KR102083306B1 - Genetic markers and methods for identifying species belong to Myxinidae - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다른 어종에 비하여 원시적이고 단순한 형태를 가지고 있어 육안으로 유사 종과의 비교 시 정확한 종 판별에 어려움이 있는 먹장어류 어종을 빠르게 정확하게 판별할 수 있는 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별방법을 제공한다. The present invention has a primitive and simple form compared to other fish species, and genetic markers for discriminating fish species, which can quickly and accurately discriminate between fish species that have difficulty in determining exact species when compared to similar species with the naked eye, and discrimination using the same. Provide a method.
Description
본 발명은 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것이다. The present invention relates to a genetic marker and a method for discriminating fish species, and more particularly, to a genetic marker and a method for discriminating fish species.
전 세계 꾀장어과 어류는 6속 81종이 보고되고 있고 국내 식용으로 꼼장어라고 불리우는 먹장어(Eptatretus burgeri)가 주요 경제 어종이라고 할 수 있다. 먹장어는 국내 남해안을 중심으로 서식하고 있으나 과도한 어획, 환경오염으로 인해 자연자원이 감소하였고 현재 국내 생산량은 약 40톤으로 그 수요를 충족시키기 위하여 미국, 일본, 캐나다, 뉴질랜드 등에서 6,000톤 이상 수입되고 있는 실정이다. 주로 미국에서 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii)가 수입되고 있으며 대부분 활어, 냉동상태로 수입되거나 일부 껍질이나 펠렛 상태로 수입되고 있다. 국내 수입되는 꾀장어과 어류는 우리나라에서 볼 수 없는 종들도 많이 유통되고 있으나 실질적으로 종이나 원산지가 다르게 표시되는 경우가 빈번하게 발생하고 있다. 먹장어류는 다른 어종에 비하여 원시적이고 단순한 형태를 가지고 있어 육안으로 유사종과의 비교 시 정확한 종판별에 어려움이 있다. 현재까지 유전자 감식을 통한 꾀장어과의 어류의 분자 계통에 대한 연구는 미토콘드리아 DNA의 16S rRNA 유전자를 이용한 연구가 이루어졌는데 국제생물바코드컨소시엄(CBOL, Consortium for the Barcode of life)에서는 전세계 생물종의 분류를 위해 cytochrome c oxidase subunit Ⅰ(COI) 유전자 영역을 생물종 분류하기 위한 공통의 바코드 영역으로 제안하고 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1720483호는 뱀장어 종 판별용 펩티드핵산(PNA) 프로브 세트 및 이를 이용한 뱀장어 종판별 방법에 대해 개시하고 있다. Eel and fish are reported in 6 genus and 81 species worldwide. Eptatretus burgeri , which is called eel for domestic consumption, is the main economic fish species. The eel lives in the southern coast of Korea, but natural resources have decreased due to excessive fishing and environmental pollution. Currently, domestic production is about 40 tons, and more than 6,000 tons are imported from the United States, Japan, Canada, and New Zealand to meet the demand. It is true. Pacific eel ( Eptatretus stoutii ) is mainly imported from the United States, mostly live fish, frozen or some shells or pellets. There are many species of eel and fish that are imported from Korea, which are not found in Korea, but are often marked differently from paper or origin. The black fish has a primitive and simple form compared to other fish species, which makes it difficult to discriminate accurately when compared with similar species. To date, genetic studies have examined the molecular lineage of the eel family through the use of mitochondrial DNA 16S rRNA genes. The Consortium for the Barcode of life (CBOL) has identified the classification of species in the world. To this end, we propose a common barcode region for classifying species in the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene region. In this regard, Korean Patent No. 1720483 discloses a peptide nucleic acid (PNA) probe set for eel species discrimination and an eel species discrimination method using the same.
그러나 상기 선행기술의 경우, 펩티드 핵산(PNA)을 이용하여 뱀장어 종마다 다른 융해온도의 분석에 따라 종 판별하는 방법으로 현재 먹장어의 종판별 방법은 아직 존재하지 않는다. However, in the case of the prior art, a species discrimination method of an eels is not yet present as a method for discriminating species according to an analysis of melting temperature of each eel species using a peptide nucleic acid (PNA).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 육안으로 유사종과의 비교 시 정확한 종판별에 어려움이 있는 먹장어류 어종을 특이적으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The present invention is to solve a number of problems, including the above problems, the fish species that can quickly and accurately determine the fish species that are difficult to determine the exact species when compared to similar species with the naked eye An object of the present invention is to provide a genetic marker for discrimination and a discrimination method. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제4포워드 프라이머; 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 꾀장어과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트가 제공된다. According to one aspect of the invention, the first forward primer consisting of a nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1; A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; A fourth forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; And a general-purpose reverse primer consisting of a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, a species-specific PCR kit for discriminating eel and fish species is provided.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 먹장어로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 꾀장어과 어종 판별방법이 제공된다. According to another aspect of the invention, the genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the fish; DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted by the PCR kit of claim 1; An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing the band pattern of the electrophoretic DNA.
