をビオチ
ン標識し、更にアビジンで標識した酵素と反応させ、以
下酵素を用いる検出の場合と同様の反応を行って、検出
することも可能である。また蛍光物質を用いる方法では
、蛍光物質として、フルオレッセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）等を例示することができる。これらは例
示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用されてい
るものであれば、他のものでも使用できる。

【００１３】本発明で用いる抗体を使用して、ＲＩＡを
組むことも可能である。ＲＩＡの１つの方法としてＡＰ
Ｐ７５１やＡＰＰ７７０又はその断片を、放射性同位元
素で標識して標識抗原とし、これと試料中の抗原（非標
識抗原）とが、本発明で用いる抗体を不溶性担体に結合
したものに、競争的に結合させ、標識抗原の結合の度合
いで、試料中の抗原量を測定する方法が挙げられる。即
ち、試料中の抗原量が多ければ、不溶性担体に結合した
標識抗原は少なくなり、遊離の標識抗原が多くなる。試
料中の抗原量が少なければ、その逆となる。また、ＲＩ
Ａの他の方法として、先述した様に、本発明で用いる第
２抗体を放射性同位元素で標識し、試料中の抗原と結合
した標識抗体量を測定する方法も挙げられる。

【００１４】次に本発明による、ＫＰＩ配列を含むアル
ツハイマー病アミロイド前駆体蛋白の測定方法について
具体的に説明する。ＫＰＩ配列を認識する抗体（第１抗
体）を適当な不溶性担体、例えば９６穴ポリスチレン製
マイクロプレートに固定化する（以下これを“固定化抗
体”という）。固定用バッファーとしては、炭酸ナトリ
ウム−炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）、
或いはリン酸緩衝塩類溶液（以下ＰＢＳ（−）と略す）
等が用いられる。固定は、４℃で一晩放置するのが一般
的であるが、例えば、室温で２時間程度静置することも
可能である。このようにして第１抗体を固定したマイク
ロプレートをＰＢＳ（−）等によって洗浄する。次いで
不溶性担体と、測定しようとする試薬又は被検試料との
非特異的結合を避けるために、適当な物質、例えば１〜
３％ウシ血清アルブミンやスキムミルク／ＰＢＳ（−）
溶液で、不溶性担体の表面を被覆する。被覆は、３７℃
や室温で２時間程度、静置又はプレートミキサー等で攪
拌しながら行うのが一般的である。被覆後、再びマイク
ロプレートをＰＢＳ（−）等で洗浄する。このようにし
て得られた、第１抗体が固定化された不溶性担体を被検
試料と一定時間及び一定温度で接触させ反応させる。反
応は４℃で一晩プレートミキサー等で攪拌しながら行う
のが一般的であるが、室温や３７℃で１〜２時間程度行
うことも可能である。この間に固定化抗体（第１抗体）
と被検試料中のＫＰＩ配列を含むＡＰＰ又はその断片が
結合する。次いでＰＢＳ（−）等で洗った後、適当な標
識物質、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等
の酵素や、１２５−Ｉ等の放射性同位元素で標識化した
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０を認識
する抗体（第２抗体）の溶液を、不溶性担体上の固定化
抗体に結合したＡＰＰ又はその断片と一定時間及び一定
温度例えば、４℃で一晩、或いは室温で１〜２時間接触
させ第２抗体と反応させる。これを再び、ＰＢＳ（−）
等で洗い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標
識された標識物質の量を測定する。酵素を用いる検出方
法では、酵素としては、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β
−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、（
ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）等があり
、それぞれの酵素に対応する比色基質、或いは蛍光基質
を加え、比色計、または蛍光光度計を用いて生成物を定
量する。上記酵素に対する代表的基質としては、β−Ｇ
ａｌの基質として、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（比色基質）、４−メチルウンベリフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（蛍光基質）等、ＨＲＰの基質と
して、ｏ−フェニレンジアミン（比色基質）等、ＡＰの
基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（比色基質）等を
挙げることができる。放射性同位元素を用いる検出方法
としては、１２５−Ｉ等で標識された第２抗体を用い、
γ−ウェルカウンター等を用いて放射活性を測定する。 またアビジンのビオチンに対する高親和性を利用して、
第２抗体をビオチン標識し、更にアビジンやストレプト
アビジンで標識した酵素をと反応させ、以下酵素を用い
る検出の場合と同様の反応を行って、検出することも可
能である。

【００１５】一方、被検試料の代わりに種々の濃度の標
準品、例えば組換えＤＮＡ法により産生した、精製アル
ツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又はその断片、或い
は標準となる髄液や血液、尿などを用いて標準検量線を
作製し、これと、被検試料の測定値を対比させ、被検試
料中のアルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白の量を算
出し、定量することができる。第１抗体としてＫＰＩ配
列を認識する抗体、第２抗体としてＡＰＰを認識する抗
体について述べたが、第１抗体と第２抗体の組み合わせ
は逆であっても構わないし、第１抗体、第２抗体がＫＰ
Ｉ配列上の異なる抗原決定基を認識する抗体との組み合
わせであってもよい。

【００１６】本発明に於ける測定試薬は、一方を不溶性
担体に結合した第１抗体と他方の第２抗体とにより構成
される。また、この試薬を能率よく、且つ簡便に利用す
るために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキッ
トを形成することができる。係る補助剤としては、例え
ば、検量線作製用標準品、試薬を溶解させるための溶解
剤、不溶化担体を洗浄するために使用される洗浄剤、抗
体の標識物質として酵素を使用した場合、酵素活性を測
定するための基質、その反応停止剤等の免疫学的測定試
薬のキットとして通常使用されるものが挙げられる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳述するが、本
発明は該実施例によって限定されるものではない。

【００１８】

【実施例１】　　抗原、アッセイ用タンパク及び抗体の
作成 ［工程１］　　抗ＺｔＰＩ（抗ＫＰＩ）ポリクローナル
抗体の作成及び精製 ［工程１−１］　　β−ガラクトシダーゼ・ＫＰＩ融合
蛋白の大腸菌による発現 （ｉ）　融合タンパク発現プラスミドの構築大腸菌β−
ガラクトシダーゼのＮ末端にｓＰＩ（ＡＰＰ７７０の２
８８番目のＡｒｇ残基から３５９番目のＡｒｇ残基まで
を含む。従ってＫＰＩを含む。）を結合した融合タンパ
ク（ＺＰＩ）を発現しうるプラスミドを構築した。具体
的には、発現用ベクターｐＥＸ１（ベーリンガー・マン
ハイム山之内社）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで
切断し、直鎖状ベクターＤＮＡ断片を得た。 一方、欧州特許出願公開番号０３０４０１３号の実施例
４に記載のプラスミドｐＰＩｔｒｐ７５−１をＢａｍＨ
Ｉ及びＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後０
．３ｋｂｐの断片を、フナコシ社製ジーンクリーン・キ
ットを用いて単離した。得られた２つの断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結せしめた。

