KR102116620B1 - 무세포 연골 이식편의 제조 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 무세포 연골 이식편의 제조 방법을 개시한다. 이 방법은 동물 유래의 연골 기질에 알칼리, 살균 및 탈세포화 처리를 실시하는 단계를 포함한다. 이와 같이 생성된 연골 이식편은 그 안에 콜라겐 섬유의 다공성 및 완전성을 유지하면서 어떠한 세포성 물질도 없기 때문에 숙주 세포가 이식되는 이종 이식편(xenograft)으로서 적합하다. 본 발명은 또한 본 발명의 무세포 연골 이식편을 대상의 병변 부위에 적용하여 대상체의 골 연골 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

무세포 연골 이식편의 제조 및 그 용도
본 출원은 2015년 8월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/203,904호의 우선권을 주장하며, 이는 본 명세서에서 그 전체가 참고로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 무세포 연골 이식편(cartilage graft)의 제조 분야, 특히 세포가 성장하기 위한 생물학적 스캐폴드로서 사용하기에 적합한 무세포 연골 이식편의 제조 방법에 관한 것이며, 따라서 무세포 연골 이식편은 골 연골 질환 치료용 이종 이식편으로서 유용하다.
연골 조직에 대한 손상은 급성 또는 반복적인 상해 또는 노화의 결과로서 활동적인 개체 및 노인에서 상당히 일반적이다. 치료 옵션에는 휴식, 손상된 연골 부위를 청소하기 위한 작은 관절경 수술 및 미세 골절, 천공 및 마모와 같은 다른 수술 절차가 포함된다. 이 모든 것은 일시적으로 도움이 되는 증상 완화 뿐이며 특히 부상 전에 동일한 수준의 활동을 유지했다면 더욱 그렇다. 예를 들어, 만성 무릎 관절 손상은 관절 연골의 더 심한 악화를 초래할 수 있으며, 결국 무릎 관절 대체를 초래할 수 있다. 골 연골(Osteochondral) 질병이나 부상 치료의 요구가, 현재 의료 절차 및 방법에 의해 완전히 충족되지 않은 또 다른 도전을 제시한다. 상기한 바와 같은 노화, 상해 및/또는 장애로 인한 연골 손상 이외에, 비강 확대, 안면 좌우 비대칭(facial left-right asymmetry) 교정 수술, 눈꺼풀 주위 교정 수술, 안면 성형 수술 등과 같은 연골 조직의 수리 또는 보강을 필요로 하는 성형 또는 미용 수술에서 연골 이식의 필요성이 증가하고 있다.
하이드로겔 또는 천연 또는 합성 고분자 스캐폴드에 씨딩함으로써 생성된 기존의 조작된 연골은 콜라겐이 주성분인 자연 연골과 동일한 기계적 성질을 갖지 않는다. 이러한 결점을 극복하기 위해, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 가교제가 하이드로겔 또는 고분자 스캐폴드의 기계적 강도를 향상 시키는데 사용되어 왔다. 그러나, 상기 가교제는 인간에게 독성이 강하므로 사용이 제한적이다.
따라서, 전술한 임의의 상해 또는 교정 수술로 치료하기 위한 개선된 연골 이식편을 제공하는 것이 유리할 것이다. 개선된 연골 이식편은 자연 연골의 기계적 강도 및 형태를 가질뿐만 아니라, 따라서 추가의 합병증 (예를 들어, 면역원성 문제)을 일으키지 않고 연골을 손상 전 상태로 효과적으로 회복시킬 수 있고, 또한 비교적 낮은 비용으로 쉽게 준비할 수 있다.
본원의 배경이 되는 기술은 미국특허공개번호 제2008-0077251호, 유럽특허공개번호 제0748632호 및 Crapo et al., “An overview of tissue and whole organ decellularization processes” Biomaterials (2011)에 개시되어 있다.
본 개시는 상기 언급된 문제점을 극복하기 위해 본 발명자들에 의해 개선된 연골 이식편의 제조, 특히 향상된 기계적 강도, 및 천연 연골의 본래 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 연골 이식편의 제조법이 창안되었다.
