KR102236944B1 - 갈락토올리고당, 또는 갈락토올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 면역기능 개선 및 피부상태 개선용 기능성 식품조성물 및 화장료 조성물 - Google Patents

갈락토올리고당, 또는 갈락토올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 면역기능 개선 및 피부상태 개선용 기능성 식품조성물 및 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS)을 유효성분으로 포함하는 면역기능 개선 또는 염증개선용 기능성 식품조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용, 면역기능 또는 장내 균총 개선용 기능성 식품조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 갈락토 올리고당 또는 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 상술한 용도의 효과가 우수한 바, 상술한 용도의 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

갈락토올리고당, 또는 갈락토올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 면역기능 개선 및 피부상태 개선용 기능성 식품조성물 및 화장료 조성물{Functional food composition and cosmetic composition comprising galacto-oligosaccharide, or galacto-oligosaccharide and collagen tripeptides for improving immune function and skin condition}
본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 또는 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 포함하는 면역기능 개선 및 피부상태 개선용 식품조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다
피부의 노화는 피부를 구성하는 세포들의 회복능력의 저하에 기인한다. 피부 노화의 원인은 나이가 들어감에 따른 내인성 노화와, 지속적인 자외선 노출에 의하여 발생하는 외인성 노화(예컨대 광노화)로 분류된다. 내인성 노화의 특징은 세포수가 감소함에 따라 세포 외 기질 단백질 섬유의 합성량이 감소하고 느슨해져 탄력이 감소되고, 피부세포 내 수분 손실로 인하여 각질층 구조가 변하는 미세한 주름, 피하지방층의 감소, 피부보습이 감소되는 임상적인 특징을 가진다. 외인성 노화는 자외선의 자극으로 인하여 발생되는 활성 산소종(ROS)이 염증성 사이토카인의 발생을 촉진시키고 굵고 깊은 주름이 발생되며, 피부가 건조해지며, 탄력성이 감소하는 증상을 나타낸다. 내인성 또는 외인성 노화의 공통적인 요인으로써 생성되는 활성산소종이 적절하게 제거되지 못하면 피부의 회복능력을 방해하여 피부노화를 가속시키는 것으로 알려져 있다.
Hong et al., Korean J Food Sci Anim Resour. 2015; 35(3): 413-420.
본 발명자들은 갈락토 올리고당(GOS)과, 갈락토 올리고당(GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(CTP)의 혼합물이 피부에 미치는 다양한 효과와 그 작용기전을 확인하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 갈락토 올리고당의 면역기능 개선 및 항염증 또는 항산화 효과와, 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드 혼합물의 면역기능 개선 및 항염증, 항산화, 주름 또는 탄력개선, 피부보습, 광노화 억제효과를 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS)을 유효성분으로 포함하는 면역기능 개선 및 염증개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 식품조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 갈락토 올리고당, 또는 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS)을 유효성분으로 포함하는 면역기능 개선 및 염증개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서, "갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS)"은 갈락토올리고당을 포함하는 여러 종류의 당들의 혼합물이다. 상기 갈락토올리고당은 글루코스와 갈락토스의 단당류들과; 이당류인 갈락토바이오스와 락토스 및 알로락토스; 갈락토실락토스를 포함한 3당류와 그 외 4당류 이상의 갈락토 올리고당을 포함할 수 있다. 상기 갈락토바이오스는 4-베타-갈락토바이오스, 6-베타-갈락토바이오스를 포함할 수 있다. 상기 알로락토스는 6-갈락토실-글루코스를 포함할 수 있다. 상기 베타 갈락토실락토스는 3’-갈락토실락토스, 4’-갈락토실락토스, 6’-갈락토실락토스, 4-베타-디-갈락토실락토스, 4-베타-트리-갈락토실락토스, 4-베타-테트라-갈락토실락토스 등을 포함할 수 있다.
구체적으로 본 발명에 사용된 갈락토올리고당은 2당류인 갈락토바이오스와 알로락토스; 및 갈락토실락토스를 포함한 3당류 이상인 갈락토올리고당을 포함한다.
상기 갈락토올리고당은 무수물 기준 2당류의 합이 17~25%, 3당류의 합이 26 ~ 36%, 4당류 이상의 합이 16 ~ 30% 일 수 있으며, 단당류인 글루코스와 갈락토스 및 2당류인 락토스를 제외한 갈락토올리고당의 함량은 무수물기준 70~80% 일 수 있다.
상기 갈락토 올리고당은 비소화성 프리바이오틱스로서, 소화를 촉진하고 장내 유익균의 성장을 도움으로써 면역 건강에 기여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서, "콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)"는 3개의 아미노산으로 이루어진 콜라겐의 최소 단위이다. CTP는 종래의 콜라겐과는 상이하여 장관내로 쉽게 흡수된다. 콜라겐 트리펩타이드는 상처와 골절의 치유, 인대 강화 등의 생물활성을 가진 물질로서 식품의 재료로 사용되고 있다.
본 발명에 있어서, '항염증' 또는 '염증개선(완화)' 효과라 함은 염증을 억제하는 것을 말하며, 염증은 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식의 세가지를 병발하는 복잡한 병변을 말한다. 보다 구체적으로 염증은 선천성 면역의 일부이며 염증반응은 손상된 조직 또는 상처 부위에 침입할 수 있는 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서는 초기단계 면역반응을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다. 상기 염증반응 활성화와 관련되는 사이토카인으로는 IL-6, IL-12, TNF-alpha 등이 있다. 상기 사이토카인은 염증반응과 관련된 면역지표이기도 하다.
상기 IL-6 (interleukin-6)는 염증 반응 및 당뇨, 동맥경화, sLE, 다발성 골수종, 전립선암, 베체트 병, 류마티스성 관절염 등 많은 질병에서 자가면역 반응을 촉진하는 사이토카인이다. 상기 IL-12는 수지상세포, 대식세포, 호중구 등의 세포에서 항원 자극에 대한 반응으로 자연적으로 생성되는 인터루킨으로서, 광범위한 전염성 질환에 있어 작용하는 사이토카인이다. 상기 TNF-alpha (tumor necrosis factor-alpha)는 전신성 염증반응에 작용하는 사이토카인으로 급성 염증반응을 비롯한 염증반응 활성화에 중추적인 역할을 한다.
자외선에 의한 자극이 반복되면 활성산소종(ROS)를 발생시키고, 전-염증성 사이토카인의 생성이 촉진되어 여러 신호전달 체계를 활성화시킴으로써 염증반응이 증가되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 갈락토 올리고당은 IL-6, IL-12, TNF-alpha 와 같은 염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 효과가 우수하므로, 면역기능의 개선 및 염증개선용 식품조성물로 유용하게 사용될 수 있으며, 과도한 염증반응 또는 과도한 면역반응에 의해 야기되는 회복의 지연을 예방하고 상처 또는 질병으로부터의 회복을 촉진한다. 상기 면역기능, 염증의 개선은 구체적으로 피부 면역기능, 피부 염증의 개선을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염증과 관련된 피부질환의 예로는 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 산 화상, 자외선에 의한 화상, 수포성 피부병, 태선, 알레르기에 기한 가려움증, 장미 여드름, 심상성 천포창, 다형 삼출성 홍반, 결절 홍반, 귀두염, 음문염, 원형 탈모증과 같은 염증성 모발 손실, 피부 T-세포 림프종 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 염증과 관련된 피부질환의 증상으로는 홍반, 구진, 수포, 과도한 각질형성, 가려움증 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염증과 관련된 질환은 피부질환에 한정되지 않으며, 예컨대 구내염, 혈관염, 심내막염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 구내염, 또는 염증성 장질환 등을 포함한다. 상기 염증성 장질환은 구체적으로 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(crohn's disease), 장형 베체트(intestinal behcet's disease), 불확정 대장염(indeterminate colitis), 세균성 장염, 바이러스성 장염, 아메바성 장염, 출혈성 직장 궤양, 허혈성 대장염 및 결핵성 장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이나 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론병이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 피부보습용 식품조성물을 제공한다.
피부의 보습은 피부의 가장 외층인 표피의 각질층에 존재하는 수분과 진피에 존재하는 콜라겐에 의해 유지된다. 각질층의 수분 함량은 표피에서 생성 분비되는 지질 혼합체인 피지막과 각질층 내에 존재하는 수용성 성분인 자연 보습인자(NMF: natural moisturizing factor)에 의해 결정된다. 건강한 표피의 각질층은 15-20%의 수분을 함유하고 있으며 수분이 10% 이하로 떨어지면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름이 증가하게 된다.