【００１９】該反応物を、マニアティスらの実験書（Ｔ
．Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ
ｌ、Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））に記載されている方
法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３６株（ベーリン
ガー・マンハイム山之内社）コンピテントセルに加え、
形質転換せしめた。アンピシリン耐性形質転換コロニー
６個を選び、各プラスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ及びＰ
ｓｔＩで切断し解析したところ、すべて目的とするプラ
スミドを有してした。得られたプラスミドをｐＥＸ−Ｚ
ＰＩと命名した。本プラスミドは、ラムダ・ファージ由
来のＰＲプロモーターの制御により、β−ガラクトシダ
ーゼ・ＫＰＩの融合タンパクを発現しうる。

【００２０】（ｉｉ）　融合タンパクの生産本実施例工
程１−１の（ｉ）　で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＰＩを
保持する大腸菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＰＩを、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩
培養せしめた。本培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有Ｌ培地５０ｍｌに添加し、３０℃にて３時
間培養した後、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに３時
間培養した。４２℃において、ラムダ・ファージＰＲプ
ロモーターのリプレッサーは不活化され、ＰＲプロモー
ターが作動することによって、目的とする融合タンパク
が生産される。

【００２１】該培養液を遠心分離し、菌体を集め、菌体
の一部を、レムリーの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．
，Ｎａｔｕｒｅ、２２７．６８０−６８５（１９７０）
〕に従って、ＳＤＳ・サンプルバッファー中で煮沸後、
１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルをク
マシー染色した結果、分子量約１２０Ｋｄの目的とする
融合タンパクが存在することが確認された。以下このβ
ガラクトシダーゼ・ＫＰＩ融合タンパクをＺＰＩと略す
。

【００２２】（ｉｉｉ）ＺＰＩの可溶化本実施例工程１
−１の（ｉｉ）で得た培養菌体の一部を、尿素を終濃度
０Ｍ，２Ｍ，４Ｍ，６Ｍ，８Ｍをそれぞれ含む２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）に懸濁し、オータケ・ソニケ
ーター（大岳製作所）を用いて菌体を超音波破壊し、遠
心分離により不溶物を集めた。得られた不溶物を本実施
例工程１−１の（ｉｉ）と同様に処理して、ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により解析した。

【００２３】クマシー染色の結果、目的物ＺＰＩのバン
ドは、尿素０Ｍ，２Ｍおよび４Ｍ含有バッファーで抽出
した不溶画分では検出されたが、尿素６Ｍおよび８Ｍ含
有バッファー抽出後の不溶画分では認められなかった。 以上の結果から、目的融合タンパクは産生後大腸菌体内
で不溶物としてタンパク封入体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　
　ｂｏｄｙ）を形成し、この不溶物は６Ｍ以上の尿素で
可溶化されることが判明した。

【００２４】（ｉｖ）　ＺＰＩの部分精製本実施例工程
１−１の（ｉｉ）と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３６
／ｐＥＸ−ＺＰＩを培養し、２００ｍｌの培養液から菌
体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を含
む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁
し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（１
００００×ｇ，１０分間）し、沈澱物を回収した。次い
でこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリ
ス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音波処
理により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１００００×
ｇ，１０分間）後上清を回収した。以上の操作により、
４Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素に不
溶な大腸菌タンパクが除去され、ＺＰＩの部分精製液が
得られた。この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タンパク
質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＰＩであった
。

【００２５】（ｖ）プロテアーゼインヒビター領域の抽
出本実施例工程１−１の（ｉｖ）で得たＺＰＩ部分精製
液２０ｍｌを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）２Ｌ
に対して２回透析し、尿素を除去せしめると同時にタン
パクの立体構造を回復せしめた。得られた透析液を３７
℃にて保温した後、ＴＰＣＫ処理済みトリプシン固定化
アガロースビーズ（シグマ社）１００単位を加え、３７
℃で１時間振とうすることにより、ＺＰＩ中のβガラク
トシダーゼ領域を切断すると同時にプロテアーゼインヒ
ビター領域を吸着させた。かかる懸濁液を、５′プライ
ム→３′プライム社のセレクトＳＴＭ空カラムに充填し
、アガロースビーズを回収した。アガロースビーズとバ
ッファーとの分離は、１，０００ｒｐｍ、１分間の遠心
操作により行った（以下の記述中のアガロースビーズの
回収も同様にして行った）。回収したビーズを、０．３
Ｍ　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　、１０ｍＭ
　　ＨＣｌ（ｐＨ２）からなる溶出液６ｍｌで溶出した
。溶出は計３回行い、各溶出液を５ＮＮａＯＨを用いて
中和した後、トリプシン阻害活性を測定した。阻害活性
の測定は、欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例４
に記載のｓＰＩのトリプシン阻害活性測定と同様の方法
によった。

【００２６】各溶出液に含まれるトリプシン・インヒビ
ター活性濃度は、溶出分画の順に、ＢＰＴＩに換算して
１６．４μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、０．２７μｇ
／ｍｌであった。これらの溶出分画を、ＺｔＰＩ画分と
する。 （ｖｉ）　プロテアーゼ・インヒビターの解析本実施例
工程１−１の（ｖ）　で得た溶出液に、あらかじめ−２
０℃に冷却したアセトンを４倍容量加え、−２０℃にて
１時間冷却した。さらに、冷却遠心分離（１０，０００
×ｇ１５分間）し、沈澱を回収し、得られた沈澱を１ｍ
ｌの２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）に再溶解した。 本実施例工程１−１の（ｖ）　と同様にしてトリプシン
阻害活性量を測定した。その結果、欧州特許公開番号０
３０４０１３号実施例４に記載のｓＰＩに換算して６２
μｇ相当のトリプシン・インヒビターが含まれているこ
とが判明した。

