KR102227648B1 - B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

B형 인플루엔자 바이러스를 특이적이며 또한 종래법보다 고감도로 검출할 수 있는 면역 측정에 의한 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법 및 그를 위한 기구 또는 키트가 개시되어 있다. B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법은 B형 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M1)의 125~248번째의 아미노산 영역과 각각 특이적으로 반응하는 2종류의 단일 클론 항체이며, 동시에 M1의 125~248번째의 아미노산 영역에 결합할 수 있는 2종류의 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용하는 샌드위치법에 의해 B형 인플루엔자 바이러스를 면역 측정하는 것을 포함한다.

Description

B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법{METHOD FOR MEASURING INFLUENZA B VIRUS}
본 발명은 면역 측정에 의한 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법 및 그를 위한 기구 또는 키트에 관한 것이다.
인플루엔자는 동절기에 유행하는 감염증이며, 고열, 상기도염, 권태감 등의 임상 증상을 보이지만 그들의 증상만으로는 아데노, RS, 파라인플루엔자, 인간 메타뉴모 등 다른 바이러스에 기인하는 감염증과 구별하는 것은 반드시 용이하지는 않다.
인플루엔자의 확정 진단법으로서는 바이러스 분리, 혈청학적 진단, 핵산검출(PCR법) 등이 있지만, 이들 방법은 진찰실 등의 일상 의료 현장에서 간단히 행해지는 것이 아니기 때문에 보다 간편한 진단 방법이 요구되어 있었다. 최근이 되어 간편성과 신속성을 겸비한 면역 크로마토그래피법을 원리로 하는 항원 검출 시약이 개발되자 널리 진단 보조에 이용되도록 되었다.
그러나, B형 인플루엔자에서는 A형 인플루엔자에 비해 환자로부터 채취된 검체에 포함되는 바이러스량이 적어 항원 검출 시약을 사용했을 경우에 A형보다 검출 감도가 낮은 것이 지적되어 있다(비특허문헌 1).
인플루엔자 바이러스는 분절상의 마이너스쇄 RNA를 게놈 유전자로 하는 바이러스이며, HA, NA, PA, PB1, PB2, M, NP, NS의 8분절로 이루어진다. 인플루엔자 바이러스는 구성하는 단백질 중, 매트릭스 단백질(M1)과 핵단백질(NP)의 항원성의 차이에 의해 A형, B형 및 C형으로 분류된다. 상기 단백질은 항원성이 각각 상이하기 때문에 상이한 형태 사이에서 교차 반응을 나타내지 않는다.
B형 인플루엔자는 바이러스 형태 및 임상 증상으로부터는 A형 인플루엔자와 구별이 되지 않지만, A형과 마찬가지로 인간 인플루엔자의 병원체로서 중요하다.
B형 인플루엔자 바이러스의 M분절에는 M1과 BM2라는 상이한 2개의 유전자가 코딩되어 있으며, 각각으로부터 구성 단백질이 합성된다. 이들 단백질은 A형 인플루엔자 바이러스의 M1과 M2에 상당하지만, B형의 BM2는 A형의 M2와 구조가 크게 다르다. M1은 바이러스막의 내측을 라이닝하는 형태로 국재되어 있고, 이것이 실질적인 쉘의 역할을 하고 있는 것으로 여겨져 있다.
인플루엔자에 대한 치료약으로서 오셀타미비르인산염, 자나미비르 수화물, 페라미비르 수화물, 라니나미비르옥탄산 에스테르 수화물, 아만타딘염산염이 사용되고 있지만, M2 저해제인 아만타딘염산염은 B형 인플루엔자 바이러스의 감염 증식을 저해하지 않기 때문에 A형 인플루엔자의 치료에만 사용된다. 또한, 앞의 4개는 노이라미니다제(NA) 저해제로서 동일 작용점을 나타내는 치료약이지만, 인플루엔자의 형태에 따라 해열 시간이나 바이러스 잔존율 등의 유효성에 차이가 있는 것이 지적되어 있다(비특허문헌 2). 따라서, 인플루엔자의 형태의 감별은 그 후의 적절한 치료약 선택을 위해서 중요하다.