따라서, 본원의 제 1 양태는 미용 수술 (예를 들면, 코 성형술, 얼굴의 교정 수술 등) 또는 골 연골 질환의 치료에 사용하기에 적합한 무세포 연골 이식편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 방법은,
(1) 동물의 연골을 다이싱(dicing)하여 연골 매트릭스를 생성시키는 단계;
(2) 단계 (1)의 상기 연골 매트릭스를 알칼리 처리하는 단계;
(3) 단계 (2)의 상기 알칼리 처리된 연골 매트릭스를 살균(disinfection) 처리하는 단계; 및
(4) 단계 (3)의 상기 살균된 연골 매트릭스를 탈세포화 처리하여 무세포 연골 이식편을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 단계 (1)에서, 상기 연골은 포유 동물로부터 유래되고, 비강 연골, 리브 연골(rib cartilage), 귀 연골 또는 무릎 연골일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 단계 (2)에서, 상기 알칼리 처리는 실온에서 약 3 내지 24시간 동안 연골 매트릭스를 수산화 나트륨 용액(sodium hydroxide solution)으로 처리하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (3)에서, 상기 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 알콜, 산화제, 방사선, 페놀 및 4급 암모늄 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 살균제의 처리를 받았다.
일부 구체예에서, 단계 (3)에서 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 에탄올 또는 이소프로판올일 수 있는 알콜의 처리를 받았다.
다른 구현예에서, 단계 (3)에서, 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 과산화수소 일 수 있는 산화제의 처리를 받았다.
또 다른 구현예에서, 단계 (3)에서, 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 감마선 일 수 있는 방사선의 처리를 받았다.
다른 구체예에서, 단계 (3)에서, 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 파라벤, 벤조산 또는 살리실산일 수 있는 페놀(phenolic)의 처리를 받았다.
또 다른 실시예에서, 단계 (3)에서, 알칼리 처리된 연골 매트릭스는 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride), 염화 알킬디메틸벤질암모늄(alkyldimethylbenzylammonium chloride), 염화 디데실디메틸암모늄(didecyldimethylammonium chloride) 또는 염화암모늄(ammonium chloride)일 수 있는 4급 암모늄 화합물의 처리를 받았다.
본 개시의 실시예에 따르면, 단계 (4)에서, 상기 탈세포화 처리는 살균된 연골 매트릭스를 30-50℃의 온도에서 약 20분 내지 5일 동안 약 150-350 bar의 압력하에 초임계 유체 (SCF)로 처리하는 단계를 포함한다.
상기 SCF는 초임계 이산화탄소(scCO2), 초임계 아산화 질소(scN2O), 초임계 수(scH2O), 초임계 알칸, 초임계 알켄, 초임계 알콜 또는 초임계 아세톤 중 어느 하나일 수 있다. 일 예시에서, SCF는 scCO2이다. 또 다른 예에서, SCF는 scN2O이다.
바람직한 일 실시예에 따르면, 탈세포화 처리는 온도가 약 37℃이고, 압력이 약 350 Bar이고, 처리가 100분 동안 수행되는 조건에서 수행된다.
이와 같이 제조된 연골 이식편은 그 본래의 구조 및 형태가 보존된 콜라겐을 주요한 구성으로 하여, 피험자에 적용한 후(예, 이식) 세포가 성장할 수 있는 3차원 바이오-스캐폴드로서 기능할 수 있다. 또한, 이와 같이 생성된 연골 이식편은 무세포이며, 이는 어떠한 세포성 물질도 갖지 않으며, 따라서 실질적으로 비면역원성(non-immunogenic)이고 그 숙주에 면역원성 반응을 유도하지 않을 것이라는 것을 의미한다. 또한, 이와 같이 생성된 연골 이식편의 기계적 성질은 천연 연골보다 우수하여, 원래의 연골 및/또는 기존의 조작된 연골보다 더 나은 이종이식편(xenograft)을 부여한다.
따라서, 본 발명의 제 2 양태는 본 방법에 의해 제조된 연골 이식편을 제공하는 것이다. 따라서, 본 개시의 연골 이식편은 교정 수술(corrective surgery)의 이종 이식편으로서 유용하고, 또는 노화, 상해 또는 질병으로 인한 연골 결손의 치료에 유용하다. 교정 수술의 예로는 비강 확대, 안면 좌우 비대칭 교정 수술, 눈꺼풀 주변 교정 수술, 안면 성형 수술 등이 있다.