【００２７】得られたインヒビター溶液の一部を、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により解析した
ところ、分子量約６Ｋｄのメジャーな蛋白質が検出され
た。 ［工程１−２］　　抗ＺｔＰＩ抗血清の作成本実施例工
程１−１の（ｉｖ）で得られたＺＰＩ３００μｇを、前
述したレムリーの方法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で用いるサンプルバッファー（２％ＳＤ
Ｓ、５％β−ＭＥを含む、ただし色素は加えなかった）
中で、１００℃で５分間処理したのち、４倍容のアセト
ンを加え、−２０℃で１時間冷却を行い、９０００回転
２０分間の遠心操作を行い、沈澱を回収した。その沈澱
をＰＢＳ（−）に懸濁し、これとフロイント完全アジュ
バント（ＦＣＡ）とをよく混合してウサギに皮下注射し
た。３１日後にＦＣＡのかわりにフロイント不完全アジ
ュバントを用いた以外は同じ処理（免疫）を行った。さ
らに１４日後、３００μｇの本実施例工程１−１の（ｖ
）　で得られたＺｔＰＩを同様の処理を行い免疫した。 さらに１６日後、ＺｔＰＩを用いて同じ処理を行った。 さらに１５日後、欧州特許公開番号０３０４０１３号実
施例４に記載のｓＰＩ１５０μｇを同じ処理をして免疫
した。このウサギから５０ｍｌ採血し、抗血清を得た。 以後この抗血清を抗ＺｔＰＩ抗血清と呼ぶ。血清中の抗
体価は、非変性及びＳＤＳ変性のｓＰＩ（２５ｎｇ／ウ
ェル）を抗原とする固相ＥＬＩＳＡによって行った。最
終的に得られた抗血清の力価は、対照（抗原なしのウェ
ル）の３倍以上の発色を示す抗血清の希釈度で示すと、
非変性ｓＰＩに対して６４０００倍、ＳＤＳ変性ｓＰＩ
に対して１２８０００倍であった。また尿中トリプシン
インヒビター（日本ケミカルリサーチ社）とは全く反応
しなかった。即ち、本抗ＺｔＰＩ抗血清はＫＰＩ配列に
対する高い特異性と抗体価を有することがわかった。 ［工程１−３］　　抗ＺｔＰＩ　　ＩｇＧの精製本実施
例工程１−２で得た抗ＺｔＰＩ血清２０ｍｌを５６℃に
て３０分インキュベートして非働化させた後、等量のＰ
ＢＳ（−）を加えて希釈し、４℃で１００％飽和硫安溶
液（予め０．１Ｎアンモニア溶液にてｐＨ６．５に調整
したもの）を最終濃度３３％飽和になる様攪拌しながら
徐々に加えた。加え終わってから更に１２時間攪拌を続
けた後、３０００×ｇで３０分間冷却遠心した。 得られた沈澱を５０％飽和硫安溶液に懸濁し、再び冷却
遠心して沈澱を得た。沈澱を１０ｍｌの１０ｍＭリン酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、透析チ
ューブにつめて５Ｌの同バッファーに対して３回透析を
行った。得られた透析試料を予め１０ｍＭリン酸ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化させたＤＥＡＥ
−セルロースカラム（ＤＥ５２、ワットマン社）にアプ
ライし、同バッファーで溶出させた。素通り画分を集め
、セントリプレップＴＭ３０（アミコン社）で濃縮し、
１５．７ｍｇの部分精製抗ＺｔＰＩ抗体を得た。部分精
製抗体をアフィプレップＴＭプロテインＡカートリッジ
（バイオラッド社）を用い、バイオラッド社発行添付プ
ロトコールに従って、更に精製を行い、精製抗ＺｔＰＩ
　　ＩｇＧ１２．７ｍｇを得た。 ［工程２］　　ＡＰＰの調製 （ｉ）　ＡＰＰ５９２の調製 ＡＰＰ６９５のＣ末端側１０３アミノ酸を欠失させた蛋
白である５９２アミノ酸（シグナルペプチドを含む）か
ら成るＡＰＰ５９２（図２）は、欧州特許公開番号０３
０４０１３号実施例１に記載の方法で得たヒト老人斑ア
ミロイド前駆体ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡから出発して、上
述欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例５に記載の
方法でサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞で産生させ培養上
清中へ分泌させ、精製した。以下詳述する。

【００２８】欧州特許公開番号０３０４０１３号実施例
５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ５９２をＣＯＳ−
１細胞に導入した。即ち、ｐＳＶＭＴ５９２　　２０μ
ｇを、１×１０６　個のＣＯＳ−１細胞に対し、ショ糖
含有ＰＢＳ（２７２ｍＭショ糖、７ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．４）１ｍＭＭｇＣｌ２）中で、バイオラッ
ド社のジーンパルサーＴＭを用い、電圧４００Ｖ、キャ
パシター３μＦ，１．０〜１．３ｍ秒で、３０秒の間隔
をおいて２回電気パルスを与えることにより導入を行っ
た。導入後の細胞を、１０％ウシ胎児血清（以下ＦＣＳ
と略す）を含むダルベッコの変法最小基本培地中で３７
℃、５％ＣＯ２　の条件下で２４時間培養後、ダルベッ
コのリン酸緩衝塩類溶液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含）（
以下ＰＢＳ（−）と略す）で洗浄し、ＦＣＳを除いた後
、ＦＣＳを含まない培地に交換し、以後４８時間毎に培
地を交換し、計３回培養上清を回収した。更に導入を３
０回行い、計９００ｍｌの培養上清を得た。

【００２９】ついで、プラスミド導入ＣＯＳ細胞の培養
上清に対し終濃度２ｍＭになるよう（ｐ−アミジノフェ
ニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（和光純薬工
業株式会社）を添加し、ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＴＭ３０
（アミコン社）を用いて濃縮を行いさらに同装置中で２
０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）にバッファー交換
を行った。次に、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム
（ファルマシア社）を用い、上記試料をアプライし、２
０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸（ｐＨ８．０）、ＮａＣｌ勾配０
−１Ｍの条件でカラムクロマトグラフィーを行った。ク
ロマトグラフィーの各画分について、後述する参考例２
において大腸菌で発現させたＡＰＰ１９−３７９　（Ｚ
ＫＸ）に対して作成したウサギ抗ＡＰＰ１９−３７９　
（ＺＫＸ）抗血清を用いた固相ＥＬＩＳＡを行い、ＡＰ
Ｐ溶出位置を同定した。（ＺＫＸは、ＡＰＰ７７０中の
Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基から３７９番目のア
ミノ酸残基までを含むポリペプチドとβ−ガラクトシダ
ーゼとの融合タンパクであり、大腸菌中に発現させ、６
Ｍ尿素による可溶化を行い精製した。（精製法は参考例
２で詳述した。）ＺＫＸは、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５
１、ＡＰＰ６９５に共通な配列のほかに、プロテアーゼ
インヒビター部分及びＡＰＰＰ７７０に特異的な配列を
含むが、ＡＰＰの膜貫通領域からＣ末端までの配列は含
まない）。 ＡＰＰ５９２は、０．３−０．４ＭＮａＣｌで溶出され
た。ＥＬＩＳＡ陽性画分をセントリコンＴＭ３０（アミ
コン社）を用いて濃縮し、さらに同装置中で５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）にバッファー交換した。