상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커를 이용하여 다른 어종에 비하여 원시적이고 단순한 형태를 가지고 있어 육안으로 유사 종과의 비교 시 정확한 종판별에 어려움이 있는 먹장어류 어종을 빠르게 정확하게 판별할 수 있는 종 판별효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.As described above, according to one embodiment of the present invention, using a genetic marker for discriminating fish species, it has a primitive and simple form compared to other fish species, and it is difficult to accurately discriminate when comparing with similar species with naked eyes. A species discrimination effect can be realized to quickly and accurately identify fish species. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.
도 1은 본 발명의 먹장어류 mt-DNA CO1 영역의 염기서열 비교 및 종특이 마커 개발을 위한 프라이머 영역을 나타내는 그림이다.
도 2는 본 발명의 먹장어류 4종의 종특이 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용한 전기영동 사진이다. 1 is a diagram showing a primer region for the comparison of the nucleotide sequence of the mutant fish mt-DNA CO1 region of the present invention and the development of a species-specific marker.
Figure 2 is an electrophoresis picture using four species-specific multiplex PCR primers of the ink fish of the present invention.
용어의 정의:Definition of Terms:
본 문서에서 사용되는 "먹장어(Eptatretus burgeri)"는 먹장어목 꾀장어과에 속하는 바닷물고기로 다른 물고기에 달라붙어 살과 내장을 파먹는 기생어류이다. 뱀장어와 비슷한 생김새를 갖고 있으나, 경골어류(硬骨魚類)에 속하는 뱀장어, 갯장어, 붕장어와 달리, 턱이 없어 입이 둥근 원구류(圓口類)에 속하며 칠성장어와 유연관계를 갖는다. 주로 통발과 그물을 사용하여 포획하며 해방 이후 지갑, 구두 등의 가죽제품을 만들기 위해 가죽만 사용하고 버리던 먹장어를 싼값에 사다 구워 팔았던 것이 시초가 되어 식용하기 시작하였다.As used herein, " Eptatretus burgeri " is a saltwater fish belonging to the eel family, which is a parasitic fish that clings to other fish and eats flesh and intestines. It has a similar appearance to eel, but unlike eel, eel, and conger eel belonging to tibia, it has no jaws and is a round mouth (류 口 類). It was mainly caught using traps and nets, and after the liberation, they used only leather for making leather goods such as wallets and shoes.
발명의 상세한 설명:Detailed description of the invention:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제4포워드 프라이머; 및 서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 꾀장어과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트가 제공된다.According to one aspect of the invention, the first forward primer consisting of a nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1; A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; A fourth forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; And a general-purpose reverse primer consisting of a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, a species-specific PCR kit for discriminating eel and fish species is provided.
상기 종특이적 PCR 키트에 있어서, 국내 유통되는 먹장어 중 국내 먹장어(Eptatretus burgeri), 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii), 뉴질랜드 먹장어(Eptatretus cirrhatus) 및 캐나다 먹장어(Myxine limosa)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. In the species-specific PCR kit, it can be selected from the group consisting of domestic eel ( Eptatretus burgeri ), Pacific eel ( Eptatretus stoutii ), New Zealand eel ( Eptatretus cirrhatus ) and Canadian eel ( Myxine limosa ) among the eel in circulation in Korea. .
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 먹장어로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 꾀장어과 어종 판별방법이 제공된다. According to another aspect of the invention, the genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the fish; DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted by the PCR kit of claim 1; An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing the band pattern of the electrophoretic DNA.