종래 인플루엔자의 검출에는 항 NP 항체(특허문헌 1~3), 항 M2 항체(특허문헌 4) 등이 사용되어 있었지만, M1과 특이적으로 반응하는 항 M1 항체는 사용되어 있지 않았다.
일본 특허공개 2007-285749 일본 특허 4936428 WO 2005/007698 일본 특허 4932940
바이러스 제 56 권 제 1 호, pp.109-116, 2006(인플루엔자의 진단과 치료) J Infect. 2008 Jan; 56(1):51-7. Epub 2007 Oct 15.(A comparison of the effectiveness of zanamivir and oseltamivir for the treatment of influenza A and B.) Orthobyxoviridae, Fields Virology. 4th edition. 2001
종래의 면역 측정법에서는 항 NP 단일 클론 항체 등이 사용되어 있었지만, B형 인플루엔자 바이러스에 대한 반응성이 낮아 보다 반응성이 높은 항체가 요구되어 있었다.
본 발명의 목적은 B형 인플루엔자 바이러스를 특이적이며 또한 종래법보다 고감도로 검출할 수 있는 면역 측정에 의한 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법, 및 그를 위한 기구 또는 키트를 제공하는 것이다.
본원발명자들은 예의 연구의 결과, B형 인플루엔자 바이러스의 M1 단백질의 특정 영역을 에피토프로 하는 2종류의 단일 클론 항체를 사용한 샌드위치법에 의해 B형 인플루엔자 바이러스를 특이적이며 또한 종래법보다 고감도로 검출할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은 B형 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M1)의 125~248번째의 아미노산 영역과 각각 특이적으로 반응하는 2종류의 단일 클론 항체이며, 동시에 M1의 125~248번째의 아미노산 영역에 결합할 수 있는 2종류의 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용하는 샌드위치법에 의해 B형 인플루엔자 바이러스를 면역 측정하는 것을 포함하는 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 B형 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M1)의 125~248번째의 아미노산 영역과 각각 특이적으로 반응하는 2종류의 단일 클론 항체이며, 동시에 M1의 125~248번째의 아미노산 영역에 결합할 수 있는 2종류의 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는 B형 인플루엔자 바이러스 측정용 면역 측정 기구 또는 키트를 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명의 면역 측정에 의해 종래와는 상이한 단백질을 표적으로 하여 B형 인플루엔자 바이러스를 A형 인플루엔자 바이러스와 감별해서 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 면역 측정 기구 또는 키트를 사용함으로써 B형 인플루엔자 바이러스를 특이적이며 또한 고감도로 검출하는 것이 가능해져 인플루엔자의 진단 및 치료에 크게 공헌하는 것으로 생각된다.
도 1은 본 발명의 면역 크로마토그래피 면역 측정 기구의 바람직한 일형태를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 하기 실시예에 있어서 행한 각종 단일 클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯의 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명에 사용하는 단일 클론 항체는 B형 인플루엔자 바이러스 M1(이하, B-M1로 생략한다)과 항원 항체 반응한다. B-M1은 248아미노산 잔기로 구성되는 단백질이며, 웨스턴 블롯법에 의한 검출에 상기 항체를 사용함으로써 분자량 20~35kD에 항원 항체 반응에 의한 특이적인 시그널을 검지할 수 있다. 본 명세서에 있어서 「특이적」이란 단백질과 상기 항체가 서로 섞이는 액계에 있어서, 상기 항체가 B-M1 이외의 단백질 성분과 검출 가능한 레벨에서 항원 항체 반응을 일으키지 않거나, 또는 어떠한 결합 반응이나 회합 반응을 일으켰다고 해도 상기 항체의 B-M1과의 항원 항체 반응보다 명백하게 약한 반응밖에 일으키지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 사용하는 단일 클론 항체는 B-M1 아미노산 서열의 125~248번째의 아미노산 영역과 반응한다. B-M1의 아미노산 서열은 공지이며, 예를 들면 GenBank: AEN79424 등에 기재되어 있다(서열번호 1).