【００３０】次にヘパリンカラムを用いたアフィニティ
ークロマトグラフィーを行った。即ち、ＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラム（ファルマシア社）による部分精
製画分をヘパリン−５ＰＷカラム（東ソー株式会社）に
アプライし、ＮａＣｌ勾配０−２Ｍの条件でクロマトグ
ラフィーを行った。クロマトグラフィーの各画分につい
て同様にウサギ抗ＡＰＰ１９−３７９　（ＺＫＸ）抗血
清を用いた固相ＥＬＩＳＡを行い、ＡＰＰ５９２溶出位
置を同定した。ＡＰＰ５９２は１．０−１．２ＭＮａＣ
ｌで溶出した。ＥＬＩＳＡ陽性画分をセントリコンＴＭ
３０（アミコン社）を用いて濃縮後、２０ｍＭＴｒｉｓ
−塩酸（ｐＨ８．０）にバッファー交換した。これらを
７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
染色を行い、純度及び分子量の確認を行った。ｐＳＶＭ
Ｔ５９２を導入したＣＯＳ−１細胞培養上清から、上記
操作を行うことにより得られたタンパクは、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上でややブロードな単一バンドであり、見かけの
分子量は９４．５ｋＤａと決定された。更に、この蛋白
のＮ末端のアミノ酸配列を、アプライド社気相シーケン
サーで解析したところ、ＡＰＰ６９５のうちシグナルペ
プチド（Ｎ末端から１７アミノ酸）が除去された、ＡＰ
Ｐ６９５のＮ末端から１８番目のＬｅｕから３３番目の
Ｇｌｎまでのアミノ酸配列（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７
０にも共通）が確認された。こうして、精製ＡＰＰ５９
２が得られた。

【００３１】（ｉｉ）　ＡＰＰ６４８及びＡＰＰ６６７
の調製 ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０各々のＣ末端側１０３アミ
ノ酸を欠失させた蛋白である、６４８アミノ酸（シグナ
ルペプチドを含む）から成るＡＰＰ６４８（図２）、及
び、６６７アミノ酸（シグナルペプチドを含む）から成
るＡＰＰ６６７（図２）は、欧州特許公開番号０３０４
０１３号実施例５工程２記載のプラスミドｐＳＶＭＴ６
６７、及びｐＳＶＭＴ６４８を、本実施例工程２（ｉ）
　と同様にして、ＣＯＳ−１細胞への導入、培養上清の
回収、精製を行った。精製に際しては、クロマトグラフ
ィーの各フラクションの確認に、ウサギ抗ＡＰＰ１９−
３７９　抗血清の他に、ＡＰＰ６６７については、特開
平２−１３８９９５号公報の実施例９で得たモノクロー
ナル抗体ＡＤＪ５−３−７（微工研菌寄第１０３８８号
）も用いた。さらに、ＡＰＰ６６７及びＡＰＰ６４８に
ついては、そのトリプシン阻害活性も確認手段の一つと
し、その両者とも強い阻害活性を示すことを確認した（
阻害活性測定は、欧州特許公開番号０３０４０１３号実
施例に記載のｓＰＩのトリプシン阻害活性測定の方法に
準じて行った）。精製したＡＰＰ６４８、ＡＰＰ６６７
の分子量は、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、それぞ
れ１００．５ｋＤａ、１０５．５ｋＤａであった。 ［工程３］　　抗ＡＰＰ抗体の作製 ［工程３−１］　　抗ＡＰＰモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ３Ｂ２及び６Ａ３の作製 （ｉ）マウスの感作 ハイブリドーマ作成のための抗原は、以下のようにして
調製した。本実施例工程２（ｉ）　で得た精製ＡＰＰ５
９２をＰＢＳ（−）に溶かし、ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳ
−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ
．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ２２７　　６８０−６８５（１９７
０））中で１００℃、３分間煮沸後、４倍容のアセトン
を加え、−２０℃で１時間冷却を行い、９０００回転２
０分間の遠心操作を行った。こうして過剰量のＳＤＳを
除去し、沈査よりＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を回収し、こ
れをハイブリドーマ作成のための抗原として用いた。免
疫は２０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を５００μｌの
ＰＢＳ（−）に溶かしたものをそれぞれ３匹の６週齢の
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスの皮下にフロイントの完全アジュ
バントと共に注射し、以後２週間の間隔で合計３回の免
疫を行った。さらに、１週間の間隔で２回皮下注射を行
った。

【００３２】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエン
ティフィク富山朔二著）に従って、固相ＥＬＩＳＡ法に
より確認した。 （ｉｉ）　細胞融合 単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフ
ィク富山朔二著）に従って細胞融合を行った。即ち、血
清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰＢＳ
（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２を
尾静脈より注射し、ブーストとした。その３日後に、脾
細胞を無菌的に取り出し、ステンレスメッシュで単細胞
にほぐし、脾細胞の１／５量の８−アザグアニン耐性骨
髄細胞腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細胞（株式会社
　　免疫生物研究所より入手）と、ＭｅｄｉａＩ培地（
株式会社　　免疫生物研究所）を混合し、遠沈後、細胞
のペレットに５０％ＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製
）を加え、融合操作を行った。