본 발명의 제 3 양태는 골 연골 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 본 무세포 연골 이식편을 대상의 치료 부위 (예를 들어, 병변 부위)에 적용하는 단계를 포함한다.
골 연골 질환은 선천적 결함(congenital defects), 골절(bone fracture), 반월판 손상 또는 결손(meniscal injuries or defects), 골/척추 변형(bone/spinal deformation), 골육종(osteosarcoma), 골수종(myeloma), 골이형성증(bone dysplasia) 및 척추 측만증(scoliosis), 골다공증(osteoporosis), 치주질환(periodontal disease), 치아 골손실(dental bone loss), 골연화증(osteomalacia), 구루병(rickets), 섬유성 골염(fibrous osteitis), 신장 골영양 장애(renal bone dystrophy), 척추 융합(spinal fusion), 척추 디스크 재건 또는 제거(spinal disc reconstruction or removal), 파제트 골질환(Paget's disease of bone), 반월 손상(meniscal injuries), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis) 및 연골에 대한 외상 또는 수술 손상일 수 있다.
본 개시의 하나 이상의 실시예의 세부 사항은 이하의 첨부된 설명에서 개시된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시로서, 청구된 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위한 것임을 이해해야 한다.
본 명세서에 통합되어 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 본 발명의 다양한 양태의 다양한 예시적인 시스템, 방법 및 다른 예시적인 실시예를 도시한다. 본 설명은 첨부 도면을 고려하여 파악되는 다음의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해 될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 20,000x의 배율에서 촬영한, (A) SCF 처리 전, 및 처리 후 (B) 150 bar, (C) 200 bar 및 (D) 350 bar에서의 H & E 염색에 의한 본 연골 이식편의 사진이다;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 SCF 처리 전(A) 및 후(B)의 본 연골 이식편의 H & E 및 DPAI 염색 사진이다;
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 SCF 처리 전(A) 및 후 (B)의 본 연골 이식편의 알시안 블루(alcian blue) 염색 사진이다;
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 (A) 500k, (B) 1000k 및 (C) 2,000k의 배율에서 취한 본 SCF 처리된 연골 이식편의 주사 전자 현미경 (SEM) 사진이다; 그리고
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 실시예 1.1의 SCF 처리된 연골 이식편 및 (A) 응력 하중(stress load) 및 (B) 영 모듈(Young's modulus)에 각각 제공된 천연 연골의 압축 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
이하에 제공되는 상세한 설명은 본 개시의 설명으로서 의도되며, 본 개시 내용이 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내기 위한 것이 아니다.
단수 형태는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 여기서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "무세포(acellular)"는 생물학적으로 활성인 세포 및/또는 데브리스와 같은 임의의 세포성 물질이 없는 임플란트(implant)를 지칭한다. 따라서, 용어 "무세포 연골 이식편(acellular cartilage graft)"은 임의의 세포성 물질이 실질적으로 없는, 동물 (예: 포유류)의 연골로부터 유래된 연골 이식편을 말한다. 하나의 예에서, 상기 연골은 돼지의 코 연골로부터 취해진다. 다른 예에서, 상기 연골은 돼지의 무릎 연골로부터 취해진다. 추가의 예에서, 상기 연골은 돼지의 갈비 연골(rib cartilage) 로부터 유도된다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오류를 포함한다. 또한, 여기에서 사용되는 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 상기 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 예 이외에, 또는 달리 명시하지 않는 한, 여기에 개시되는 재료의 양, 시간의 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율 모든 예에서 "약"이라는 용어로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 파라미터는 원하는 바에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명은 가장 넓은 의미에서, 미용 또는 성형외과 수술에 사용하기에 적합한 무세포 연골 이식편의 제조에 관한 것이다. 본 방법에 의해 제조된 무세포 연골 이식편을 연골 병변에 이식함으로써 손상(damaged), 부상(injured), 외상 또는 노화된 연골의 회복 또는 복구 및/또는 골 연골 결손의 회복을 포함하는 골 연골 질환의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 콜라겐의 기계적 강도 및 본래 구조 및 형태가 유지되는 무세포 연골 이식편의 제조 방법을 제공하는 것으로, 따라서, 연골 조직 재구성 또는 골 연골 질환의 치료를 위한 숙주에 이식 후 숙주 조직 세포가 그 성장을 위한 최적의 미세 환경을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제조된 연골 이식편은 세포성 물질이 전혀 없으므로, 실질적으로 비-면역원성이며, 이식 후 면역원성 반응을 유도하지 않을 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:
(1) 동물의 연골을 다이싱(dicing)하여 연골 매트릭스를 생성시키는 단계;
(2) 단계 (1)의 상기 연골 매트릭스를 알칼리 처리하는 단계;
(3) 단계 (2)의 상기 알칼리 처리된 연골 매트릭스를 살균(disinfection) 처리하는 단계; 및
(4) 단계 (3)의 상기 살균된 연골 매트릭스를 탈세포화 처리하여 무세포 연골 이식편을 제조하는 단계.