본 발명의 단일 클론 항체를 기초로 항원 결합 부위만을 분리시켜서 반응에 사용할 수 있다. 즉, 공지의 방법에 의해 제작된 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv) 등의 특이적인 항원 결합성을 갖는 단편(항원 결합성 단편)은 본 발명의 범위에 포함된다. 또한, 단일 클론 항체의 클래스는 IgG에 한정되지 않고, IgM이나 IgY이어도 좋다.
B형 인플루엔자 바이러스는 항원적·유전 계통적으로 상이한 2개의 그룹, 즉 야마가타계통 및 빅토리아계통으로 분류되지만, 바람직한 형태에서는 본 발명의 단일 클론 항체는 어느 계통의 바이러스주이어도 특이적으로 B-M1과 반응한다. 보다 바람직하게는 공지의 모든 인플루엔자 B형 바이러스주의 M1과 특이적으로 반응한다.
바람직한 형태에서는 본 발명에 사용하는 단일 클론 항체는 다른 감염증의 병원체와 특이적인 항원 항체 반응하지 않는다. 예를 들면, A형 인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕삭키바이러스, 에코바이러스, 단순헤르페스바이러스, 홍역바이러스, 멈프스바이러스, 파라인플루엔자바이러스, RS바이러스, 앵무병 클라미디아, 트라코마·클라미디아, 폐렴미코플라스마, 백일해균, 대장균, 인플루엔자균, 레지오넬라ㆍ뉴모필라, 리스테리아균, 녹농균, 세라티아균, 황색포도상구균, 표피포도상구균, 폐렴구균, 화농연쇄구균, B군연쇄구균, C군연쇄구균, G군연쇄구균과 항원 항체 반응을 하지 않는다.
본 발명에 사용하는 단일 클론 항체는 공지의 면역학적 방법을 사용하여 B-M1 또는 그 부분 펩티드(125~248번째의 아미노산 영역으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 부분 펩티드)를 피면역 동물에 면역하고, 피면역 동물의 세포를 사용하여 하이브리도마를 제작함으로써 얻을 수 있다. 면역에 사용하는 펩티드의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5아미노산 이상, 보다 바람직하게는 10아미노산 이상의 펩티드를 사용하여 면역원으로 할 수 있다.
면역원으로 하는 B-M1은 배양 바이러스액으로부터 얻을 수도 있지만, B-M1을 코딩하는 DNA를 플러스미드 벡터에 장착하고, 이것을 숙주 세포에 도입해서 발현시킴으로써 얻을 수도 있다.
면역원으로 하는 B-M1 또는 그 부분 펩티드는 이하에 예시하는 단백질과 융합 단백질로서 발현시켜 정제 후 또는 미정제인 채로 면역원으로서 사용할 수도 있다. 융합 단백질의 제작에는 당업자가 「단백질 발현·정제 태그」로서 일반적으로 사용하는 글루타티온S-트랜스페라아제(GST), 말토오스 결합 단백질(MBP), 티오레독신(TRX), Nus태그, S태그, HSV태그, FRAG태그, 폴리히스티딘태그 등을 이용할 수 있다. 이들과의 융합 단백질은 소화 효소를 사용하여 M1 또는 그 부분 펩티드 부분과 그 이외의 태그 부분을 절단하고, 분리 정제한 후에 면역원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
면역한 동물로부터의 단일 클론 항체의 조제는 주지의 쾰러들의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 용이하게 행할 수 있다. 즉, 면역한 동물로부터 비장세포나 림프구 등의 항체 산생 세포를 회수하고, 이것을 상법에 의해 마우스 골수종 세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 얻어진 하이브리도마를 한계 희석법 등에 의해 클로닝하고, 클로닝된 각 하이브리도마가 산생하는 단일 클론 항체 중 B-M1의 125~248번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(이하, 「B-M1C」)와 항원 항체 반응하는 단일 클론 항체를 선택한다.