상기 꾀장어과 어종 판별방법에 있어서, 상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 437 bp의 밴드가 확인되면 국내 먹장어(Eptatretus burgeri), 96 bp가 확인되면 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii), 209 bp가 확인되면 뉴질랜드 먹장어(Eptatretus cirrhatus), 및 325 bp가 확인되면 캐나다 먹장어(Myxine limosa)로 결정함으로써 수행될 수 있고 멀티플렉스(multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭할 수 있다. In the method of determining the eel and fish species, the step of analyzing the band pattern of the DNA is domestic eel ( Eptatretus burgeri ) when the band of 437 bp is confirmed, Pacific eel ( Eptatretus stoutii ), 209 bp is confirmed when 96 bp is confirmed New Zealand eel ( Eptatretus cirrhatus ), and 325 bp can be identified by determination as Canadian eel ( Myxine limosa ) and genomic DNA can be amplified by multiplex PCR.
먹장어(inshore hagfish)는 국내 남해안을 중심으로 서식하고 있으나 과도한 어획, 환경오염으로 인해 자연자원이 감소하였고 현재 국내 생산량은 약 40톤으로 수요를 충족시키기 위하여 미국, 일본, 캐나다, 뉴질랜드 등에서 6,000톤 이상 수입되고 있다. 해외에서 수입된 어류가 국내 유통되는 과정에서 종이나 원산지가 다르게 표시되는 경우가 자주 발생하고 있는데, 특히 먹장어류는 다른 어종에 비하여 원시적이고 단순한 형태를 가지고 있어 육안관찰만으로는 정확한 종판별이 어렵고, 먹장어류의 유전자 서열분석을 위해서는 많은 시간과 비용이 요구되므로, 본 발명자들은 서열분석 이전의 단계에서 종식별을 위한 쉽고 효율적인 방법이 필요함을 인식하고 이를 해결하기 위해 예의 노력한 결과 다중(multiplex) PCR 방법을 이용하여 국내 유통되는 꾀장어과 어류 4종을 신속하고 간편하게 판별할 수 있는 먹장어류 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법을 개발하였다. Inshore hagfish inhabit the southern coast of Korea, but natural resources have decreased due to excessive fishing and environmental pollution. Currently, domestic production is about 40 tons, and more than 6,000 tons in the US, Japan, Canada and New Zealand to meet the demand. It is imported. Papers and origins are often marked differently in the process of domestically imported fishes. Especially, the fishes have a primitive and simple form compared to other fish species, so it is difficult to discriminate precisely by visual observation alone. Since a lot of time and cost are required for gene sequencing, the present inventors have recognized that there is an easy and efficient method for identifying species at the stage before sequencing. We have developed a genetic marker and discrimination method for fish species identification that can be used to quickly and easily discriminate four kinds of eel and fish in Korea.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but can be implemented in various different forms, the following examples are intended to complete the disclosure of the present invention, the scope of the invention to those skilled in the art It is provided to inform you completely.
실시예 1: 게놈 DNA 추출 Example 1: Genomic DNA Extraction
본 발명자들은 꾀장어과(Myxinidae) 어류의 종 분석을 위해 국내산 먹장어(Eptatretus burgeri) 시료 30 개체, 국내에 수입된 미국산 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii) 30 개체와 뉴질랜드산 먹장어(Eptatretus cirrhatus) 5 개체와 캐나다산 먹장어(Myxine limosa) 50 개체를 포함하여 총 115 개체를 분석에 사용하였다. 구체적으로 상기 꾀장어과 샘플을 실험실로 이송한 후, 개별 표본의 조직을 제거하고 DNA 추출 전에 100% 에탄올로 보존하였고 MagExtractor MFX-6100 자동 DNA 추출 시스템(Toyobo, Osaka, Japan)을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 그 후, 상기 추출된 게놈 DNA를 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA)를 이용하여 정량하였으며, 분석에 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. The present inventors have sought jangeogwa (Myxinidae) Domestic hagfish for the kind of analysis of the fish (Eptatretus burgeri) samples 30 Object, Domestic US Pacific hagfish imports (Eptatretus stoutii) 30 objects and New Zealand hagfish (Eptatretus cirrhatus) 5 objects and Canadian A total of 115 individuals were used for analysis, including 50 individuals of Myxine limosa . Specifically, after transferring the sample of the eel eel to the laboratory, the tissues of individual samples were removed and preserved in 100% ethanol before DNA extraction, and genomic DNA was extracted using MagExtractor MFX-6100 automated DNA extraction system (Toyobo, Osaka, Japan). Extracted. The extracted genomic DNA was then quantified using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA) and stored at −20 ° C. until used for analysis.