본 발명에서 콜라겐은 교원섬유라고도 불리며, 진피의 85∼90%를 차지하는 세포외 기질의 주요 구성 성분이다. 콜라겐은 섬유아세포의 작용에 의해 프로콜라겐의 형태로 생성되는 단백질이다. 새롭게 합성된 프로콜라겐은 효소반응을 거쳐 피부세포의 세포외 공간으로 분비되어 삼중나선구조의 microfibril을 형성하고, microfibril들은 leucine-rich small proteoglycans과 결합하여 피브릴을 형성하는데, 이러한 과정을 fibrillogenesis라고 한다. 결과적으로 이렇게 만들어진 피브릴들이 모여 콜라겐 섬유를 형성하게 되어 피부의 결합력과 탄력성을 갖게 한다. 피부 콜라겐 중 대부분을 차지하는 것은 type-1 콜라겐이다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화 유도 등이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 혼합물은 섭취시 진피내 콜라겐의 함량을 향상시키는 효능이 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에서 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 전과 후의 수분 보유량의 변화를 확인한 결과, GOS/CTP의 중량비가 3:1~1:3인 처리군 모두에서 NOR 그룹보다 더 콜라겐 함량이 향상됨을 확인하였으며, GOS와 CTP 단독 처리군과 비교하여 콜라겐 함량의 면에서 시너지 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 혼합물은 섭취시 수분 보유량을 높게 유지시키고, 경표피 수분 손실량을 감소시키는 효능이 있다. 여기서 경표피 수분손실량(transepidermal water loss, TEWL) 수치는 피부로부터 발산되는 수분량으로서 이 수치가 높을수록 피부의 보습 기능이 떨어져 있음을 의미하며, 동시에 피부 고유의 장벽 기능이 손상되었음을 알 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드는 1-10:1-10의 중량비로 포함되는 것이다. 상기 중량비는 보다 구체적으로는 1-10:1-10, 1:1-10, 1-10:1, 1-5:1-5, 1:1-5, 1-5:1, 1-3:1-3, 1:1-3, 1-3:1, 1:10, 1:5, 1:3, 1:2, 1:1, 10:1, 5:1, 3:1, 또는 2:1일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 본 발명의 조성물 내 유효성분으로 포함되는 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 중량비는 본 발명의 기능성 식품 조성물의 용도에 관계없이 동일하게 적용된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 전과 후의 수분 보유량의 변화를 확인한 결과, GOS/CTP 1:1 그룹에서 수분 보유량의 변화가 유의적으로 증가하였으며, 경표피 수분 손실량은 모든 시료 투여군에서 유의적으로 감소하였으며, GOS/CTP 3:1~1:3 처리군 모두에서 GOS와 CTP 단독 처리군과 비교하여 경표피 수분 손실량이 감소에 대해 시너지 효과를 나타내었다.
피부에 존재하는 히알루론산은 섬유모세포 및 각질형성세포에서 형성되며 점다당질의 구성 성분으로 다당류가 많이 들어있어 수분을 상당량 함유할 수 있는 특징이 있다. 주기는 2~4.5일이며, 무게가 자신의 1,000배인 수분과 결합하여 피부장벽 기능의 조절과 세포외기질을 수화시켜 조직 내 수분의 항상성을 유지시킨다. 또한 히알루론산은 진피뿐만 아니라 표피의 세포 간격, 특히 가시층에 있으나 각질층과 과립층에는 존재하지 않는다.
히알루론산 가수분해효소(Hyaluronidase, HYAL)는 피부 보습인자인 히알루론산(hyaluronan)의 가수분해 효소이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 히알루론산 분해 효소인 HYAL의 유전자 발현량을 측정한 결과, 자외선에 노출시킨 대조군에서 유의적으로 증가하였으며, 모든 조성물 투여 군에서 감소하는 경향을 나타냈다. 특히, GOS/CTP 3:1, 1:1, 1:3의 비율로 포함하는 혼합 조성물을 처리시 HYAL 발현량은 GOS, CTP를 단독으로 투여한 그룹과 비교하여 모든 그룹에서 히알루론산 분해 효소 감소의 면에서 시너지 효과를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 혼합물은 피부보습 효과가 매우 우수한 바, 피부보습용 식품조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 피부진정용 또는 피부자극 완화용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서 피부 진정이란 피부에 냉감을 부여하는 것, 피부의 홍반/발적을 가라앉히는 효과를 의미한다.
본 발명에서 피부자극 완화란 피부에 가해지는 외부적, 내부적 자극에 대한 피부의 반응을 감소시키는 것으로, 예컨대 자외선 노출에 의해 피부에 가해지는 자극에 대한 (염증, 홍반/발적)을 감소시키는 효과를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 투여는 자외선 자극에 대하여, 염증과 관련된 면역지표로서의 사이토카인인 IL-6, IL-12, 및 TNF-alpha의 발현을 현저하게 감소시키는 효과를 나타냈으며, 홍반 지수를 평가한 결과 GOS/CTP 1:3 처리군에서 특히 우수한 홍반 감소 효과를 나타냈다.
따라서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드는 피부진정용 또는 피부자극 완화용 식품조성물의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 식품조성물을 제공한다.
피부가 자외선에 노출되면 피부 조직 내에 물리적 생화학적 성상의 변화가 유발되어 상피 세포의 증식, 과색소 침착, 과도한 활성 산소의 형성을 통한 DNA 손상, 각종 효소와 단백질의 비정상적 활성화 등이 초래된다. 피부 조직 내 변화는 외부 물질의 피부 흡수 및 수분 증발을 조절하는 정상적인 피부 장벽 기능에 손상을 입히고, 피부 두께를 증가시키며 진피층의 구조를 손상시켜 궁극적으로 주름을 유발시키게 된다.
본 발명에 있어서, '주름 개선' 효과라 함은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 혼합물의 투여는 주름 양상의 지표(주름의 면적 및 최대 주름 깊이)를 대조군 대비 유의적으로 감소되는 경향을 확인하였으며, 조성물 중 GOS/CTP 1:3~1:1의 혼합 처리군에서 최대 주름 깊이를 시너지적으로 감소시켰고, GOS/CTP 3:1~1:3 혼합 처리군 모두에서 주름의 면적을 시너지적으로 감소시켰다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 주름 개선용 식품조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 피부 손상 억제용 식품조성물을 제공한다.
피부가 자외선에 노출되면 피부 조직 내에 손상이 유발됨은 상술한 바와 같다. 장기간 UV 노출 시 피부조직에서는 표피 두께가 2~3배 증가하며, 표피층에서는 유극세포의 증가, 각질세포의 다형성 등이 관찰되는 것이 특징이다. 광노화시 피부의 진피층 보호를 위해 각질층의 형성이 증가하여 피부의 두께는 두꺼워지기 때문에 자외선 등에 의한 피부의 두께가 두꺼워졌다는 것은 그만큼 피부 손상이 크다는 것을 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 조성물의 투여는 자외선 조사에 의한 표피 두께의 유의적 증가를 감소시켰으며, 특히 GOS/CTP를 1:1, 3:1의 중량비로 포함하는 조성물 처리군의 표피의 두께가 GOS, CTP 단독 물질 처리군 보다 유의적으로 감소하여 시너지 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 자외선에 대한 피부 손상을 효과적으로 억제시키며 특히 1:1~3:1의 중량비 범위에서 시너지 효과를 나타낸다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 광노화 억제용 식품조성물을 제공한다.
태양광선의 자외선에 대한 자극에 의하여 활성산소종(ROS)이 발생되고, 전염증성 사이토카인의 생성이 촉진되어 여러 가지 신호전달 체계를 활성화시킨다. 또한 AP-1을 활성화시켜 TGF-β 및 TGF-α를 억제함으로써 진피의 주된 성분인 collagen typ3 I과 collagen type III의 합성을 감소시키며, AP-1과 NF-κβ의 활성화는 MMPs, 특히 MMP-1, MMP-3, MMP-9을 활성화시켜 진피내 결체조직의 분해를 촉진시킨다.
피부 진피의 주 구성물질인 콜라겐(collagen)은 피부조직의 탄력과 강도를 유지하는데 주요한 요소로 자외선에 의한 피부보호 지표이다. 전체 콜라겐 중에서 제1형 콜라겐(collagen type I, COL1a1)은 80~85%를 차지한다.
또한, MMP(Matrix metalloproteinase)는 콜라겐 분해 효소로서, MMP의 활성이 증가하면 콜라겐의 분해가 촉진된다. 자외선은 몇몇 MMP의 발현이 증가시켜 상기 콜라겐의 분해를 증가시키며, 진피층의 구조를 손상시켜 궁극적으로 피부의 주름(노화)를 유발시키게 된다.
MMP가 콜라겐을 분해하는 대표적인 효소인데 반하여 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases)는 상기 MMP의 활성을 저해하는 억제제이다.
본 발명의 일 구현예에서, 진피 내의 콜라겐 함량을 확인한 결과, 전체 시료 군에서 콜라겐 함량의 증가를 확인하였으며, CTP 단독 섭취군보다 GOS 단독 또는 GOS/CTP 혼합 섭취 군의 1:3~3:1 모든 중량비에서 콜라겐 함량이 유의적으로 시너지적 증가하였고, 특히 GOS/CTP 1:3 혼합 섭취 군에서 가장 유의적인 효과를 나타냈다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 진피 내의 콜라겐 분해효소 MMPs의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 본 발명의 GOS 및 CTP를 포함하는 조성물 투여시 MMP2/3/9/13 유전자의 발현량이 GOS/CTP 1:1 및/또는 3:1 혼합물 처리시에 유의적으로 감소하였다.
또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 진피 내의 콜라겐 분해효소의 억제제인 TIMP1 및 TIMP2 유전자의 발현량을 측정한 결과, 본 발명의 GOS 및 CTP를 포함하는 조성물 투여시 GOS/CTP의 중량비가 1:3~3:1 모든 범위에서 TIMP1 및 TIMP2의 발현량이 증가하였다.
따라서, 본 발명의 상기 광노화 억제용 조성물은 GOS/CTP의 중량비가 1:3~3:1, 보다 구체적으로는 GOS/CTP의 중량비가 1:1~3:1인 범위에서 광노화 억제에 대하여 시너지 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 피부탄력 개선용 식품조성물을 제공한다.
광노화 혹은 내인성 노화에 따라, 진피층의 그물망구조를 갖고 있는 엘라스틴 단백질의 감소 또한 피부 탄력의 저하와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 엘라스틴은 진피층의 3∼4% 정도를 차지하며 피부의 탄력에 영향을 주는 탄성섬유이다. 엘라스틴 유전자 발현에 따라 트리포엘라스틴이라는 단백질을 합성하게 되고, 이러한 트리포엘라스틴은 서로 다른 트리포엘라스틴과 결합하여 최종적으로 엘라스틴 단백질을 만들게 된다.