복수나 배양 상청으로부터의 단일 클론 항체의 정제는 공지의 면역글로불린 정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 황산 암모늄이나 황산 나트륨을 사용한 염석에 의한 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, DEAE 이온 교환 크로마토그래피법, 겔여과법 등을 들 수 있다. 또한, 면역 동물종과 단일 클론 항체의 클래스에 따라 단백질A, 단백질G, 단백질L 중 어느 하나를 결합시킨 담체를 사용한 어피니티 크로마토그래피법에 의해서도 정제하는 것이 가능하다.
본 발명의 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법에서는 상기와 같이 해서 제작한 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1C 항체(이하, 「항 B-M1C 항체」라고 생략하는 경우가 있다)를 2종류 사용해서 샌드위치법에 의한 면역 측정을 행한다. 샌드위치법을 행하기 위해서는 이들 2종류의 단일 클론 항체는 동시에 B-M1C에 결합 가능한 것이 필요하며, 그러한 조합을 선택한다. 샌드위치법 자체는 면역 측정의 분야에 있어서 주지이며, 예를 들면 면역 크로마토그래피법이나 ELISA법에 의해 행할 수 있다. 이들 샌드위치법 자체는 모두 주지이며, 본 발명의 방법은 상기한 2종류의 항 B-M1C 항체를 사용하는 이외에는 주지의 샌드위치법에 의해 행할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「측정」에는 정량, 반정량, 검출 모두가 포함된다.
샌드위치법을 검출 원리로 하는 면역 측정에 있어서 항체가 고정화되는 고상으로서는 항체를 공지 기술에 의해 고정 가능한 것은 모두 사용할 수 있고, 예를 들면 모세관 작용을 갖는 다공성 박막(멤브레인), 입자상 물질, 시험관, 수지 평판 등 공지의 것을 임의로 선택할 수 있다. 또한, 항체를 표지하는 물질로서는 효소, 방사성 동위체, 형광 물질, 발광 물질, 유색 입자, 콜로이드 입자 등을 사용할 수 있다.
상술한 여러 가지 재료에 의한 면역 측정법 중에서도 특히 임상 검사의 간편성과 신속성의 관점으로부터 멤브레인을 사용한 측방 유동식의 면역 측정법이 바람직하다.
본 발명에서는 항 B-M1 항체를 사용하여 측방 유동식으로 면역 측정을 행할 수 있는 면역 측정 기구도 제공한다. 본 발명이 제공하는 면역 측정 기구는 측정 대상물(항원)을 포착하는 항체(항체 1)가 고정화된 검출 영역을 갖는 지지체, 이동 가능한 표지 항체(항체 2)를 갖는 표지체 영역, 검체를 적가(滴加)하는 샘플 패드, 전개된 검체액을 흡수하는 흡수대, 이들 부재를 1개로 접합하기 위한 백킹 시트로 이루어지고, 항체 1 및 항체 2 중 적어도 한쪽이 본 발명의 항 B-M1 항체인 면역 측정 기구이다.
또한, 검출 영역의 수 및 표지체 영역에 포함되는 표지 항체의 종류는 1개로 한정되는 것은 아니고, 복수의 측정 대상물에 대응하는 항체를 사용함으로써 2 이상의 항원을 동일 면역 측정 기구로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 면역 측정 기구의 바람직한 일형태를 나타낸 도면이다. A가 지지체, B가 표지체 영역, C가 검출 영역, D가 샘플 패드, E가 흡수대, F가 백킹 시트를 가리키고 있다.
도 1의 위가 평면도, 아래가 절단 단면도이다. 도의 예에서는 백킹 시트 위에 2개의 검출 영역이 형성된 지지체, 흡수대, 표지체 영역, 샘플 패드 등이 각각 적층되어 있다. 그리고 도면에 나타내는 바와 같이, 흡수대의 한쪽 단부와 지지체의 한쪽 단부, 지지체의 다른쪽 단부와 표지체 영역의 한쪽 단부, 표지체 영역의 다른쪽 단부와 샘플 패드의 한쪽 단부가 각각 겹쳐 있고, 이에 따라 연속한 측방 유동의 유로가 형성되어 있다.