실시예 2: 분자계통학적 분석 Example 2: Molecular Systematic Analysis
본 발명자들은 미토콘드리아 DNA의 COI 영역 유전자 분석을 위해 미국의 국립생물공학정보센터(National Center for biotechnology Information, NCBI, www.ncbi.nlm.nih)에 등록된 꾀장어과 어류 중 미토콘드리아 DNA의 염기 서열이 일부 분석된 Eptatretus burgeri(Accession No. AJ278504), Eptatretus stoutii (Accession No. GU440317), Eptatretus cirrhatus(Accession No. JX050996)와 Myxine limosa(Accession No. KC807332)의 유전자 서열을 바탕으로 Bioedit 플랫폼의 Clustal W 프로그램을 사용하여 COI 영역에서 먹장어과에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 위치를 확인하고 특이 프라이머를 제작하였다. 그 후 PCR 증폭은 10 pM 먹장어과 특이 프라이머(서열번호 5 및 6) 각 1 ㎕, DNA 1 ㎕, 증류수로 구성된 PCR 혼합물 20 ㎕를 AccuPower PCR Master Mix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 수행하였고 PCR 반응조건은 먼저 94℃에서 7분간 변성시키고, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 1분씩 총 35회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 7분간 신장시켜주는 과정을 거쳤다. 그 후 상기 증폭된 PCR 산물은 염기 서열 분석을 위해 Expin PCR SV(GeneAll Biotechnology, South Korea)를 사용하여 정제하였고 BigDye terminator v1.1(Applied Biosystems)를 이용하여 생어 방식의 염기서열 분석(Sanger sequencing)을 수행하였다. The present inventors have found that the nucleotide sequence of mitochondrial DNA in eel and fish is registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih) of the United States for gene analysis of COI region of mitochondrial DNA. Based on the analyzed gene sequences of Eptatretus burgeri (Accession No. AJ278504), Eptatretus stoutii (Accession No. GU440317), Eptatretus cirrhatus (Accession No. JX050996) and Myxine limosa (Accession No. KC807332), the Clustal W program of the Bioedit platform In the COI region, primer positions that can specifically bind to the eel family were identified and specific primers were prepared. PCR amplification was then performed using AccuPower PCR Master Mix (Bioneer, Daejeon, Korea) with 20 pL of PCR mixture consisting of 1 pL of 10 pM eel and specific primers (SEQ ID NOS: 5 and 6), 1 μl of DNA, and distilled water. The reaction conditions were first denatured at 94 ° C. for 7 minutes, repeated 45 times at 94 ° C., 45 seconds at 55 ° C., and 1 minute at 72 ° C., and finally extended at 72 ° C. for 7 minutes. The amplified PCR product was then purified using Expin PCR SV (GeneAll Biotechnology, South Korea) for sequencing and Sanger sequencing using BigDye terminator v1.1 (Applied Biosystems). Was performed.
그 후 상기 정제된 PCR 반응물 1 ㎕, 5x Big Dye terminator v1.1 sequencing buffer 2 ㎕, BigDye terminator reaction mix v1.1 0.8 ㎕, 0.1 pM 정방향 또는 역방향 프라이머 1 ㎕, 증류수 5.2 ㎕로 전체 10 ㎕의 반응액을 준비하였다. Then, 1 μl of the purified PCR reaction, 2 μl of 5x Big Dye terminator v1.1 sequencing buffer, 0.8 μl of BigDye terminator reaction mix v1.1, 1 μl of 0.1 pM forward or reverse primer, and 5.2 μl of distilled water. The liquid was prepared.
한편 Sequencing PCR 조건은 96℃에서 2분간 변성시키고 96℃에서 15초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분씩 총 25회 반복하였다. Sequencing PCR로 증폭된 DNA에 50 ml EDTA (pH 8.0) 1 ㎕, 600 mM sodium acetate(pH 5.2) 1 ㎕ 및 99.9% 에탄올 25 ㎕를 첨가하고, 4℃ 조건의 3,000 rpm(2,272×g)에서 45분간 원심분리 하였다. 그 후 70% 에탄올로 세척하였으며, 상온에서 10분간 건조시킨 후 10 ㎕ Hi-Di formamide(Applied Biosystems)로 DNA 펠렛을 녹여 ABI 3730 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 서열분석을 수행하였다. 또한, DNA Star SeqMan 소프트웨어(DNASTAR, USA)를 사용하여 상기 수집한 양방향 서열을 분석하였다.On the other hand, the sequencing PCR conditions were denatured at 96 ° C. for 2 minutes and repeated 25 times for 15 seconds at 96 ° C., 5 seconds at 50 ° C. and 2 minutes at 60 ° C. To the DNA amplified by sequencing PCR, 1 μl of 50 ml EDTA (pH 8.0), 1 μl of 600 mM sodium acetate (pH 5.2) and 25 μl of 99.9% ethanol were added and 45 at 3,000 rpm (2,272 × g) at 4 ° C. Centrifuged for a minute. Thereafter, the resultant was washed with 70% ethanol, dried at room temperature for 10 minutes, and DNA pellets were dissolved in 10 μl Hi-Di formamide (Applied Biosystems) and subjected to sequencing with ABI 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). In addition, the collected bidirectional sequences were analyzed using DNA Star SeqMan software (DNASTAR, USA).