바람직한 무세포 연골 이식편을 제조하기 위해, 비강 연골, 리브 연골, 귀 연골 또는 무릎 연골과 같은 손상되지 않은 연골을 비인간 동물, 바람직하게는 농장 동물로부터 제거하여 연골의 공급원로서 이용한다. 연골의 공급원으로서 작용할 수 있는 적합한 농장 동물의 예로는 돼지(hogs), 소(cattle), 암소(cow), 황소(bull), 양, 염소, 당나귀, 토끼, 오리, 거위 및 새(fowl)가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 연골 이식편의 공급원으로 사용되는 연골은 새로 죽인 동물에게서 수집하여 즉시 멸균된 등장액이나 다른 보존 용액에 넣어야 한다. 수확된 연골을 적절한 크기와 모양으로 절단하여 디스크, 스트립, 입자 및 원뿔 형태의 연골 매트릭스를 생산한다. 일부 예에서, 각 연골 매트릭스는 디스크 형태를 가지며, 직경이 약 8-12mm, 바람직하게는 직경이 약 11mm이다. 다른 예에서, 각 연골 매트릭스는 길이가 약 6cm, 폭이 10mm, 두께가 2-5mm인 스트립의 형태를 갖는다. 일반적으로, 각각의 연골 이식편의 크기 및 형태는 치료 부위의 크기 및 모양을 따르는 한 본 개시에 따라 중대하지는 않다.
상기 다이싱된 연골 매트릭스는 단계 (2) 및 (3)에 각각 기술된 바와 같이 알칼리 처리 및 살균 처리를 받는다. 본 방법에서 사용하기에 적합한 알칼리제의 예는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 칼슘, 우레아, 황화 나트륨, 티오아세트산 칼슘 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 연골 매트릭스를 실온에서 약 3시간 동안 수산화 나트륨 용액으로 처리한다. 연골 기질을 살균하기 위해 알코올, 산화제, 페놀계 화합물, 4급 암모늄 화합물, 항생제 및 방사선과 같은 살균제의 처리에 의해 연골 기질을 처리함으로써 상기 살균이 수행될 수 있다. 본 방법에 유용한 살균제의 적절한 예는 에탄올, 이소프로판올, 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate), 과산화수소(hydrogen peroxide), 아세트산(acetic acid), 술폰아미드(sulfonamides), 파라벤(paraben), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride), 염화 알킬디메틸벤질암모늄(alkyldimethylbenzylammonium chloride), 염화 디데실디메틸암모늄(didecyldimethylammonium chloride), 염화암모늄(ammonium chloride), X 선, 감마선 및 자외선이 포함된다. 일부 실시예에서, 상기 연골 매트릭스는 과산화수소 용액으로 처리된다. 또한, 각 단계 후에, 상기 연골 매트릭스는 다량의 물로 세척되어 임의의 가용성 물질을 제거하고, 다음 처리를 받게 된다.