본 발명의 일 구현예에서, 진피 내 엘라스틴 섬유의 함량을 확인한 결과, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 조성물은 모든 중량비 범위에서 대조군과 비교하여 엘라스틴 섬유의 함량을 증가시켰으며, 특히 GOS/CTP가 1:3 및 3:1 중량비인 조성물을 투여한 경우에는 GOS, CTP 단독 투여군과 비교하여 엘라스틴 섬유 증가 효과의 면에서 시너지 효과를 나타낸다.
또한, 피부의 탄력성은 진피 내의 콜라겐의 함량과도 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 전체 시료 군에서 콜라겐 함량의 증가를 확인하였으며, CTP 단독 섭취군보다 GOS 단독 또는 GOS/CTP 혼합 섭취 군의 1:3~3:1 모든 중량비에서 콜라겐 함량이 유의적으로 시너지적 증가하였고, 특히 GOS/CTP 1:3 혼합 섭취 군에서 가장 유의적인 효과를 나타냈다.
따라서, 본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 혼합물은 피부탄력 개선용 식품조성물로 유용하게 사용될 수 있고, 구체적으로 GOS/CTP의 중량비가 1:3~3:1의 범위에서, 보다 구체적으로는 GOS/CTP의 중량비가 1:3 또는 3:1인 경우이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 면역기능 및 염증개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 면역기능 개선용 또는 장내 균총 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 염증개선(염증완화, 또는 항염증) 효과는 갈락토 올리고당을 유효성분으로 포함하는 면역 기능 개선 및 염증개선용 식품조성물과 관련하여 기술한 것과 동일하다.
본 발명에서 용어 '면역'은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다. 외부 자극에 의한 손상이나 병원 미생물의 침입으로부터 자신을 방어하기도 하지만 염증반응 등과 같이 자기 자신의 조직에 손상을 줄 수도 있다. 면역기능 개선은 면역기능의 변화를 조절하여 정상으로 회복시키거나 변화의 폭을 줄여 주는 작용으로 과민면역 반응 완화나 면역기능 증강으로 구분된다. 과민면역 반응 완화는 외부 물질에 대해 불리하게 반응하여 초래되는 알레르기 반응, 자기항원 또는 변형된 자기항원에 대한 반응 등 바람직하지 않게 증가된 면역 반응을 억제시키는 것을 의미한다. 면역기능 개선은 생체방어 능력을 증강시키는 목적으로 하는 면역기능 증진과 민감해진 면역 기능을 조절하여 개선시키는 목적인 과도한 면역반응 완화로 나누어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역기능 개선은 과도한 면역반응의 완화이다. 상기 과도한 면역 반응의 완화는 장기이식 거부, 알레르기의 완화, 염증 또는 염증성 질환의 완화, 자가면역질환의 완화를 포함한다.
본 발명에서 상기 장기이식 거부는 구체적으로는 심장, 폐, 심장 및 폐 복합, 간, 신장, 췌장, 피부, 장(bowel) 또는 각막의 이식 후에 발생하는 급성 또는 만성 이식 거부 반응, 그리고 골수이식 후 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)일 수 있으며, 특히 T 세포가 매개하는 이식 후 거부 반응일 수 있다.
본 발명에서 상기 알레르기, 자가면역질환, 염증 또는 염증성 질환은 피부 알레르기, 코 알레르기, 기관지 알레르기, 음식물 알레르기, 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 다 발성 경화증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증(sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군(GuillainBarre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 사이토카인 폭풍(cytokine storm), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 글루텐(gluten) 민감성 장질환, 휘플병(Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역매개성 피부질환, 수포성 피부질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 소양증, 음식물 과민증, 여드름, 두드러기, 폐의 면역질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "소양증"은 임의의 가려움증 상태로, 예를 들면 피부를 긁거나 비벼대고 싶은 욕망을 일으키는 불유쾌한 감각을 포함한다. 이러한 소양증은 크게 피부질환에 의한 소양증과 내과적 질환에 의한 소양증으로 나뉠 수 있다. 피부질환에 의한 소양증에는 아토피성 피부염, 두드러기, 건선, 천포창, 피부 건조증, 만성단순태선(Lichen simplex chronicus), 결절성 양진, 태선 등에 의한 소양증을 포함한다. 내과적 질환에 의한 소양증에는 갑상선 질환에 의한 소양증, 당뇨 등의 호르몬 이상으로 인한 소양증, 만성 신부전 및 혈액 투석에 따른 신장성 소양증 혹은 요독성 소양증, 백혈병이나 림프종 등에 의한 종양성 소양증, 담즙 정체성 소양증, 이식편대숙주질환에 의한 소양증, 빈혈 및 대사성 질환에 의한 소양증, 후천성면역결핍증에 의한 소양증 등을 포함한다.
면역반응 완화와 관련된 기능성 확인을 위한 바이오마커로는 면역글로불린(IgE), 프로스타글란딘, 류코트리엔, 히스타민, NO, iNOS, COX2, 사이토카인(TNF, IL, IFN) 등이 있다.
본 발명의 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품조성물은 염증성 사이토카인인 IL-6, IL-12 및 TNF-alpha의 발현을 감소시키는 효과가 우수하다. 상기 IL-6는 피부의 가려움증과 관련성이 있다고 알려진 사이토카인으로서, 본 발명의 조성물이 소양증의 예방, 개선, 또는 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다. 상기 IL-12는 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염 등 다양한 피부의 염증반응에서 증가하는 것으로 알려져 있다. 상기 TNF-alpha는 아토피성 피부염, 건선 등의 피부 질환 뿐만 아니라, 류마티스성 관절염 등에서 염증을 유발하는 사이토카인으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 GOS 및 CTP의 혼합물은 GOS와 CTP의 중량비가 1:3, 1:1, 3:1인 경우에서 모두 GOS, CTP 단독 투여군과 비교하여 염증성 사이토카인의 분비 감소효과의 면에서 시너지적 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 면역기능 개선 또는 염증개선(항염증)용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역기능 개선은 장관내 면역기능 개선을 포함한다. 상기 장관내 면역기능 개선은 장관내 유해균을 억제하고, 유산균 등 장관내 유익균을 증가시킴으로써 달성된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 장내 균총 개선은 장내 퍼미큐티스(Firmicutes)문 균/박테로이데테스(Bacteroidetes)문 균의 비율을 감소시키는 것이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 장내 균총 개선은 장내 비피도박테리움속 균주를 증가시키는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 GOS, 또는 GOS 및 CTP의 혼합물은 장내 퍼미큐티스(Firmicutes)문 균/박테로이데테스(Bacteroidetes)문 균의 비율을 감소시키고, 장내 유산균 중 비피도박테리움 속 균주를 증가시키므로, 장내 균총 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 장내 균총 개선은 장내 단쇄지방산의 증가에 의해 뒷받침된다. 장내 미생물들은 장내에서 식이섬유를 발효시켜 단쇄지방산들, 주로 아세트산, 프로피온산, 부티르산을 생성하며 단쇄지방산은 장 점막으로부터 빨리 흡수되어 대장점막세포의 주요한 에너지원으로 이용되는 것으로 알려져 있다(Thompson DB, 2000).
본 발명의 일 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 GOS 또는 GOS 및 CTP의 혼합물은 장내 총 단쇄지방산 및 개별 단쇄지방산(아세트산, 부티르산, 발레르산 등)을 증가시키므로, 장내 유산균의 증가 및 장내 유해균의 감소로 인해 장관내 면역기능을 개선하고, 장내 균총을 개선시킴을 알 수 있다.
본 발명에서 상기 식품조성물은 각종 식품첨가물 또는 건강기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있고, 구체적으로 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 또는 건강보조 식품류일 수 있다.
상기 식품 조성물에 함유된 본 발명의 GOS 및 CTP의 혼합물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 조절될 수 있고 특별한 제한이 없다. 예컨대, GOS 및 CTP의 함량은 전체 식품 중량의 0.001 내지 30 중량% 또는 0.01 내지 20 중량%일 수 있고, 건강 음료 조성물의 경우 100 ml을 기준으로 0.001 내지 15 g, 0.02 내지 10 g, 또는 0.3 내지 1 g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 GOS 및 CTP의 혼합물을 포함하는 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 GOS 및 CTP의 혼합물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가 성분은 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 상기 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 i) 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS), 또는 ii) 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 유효성분인 상기 i) 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS), 또는 ii) 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)는 상술한 실시예에서 입증된 바와 같이, 염증 반응과 관련된 사이토카인의 발현을 현저하게 감소시키며, 경피수분손실양, 홍반지수 등을 감소시키는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부장벽기능을 강화하고, 피부자극으로부터 피부를 보호하며, 피부자극을 완화시키는 효과가 우수하다.
본 발명의 상기 피부상태 개선은 상술한 조성물에서 정의한 것과 동일하다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 유효성분인 i) 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS), 또는 ii) 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP) 뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 담체로서, 정제수, 일가 알코올류(에탄올 또는 프로필 알코올), 다가 알코올류(글리세롤, 1,3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜), 고급 지방산류(팔미틸산 또는 리놀렌산), 유지류(소맥 배아유, 동백기름, 호호바유, 올리브유, 스쿠알렌, 해바라기유, 마카데미아땅콩유, 아보가드유, 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 필요에 따라 계면활성제, 살균제, 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.
계면활성제로는 폴리옥시에틸렌, 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌, 올레일에테르, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌, 글리세릴모노스테아레이트, 모노스테아린산소르비탄, 모노올레인산폴리옥시에틸렌, 소르비탄, 자당지방산에스테르, 모노라우린산헥사글리세린, 폴리옥시에틸렌 환원라놀린, POE, 글리세릴피로글루타민산, 이소스테아린산, 디에스테르, N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르 등을 사용할 수 있다.