지지체는 항원을 포착하기 위한 항체를 고정화하는 성능을 갖는 재료이며, 또한 액체가 수평 방향으로 통행하는 것을 방해하지 않는 성능을 갖는다. 바람직하게는 모세관 작용을 갖는 다공성 박막이며, 액체 및 그것에 분산된 성분을 흡수에 의해 수송 가능한 재료이다. 지지 형태를 이루는 재질은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF), 유리 섬유, 나일론, 폴리케톤 등을 들 수 있다. 이 중 니트로셀룰로오스를 사용하여 박막으로 한 것이 보다 바람직하다.
표지체 영역은 표지 항체를 포함하는 다공성 기재로 이루어지고, 기재의 재질은 일반적으로 사용되어 있는 유리 섬유나 부직포 등을 사용할 수 있다. 상기 기재는 다량의 표지 항체를 함침시키기 위해서 두께 0.3㎜~0.6㎜정도의 패드형상인 것이 바람직하다.
검출 영역은 항원을 포착하는 항체가 고정화된 지지체의 일부의 영역을 가리킨다. 검출 영역은 B-M1 항원을 포착하기 위한 항 B-M1 항체를 고정화한 영역을 적어도 1개 설정하고, 또한 A형 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 검출 영역을 설정하는 것이 실제의 진단 보조를 위해서는 바람직하다.
샘플 패드는 검체 또는 검체를 사용하여 조제된 시료를 적가하기 위한 부위이며, 흡수성을 갖는 다공성 재료이다. 상기 재료에는 일반적으로 사용되는 셀룰로오스, 유리 섬유, 부직포 등을 사용할 수 있다. 다량의 검체를 면역 측정에 사용하기 위해서 두께 0.3㎜~1㎜정도의 패드형상인 것이 바람직하다. 또한, 샘플 패드와 상술한 표지체 영역은 어디까지나 기능적인 구별이며, 반드시 개별의 재료일 필요는 없다. 즉, 샘플 패드로서 설치한 재료의 일부 영역이 표지체 영역의 기능을 갖는 것도 가능하다.
흡수대는 지지체에 공급되어 검출 영역에서 반응에 관여하지 않은 성분을 흡수하기 위한 부재이다. 상기 재료에는 일반적인 천연 고분자 화합물, 합성 고분자 화합물 등으로 이루어지는 보수성이 높은 여과지, 스폰지 등을 사용할 수 있지만, 검체의 전개 촉진을 위해서는 흡수성이 높은 것이 바람직하다.
백킹 시트는 상술한 모든 재료, 즉 지지체, 샘플 패드, 표지체 영역, 흡수대 등이 부분적인 겹침에 의해 부착·고정되기 위한 부재이다. 백킹 시트는 이들 재료들이 최적인 간격으로 배치·고정되는 것이면 반드시 필요하지는 않지만, 제조상 또는 사용상의 편리성으로부터 일반적으로는 사용한 편이 바람직하다.
도 1에서 설명한 형태의 면역 측정 기구에 있어서, 검체는 샘플 패드, 표지체 영역, 지지체, 검출 영역, 흡수대 등의 일련의 접속에 의해 형성된 다공성 유로를 통과한다. 따라서, 본 형태에 있어서는 이들 모두가 검체 이동 영역이 된다. 각 구성 재료의 재질이나 형태에 따라 검체가 재료 내부를 침투하지 않고 계면을 통행하는 형태도 있을 수 있지만, 본 명세서에서 정의하는 검체 이동 영역은 재료의 내부인지 계면인지를 불문하기 때문에 상기 형태의 면역 측정 기구도 본 명세서의 범위에 포함된다.
도 1의 형태에 의거하여 본 발명의 면역 측정 기구의 사용 방법에 대해서 설명한다.
측정은 검체 또는 검체를 사용하여 조제된 시료를 샘플 패드에 적가함으로써 개시된다. 적가하는 검체 시료는 미리 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용하여 2~20배 정도로 희석되어 있는 것이 바람직하다.