다음으로, 단계 (3)의 알칼리 처리되고 살균된 연골 매트릭스는 탈세포화 공정을 거친다. 탈세포화 공정은 콜라겐의 물리적 및 생화학적 특성을 보존하면서 상기 연골 조직으로부터 세포성 물질을 제거하기 위한 목적으로 수행되어, 조직 스캐폴드(예 : 이종 이식편)로서 더 잘 제공될 수 있다. 따라서, 단계 (4)에서, 단계 (3)의 살균된 연골 매트릭스는 초임계 유체 (SCF)로 처리되는데, 약 100 내지 500 bar의 압력하, 예를 들어 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 및 500 bar; 바람직하게는 약 150 - 350 bar, 예를 들어 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 및 350 Bar 하에서 처리된다. 추가로, 상기 단계(4)는 30-50℃ 사이의 온도, 예를 들어 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50℃; 바람직하게는 35-45℃ 사이, 예를 들어 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 및 45℃; 약 20분 내지 5일 동안, 예를 들어 20, 30, 40, 50, 및 60분; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24시간; 2, 3, 4, 및 5일 동안 수행된다. 일부 실시 예에서, 단계 (3)의 살균된 연골 매트릭스는 SCF로 약 1 내지 24시간 동안 처리된다. 다른 예에서, 단계 (3)의 살균된 연골 매트릭스는 SCF로 약 2 내지 5일 동안 처리된다.
상기 SCF는 초임계 이산화탄소 (scCO2), 초임계 아산화 질소 (scN2O), 초임계 수 (scH2O), 초임계 알칸, 초임계 알켄, 초임계 알콜 또는 초임계 아세톤 중 어느 하나일 수 있다. 일 예시에서, SCF는 scCO2이고, 이는 scCO2가 약 350 Bar에서 약 37℃의 온화한 임계 조건을 가지며, 따라서 체온 (즉, 37℃) 또는 그 근처에서 생물학적 물질을 제거할 수 있게 한다. 또 다른 바람직한 예에서, SCF는 scN2O이다.
선택적으로, 상기 SCF는 공-용매와 함께 단계 (3)의 살균된 연골 매트릭스에 적용된다. 상기 공용매는 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, t-부탄올 및 시클로부탄올을 포함하는 C1-4 알콜일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 공용매는 에탄올이고, SCF와 함께 1:20 내지 1 : 4의 부피비로 적용되는데, 예를 들어, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 및 1:4로 적용된다. 하나의 바람직한 실시예에서, 에탄올은 1:19의 부피비로 SCF로 적용된다. 또 다른 실시예에서, 에탄올은 1 : 10의 부피비로 SCF로 적용된다. 또 다른 실시예에서, 에탄올은 1 : 4의 부피비로 SCF로 적용된다. 가장 바람직하게, 에탄올 및 SCF는 약 1:10의 부피비로 동시에 적용된다.
본 개시의 구체예에 따르면, 단계 (4)의 SCF 처리된 연골 이식편은 실질적으로 임의의 세포성 물질이 없기 때문에, 어떠한 추가의 효소 분해 처리 (예를 들어, 프로테아제 및/또는 글리코시다제로 분해)를 요구하지 않고, 이종 이식편의 면역원성 거부의 근원으로 작용할 수 있는 항원 표면 탄수화물 잔기를 제거한다. 본 개시의 구체예에 따르면, 본 방법에 의해 제조된 연골 이식편은 임의의 핵산 및 비-콜라겐 단백질이 없다.
또한, 상기 (4) 단계의 SCF 처리된 연골 이식편은 콜라겐 섬유의 기계적 강도와 완전성이 유지된 콜라겐 섬유로 이루어져, 숙주 세포의 성장을 위한 생물학적 스캐폴드로 사용하기에 적합하다. 본 개시의 구체예에 따르면, 본 개시의 연골 이식편은 콜라겐 섬유의 본래 구조 및 형태를 보존하고, 섬유아세포의 성장을 지지할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법이 종래의 방법과 다른 점은, 생성된 연골 이식편에서 콜라겐 섬유의 완전성 및/또는 기계적 강도를 유지하는 반면, 연골 이식편의 제조를 위해 고장성 염 용액, 탈수(de-watering) 및/또는 결빙 처리를 없애고, 본 방법이 더 단순하고 사용하기 쉽다는 점에서 가치가 있다. 또한, 본 방법은 연골 이식편의 단백질을 가교 결합시키는 가교제 (예 : 글루타르알데히드, 포름알데히드 등)를 사용할 필요가 없기 때문에 독성 및 연골 이식편의 면역원성이 감소되거나 줄어드는 점에서도 종래 방법과 다르다.