살균제로는 히녹티올, 트리크로산, 크롤헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아즐렌 (azulene), 살리실산 및 징크피리타온 등을 사용할 수 있다.
산화방지제로는 부틸히드록시아니솔, 몰식자산, 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용이 가능하다.
자외선 흡수제로는 디히드록시벤조페논 등의 벤조페논류, 멜라닌, 파라아미노벤조산에틸, 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸헥실에스테르, 시녹사이트, 파라메톡시계피산 2-에틸헥실에스테르, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐) 벤조트리아졸, 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 등을 사용할 수 있다.
소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인 등을 사용할 수 있고, 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘톨 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 겔, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 앰플, 헤어앰플, 두피트리트먼트, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어트리트먼트, 헤어로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 린스겸용 샴푸, 모발 영양화장수, 헤어젤, 헤어왁스, 헤어 스프레이, 염색제, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 i) 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS), 또는 ii) 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 포함하는 조성물을 대상체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 피부상태 개선 방법을 제공한다.
상기 피부상태 개선이란, 피부보습, 피부진정, 피부자극 완화, 피부주름 개선, 자외선에 대한 피부손상 억제, 광노화 억제, 피부탄력 개선, 또는 항염증을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 호흡기 질환을 겪는 대상체(개체)에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "대상체"는 인간, 마우스, 랫트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 및 붉은털 원숭이 등을 포함하는 포유류이다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 상기 피부상태 개선 방법은, 본 발명의 일 양태인 다양한 용도의 식품조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 또는 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 기능성 식품조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 광노화 억제용, 피부주름 또는 피부탄력 개선용, 항산화용, 항염증용, 또는 피부보습용의 용도와 관련된 효과가 우수한 바, 상술한 용도의 기능성 식품조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 실험군별 사료 섭취량을 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 실험군별 음수 섭취량을 나타낸 도이다.
도 2a는 본 발명의 실험군별 피부 수분 보유량을 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 실험군별 피부 수분 보유량의 변화량을 나타낸 도이다.
도 3a는 본 발명의 실험군별 경피 수분 손실량을 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 실험군별 경표피 수분 손실량의 변화량을 나타낸 도이다.
도 4a는 본 발명의 실험군별 홍반 수치를 나타낸 도이다.
도 4b는 본 발명의 실험군별 홍반 수치 변화량을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실험군별 마우스 등쪽 피부를 육안 및 촬영하여 관찰한 도이다.
도 6a는 본 발명의 실험군별 전체 피부 주름의 면적을 나타낸 도이다.
도 6b는 본 발명의 실험군별 피부 주름의 최대 깊이를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 실험군별 마우스 피부의 H&E 염색결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 실험군별 마우스 피부의 H&E 염색결과로부터 표피의 두께를 측정하여 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 실험군별 마우스 피부의 콜라겐에 대한 IHC 염색결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 실험군별 마우스 피부의 콜라겐에 대한 IHC 염색결과로부터 콜라겐 수치를 측정하여 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 실험군 별 마우스의 진피 내 엘라스틴 량을 측정한 결과이다.
도 12 내지 도 15는 본 발명의 실험군 별 피부 조직의 MMP2/3/9/13의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 16 및 도 17은 본 발명의 실험군 별로 피부 조직의 TIMP1 및 TIMP2의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 실험군 별로 피부 조직의 제1형 콜라겐(COL1a1)의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명의 실험군 별로 피부 조직의 히알루론산 분해 효소의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 20 내지 22는 본 발명의 실험군 별로 피부 조직 내 염증성 사이토카인의 분비량을 나타낸 도이다(도 20: IL-6, 도 21: IL-12, 도 22: TNF-alpha).
도 23 내지 도 27은 본 발명의 실험군 별로 단쇄 지방산(short chain fatty acid, SCFA)을 나타낸다(도 23: Acetic acid, 도 24: Propionic acid, 도 25: Butyric acid, 도 26: Valeic acid), 도 27: Total SCFA).
도 28은 속 수준의 GOS 장 건강 기능성 마이크로바이옴의 군집 분포를 나타낸다.
도 29는 본 발명의 각 실험군 별 피부 및 장 건강 기능성 마이크로바이옴의 유연관계를 분석하기 위하여 주성분(PCoA)을 분석한 결과이다.
도 30은 본 발명의 각 실험군 별 피부 및 장 건강 기능성 마이크로바이옴의 군집을 분석하기 위하여 UPGMA Clustering 분석을 한 결과이다.
도 31 내지 도 33은 본 발명의 각 실험군 별 장내 마이크로바이옴 중 Bacteroidetes와 Firmicutes의 분포를 나타낸 도이다.
도 34 내지 도 37은 본 발명의 각 실험군 별 장내 마이크로바이옴 중 Bacteroidetes와 Firmicutes의 분포를 나타낸 도이다.
도 38 내지 도 42은 본 발명의 각 실험군 별 장내 마이크로바이옴 중 장내 미생물의 문(phylum) 및 과(family) 분포를 나타낸 도이다.
도 43 내지 도 46은 본 발명의 각 실험군 별 장내 마이크로바이옴 중 장내 미생물의 속(genus) 분포를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
재료 및 시약
갈락토올리고당(Galacto-oligosaccharide, GOS)과 콜라겐 트리펩타이드(Collagen-tripeptide, CTP)는 네오크레마로부터 제공받아 사용하였다. 제공받은 갈락토올리고당의 구성은 글루코스 0.5%, 갈락토스 1.8%, 락토스 21.7%, 갈락토올리고당 성분 중 2당류 20.4%, 갈락토올리고당 성분 중 3당류 30.6%, 갈락토올리고당 성분 중 4당류이상이 25.0% 로 구성되었다. 본 발명에 사용된 GOS와 CTP를 단독 또는 비율별로 혼합하여 증류수에 용해하여 사용하였다.
실험동물의 처치
실험군은 총 7군(군당 6마리)으로 정상대조군(normal, not UVB-induced), 음성대조군(control, UVB-irradiated), GOS 단독처리군(GOS 200 mg/kg, UVB-irradiated) 및 CTP 단독처리군(CTP 200 mg/kg, UVB-irradiated), GOS/CTP 1:3 혼합 처리군(GOS/CTP 50:150 mg/kg, UVB-irradiated), GOS/CTP 1:1 혼합 처리군(100:100 mg/kg, UVB-irradiated), GOS/CTP 3:1 혼합 처리군(GOS/CTP 150:50 mg/kg, UVB-irradiated)으로 분류하였다.
실험동물은 SKH-1 Hairless mice(SkH: HR-1) 수컷을 오리엔트바이오에서 구입하여 사육하였다. 동물 사육실 환경 온도는 22±2°C, 상대습도는 50±10%, 명암은 12시간 주기로 조절하였고 음수와 사료는 자유급식으로 하였다.
본 실험은 고려대학교 동물실험윤리위원회 승인을 받은 후 '실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC)'에 맞추어 관리하며 실시하였다.
일주일 동안의 적응기가 지난 후 정상대조군(NOR)을 제외한 6군에 8주간 주 3회 UVB-자외선램프(T-8M; Vilber Lourmat, France)가 부착된 자외선 조사기(BLX-254; Vilber Lourmat, France)를 이용하여 등 피부에 자외선을 쬐어 광노화를 유발하였다(Hong et al., 2015). 자외선 조사량은 UV Light meter(UV-340; Lutron, Taiwan)로 자외선 조사기 내부의 조사량을 측정하여 조정한 뒤 아래의 표 1과 같이 UVB 조사량을 조절하였다.
week 1 2 3 4~8
UVB dosage 1 MED 2 MED 3 MED 4 MED
*1 MED = 75 mJ/cm2자외선 조사 시작일로부터 8주간 정상대조군(NOR)과 음성대조군(CON)은 음용수만 경구투여 하였으며, 시료 처리군은 체중 측정 후 농도에 맞추어 시료를 음용수와 혼합하여 경구투여하였다. 각 마우스들은 8주간의 자외선 조사 및 GOS, CPT 단독 또는 혼합 샘플 투여 기간이 종료된 후 희생하였다.
실시예 1: 음수 섭취량 및 사료 섭취량
본 발명자들은 본 발명의 조성물이 마우스의 음수 및 사료 섭취량에 미치는 영향을 확인하고자, 마우스를 자외선 조사하고 시료를 투여하는 기간 동안 일주일에 1회씩 음수 및 사료의 섭취량을 측정하였다.
도 1a는 본 발명의 실험군별 사료 섭취량을 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 실험군별 음수 섭취량을 나타낸 도이다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 식이 섭취량은 GOS/CTP 3:1 그룹이 19.14 g/day로 전체 실험군의 평균 식이 섭취량인 16.62 g/day에 비해 증가한 경향을 나타냈지만, 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 음수 섭취량은 UVB 조사를 진행한 GOS/CTP 1:1 그룹을 제외한 시료 투여군에서 NOR 그룹에 비해 음수섭취량이 증가하였으며, 이 중 GOS/CTP 1:3 그룹의 음수섭취량이 18.36 ml/day로 유의적으로 높은 수치를 나타내었다(p<0.05).
실시예 2: 피부 수분 보유량, 경표피 수분 손실량( TEWL ) 및 홍반 평가
본 발명자들은 본 발명의 조성물이 피부 상태에 미치는 영향을 확인하고자, 자외선을 조사한 쥐의 등 쪽 피부를 Multi Probe Adapter® MPA 6(Courage und Khazaka, Germany)로 피부의 수분보유량, 경표피수분손실량(TEWL)과 홍반을 측정하였다. 자외선 조사 시작 전 모든 그룹에서 피부 측정이 진행되었으며, NOR 그룹과 CON 그룹 사이의 피부 측정 결과에서 유의적인 차이가 나타나는 것을 확인하고자 자외선 조사 4주 이후부터 일주일 간격으로 피부측정을 진행하였다. 피부 측정 결과는 희생 전날 마지막으로 측정한 결과와 자외선 조사 전의 초기 피부를 비교한 값과 마지막 측정 결과를 그래프로 나타내었다.