샘플 패드에 적가된 검체 시료는 모관 작용에 의해 표지체 영역, 지지체, 흡수대로 순차적으로 수평 방향으로 전개된다. 표지체 영역에서는 검체 시료의 전개와 함께 표지 항체가 액 중으로 방출되어 지지체로 전개된다. 검체 시료 중에 항원이 존재하는 경우에 있어서 지지체의 검출 영역에서는 포착 항체에 의해 항원이 특이적으로 포착되며, 또한 항원은 표지 항체와도 특이적 반응에 의해 복합체를 형성한다. 이에 따라 검출 영역에서는 항원을 개재한 항체의 샌드위치가 성립하고, 표지 항체-항원 복합물을 검출 영역에서 검지할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 단일 클론 항체의 제작
1. B형 인플루엔자 바이러스 M1 항원의 조제
B/Florida/4/2006주 바이러스 RNA로부터 역전 사진 반응에 의해 구축한 cDNA 라이브러리를 기초로 M1을 코딩하는 DNA를 플러스미드 벡터에 서브클로닝했다. 상기 플러스미드 벡터를 도입한 대장균주를 통기 교반 배양함으로써 M1을 발현시켰다. M1은 균체를 파쇄하여 원심분리에 의해 회수한 후, 크로마토그래피에 제공해서 정제했다. 본 명세서에 있어서 상기 정제품을 정제 M1 항원이라고 칭한다.
2. 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 단일 클론 항체의 제작
정제 M1 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 쾰러들의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, 정제 M1 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단일 클론화)를 행했다. 취득한 상기 세포주를 프리스탄 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하고, 약 2주일 후 항체 함유 복수를 채취했다. 얻어진 복수로부터 단백질A 컬럼을 사용한 어피니티 크로마토그래피법에 의해 IgG를 정제하여 정제 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 항체를 얻었다.
(참고예 1)
1. 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 단일 클론 항체의 제작
B형 인플루엔자 바이러스 항원을 BALB/c 마우스에 면역하고, 일정 기간 사육한 마우스로부터 비장을 적출하고, 쾰러들의 방법(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))에 의해 마우스 골수종 세포(P3×63)와 융합했다. 얻어진 융합 세포(하이브리도마)를 37℃ 인큐베이터 중에서 유지하고, B형 인플루엔자 바이러스 NP 항원을 고상한 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 상청의 항체 활성을 확인하면서 세포의 순화(단일 클론화)를 행했다. 취득한 상기 세포주를 프리스탄 처리한 BALB/c 마우스에 복강 투여하고, 약 2주일 후 항체 함유 복수를 채취했다.
얻어진 복수로부터 단백질A 컬럼을 사용한 어피니티 크로마토그래피법에 의해 각각 IgG를 정제하여 정제 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체를 얻었다. 본 명세서에 있어서 상기 정제 항체를 항 B-NP 항체라고 칭한다.
(실시예 2) 착색 폴리스티렌 입자를 사용한 인플루엔자 바이러스 항원 검출 시약
1. 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
실시예 1에서 정제한 항 B-M1 항체를 1.0㎎/㎖가 되도록 정제수로 희석한 액을 PET 필름에 의해 라이닝된 니트로셀룰로오스 멤브레인의 소정의 위치에 선형상으로 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켜 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 항체 고정화 멤브레인을 얻었다. 본 명세서에 있어서 항 M1 항체 고정화 멤브레인이라고 칭한다.
2. 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체의 니트로셀룰로오스 멤브레인으로의 고정화
참고예 1에서 제작한 항 NP 항체를 사용하여 상술한 실시예 2-1와 마찬가지의 방법에 의해 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 고정화 멤브레인을 얻었다. 본 명세서에 있어서 항 NP 항체 고정화 멤브레인이라고 칭한다.
3. 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
실시예 1에서 제작한 항 B-M1 항체를 1.0㎎/㎖가 되도록 정제수로 희석하고, 이것에 착색 폴리스티렌 입자를 0.1%가 되도록 첨가하여 교반 후, 카르보디이미드를 1%가 되도록 첨가하여 더 교반한다. 원심 조작에 의해 상청을 제거하고, 50mM Tris(pH 9.0), 3% BSA에 재부유하여 항 B형 인플루엔자 바이러스 M1 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다. 본 명세서에 있어서 항 M1 항체 고정화 입자라고 칭한다.