본 발명의 임의의 실시예에 따르면, 상기 SCF 처리된 연골 이식편은 임의의 공지된 방법 (예를 들어, 전술한 바와 같은 살균제로 처리)을 사용하여 살균될 수 있고, 사용될 때까지 건조되고 멸균된 상태로 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, 연골 이식편은 10-60 kGy, 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 및 60 kGy의 세기를 갖는 감마선에 노출되어 상기 연골 이식편이 멸균된다. 보다 바람직하게는, 상기 연골 이식편은 10-30 kGy, 예를 들어, 10, 15, 20, 25, 및 30 kGy의 세기를 갖는 감마선에 노출되어 상기 연골 이식편이 멸균된다.
이와 같이 제조된 무세포 연골 이식편은 미용 또는 성형수술에 사용하기에 적합하고, 또는 본 방법에 의해 제조된 무세포 연골 이식편을 치료부위(예를 들어, 연골 병변)에 삽입함으로써 손상, 부상, 외상 또는 노화된 연골의 재건, 회복 또는 복구 및/또는 골 연골 결손의 회복을 포함하는 골 연골 질환의 치료에 적합하다.
따라서, 본 개시의 추가의 양태는 대상의 골 연골 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 방법은 본 연골 이식편을 대상의 치료 부위 (예를 들어, 병변 부위)에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 골 연골 질환의 예는, 비제한적으로, 선천적 결함(congenital defects), 골절(bone fracture), 반월판 손상 또는 결손(meniscal injuries or defects), 골/척추 변형(bone/spinal deformation), 골육종(osteosarcoma), 골수종(myeloma), 골이형성증(bone dysplasia) 및 척추 측만증(scoliosis), 골다공증(osteoporosis), 치주 질환(periodontal disease), 치아 골손실(dental bone loss), 골연화증(osteomalacia), 구루병(rickets), 섬유성 골염(fibrous osteitis), 신장 골영양 장애(renal bone dystrophy), 척추 융합(spinal fusion), 척추 디스크 재건 또는 제거(spinal disc reconstruction or removal), 파제트 골질환(Paget's disease of bone), 반월 손상(meniscal injuries), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis) 및 연골에 대한 외상 또는 수술 손상을 포함한다. 현재 SCF 처리된 연골 이식편이 병변 부위에 이식된 후 이웃하는 연골 세포가 활성화되어, 궁극적으로 병변 부위의 손상된 연골을 대체할 때까지 성장하기 시작하는 연골 이식편의 다공성 구조로 이동할 것이라고 예상되고, 현재 SCF 처리된 연골 이식편은 완전히 분해되어 피험자에 독성 잔류물을 남기지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 이는 한정보다는 예시를 목적으로 한다. 이들은 전형적으로 사용될 수 있는 것들이지만, 당업자에게 알려진 다른 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
[ 실시예 ]
재료 및 방법
세포 배양
NIH-3T3 섬유 아세포는 10% 소태아혈청(FBS), 100 units/ml 페니실린 및 100 ㎎/ml 스트렙토마이신을 포함하는 보충물을 DMEM-고 글루코오스에서 5% CO2의 가습 분위기하 37℃에서 배양되었다.
연골 세포의 분리
연골 세포를 돼지 관절 연골로부터 분리하였다. 상기 연골을 배지에서 헹구고 콜라게나제 타입 H가 함유된 분해 배지(digestion medium)(DMEM, 10% FBS, 1% P/S, 0.1 mg/mL 스트렙토마이신)에 옮기고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 원심 분리(300×g, 5 분)에 의해 수집하였다.
H & E 염색
절단된 연골 조직을 크실렌에 10분 동안 침지함으로써 탈파라핀화시키고, 처리를 한번 더 반복하였다. 이어서 상기 탈파라핀화된 조직을 알코올 농도가 100% 내지 95%, 85% 및 75%로 각각 변화된 일련의 알코올 배스(alcohol bath)를 통과시킴으로써 수화시켰다. 각 패스에서, 상기 조직 샘플을 2분 동안 알코올 용액에 머물게한 다음, 다량의 탈이온수로 헹구었다. 수화 후, 조직 샘플을 3-5분 동안 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색한 다음, 탈이온수 및 75% 에탄올로 세척하였다. 헤마톡실린으로 염색된 연골을 1% Eosin Y로 약 30초간 더 염색한 후, 순차적으로 탈이온수, 및 95% 및 100% 에탄올로 세척하였다.