피부 수분 보유량
도 2a는 본 발명의 실험군별 피부 수분 보유량을 나타낸 도이다.
도 2b는 본 발명의 실험군별 피부 수분 보유량의 변화량을 나타낸 도이다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 수분 보유량은 음성 대조군(CON)에서 정상 대조군(NOR) 대비 약 1.61배 유의적 감소를 나타냈으며, 모든 시료 투여군에서 CON 그룹 대비 수분 보유량이 증가하였다. 특히, GOS 그룹과 GOS/CTP 1:1 그룹의 수분보유량이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(p<0.05).
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 전과 후의 수분 보유량의 변화를 확인한 결과, CON 그룹은 NOR군 대비 유의적인 감소를 확인하였다. CTP 단독 처리군 및 GOS/CTP 1:1 그룹에서 수분 보유량의 변화가 유의적으로 증가하였으며, 특히 GOS/CTP 1:1 그룹은 NOR과 유사한 수준으로 수분 보유량의 변화가 확인되었다(p<0.05).
경표피 수분 손실량
도 3a는 본 발명의 실험군별 경피 수분 손실량을 나타낸 도이다.
도 3b는 본 발명의 실험군별 경표피 수분 손실량의 변화량을 나타낸 도이다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 경표피 수분 손실량은 음성 대조군(CON)이 정상 대조군(NOR) 대비 약 3.99배 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 모든 시료 투여군은 CON 대비 경표피 수분 손실량이 유의적으로 감소하였으며, 특히 GOS/CTP 1:1 처리군은 NOR 그룹과 유사한 수준으로 경표피 수분 손실량이 감소하였다(p<0.05).
또한, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 전과 후의 경표피 수분 손실량의 변화량을 확인한 결과, NOR 그룹을 제외한 UVB를 조사한 모든 군에서 모두 증가한 양상을 보였으며, 모든 시료 투여군은 CON군 대비 유의적인 감소를 나타냈다(p<0.05).
홍반 수치
도 4a에 나타낸 바와 같이, 홍반 수치는 NOR 그룹 대비 CON 그룹이 약 1.60배 유의적인 증가를 나타냈으며(p<0.05), 시료 투여 군에서의 홍반 수치는 CON 대비 유의적인 변화가 확인되지 않았다.
또한 도 4b에 나타낸 바와 같이, 자외선 조사 전과 후의 홍반 수치 변화량을 확인한 결과, NOR을 제외한 모든 UVB 조사 군에서 홍반 수치가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(p<0.05). 그 중 GOS와 CTP 단독, GOS/CTP 1:3 혼합그룹에서 CON군 대비 감소하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 확인되지 않았다.
상기 결과로부터 GOS 및 CTP를 단독 섭취군보다 GOS/CTP를 1:1 및 3:1의 혼합비율로 섭취하였을 때 수분 보유량, 경표피 수분 손실량 및 홍반 수치 모두에서 긍정적인 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 발명의 GOS 및 CTP의 혼합 조성물은 자외선에 의해 유발되는 피부 수분 손실 및 피부 장벽의 손상을 방지하고 피부 장벽기능이 정상적으로 작용할 수 있도록 도움을 줄 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 장기 무게
본 발명자들은 본 발명의 조성물이 장기 무게에 미치는 영향을 확인하고자, GOS 및 CTP 시료를 섭취하고 독성 및 이상 유무를 확인하기 위해 장기(간, 심장, 신장, 비장)를 적출을 하여 중량을 확인하였다. 실험이 종료되는 시점에 각 장기를 적출하였으며 적출한 간, 심장, 신장 및 비장의 무게(mg)는 각 실험군 쥐의 체중(g)을 고려하여 해당 무게를 산출하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.
mg/g of body weight liver heart kidney spleen
NOR 5.59±0.18 0.50±0.03 2.08±0.12 0.27±0.02
CON 5.86±0.13 0.60±0.05 1.97±0.11 0.34±0.02
GOS 5.49±0.31 0.50±0.01 1.93±0.09 0.31±0.03
CTP 4.94±0.16 0.48±0.01 1.91±0.06 0.14±0.01
1:3 5.27±0.33 0.56±0.01 2.08±0.10 0.12±0.01
1:1 5.14±0.10 0.50±0.02 1.92±0.07 0.12±0.01
3:1 4.37±0.25 0.46±0.03 1.76±0.10 0.11±0.01
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 신장 및 비장의 무게는 실험군들 사이의 유의적인 차이가 없었으며, 간과 심장의 무게는 유의적인 차이가 다소 있었으나 NOR 그룹과 비교하였을 때 상대적 차이는 없었다.
실시예 4: 피부의 육안 관찰 및 피부주형의 분석
본 발명자들은 본 발명의 조성물의 주름 개선효과를 확인하고자, 쥐의 등쪽 피부를 촬영하고, 주름 양상의 분석을 위해 Visioline(VL650; CK electronic GmbH, Germany)를 사용하여 얻은 replica를 이용하여 주름의 면적, 수, 길이, 깊이 등을 분석하였다. 결과는 도 5 및 도 6a-6b에 나타내었다.
도 6a-6b를 통해 주름 양상의 지표를 분석한 결과, 음성 대조군(CON)은 주름 면적과 깊이가 정상대조군(NOR) 대비 유의적으로 증가하였다(p<0.05). 또한, 본 발명의 조성물을 투여시 주름 양상의 지표가 CON 대비 유의적으로 감소되는 경향을 확인하였으며, 특히 조성물 중 GOS/CTP 1:3 혼합 처리군에서 주름의 면적과 최대 깊이가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(p<0.05).
이를 통하여 본 발명의 GOS와 GOS 및 CTP의 혼합조성물을 섭취 시 UVB에 의한 주름 생성에 대한 억제 효과가 있다는 것을 확인하였으며, 특히 GOS와 CTP를 1:3의 비율로 혼합하여 섭취 시 주름 개선에 유의적인 효과를 확인하였다.
상기 결과로부터, 자외선에 의해 생성된 피부의 주름이 GOS와 CTP를 단독으로 섭취시에도 감소하나 GOS/CTP 1:3의 비율로 혼합하여 섭취했을 때 광노화로 생성된 주름을 가장 유의적으로 감소시키는 효과를 확인하였다.
실시예 5: 피부의 조직병리학적 분석 - 표피의 두께 및 콜라겐 측정
본 발명자들은 본 발명의 조성물이 표피 두께 및 콜라겐 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 자외선 조사 및 조성물 투여 실험 종료 후 모든 쥐의 등 쪽 피부를 채취하여 10% formalin에 넣은 후, 조직병리학적인 변화를 확인할 수 있는 hematoxylin and eosin(H&E) 염색, 및 진피(Dermis)에 존재하는 콜라겐을 확인할 수 있는 immunohistochemistry(IHC)염색을 수행하였다. 염색이 완료된 조직을 광학현미경을 이용하여 사진을 찍어 이미지화 한 후, 분석하였다.
도 7-8에 나타낸 바와 같이, H&E 염색 결과, 정상 대조군(NOR)에 비해 UVB 조사 군의 표피(epidermis)의 두께가 유의적으로 증가된 것을 확인하였다(p<0.05). 또한, 전체 시료 투여군에서 CON군 대비 표피 두께가 유의적으로 감소했으며, 특히 GOS/CTP 1:1, 3:1 혼합 처리군의 표피의 두께가 단독 물질 처리군 보다 유의적으로 감소한 경향을 나타냄을 확인하였다(p<0.05).
본 실험에서 피부 조직의 병리학적 관찰 결과, UV 조사군은 대조군 대비 약 4배 정도 표피의 두께가 증가하였으며, GOS 및 CTP 단독 처리보다 혼합처리군에서 두께가 줄어드는 양상을 관찰할 수 있었다(도 7-8).
또한, 콜라겐에 대한 IHC 염색 결과, 정상 대조군(NOR)에 비해 음성 대조군(CON)의 진피(dermis) 내 콜라겐 비율이 유의적으로 감소한 것을 확인하였음(p<0.05, Fig. 7). 전체 시료 투여군에서 CON군 대비 진피 내 콜라겐 비율이 유의적으로 증가했으며, 특히 GOS/CTP 1:3 혼합 처리군의 진피 내 콜라겐 비율이 가장 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
실시예 6: 엘라스틴( Elastin ) 측정
피부 진피의 구성물질인 엘라스틴은 피부조직의 탄력에 영향을 미치는 탄력질로, 피부가 광노화 되었을 때 그 수와 직경이 감소하며 피부탄력을 감소시키게 된다. 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 피부 탄력에 미치는 영향을 확인하고자, 각 실험군별로 10 mg 가량의 피부조직을 추출한 뒤 Fastin Elastin assay(F2000; Biocolor, UK)에서 제공한 방법을 이용하여 피부조직 내의 엘라스틴 양을 측정하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물 투여군은 CON 그룹과 비교하였을 때 모두 엘라스틴 함량이 증가하는 경향을 나타냈으며, 특히 GOS/CTP 3:1 혼합물 처리시 CON군 대비 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
상기 결과로부터 본 발명의 GOS 단독 조성물 뿐만 아니라, GOS와 CTP를 모두 포함하는 조성물, 특히 GOS/CTP를 3:1의 혼합 비율로 포함하는 조성물을 경구 섭취할 경우 UV에 의해 감소된 엘라스틴의 함량을 증강시켜 피부의 진피층 그물망 구조를 개선을 통해 탄력 증진 효과를 기대할 수 있는 것을 확인하였다.