【００３３】その後、融合細胞を遠心して上清を吸引除
去した後、３０％ＦＣＳ入りＨＡＴ培地を加え、９６穴
マイクロプレート１１枚にまいた。融合後、約２週間で
約９５０ウェルからコロニーが生育し、これらの培養上
清についてＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２をスクリーニング用
抗原とした固相ＥＬＩＳＡを行い、抗原と強く反応する
クローンを得、限界希釈法によるクローニングを３回繰
り返した。３回のクローニングにより安定した抗体産生
を示す２つのクローンを３Ｂ２及び６Ａ３と各々命名し
、これを平成３年１月１０日付けで微生物工業技術研究
所に寄託した。（３Ｂ２の受託番号は、微工研菌寄第１
１９４３号、および、６Ａ３のそれは微工研菌寄第１１
９４４号）。これらのハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体３Ｂ２及び６Ａ３の反応性を本実施例工程
２（ｉ）　及び（ｉｉ）で作成した、ＡＰＰ６６７、Ａ
ＰＰ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検討したところ、後
述するように、ＳＤＳ変性、非変性何れの条件でもこれ
ら３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した。即ち、これらの
モノクローナル抗体は、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、
ＡＰＰ６９５の何れをも認識できることがわかった。 ［工程３−２］　　抗ＡＰＰモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ１Ｂ２の作製 （ｉ）　マウスの感作 後述するように参考例２で得たＺＫＸを、上述の本実施
例工程３−１（ｉ）　記載と同様の方法で変性させた。 このＳＤＳ変性ＺＫＸ２０μｇを５００μｌのＰＢＳ（
−）に溶かしたものをそれぞれ４匹の６週齢のＢａｌｂ
／ｃ雌マウスの皮下にフロイントの完全アジュバントと
共に注射し、２週間後に同様の免疫を行った。さらに、
２週間の間隔で、ＳＤＳ変性ＺＫＸの免疫を、フロイン
トの不完全アジュバントを用いて６回行った。その２週
間ののちＳＤＳ変性ＺＫＸ２０μｇを静注した。約１カ
月後、今度は２０μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２をフロ
イントの完全アジュバントと共に皮下に注射し、さらに
１週間後同様にしてＡＰＰ５９２による免疫を行った。

【００３４】免疫の過程で抗原に対する血清の抗体価の
上昇を本実施例工程３−１と同様にして、固相ＥＬＩＳ
Ａ法により確認した。 （ｉｉ）　細胞融合 血清の抗体価の最も高かったマウスに２００μｌのＰＢ
Ｓ（−）に溶かした２５μｇのＳＤＳ変性ＡＰＰ５９２
を尾静脈より注射し、ブーストとした。これ以降の操作
は、本実施例工程３−１（ｉｉ）と同様に行い、ＡＰＰ
５９２と強く反応するクローンを得、限界希釈法による
クローニングを３回繰り返した。３回のクローニングに
より安定した抗体産生を示すクローンを１Ｂ２と命名し
、これを平成３年１月１０日付けで微生物工業技術研究
所に寄託した（微工研菌寄第１１９４２号）。このハイ
ブリドーマが産生するモノクローナル抗体１Ｂ２の反応
性を本実施例工程２（ｉ）　及び（ｉｉ）で作成した、
ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、ＡＰＰ５９２に対して検
討したところ、後述するように、ＳＤＳ変性、非変性何
れの条件でもこれら３種のＡＰＰ誘導体と強く反応した
。即ち、モノクローナル抗体１Ｂ２は、ＡＰＰ７７０、
ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５の何れをも認識できること
がわかった。 ［工程４］　　モノクローナル抗体の特徴づけ（ｉ）免
疫グロブリンのクラス及びサブクラスの決定モノクロー
ナル抗体１Ｂ２，３Ｂ２，６Ａ３の免疫グロブリンのク
ラス及びサブクラスをアイソタイピングキット（アマー
シャム社）を使用して決定した。その結果、１Ｂ２につ
いてはＩｇＧ２ｂ、Ｌ鎖はｋ、３Ｂ２についてはＩｇＧ
２ｂ、Ｌ鎖はｋ、６Ａ３についてはＩｇＧ２ａ、Ｌ鎖は
ｋと決定された。 （ｉｉ）特異性の決定 上記モノクローナル抗体の特異性を以下に示す試験によ
り決定した。

【００３５】各種ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８
、ＡＰＰ５９２）を用い、非変性及びＳＤＳ−変性処理
を行い、通常の固相ＥＬＩＳＡ法を用いて判定を行った
。一次抗体として上記モノクローナル抗体を２μｇ／ｍ
ｌのＩｇＧ濃度で加え、二次抗体はβ−ガラクトシダー
ゼ標識ヒツジＦ（ａｂ′）２　抗マウスＩｇ（アマーシ
ャム社）を用い、基質は４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを用い、３０分間酵素反応
を行った後、蛍光リーダーＦＣＡ（ＰＡＮＤＥＸ社）を
用いて蛍光強度を測定した。その結果を表１に示す。

【００３６】本発明によるモノクローナル抗体、１Ｂ２
、３Ｂ２、６Ａ３は、いずれも、３種のＡＰＰ（ＡＰＰ
６６７、ＡＰＰ６４８及びＡＰＰ５９２）のすべてを、
強く認識した。ネガティブコントロールとしてウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）との反応性も検討したが、これら
３つのモノクローナル抗体はＢＳＡとは全く反応しなか
った。 ［工程５］　　腹水化モノクローナル抗体からのＩｇＧ
の精製 大量のモノクローナル抗体を得るため工程３で得た１Ｂ
２、３Ｂ２、６Ａ３の各ハイブリドーマ１×１０７　個
を、ＭｅｄｉａＩ培地（株式会社　　免疫生物研究所）
０．５ｍｌに浮遊させ、予め１週間前に腹腔内に０．５
ｍｌのプリスタン（アルドリッチ社）投与しておいたＢ
ａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。約２週間で腹部の
肥大が認められ、腹腔切開により腹水を採取した。各ハ
イブリドーマにつき７匹のマウスを処理し、各々約１０
ｍｌずつの腹水を得た。得られた各ハイブリドーマ由来
腹水５ｍｌずつを、アフィプレップＴＭプロテインＡカ
ートリッジ（バイオラッド社）を用いて精製を行った。 精製はバイオラッド社発行の添付プロトコールに従った
。 １Ｂ２クローンから７．９ｍｇ、３Ｂ２クローンから４
．３ｍｇ、６Ａ３クローンから３．３ｍｇの精製ＩｇＧ
が得られた。 〔工程６〕抗体のビオチン化 本実施例工程１−３及び工程５で得た抗ＺｔＰＩ抗体及
び１Ｂ２、３Ｂ２及び６Ａ３精製モノクローナル抗体各
２ｍｇを用い、免疫実験操作法（第９巻、３５３９−３
５４９　　１９８２　　日本免疫学会編）に従って抗体
のビオチン化を行った。予め０．１ＭＮａＨＣＯ３　溶
液に対して透析、バッファー交換を行い、濃度を１ｍｇ
／ｍｌに調整しておいた精製１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３、
及び抗ＺｔＰＩ抗体に、１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した
ＮＨＳ−ビオチン（Ｎ−ヒドロキシサクシニミド−ビオ
チン、ピアス社）のジメチルスルホキシド溶液２８０μ
ｌを加え、室温で４時間静かに攪拌した。次に、４°Ｃ
で３ＬのＰＢＳ（−）に対して４回の透析を行い、ビオ
チン標識１Ｂ２、３Ｂ２、６Ａ３及び抗ＺｔＰＩ抗体を
得た。