알시안 블루 ( Alcian blue ) 염색
상기 연골 조직 절편을 "H & E 염색" 섹션에 기술된 절차에 따라 탈 파라핀화 및 수화시켰다. 그런 다음, 상기 샘플을 알시안 블루(alcian blue)로 30분 동안 염색한 다음, 2분 동안 흐르는 수돗물로 세척하고 탈 이온수로 헹구었다. 알시안 블루로 염색된 연골 샘플을 핵 고속 레드 용액(nuclear fast red solution)에서 5 분간 대조염색한 다음 1분 동안 흐르는 수돗물로 씻었다. 상기 연골 샘플은 95% 에탄올 및 100% 에탄올 (각 2분마다 2회)을 통과시켜 탈수시킨 다음, 수지상 마운팅 매질(resinous mounting medium)로 마운팅하였다.
연골 이식편상의 3T3 세포의 재세포화 ( Recellularization )
3T3 세포를 80% 컨플루언트까지 성장시킨 다음, 효소 처리 (1mM EDTA 중 0.25% 트립신) 및 5분 동안 500xg에서 원심 분리하여 수확하였다. 상기 수집된 세포를 배양 배지에 2x106 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 본원의 SCF 처리된 연골 이식편을 배양 배지로 미리 적셔 밤새 배양한 다음, 낮은 부착 24-웰 플레이트(low-attachment 24-well plates)(Corning)에 두었다. 상기 세포 현탁액(200uL)의 절반을 각 SCF-처리된 연골 이식편의 한쪽 면에 조심스럽게 놓고 상기 세포가 표면에 부착되도록 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 나머지 세포 현탁액을 방금 설명한 동일한 방법에 따라 SCF-처리된 연골 이식편의 다른 면 (즉, 세포와 접촉하지 않은 면) 상에 놓았다. 그 후 각 세포 접종된 연골 이식편을 2mL 배양 배지에서 7일 동안 배양하고, 다음 분석을 위해 10% 포르말린에 고정시켰다.
연골 이식편에서의 주요 연골 세포의 재세포화
상기 연골 이식편을 24-웰 플레이트 (200㎎/웰)에 넣은 다음 새로 단리된 연골 세포를 연골 이식편에 씨딩하였다. 최종 세포 수는 배지에서 웰당 1.2 x 107 세포였다. 상기 배지는 주 3회 교체되었다. 배양 2주 후, 상기 연골 이식편을 수집하여, 이후 분석을 위해 10% 포르말린에 고정시켰다.
압축 강도( Compressive strength )의 측정
모든 연골 샘플을 PBS 용액 중에서 적어도 16시간 동안 재수화시킨 다음, 상기 샘플의 형태에 의존하는 각각의 높이 및/또는 직경을 측정하였다; 상기 연골 샘플이 스트립 형태인 경우, 그 높이가 측정되었다; 다른 한편, 상기 연골 샘플이 디스크 형상인 경우, 시험 전의 직경이 기록되었다. 상기 압축 강도 측정은 Lloyd 장비 (LRX Instrument, England)에서 수행되었다. 각 테스트는 2N의 예압(preload)으로 시작되었고, 상기 로드 속도는 0.18 mm/분으로 설정되었으며, 상기 로드로 인해 샘플 높이 및/또는 직경이 65% 감소했을 때 테스트가 중단되었다.
실시예 1 : 연골 이식편의 제조 및 특성화
1.1 탈세포화 된 연골 이식편의 제조
돼지 관절을 멸균시키고 연골을 외과적으로 제거하였다. 연골을 물로 세척한 다음, 원하는 용도에 따라 다양한 크기 및 모양의 매트릭스로 다이싱하였다.
상기 연골 매트릭스를 먼저 수산화나트륨 용액 (1N)에 실온에서 3시간 동안 침지시킨 다음, 4℃에서 48시간 동안 과산화수소 용액(5%)에 침지시켰다. 각 용액 처리 후, 임의의 잔류 처리 용액을 제거하기 위해 연골 매트릭스를 다량의 물로 세척하였다.