실시예 7: qRT - PCR을 이용한 피부 관련 유전자 발현량 분석
본 발명자들은 본 발명의 조성물이 피부 상태와 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, 제1형 콜라겐, MMP(Matrix metalloproteinase)2/3/9, TIMP1/2, 히알루론산 가수분해효소(hyaluronidase, HYAL), NF-K의 발현량을 GAPDH와 비교하여 측정하였다.
구체적으로, 본 발명의 조성물을 투여한 각 실험군의 마우스로부터 100 mg 가량의 피부 조직을 채취하고, TRIzol 시약을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA에 50 μM Oligo-(dT) primer와 10 mM dNTP mix를 넣어 65°C에서 5분 반응시킨 후 5X RT Buffer, 0.1 M DTT, RNaseOUT, SuperScript III, 25 mM MgCl2를 혼합하여 넣고 50°C에서 50분, 85°C에서 5분 조건으로 반응시켰다. RNase H를 넣고 37°C에서 20분 반응시켜 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. PCR을 수행하기 위해서 합성한 cDNA 1 μL에 primer 및 SYBR green gene expression master mix와 DEPC water를 혼합하고 qPCR을 수행하였다. 각 타겟 유전자 별 프라이머는 도 3에 나타내었다. 각 타겟 유전자의 발현량은 NOR 그룹 대비 상대적인 발현량으로 나타냈다.
타겟 유전자 구분 PCR 프라이머 서열 (5' to 3') 서열번호
MMP2 F CAA GGA TGG ACT CCT GGC ACA T 1
R TAC TCG CCA TCA GCG TTC CCA T 2
MMP3 F TTC TGG GCT ATA CGA GGG CA 3
R CTT CTT CAC GGT TGC AGG GA 4
MMP9 F GCT GAC TAC GAT AAG GAC GGC A 5
R TAG TGG TGC AGG CAG AGT AGG A 6
TIMP1 F TCT TGG TTC CCT GGC GTA CTC T 7
R GTG AGT GTC ACT CTC CAG TTT GC 8
TIMP2 F AGC CAA AGC AGT GAG CGA GAA G 9
R GCC GTG TAG ATA AAC TCG ATG TC 10
COL1a1 F CCT CAG GGT ATT GCT GGA CAA C 11
R CAG AAG GAC CTT GTT TGC CAG G 12
HYAL F AAG TAC CAA GGA ATC ATG CC 13
R CTC AGG ATA ACT TGG ATG GC 14
NF-Kb F TTG TGC CAA GAG TGA TGA CG 15
R CTG AAA TCC CAT GTC CTG CT 16
GAPDH F CAT CAC TGC CAC CCA GAA GAC TG 17
R ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AG 18
Metalloproteinases ( MMPs )
콜라겐 분해효소 MMP 2의 유전자 발현량을 측정한 결과, CON 그룹은 NOR 그룹 대비 약 1.21배 증가하였으며, 시료를 투여한 모든 군에서 MMP 2의 발현량이 감소하는 경향을 나타내었다(도 12). 특히, GOS와 CTP 단독 및 GOS/CTP 3:1 혼합물 처리군에서 CON 대비 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
MMP 3의 유전자 발현량을 측정한 결과, GOS 단독 및 GOS/CTP 3:1 혼합물 처리군에서 MMP 3 발현량이 CON 그룹 대비 감소하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 확인되지 않았다(도 13).
피부조직의 세포외기질 분해능의 지표를 관찰하기 위하여 MMP 9의 유전자 발현량을 측정한 결과, NOR 그룹 대비 CON 그룹이 약 6.31배 유의적으로 증가하였으며, CON 그룹 대비 전체 시료 투여 군에서 MMP 9의 유전자 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인함(p<0.05, 도 14). 시료 투여군 중 GOS 및 CTP 단독 처리군보다 GOS/CTP 혼합물 처리군에서 발현량이 감소하였으며, 특히 3:1 혼합물 처리시 CON 대비 유의적으로 감소하여 NOR군과 유사한 수준을 나타냄(p<0.05).
MMP 13의 유전자 발현량의 경우, NOR 그룹 대비 CON 그룹이 약 5.42배 유의적으로 증가하였으며, CON 그룹 대비 전체 시료 투여 군에서 MMP 13의 유전자 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(p<0.05, 도 15). 특히 GOS/CTP 1:1 및 3:1 혼합물 처리시 CON 대비 유의적으로 감소하여 NOR군과 유사한 수준을 나타냈다(p<0.05).
상기 결과로부터, 광노화로 유발된 MMPs의 발현이 GOS와 CTP 단독 처리보다 혼합처리에 의해 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 광노화시 주름 생성에 중요한 역할을 하고 있는 MMP-13의 유전자 발현은 GOS/CTP 1:1 처리군에서 유의적 감소를 확인하였다.
Tissue inhibitor of metalloproteinases ( TIMPs )
TIMP 1의 유전자 발현량을 측정한 결과, 모든 시료 투여군에서 CON 그룹 대비 TIMP 1의 발현량이 유의적으로 증가하였다(p<0.05, 도 16). 특히, GOS, CTP 단독 및 GOS/CTP 1:3 혼합물 처리군에서 TIMP 1 발현량이 CON 대비 유의적으로 증가하였다(p<0.05, 도 16).
TIMP 2 발현량의 경우, 시료 처리군에서 CON 그룹 대비 TIMP 2의 발현량이 증가하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 17).
상기 결과로부터, 본 발명의 GOS를 포함하는 조성물과, GOS 및 CTP를 포함하는 조성물은 특히 TIMP 1의 발현을 촉진시킴으로써 MMPs의 활성과 이에 의한 세포외 기질 단백질의 분해를 감소시키고 결과적으로 광노화에 의한 주름 생성을 억제하는 것을 알 수 있다.
Collagen typeⅠ( COL1a1 )
도 18에 나타낸 바와 같이, COL1a1의 유전자 발현량을 측정한 결과, CON 그룹은 NOR군과 비교하여 차이는 나타나지 않았으며, 본 발명의 조성물 처리군에서 COL1Al의 발현량이 증가하는 경향을 나타냈다. 특히, GOS/CTP를 1:3의 비율로 혼합한 조성물을 처리시 제1형 콜라겐의 발현량이 CON 그룹 대비 약 1.22배로 유의적인 증가를 나타냄을 확인하였다(p<0.05).
피부 결합조직에는 세포외 기질 단백질 중 I형 콜라겐이 가장 많이 존재하며, 그 밖에 엘라스틴, 파이브로넥틴, 인테그린, 피브릴린, 프로테오글리칸 등이 존재한다. 새롭게 합성된 프로콜라겐은 효소반응을 거쳐 피부세포의 세포외 공간으로 분비되어 삼중나선구조의 microfibril을 형성하고, 이들은 콜라겐 섬유를 형성하게 되어 피부의 결합성과 탄력성을 갖게 한다.
광노화 혹은 내인성 노화에 따라 진피층 콜라겐 섬유가 감소되면 피부조직의 함몰을 유발하게 되어 주름이 발생하게 되고 피부가 처지고 탄성도 잃어버리게 된다.
상기 결과로부터, 본 발명의 GOS 조성물과 GOS 및 와 CTP 처리에 의해 I형 콜라겐 유전자 발현량이 증가되는 결과를 통해 주름 개선 및 탄성 증진에 효과가 있을 것으로 판단된다.
Hyaluronidase ( HYAL )
도 19는 본 발명의 실험군 별로 피부 조직의 히알루론산 분해 효소의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
히알루론산 분해 효소인 HYAL의 유전자 발현량을 측정한 결과, CON 그룹이 NOR 그룹 대비 약 1.30배 유의적으로 증가하였으며, 모든 조성물 투여 군에서 감소하는 경향을 나타냈다(도 19). 특히, GOS/CTP 1:3의 비율로 포함하는 혼합 조성물을 처리시 HYAL 발현량은 CON 그룹 대비 약 0.61배 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(p<0.05).
실시예 8: ELISA을 이용한 염증관련 사이토카인 분석
본 발명자들은 본 발명의 조성물의 면역기능 개선 또는 항염증 효과를 확인하고자, 각 실험군 별로 피부 조직을 채취하여 염증성 사이토카인들인 IL-6, IL-12, TNF-α의 함량을 ELISA kit(BD Bioscience, San Jose, CA)를 사용하여 측정하였다. 조직 추출물에서 BCA법을 통해 단백질 양을 분석하여 염증관련 사이토카인을 단백질 mg당 함량으로 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, Interleukin-6(IL-6)의 경우 정상대조군(NOR) 대비 음성대조군(CON)이 유의적으로 증가하였으며, GOS/CTP 1:3 혼합 처리군에서 CON 대비 IL-6의 함량이 감소된 것을 확인하였다(p<0.05).
또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, Interleukin-12(IL-12)의 함량을 측정한 결과, 음성대조군(CON)이 양성대조군(NOR)과 비교하여 유의적으로 증가하였으며, 모든 조성물 투여 군에서 CON 대비 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(p<0.05). 모든 혼합 조성물에서 IL-12의 분비량 감소의 면에서 시너지 효과가 확인되었고, 특히 GOS/CTP 1:3 혼합 처리군에서 IL-12의 함량이 가장 많이 감소하는 것을 확인하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, TNF-α를 측정한 결과, 음성대조군(CON)이 정상대조군(NOR) 대비 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(p<0.05). 또한 모든 조성물 투여군에서 음성대조군(CON) 대비 TNF-α 함량이 유의적으로 감소하였으며, 모든 혼합 조성물에서 TNF-α의 분비량 감소의 면에서 시너지 효과가 확인되었다. 특히 GOS/CTP 혼합 투여군에서 유의적인 효과를 확인하였다(p<0.05).