【００３７】

【実施例２】　　抗ＺｔＰＩ抗体と抗ＺｔＰＩ抗体の組
み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ実施例１
工程１−３で得た精製抗ＺｔＰＩ抗体を５μｇ／ｍｌの
濃度で０．１Ｍ炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウムバ
ッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、９６穴マイクロプレ
ートに１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で２時間
静置した。プレートをＰＢＳ（−）で３回洗浄の後、１
％ウシ血清アルブミン（シグマ社）を含むＰＢＳ（−）
を加え、３７°Ｃで２時間被覆した。次に０．１％ウシ
血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）中で希釈した精製Ａ
ＰＰ６６７標準液（２〜２０００ｎｇ／ｍｌ）を加え、
攪拌しながら室温で１時間処理を行った。次に、０．０
５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（−）でプレート
を３回洗浄した後、実施例１の工程６で得たビオチン標
識した精製抗ＺｔＰＩ　　ＩｇＧを１μｇ／ｍｌの濃度
で５０μｌずつ各ウェルに加え、攪拌しながら室温で１
時間反応を行った。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含
むＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、β−ガラクトシダー
ゼ標識アビジンＤ（ベクター社）を加え、更に攪拌しな
がら室温で１時間反応させた。０．０５％のＴｗｅｅｎ
−２０を含むＰＢＳ（−）で５回洗浄の後、２ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２　を含むＰＢＳ（−）中に溶かした４−メチ
ルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（１
ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分反応させた後、ＦＣ
Ａ（ＰＡＮＤＥＸ社）で蛍光強度を測定した。結果は図
３に示す様に検出限界が約１ｎｇ／ウェルであった。

【００３８】

【実施例３】　　抗ＺｔＰＩ抗体と１Ｂ２モノクローナ
ル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ実施例２と同様の方法を用いて抗ＺｔＰＩ抗体と１Ｂ
２モノクローナル抗体との組み合わせによる２抗体サン
ドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図４に示す
様に検出限界が約３ｎｇ／ウェルであった。

【００３９】

【実施例４】　　抗ＺｔＰＩ抗体と３Ｂ２モノクローナ
ル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ実施例２と同様の方法を用いて抗ＺｔＰＩ抗体と３Ｂ
２モノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体サンド
イッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図５に示す様
に検出限界が約５ｎｇ／ウェルであった。

【００４０】

【実施例５】　　抗ＺｔＰＩ抗体と６Ａ３モノクローナ
ル抗体の組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳ
Ａ実施例２と同様の方法を用いて抗ＺｔＰＩ抗体と抗６
Ａ３モノクローナル抗体の組み合わせによる２抗体サン
ドイッチＥＬＩＳＡの検討を行った。結果は図６に示す
様に検出限界が約２ｎｇ／ウェルであった。

【００４１】

【参考例１】　　抗ＺｔＰＩ抗体を用いたＲＩＡ（ラジ
オイムノアッセイ）法によるＡＰＰ６６７の検出（ｉ）
　　バッファー １５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．１％ゼラチン（バイオラ
ッド社）及び０．０２％ＮａＮ３　を含む５０ｍＭリン
酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、バッ
ファーＡとした。

【００４２】（ｉｉ）　　１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７の調
製実施例１工程２（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７をボ
ルトン−ハンター法（Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｊ．１３３、５２９−５３９、１９７３）によって１
２５　Ｉ標識し、　１２５Ｉ−ＡＰＰ６６７を得た。 （ｉｉｉ）　　ＡＰＰ６６７標準液の調製実施例１工程
２（ｉｉ）で得た精製ＡＰＰ６６７を２０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、バッファーＡで
希釈し、種々の濃度のＡＰＰ６６７標準液を作成した。

【００４３】（ｉｖ）　　　ＡＰＰ６６７のＲＩＡＡＰ
Ｐ６６７標準液１００μｌを、バッファーＡで１μｇ／
ｍｌの濃度に調製した精製抗ＺｔＰＩ抗体（実施例１工
程１−１（ｖｉｉｉ））溶液２００μｌ、　１２５Ｉ−
標識ＡＰＰ６６７のバッファーＡ溶液１００μｌ（１０
０００ｃｐｍ）、及びバッファーＡ２００μｌを加えて
混和後、４°Ｃ、１８時間インキュベートした。デキス
トラン−炭素液（デキストランＴ−７０（フナコシ薬品
株式会社）、０．００２５％溶液と活性炭Ｎｏｒｉｔ　
　Ａ（シグマ社）０．２５％液で等量混合した液）２０
０μｌを添加して、４°Ｃで１８時間静置後、２．５０
０×ｇで２０分間遠心分離し、上清の放射能をガンマウ
ェルカウンターにて測定した。測定限界は約１０ｎｇ／
アッセイであった。

【００４４】

【実施例６】　　ＡＰＰ検出用キットの作製第１抗体と
して抗ＺｔＰＩ抗体、第２抗体としてビオチン標識−抗
ＺｔＰＩ抗体、標準ＡＰＰとして精製ＡＰＰ６６７、標
識検出試薬としてβ−ガラクトシダーゼ標識−ストレプ
トアビジン、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、基質溶解剤としてジメチルスルホキ
シド、バッファーとしてＰＢＳ（−）、洗浄剤としてＴ
ｗｅｅｎ−２０、酸素反応用バッファーとして１ｍＭＭ
ｇＣｌ２　含有ＰＢＳ（−）、被覆剤としてウシ血清ア
ルブミンを用い、ＡＰＰ検出キットを作製した（表２）
。このキットを用いてＫＰＩ配列を含むＡＰＰの検出を
行った。

【００４５】粉末ＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社）９
．６ｇを精製水に溶解し、１ｌのＰＢＳ（−）溶液とし
た。洗浄剤としてＴｗｅｅｎ−２０を用いて０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（−）溶液を調製し
た。被覆剤としてウシ血清アルブミン１ｇを１００ｍｌ
のＰＢＳ（−）に溶解し、１％ウシ血清アルブミン溶液
とした。