4. 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체의 착색 폴리스티렌 입자로의 고정화
참고예 1에서 제작한 항 B-NP 항체를 사용하여 상술한 실시예 2-3와 마찬가지의 방법에 의해 항 B형 인플루엔자 바이러스 NP 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자를 얻었다. 본 명세서에 있어서 항 NP 항체 고정화 입자라고 칭한다.
5. 항 B형 인플루엔자 바이러스 항체 결합 착색 폴리스티렌 입자의 도포·건조
3 및 4에서 제작한 항체 고정화 입자를 유리 섬유 부직포에 소정량 1.0㎍을 도포하고, 45℃, 30분간 건조시켰다. 본 명세서에 있어서 건조 패드라고 칭한다.
6. B형 인플루엔자 바이러스 시험편의 제작
1 및 2에서 제작한 항체 고정화 멤브레인과 5에서 제작한 건조 패드를 다른 부재(백킹 시트, 흡수대, 샘플 패드)를 접합해서 5㎜ 폭으로 절단하여 B형 인플루엔자 바이러스 시험편으로 했다. 본 명세서에 있어서 시험편이라고 칭한다. 또한, 접합 시에 항체 고정화 멤브레인 및 건조 패드 중 적어도 한쪽에 항 B-M1 항체가 포함되는 조합이 되도록 시험편을 제작했다.
7. B형 인플루엔자 바이러스 항원의 검출
6에서 제작한 시험편의 샘플 패드에 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 검체 부유액(10mM ADA(pH 6.0), 1% 폴리옥시에틸렌알킬에테르)을 60㎕ 적가하여 8분간 정치한다. 항원과 반응한 항체 고정화 입자가 항체 고정화 멤브레인의 항체 도포 위치에 있어서 포착되고, 그것에 의한 발색을 육안으로 확인할 수 있었을 경우에 +로 판정한다. 발색을 육안으로 확인할 수 없는 경우에는 -로 판정한다. 본 시험에 있어서, 모든 조합의 시험편, 즉 항체 고정화 멤브레인 및 건조 패드의 한쪽 또는 양쪽이 항 B-M1 항체일 때에 +가 되었다.
(실시예 3) 항 B형 인플루엔자 바이러스 단일 클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯법에 의한 항원 검출
1. B형 인플루엔자 바이러스 재조합체 M1의 조제
실시예 1-1에서 구축한 cDNA 라이브러리를 기초로 M1 아미노산 서열의 1~124번째를 코딩하는 DNA 및 125~248번째를 코딩하는 DNA를 각각 플러스미드 벡터에 서브클로닝했다. 상기 플러스미드 벡터를 도입한 대장균주를 통기 교반 배양함으로써 재조합체 M1을 발현시켰다. 재조합체 M1은 균체를 파쇄하여 원심분리에 의해 회수한 후, 크로마토그래피에 제공해서 정제했다. 본 명세서에 있어서 전자의 아미노산 서열로 이루어지는 재조합체 M1을 M1-N, 후자의 아미노산 서열로 이루어지는 재조합체 M1을 M1-C라고 칭한다.
2. 웨스턴 블롯법에 의한 반응성 확인
정제 M1 항원, M1-N, M1-C를 사용하여 실시예 1에서 얻어진 항체의 반응성을 확인했다. SDS-PAGE는 10% 아크릴아미드겔을 사용하여 상법에 의해 행했다. 전기 영동 후, PVDF막에 전사했다. 스킴 밀크로 블록킹을 행한 후, PBS-Tween으로 충분히 세정했다. PBS-Tween으로 1㎍/㎖로 조정한 항 B-M1 항체를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 3000배로 희석한 HRP 표지 항마우스 항체를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS-Tween으로 충분히 세정한 후, 화학 발광 검출 시약을 사용하여 시그널을 검출했다. 시험한 항체는 정제 M1 항원과 반응하는 것이 확인되고, M1-N에 반응하는 항체와, M1-C에 반응하는 항체로 판별되었다. 결과를 도 2에 나타낸다. 본 명세서에 있어서 전자의 항체를 항 M1-N 항체, 후자를 항 M1-C 항체라고 칭한다.