상기 결과로부터, 모든 조성물 투여 군에서 전염증성 사이토카인인 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 감소가 나타나는 것을 확인하였고, 특히 GOS/CTP를 혼합으로 투여하였을 때 사이토카인의 감소가 시너지 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 GOS를 포함하는 조성물 및 GOS 및 CTP을 포함하는 조성물은 피부의 염증반응을 감소시켜 면역기능 개선 또는 항염증용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 GOS 및 CTP를 1:3~3:1의 모든 범위 내에서 시너지 효과를 나타낸다.
실시예 9: GC을 이용한 short-chain fatty acid( SCFA ) 분석
마우스의 맹장을 적출하여 메탄올을 이용한 추출물을 GC컬럼(DB-FFAP 123-3253, 50 mХ0.32 mmХ0.50 μM)이 장착된 gas chromatography(Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하여 SCFA를 분석하였다. 컬럼 온도는 100°C에서 1분 유지한 후, 180°C까지 8°C/min 속도로 증가시킨 다음, 200°C까지 20°C/min 속도로 증가시킨 후 200°C에서 5분으로 정체되도록 설정하였다. Acetic acid, propionic acid 및 butyric acid의 표준물질을 통해 맹장내 SCFA 함량을 분석하였다.
결과는 도 23 내지 도 27에 나타내었다.
단쇄 지방산 생성에 대한 GOS 및 CTP시료의 영향을 gas chromatography를 이용하여 분석한 결과 아세트산의 경우 음성대조군(CON)이 정상대조군(NOR)에 비해 유의적으로 감소하였다(도 23). 반면에 GOS/CTP 1:1 혼합물 처리군에서는 CON군 대비 농도 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
프로피온산 함량은 음성대조군(CON)에서 정상대조군(NOR) 대비 감소하였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다(도 24). GOS, CTP 단독 처리군에서 CON군 대비 프로피온산의 함량이 증가하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
부티르산 함량은 음성대조군(CON)이 정상대조군(NOR)에 비해 감소하였다(도 25). GOS/CTP 3:1 혼합물 처리군을 제외한 나머지 그룹에서 CON군 대비 증가하였으며, 특히 GOS 및 CTP 단독처리군에서 유의적인 증가를 나타냄(p<0.05).
발레르산 함량은 음성대조군(CON)에서 정상대조군(NOR) 대비 감소하는 경향을 보였으며(도 26), 시료 그룹 중 CTP 단독처리군에서 CON 대비 유의적인 발레르산 함량 증가를 확인하였다(p<0.05).
총 단쇄지방산 함량을 분석한 결과 음성대조군(CON)은 정상대조군(NOR)과 비교하여 유의적으로 낮은 함량을 보였으며, GOS 단독 처리군은 CON군과 비교하여 유의적으로 높은 함량을 보였고(p<0.05), CTP 단독 및 GOS/CTP 1:1 혼합물 처리군에서 증가하는 경향을 확인하였다(도 27).
장내 미생물들은 장내에서 식이섬유를 발효시켜 단쇄지방산들, 주로 아세트산, 프로피온산, 부티르산을 생성하며 단쇄지방산은 장 점막으로부터 빨리 흡수되어 대장점막세포의 주요한 에너지원으로 이용되는 것으로 알려져 있다(Thompson DB, 2000).
본 연구 결과, 광노화로 인해 단쇄지방산들이 유의적으로 감소하여 피부와 장내 미생물간의 상호관계를 확인하였으며, 이러한 감소는 GOS 및 CTP 섭취에 의해 증가하여 장내 환경 개선 및 피부 보호 효과와 함께 그 상관관계를 확인하였다. 추후 연구를 통해 장내 균총 변화를 분석해 피부와 장내 미생물간 및 GOS와 CTP 섭취가 장내 환경 변화에 미치는 영향을 평가하고자 한다.
실시예 10: 장내 균총 변화 분석
마우스의 맹장을 적출하여 i-게놈 클리닉 DNA 추출 키트를 사용하여 추출하고, 16S rRNA 라이브러리는 Illumina 16S V3~V4 Amplicon(Illumina, San Diego, CA, USA)의 프로토콜을 통해 구성하였다. DNA 추출물을 사용하여 첫 번째 중합 효소 연쇄 반응(PCR-1)으로 16S rRNA V3~V4 영역을 증폭하고, PCR 산물을 Agencourt AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA, USA)를 사용하여 정제하여 세정된 앰플리콘으로 정량화하였다. PCR 생성물을 Illumina 이중 인덱스 어댑터 서열을 갖는 제2 PCR(PCR-II)의 주형으로 사용하여 최종 앰플리콘 라이브러리는 v3, 600 사이클 키트 및 301 염기쌍 말단 화학을 사용하여 Illumina MiSeq에서 시퀀싱을 진행하였다. QIIME 2 소프트웨어를 통해 서열 데이터 분석을 진행한 후 품질 필터링을 수행하였다. QIIME 파이프 라인에서 동종 중합체를 제거하고, 대표 서열 세트를 유사성 수준 97.0%에서 UCLUST를 사용하여 선택하고 클러스터링을 진행하였다. 서열의 작동 분류 단위(OTU)를 분석하고, 알파 다양성 분석에는 Richness, Shannon Index 및 Abundance-based Coverage Estimator(ACE) 인덱스를 포함하였다. 그룹 내 및 그룹 간 베타 다양성은 UniFrac 측정 거리를 분석하며, 이 결과는 주 좌표
분석(PCoA)로 표현하였다. 장내 균총 조성(OTU)과 동일한 그룹에서 변수는 평균 간의 상관 관계를 피어슨의 상관 관계를 사용하여 확인하였다. Kruskal-Wallis 테스트를 수행하여 장내 균총의 다양성과 상대 풍부도의 차이를 분석하며, 베타 다양성의 차이는 ANOSIM 및 순열 다변량 분석 분석(PERMANOVA) 테스트로 분석하였다.
마이크로바이옴 분석(Alpha diversity summary)
Sample name OTUs ACE CHAO Jackknife
NOR 1 595 683.32 667.23 705.13
NOR 2 658 706.74 699.64 737
NOR 3 712 773.93 759.5 807
CON 1 592 653.31 642.7 682
CON 2 742 827.06 804.16 854
CON 3 727 806.72 802.37 838.69
GOS1 624 695.04 684.6 726
GOS2 613 681.21 670.99 708
GOS3 677 747.72 745.24 778.55
CTP1 611 688.92 677.25 717
CTP2 665 723.52 722.55 752
CTP3 733 821.20 816.38 852.19
GOS/CTP 1:3 (1) 606 679.37 678.14 710.12
GOS/CTP 1:3 (2) 723 776.36 759.4 804
GOS/CTP 1:3 (3) 570 655.82 693.68 805.62
GOS/CTP 1:1 (1) 608 691.31 680.27 714.72
GOS/CTP 1:1 (2) 663 732.80 729.23 757.65
GOS/CTP 1:1 (3) 688 780.67 790.06 833.56
GOS/CTP 3:1 (1) 610 702.50 704.25 730.08
GOS/CTP 3:1 (2) 640 700.14 697.55 727
GOS/CTP 3:1 (3) 675 741.76 744.72 777.07
NOR: normal group; CON: UVB-control group. Data are expressed as means ± standard error (n=6) and the different letters indicate significant differences at p<0.05 by Tukey's test.
Sample name NPShannon Shannon Simpson Phylogenetic Diversity Good's coverage of library(%)
NOR 1 4.03 4.01 0.06 803 99.71
NOR 2 4.15 4.15 0.05 927 99.89
NOR 3 4.04 4.02 0.09 920 99.83
CON 1 4.51 4.49 0.03 794 99.75
CON 2 4.32 4.31 0.05 930 99.81
CON 3 4.26 4.25 0.06 928 99.82
GOS1 4.39 4.37 0.04 827 99.71
GOS2 3.66 3.65 0.09 872 99.86
GOS3 3.91 3.9 0.08 911 99.86
CTP1 4.26 4.25 0.06 856 99.71
CTP2 4.2 4.19 0.05 931 99.89
CTP3 4.42 4.41 0.04 968 99.81
GOS/CTP 1:3 (1) 4.55 4.53 0.03 821 99.72
GOS/CTP 1:3 (2) 4.71 4.7 0.02 989 99.89
GOS/CTP 1:3 (3) 3.36 3.35 0.1 788 99.78
GOS/CTP 1:1 (1) 4.64 4.62 0.03 825 99.71
GOS/CTP 1:1 (2) 4.49 4.49 0.04 959 99.88
GOS/CTP 1:1 (3) 4.65 4.64 0.03 937 99.81
GOS/CTP 3:1 (1) 4.08 4.06 0.07 833 99.71
GOS/CTP 3:1 (2) 4.07 4.06 0.06 885 99.87
GOS/CTP 3:1 (3) 3.69 3.68 0.1 905 99.83
NOR: normal group; CON: UVB-control group. Data are expressed as means ± standard error (n=6) and the different letters indicate significant differences at p<0.05 by Tukey's test.표 4 및 표 5는 21개 시료에 대한 군집분석의 alpha diversity의 전체적인 요약을 나타낸다. 각 분석 값의 평균은 OTUs 653.90, ACE 727.12, CHAO 722.38, Jackknife 762.73, NPShannon 4.21, Shannon 4.20, Simpson 0.06, phylogenetic diversity 886.14, good's coverage of library(%) 99.80로 조사되었다.