【００４６】第１抗体は抗ＺｔＰＩ抗体１ｍｇを１ｍｌ
のＰＢＳ（−）に溶解したものを２００倍濃縮液として
調製した。第２抗体はビオチン標識−抗ＺｔＰＩ抗体１
ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ（−）に溶解したものを１０００
倍濃縮液として調製した。β−ガラクトシダーゼ標識−
ストレプトアビジン１ｍｇを１ｍｌのＰＢＳ（−）に溶
解したものを１０００倍濃縮液として調製した。

【００４７】β−ガラクトシダーゼの基質として４−メ
チルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド１
０ｍｇを１００μｌのジメチルスルホキシドに溶解した
ものを５００倍濃縮液として用時調製した。標準ＡＰＰ
（精製ＡＰＰ６６７１０μｇ及び１０ｍｇのウシ血清ア
ルブミンを含むＰＢＳ（−）溶液１ｍｌの凍結乾燥品）
は１ｍｌの精製水に溶解した。

【００４８】各調製した試薬で、実施例２に準じてＫＰ
Ｉ配列を含むＡＰＰの検出を実施し、同様の結果を得た
。

【００４９】

【実施例７】　　本キットを用いたヒト髄液中のＫＰＩ
配列を含むＡＰＰの定量 ２名のアルツハイマー病患者から得られた髄液を検体と
して、本発明実施例６記載のキットを用いて、髄液中の
全ＡＰＰを定量した。方法は実施例２に準じた。結果は
、５４９ｎｇ／ｍｌ及び４０３ｎｇ／ｍｌであった。

【００５０】

【参考例２】　　免疫用抗原ＺＫＸタンパク及び抗ＺＫ
Ｘ抗体の作成 ［工程１］　　免疫用抗原ＺＫＸの調製まず、βーガラ
クトシダーゼの一部分と、ＡＰＰ７７０のＮ末端から数
えて１９番目残基から３７９番目残基までの断片との融
合蛋白であるＺＫＸの産生について述べる。

【００５１】［工程１−１］発現プラスミド　　ｐＥＸ
−ＺＫＸの構築 発現用ベクターｐＥＸ２（ベーリンガー・マンハイム山
之内社）を　制限酵素Ｂｓｕ３６Ｉ（ＭｓｔＩＩ）及び
ＳａｌＩで切断し、直鎖状ベクターＤＮＡ断片を得た。 一方、欧州特許出願８８１１３２８３．１号（公開番号
０３０４０１３号、対応の日本出願は特願昭６３−２０
１９９８号）の実施例１に記載のプラスミドｐＧＢＰ２
（ＡＴＣＣ−６７５０２）をＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動によりＡＰＰ７７０のＮ
末端側約３６０残基をコードするＤＮＡ断片を、フナコ
シ社製ジーン・クリーン・キットを用いて単離した。さ
らに配列表記載の６つの合成リンカー、１、２，３，４
、５、６（これらのリンカーをアニールさせると図７に
示したようにＭｓｔＩＩ切断末端とＫｐｎＩ切断末端を
有し、ｐＥＸ２のＭｓｔＩＩサイトに結合してもフレー
ムはずれずに連続するアミノ酸をコードする）をアプラ
イドバイオシステムズ社ＤＮＡ合成機３８０Ａを用いて
合成し、さきに得られた２つのＤＮＡ断片とともにＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結せしめた。図７にこの概要
を示す。

【００５２】該反応物を、マニアティスらの実験書に記
載されている方法に従って調製した大腸菌ＰＯＰ２１３
６株（ベーリンガー・マンハイム山之内社）コンピテン
トセルに加え、形質転換せしめた。アンピシリン耐性形
質転換コロニー６個を選び、各プラスミドを抽出し、Ｂ
ａｍＨＩで切断し解析したところ、すべて目的とするプ
ラスミドを有していた。得られたプラスミドをｐＥＸ−
ＺＫＸと命名した。本プラスミドは、ラムダ・ファージ
由来のＰＲ　プロモーターの制御により、βガラクトシ
ダーゼのＮ末端約１５０アミノ酸とＡＰＰ７７０のＮ末
端から数えて１９番目残基から３７９番目残基までの配
列を含む融合タンパクＺＫＸを発現しうる。ＺＫＸは、
ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ６９５に共通な配
列の一部のほかに、プロテアーゼインヒビター部分及び
ＡＰＰＰ７７０特異的な配列を含むが、ＡＰＰの膜貫通
領域からＣ末端までの配列は含まない。

【００５３】［工程１−２］　　融合タンパクの生産参
考例２工程１−１で得たプラスミドｐＥＸ−ＺＫＸを保
持する大腸菌ＰＯＰ２１３６／ｐＥＸ−ＺＫＸを、５０
μｇ／ｍｌのアンピシリン含有Ｌ培地で、３０℃一晩培
養せしめた。本培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン含有Ｌ培地５０ｍｌに添加し、３０℃にて３時間
培養した後、４２℃の恒温培養槽に移し、さらに３時間
培養した。４２℃において、ラムダ・ファージＰＲ　プ
ロモーターのリプレッサーは不活化され、ＰＲ　プロモ
ーターが作動することによって、目的とする融合タンパ
クが生産される。

【００５４】該培養液を遠心分離し菌体を集め、菌体の
一部を、レムリーの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ　　Ｕ．Ｋ．
、Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　　６８０−６８５　　（１
９７０）］に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッフ
ァー中で煮沸後、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。 泳動後、ゲルをクマシー染色した結果、分子量約５８ｋ
Ｄａの目的とする融合タンパクが存在することが確認さ
れた。以下、この部分βガラクトシダーゼ・部分ＡＰＰ
７７０融合タンパクをＺＫＸと略す。 ［工程１−３］ＺＫＸの部分精製 参考例２工程１−２と同様にして、大腸菌ＰＯＰ２１３
６／ｐＥＸ−ＺＫＸを培養し、２００ｍｌの培養液から
菌体を回収した。該培養菌体を、４０ｍｌの４Ｍ尿素を
含む２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに懸
濁し、菌体を超音波破壊した。菌体破壊物を遠心分離（
１００００×ｇ、１０分間）し、沈澱物を回収した。 次いでこの沈澱物を２０ｍｌの８Ｍ尿素を含む２０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）バッファーに再懸濁し、超音
波処理により沈澱を分散せしめた。遠心分離（１０００
０×ｇ、１０分間）後上清を回収した。以上の操作によ
り、４Ｍ尿素で可溶な大腸菌タンパク、および８Ｍ尿素
に不溶な大腸菌タンパクが除去され、ＺＫＸの部分精製
液が得られた。この部分精製液の一部をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で解析したところ、全タン
パク質のうち５０％以上が目的融合タンパクＺＫＸであ
った。ＺＫＸのトリプシン阻害活性を、欧州特許公開番
号０３０４０１３号実施例に記載のｓＰＩのトリプシン
阻害活性測定方法に準じて測定したところ強い阻害活性
を示した。また、本発明実施例１工程６記載の抗ＺｔＰ
Ｉ抗血清を用いたウエスタンブロットでも、このＺＫＸ
は強く反応した。