(실시예 4) 항 M1-N 항체와 항 M1-C 항체를 조합시킨 항원 검출 시약의 성능 확인
1. 항 M1-N 항체와 항 M1-C 항체를 조합한 시험편의 제작
실시예 2-6과 마찬가지의 방법으로 이하의 시험편을 제작했다. 항체 고정화 멤브레인과 건조 패드를 항 M1-N 항체끼리 조합시킨 시험편(NN 시험편), 항 M1-C 항체끼리 조합시킨 시험편(CC 시험편), 항체 고정화 멤브레인에 항 M1-N 항체를 사용하여 건조 패드에 항 M1-C 항체를 사용한 시험편(NC 시험편), 항체 고정화 멤브레인에 항 M1-C 항체를 사용한 건조 패드에 항 M1-N 항체를 사용한 시험편(CN 시험편).
2. 항 NP 항체의 조합에 의한 시험편의 제작
대조로서 실시예 2-6과 마찬가지의 방법으로 항 NP 고정화 멤브레인과 항 NP 고정화 입자를 사용한 시험편을 제작했다(종래법 시험편).
3. 시험편의 B형 인플루엔자 항원 검출 감도 비교
1 및 2에서 제작한 시험편의 샘플 패드에 B형 인플루엔자 바이러스 항원을 포함하는 검체 부유액(10mM ADA(pH 6.0), 1% 폴리옥시에틸렌알킬에테르)을 60㎕ 적가하여 8분간 정치한다. 항원과 반응한 항체 고정화 입자가 항체 고정화 멤브레인의 항체 도포 위치에 있어서 포착되고, 그것에 의한 발색을 육안으로 확인할 수 있었을 경우에 +로 판정한다. 발색을 육안으로 확인할 수 없는 경우에는 -로 판정한다. CC 시험편은 종래법 시험편에 비해 4배 높은 검출 감도를 나타냈다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112016029323808-pct00001
A : 지지체 B : 표지체 영역
C : 검출 영역 D : 샘플 패드
E : 흡수대 F : 백킹 시트
SEQUENCE LISTING <110> DENKA SEIKEN CO., LTD. <120> Method of measuring influenza B virus <130> PF000523-PCT <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B virus <400> 1 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Lys Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245

Claims (6)

  1. B형 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M1)의 125~248번째의 아미노산 영역과 각각 특이적으로 반응하는 2종류의 단일 클론 항체이며, 동시에 M1의 125~248번째의 아미노산 영역에 결합할 수 있는 2종류의 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용하는 샌드위치법에 의해 B형 인플루엔자 바이러스를 면역 측정하는 것을 포함하는 B형 인플루엔자 바이러스의 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 샌드위치법이 면역 크로마토그래피법인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 샌드위치법이 ELISA법인 방법.
  4. B형 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 단백질(M1)의 125~248번째의 아미노산 영역과 각각 특이적으로 반응하는 2종류의 단일 클론 항체이며, 동시에 M1의 125~248번째의 아미노산 영역에 결합할 수 있는 2종류의 단일 클론 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는, B형 인플루엔자 바이러스 측정용 면역 측정 기구.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 2종류의 단일 클론 항체의 한쪽인 제 1 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 지지체 상에 고정화된 검출 영역과, 상기 2종류의 단일 클론 항체의 다른 한쪽인 제 2 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 검체와 함께 공급하는 표지체 영역과, 검체 이동 영역을 구비한 면역 측정 기구인, B형 인플루엔자 바이러스 측정용 면역 측정 기구.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 2종류의 단일 클론 항체의 한쪽인 제 1 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 고정화된 지지체와, 상기 2종류의 단일 클론 항체의 다른 한쪽인 제 2 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 포함하는, B형 인플루엔자 바이러스 측정용 면역 측정 기구.
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