속 (Genus) 수준의 세균 군집비교
속 수준의 세균 군집분석결과 470 taxa가 조사되었으며 대표되는 50 taxa로 도 28과 같이 도식화 하였다. 분석시료 내 세균 군집의 조성을 출현한 속 순으로 나열하면 다음과 같았다.
Akkemansia, PAC000661_g, Eubacterium_g23, PAC000664_g, PAC000198_g, Sporobacter, Bacteroides, Lactobacillus, Pseudoflavonifractor, Eubacterium_g17, PAC002367_g, Parabacteroides, Oscillibacter, Ruminococcus.
속 수준의 상위 20개 taxa중 Verrucomicrobia문에 해당하는 Akkermansia 속은 10개 시료(N1, CTP1, CTP2, CTP3, GOS/CTP 1:3 (1), (3), GOS/CTP 1:1 (1), (2), GOS/CTP 3:1 (1), (3)) 시료에서 10% 이상 검출되었으며, GOS/CTP 1:3 (3) 시료에서 22.77% 검출되었다. 반면 CON 시료들은 모두 0.2% 이하로 검출되어 시료들 중 가장 낮은 수치를 나타냈다.
Bacteroides 속은 7개의 시료(N2, GOS1, 2, CTP3, GOS/CTP 1:3 (3), GOS/CTP 3:1 (1), (3)) 시료에서 10% 이상 검출되었다. Akkermansia 속과 마찬가지로 GOS/CTP 1:3 (3) 시료에서 28.73%로 검출되어 가장 높은 수치를 나타냈으며, CON1에서 3.11%로 가장 낮게 검출되었다.
시료 간 유연관계 비교
PCoA 분석
GOS와 CTP의 피부 및 장 건강 기능성 마이크로바이옴 유연관계 분석을 위해 속 수준의 군집결과를 Unifrac로 distance metrics를 사용하여 principal coordinate analysis(PCoA: 주성분)분석을 수행하였다(도 29). 21개의 시료의 군집은 scatter 되어 있으며, 특이적인 그룹을 형성하지 않았다.
UPGMA 분석
UPGMA clustering 분석결과 각 그룹 내에서 군집조성이 유사한 시료와 상이한 시료를 확인하였음(도 30). 상대적으로 NOR, CON, GOS 그룹, 특히 NOR과 GOS 그룹 간의 군집 조성이 유사하며, CTP 그룹과 GOS/CTP 혼합그룹 간의 군집 조성이 유사한 것으로 조사되었다.
장내 미생물의 균총의 변화
Bacteroidetes와 Firmicutes의 변화
GOS/CTP 혼합물의 경구투여에 따른 phylum(문)에서의 Bacteroidetes와 Firmicutes의 변화를 각각 측정하였다(도 31 내지 도 33). 인간의 장내 미생물총은 50가지 이상의 다른 종류의 phylum(문), 1000개 이상의 다른 species(종)의 세균이 있다. 이 중 주종을 이루는 5가지 phylum은 Lactobacillus가 속한 Firmicutes, Bacteroidetes, Bidifobacterium이 속한 Actinobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia가 있고, 이중에서도 Bacteroides와 Firmicutes의 두 가지 phylum이 주종을 이루어 정상 장내 미생물의 80% 이상을 차지하고 있다. 그리고 이러한 미생물 종의 다양성에도 불구하고 18개의 핵심종만이 모든 개체에 존재한다. 또한 두 가지 주종을 이루는 phylum의 비율은 개체마다 다르고, Firmicutes:Bacteroides비가 질병이 있는 환자에서 변화됨이 관찰되어 질병 발생과 관련성이 있는 것으로 판단된다.
Firmicutes/Bacteroidetes 비율은 장내 세균총의 다양성이 감소 및 증가되었다는 지표로 사용되고 있으며, 과민성 장증후군 환자에서 장내 미생물의 다양성이 감소되어 있고 Bifidobacterium과 Lactobaciilus가 감소된 소견을 보이며, Fermicutes: Bacteroides 비가 증가하는 경향을 나타낸다(Kim et al., 2013; Hong and Rhee, 2014; Tojo et al., 2014; Dupont, 2014).
광노화 모델에서 GOS, CTP 단독 또는 GOS/CTP 혼합물 경구투여시 Firmicutes는 GOS 투여시 감소하였으며, Firmicutes/Bacteroidetes 비율 역시 감소하는 경향을 보였다. CTP투여시 F/B 비율이 증가하는 경향을 보이나 CON 대비 유의적인 차이는 나지 않았으며, GOS/CTP 혼합물에서는 GOS의 농도가 높아지면 F/B 비율이 감소하였다. 이러한 결과는 GOS의 투여는 장내환경 개선에 관여하는 것으로 추정된다.
유산균의 변화
GOS/CTP 섭취에 따른 장내 미생물 중 lactic acid bacteria에 대한 변화를 측정하였으며 전체 유산균 중 Lactobacillus 와 Bifidobacterium이 주요 균주로 확인되었다. GOS 투여시 Bifidobacterium의 증가하는 경향을 보였다. 한편 GOS/CTP 1:3 혼합물 투여시 Bifidobacterium이 CON그룹 대비 유의적인 증가를 나타냈다(p<0.05). 유산균에 속하는 Lactobacillus 종의 변화는 각 군당 유의적인 차이가 없었다. Lactococcus 종의 변화는 GOS 투여로 인해 증가하는 경향을 보였으며, GOS/CTP 혼합물에서는 1:1 투여군을 제외하고 오히려 CON그룹 대비 감소하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 없었다.
인간 장내 미생물의 변화
인간 장내에서 관찰되는 대표적인 미생물의 변화를 측정한 결과는 도 38 내지 46과 같았다.
인간 유래 장내 문(phylum)과 과(family)에 속하는 미생물의 변화를 측정하였다. Proteobacteria는 문(phylum)에 속하는 미생물로 건강한 장에서는 낮은 수준 관찰되는 미생물이며, GOS/CTP 혼합물 투여시 증가하는 경향을 보이며 특히 1:3 그룹에서 CON 그룹대비 유의적인 증가를 확인하였다(p<0.05). Christensenellaceae 장내 세균은 날씬한 쌍둥이에서 주로 발견되었으며, 쥐에게 이 Christensenellaceae 장내세균을 주입하자, 비만을 유발하도록 하는 고지방의 영양분이 풍부한 먹이를 먹고도 살이 찌지 않았다는 보고가 있으나 시료 처리군에서는 오히려 정상대조군(NOR) 보다 감소하는 경향을 보였다. 노년기가 되면 장내 미생물무리의 다양성이 감소하는 것으로 알려져 있다(O'Toole and Claesson, 2010). 즉, Bifidobacteriaceae의 수가 감소하고, Enterobacteriaceae는 증가한다고 알려져 있다(Woodmansey, 2007; Claesson et al., 2011).
본 발명의 GOS/CTP 혼합물 투여군, 특히 1:3과 3:1그룹에서 이러한 Enterobacteriaceae는 감소하는 경향을 나타내었다.
도 38 내지 도 42은 본 발명의 각 실험군 별 장내 마이크로바이옴 중 장내 미생물의 문(phylum) 및 과(family) 분포를 나타낸 도이다.
대체로 Proteobacteria는 낮고, 반면에 Bacteriordes, Provotella, Ruminococcus는 풍부한 것이 건강한 장내 미생물 조성이라 여겨진다(Kim et al., 2013; Tojo et al., 2014). Bacteroidetes문에 포함되는 속(屬, Genus)에는 Bacteroides, Prevotella, Xylanibacter가 있는데, 이들은 다양한 종류의 glycan 복합체를 분해할 수 있다. GOS 및 CTP 투여로 인해 Ruminococcus의 수가 대체적으로 증가하는 경향을 나타냈으며, 특히 GOS/CTP 1:1 혼합물 투여군에서 NOR그룹 대비 유의적인 증가를 나타냈다(p<0.05).
대장내 분포하는 균의 우세종에 따라 개인을 분류(enterotype)하기도 하는데, Bacteroides 가 우세한 enterotype 1, Prevotella 가 우세한 enterotype 2, Ruminococcus 가 우세한 enterotype 3의 3가지 enterotype으로 분류할 수 있다. 분류된 enterotype의 분포 양상이 섭취 식이나 유전적인 차이 및 거주지역에 따라 차이를 보이는 것으로 알려져 있지만 그 의미에 대해서는 아직까지 논란이 있다(Bennet et al., 2015; Eupont, 2014).
인간 장내에서 관찰되는 대표적인 미생물(genus)의 변화를 측정한 결과는 도 43 내지 도 46과 같았다. Akkemansia는 NOR그룹 대비 UV대조군(CON)에서 감소하였으며, 시료 처리군에서 증가하여 NOR그룹과 유사한 수준을 나타냈다. 한편 Blautia는 CON 그룹에서 유의적으로 증가하며, 시료 처리시 대부분 감소하는 경향을 확인하였으며, Bacteroides와 Clostridium은 시료간 유의적인 차이는 확인되지 않았다. GOS/CTP 혼합물 섭취시의 장내 균총의 변화를 확인하였으며, GOS 투여시 Firmicutes/Bacteroidetes의 비율이 다소 개선되는 효과를 보였으며, 광노화 모델에서 피부 개선 효과를 나타낸 GOS/CTP 혼합물 투여군에서 증가된 장내 유산균을 확인하였다.
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  3. 갈락토 올리고당(galacto-oligosaccharide, GOS) 및 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 유효성분으로 포함하는 광노화에 의한 피부주름 개선용 식품조성물에 있어서, 상기 갈락토 올리고당 및 콜라겐 트리펩타이드의 중량비율 GOS:CTP는 1:3인, 조성물.
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