【００５５】［工程１−４］抗ＺＫＸ抗血清の作成参考
例２工程１−３で得られたＺＫＸを兎に免疫して抗血清
を得た。即ち、実施例１工程３記載のＳＤＳ変性ＡＰＰ
５９２作成と同様の方法でＳＤＳ変性ＺＫＸを作成し、
２００μｇのＳＤＳ変性ＺＫＸを１ｍｌのＰＢＳ（−）
に溶かしたものを、それぞれ２匹の家兎の背中の皮下に
フロイントの完全アジュバントと共に注射し、以後２週
間の間隔でフロイントの不完全アジュバントと共に合計
６回の免疫を行った。血清中の抗体価は、非変性及びＳ
ＤＳ変性のＺＫＸ（２５ｎｇ／ウェル）を抗原とする固
相ＥＬＩＳＡによって行った。最終的に得られた抗血清
の力価は、対照（抗原無しのウェル）の２倍以上の発色
を示す抗血清の希釈度で示すと、非変性ＺＫＸに対して
１６０００倍、ＳＤＳ変性ＺＫＸに対して３２０００倍
であり、実施例１工程２記載のＡＰＰ６６７、ＡＰＰ５
９２、さらに本実施例１工程（ｖｉ）記載のＺｔＰＩに
対しても強く反応した。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００５８】

【発明の効果】本発明の測定方法、試薬及びキットを用
いることにより、ＫＰＩ配列を含むアルツハイマー病ア
ミロイド前駆体蛋白及びその断片が簡便に且つ、高感度
に検出、定量することが可能となり、アルツハイマー病
の診断方法、試薬及び診断キットとして有用である。ま
た、アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白を用いる研
究の場に於ける研究試薬としても有用である。

【００５９】

【配列表】

【００６０】 配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー１ 配列 ＴＧＡＧＧＣＣＧＡＴ　ＡＣＴＧＣＴＧＴＣＧ　ＴＣＣ
ＣＣＴＣＡＡＡ　ＣＴＧＧＣＡＧＡＴ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９

【００６１
】 配列番号：２ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー２ 配列 ＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣ　ＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡ　ＴＧＴ
ＡＣＡＣＣＡＡ　ＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６２
】 配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー３ 配列 ＣＡＴＴＡＣＧＧＴＣ　ＡＡＴＣＣＧＣＣＧＴ　ＴＴＧ
ＴＴＣＣＣＡＣ　ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧ　ＡＧＣＴＣＧ
ＧＴＡＣ　　　　　　　　　　　　　　５０

【００６３
】 配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー４ 配列 ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧ　ＧＡＴＣＣＣＧＴＧＧ　ＧＡＡ
ＣＡＡＡＣＧＧ　ＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣ　ＧＴ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６４
】 配列番号：５ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー５ 配列 ＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧ　ＧＴＴＡＣＧＴＴＧＧ　ＴＧＴ
ＡＣＡＴＧＧＧ　ＣＧＣＡＴＣＧＴＡＡ　ＣＣ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２

【００６５
】 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：リンカー６ 配列 ＧＴＧＣＡＴＣＴＧＣ　ＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧ　ＧＧＡ
ＣＧＡＣＧＡＣ　ＡＧＴＡＴＣＧＧＣＣ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０

【図面の簡単な説明】

【図１】アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋白ＡＰＰ
６９５、ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７１４、
ＡＰＰ５６３の模式図である。ｂからｆの黒く塗りつぶ
した部分はプロテアーゼインヒビター活性を有する５６
アミノ酸から成る領域、点々部分はＡＰＰ７７０に固有
の１９アミノ酸から成る領域、斜線部は脳に沈着する老
人斑アミロイド部分を示す。ａはＡＰＰのうち脳に沈着
するアミロイドβ蛋白部分（影をつけた部分）と膜貫通
領域を示す。ＡＰＰ５６３はβ蛋白部分をもたない。

【図２】分泌型ＡＰＰ（ＡＰＰ６６７、ＡＰＰ６４８、
ＡＰＰ５９２）の構造を示す模式図である。図中の数字
は各ＡＰＰのＮ末端から数えたアミノ酸残基の番号を示
す。

【図３】抗ＺｔＰＩ抗体と抗ＺｔＰＩ抗体の組み合わせ
による２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図４】抗ＺｔＰＩ抗体と１Ｂ２モノクローナル抗体の
組み合わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図５
】抗ＺｔＰＩ抗体と３Ｂ２モノクローナル抗体の組み合
わせによる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図６】抗Ｚ
ｔＰＩ抗体と６Ａ３モノクローナル抗体の組み合わせに
よる２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ

【図７】β−ガラク
トシダーゼの一部分とＡＰＰ７７０の部分タンパクとの
融合タンパクであるＺＫＸの発現プラスミド作成の模式
図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アルツハイマー病アミロイド前駆体蛋
   白ＡＰＰ７５１、及びＡＰＰ７７０に含まれるＫＰＩ配
   列を認識する抗体を、少なくともその組み合わせの一方
   に用いることを特徴とする２抗体サンドイッチＥＬＩＳ
   Ａ法による、ＫＰＩ配列を含むアルツハイマー病アミロ
   イド前駆体蛋白又はその断片の免疫学的測定方法。
2. 【請求項２】　　請求項１記載の２種類の抗体のうち一
   方を不溶性担体に結合した第１次試薬と、もう一方の抗
   体である第２次試薬とからなる、ＫＰＩ配列を含むアル
   ツハイマー病アミロイド前駆体蛋白又はその断片の測定
   試薬。
3. 【請求項３】　　請求項２記載の測定試薬を構成要素の
   一部とする、ＫＰＩ配列を含むアルツハイマー病アミロ
   イド前駆体蛋白又はその断片の測定キット。