이어서 연골 기질에 scCO2를 350 Bar, 37℃에서 100분 동안 처리하여 잔류 세포성 물질을 제거하여 탈세포화된 연골 이식편을 생성시켰고, 이 때, 감마선 (30 kGy)을 조사하고 사용하기 전까지는 건조하고 멸균된 상태로 보관하였다.
1.2 실시예 1.1의 연골 이식편의 특성 확인
모폴로지(morphology) 분석에 따르면, SCF 처리 전에, 잔류 세포성 물질이 연골 중 연골 세포를 포함하는 작은 공간인 라쿠나(lacuna)에서 관찰되었다 (도 1, 패널 A); 그러나 다양한 수준의 압력에서 SCF 처리 후, 이전에 라쿠나에서 관찰된 잔류 세포성 물질이 완전히 사라졌으며(도 1, 패널 B, C 및 D), 이는 상기 SCF 처리가 연골에서 세포성 물질을 제거하기 위한 효과적인 수단임을 확인했다. 그 결과는 H & E 염색, DAPI 및 알시안 블루 염색에 의해 확인되었는데, 세포핵 (도 2) 또는 산성 다당류 (예를 들어, 연골에서 글리코사미노글리칸)(도 3)는 양성 반응을 나타내지 않았다. 종합하면, 도 1 내지 도 3의 결과는 SCF 처리된 연골 이식편에 잔류 세포성 물질 (예 : 핵 및 탄수화물 잔기)이 존재하지 않음을 확인했다.
또한, 상기 SCF 처리된 연골 이식편의 다공성은 상대적으로 손상되지 않은 상태로 남아 있었고 (도 4), 3T3 세포 및 그 위에 1차 연골 세포를 재세포화시키는 것을 지원하고, 상기 1차 연골 세포가 실시예 1.1과 라쿠나(데이터 표시되지 않음)에 포매된 연골 이식편의 다공성 구조로 이동하는 것으로 관찰되었다.
실시예 1.1의 SCF 처리된 연골 이식편의 기계적 특성은 천연 연골의 기계적 특성보다 우수하였으며, 상기 실시예 1.1의 SCF 처리된 연골 이식편은 압축 시험에서 적어도 2배 이상의 스트레스를 견딜수 있었다(도 5).
상기 실시예의 설명은 단지 예로서 주어지며 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시예의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시예가 특정 정도로, 또는 하나 이상의 개별 실시 예를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 개시 내용의 개념 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시예에 대한 많은 변형을 행할 수 있다.

Claims (15)

  1. 다음을 포함하는, 무세포 연골 이식편을 제조하는 방법:
    (1) 동물의 연골을 다이싱(dicing)하여 복수의 연골 매트릭스를 생성시키는 단계;
    (2) 단계 (1)의 연골 매트릭스를 3 내지 24시간 동안 실온에서 수산화나트륨 용액으로 처리하는 단계;
    (3) 단계 (2)의 수산화나트륨 처리된 연골 매트릭스를 알콜, 산화제, 방사선, 페놀 화합물 및 4급 암모늄 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 살균제를 사용하여 살균(disinfect)하는 단계; 및
    (4) 단계 (3)의 살균된 연골 매트릭스를 초임계 이산화탄소(scCO2) 처리하여 무세포 연골 이식편을 제조하는 단계로, 상기 초임계 이산화탄소(scCO2) 처리는 150-350 bar의 압력하에 30-50℃에서 100분 동안 수행되고,
    상기 무세포 연골 이식편은 효소 분해 처리를 요구하지 않도록 구성되는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 연골이 돼지에서 얻어진 비강 연골, 갈비 연골, 귀 연골 또는 무릎 연골인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 각각의 연골 이식편은 디스크, 스트립, 원뿔 또는 입자로 형상화된 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 알콜은 에탄올 또는 이소프로판올이며, 산화제는 과산화수이며, 페놀 화합물은 파라벤, 벤조산 또는 살리실산이며, 4급 암모늄 화합물은 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride), 염화 알킬디메틸벤질암모늄(alkyldimethylbenzylammonium chloride), 염화 디데실디메틸암모늄(didecyldimethylammonium chloride) 또는 염화암모늄(ammonium chloride)인 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 온도는 37℃이고, 압력은 350bar 인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 무세포 연골 이식편 각각은 천연 연골의 2배 이상의 스트레스를 견딜 수 있는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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