실시예 3: 프라이머 제작 Example 3: Primer Preparation
본 발명자들은 DNA Sequence Polymorphism(DnaSP, ver. 5.10.01) 프로그램을 사용하여 종별 하플로타입(haplotype)을 분석하였으며, 종내 유전자 변이를 배제하고 모든 개체의 염기서열이 일치하는 동시에 종간에 차이를 나타내는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 유전자 부위를 확인하였다. 이후 종간 약 100bp 이상의 서열 차이를 두고 최적의 프라이머 부위를 선택하였으며, 단일염기다형성 유전자가 3' 말단에 위치하도록 종특이 정방향 프라이머를 제작하였다(도 1). We analyzed DNA haplotypes using the DNA Sequence Polymorphism (DnaSP, ver. 5.10.01) program, which excludes genetic variations within species and shows the differences between species while matching the nucleotide sequences of all individuals. Single nucleotide polymorphism (SNP) gene region was identified. Then, the optimal primer site was selected based on the sequence difference of about 100 bp or more between species, and a species-specific forward primer was prepared such that a single nucleotide polymorphism gene was located at the 3 'end (FIG. 1).
그 후, 멀티플랙스 PCR 증폭을 위한 프라이머 조성은 각각 0.2 ㎕씩의 정방향 프라이머(Eb-F/Es-F/Ec-F/Ml-F) 및 0.4 ㎕의 역방향 프라이머(hag-R)를 혼합하여 사용하였으며, 단일 PCR 반응을 통해 확립된 56℃의 어닐링(annealing) 온도에서 PCR 증폭을 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물 2 ㎕를 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 1x redsafe(iNtRON, South Korea)와 함께 전기영동하여 확인하였다. Subsequently, the primer composition for multiplex PCR amplification was mixed with 0.2 μl of forward primer (Eb-F / Es-F / Ec-F / Ml-F) and 0.4 μl of reverse primer (hag-R), respectively. PCR amplification was performed at an annealing temperature of 56 ° C. established through a single PCR reaction. 2 μl of the amplified PCR product was confirmed by electrophoresis with 1 × redsafe (iNtRON, South Korea) on a 1% agarose gel.
그 결과, PCR 산물의 크기 차이에 따라 국내산 먹장어(437 bp), 태평양 먹장어(96 bp), 뉴질랜드 먹장어(209 bp), 캐나다 먹장어(325 bp)임을 확인하였으며 비특이적인 증폭도 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 2). 상기 멀티플랙스 PCR 증폭에 사용된 프라이머에 대한 정보를 하기 표 1에 요약하였다. As a result, according to the size difference of the PCR product, it was confirmed that the domestic eel (437 bp), Pacific eel (96 bp), New Zealand eel (209 bp), Canadian eel (325 bp) and non-specific amplification did not occur ( 2). Information on the primers used for the multiplex PCR amplification is summarized in Table 1 below.
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결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 디자인된 종특이적 프라이머에 의한 멀티플렉스 PCR 분석법은 다른 어종에 비하여 원시적이고 단순한 형태를 가지고 있어 육안으로 유사 종과의 비교 시 정확한 종 판별에 어려운 꾀장어과(먹장어류) 어종 4종에 대해 감별력이 우수한 것을 확인하였고 특이도 및 민감도가 우수하여 향후 먹거리 안전을 위한 수산물의 수출입 및 유통 관리의 정확한 종명 표기를 가능하게 하는 효과적인 방법으로 활용될 수 있다. In conclusion, the multiplex PCR assay using a species-specific primer designed according to an embodiment of the present invention has a primitive and simple form compared to other fish species. (Duckfish) It has been confirmed that it has excellent discrimination ability against four species, and it has excellent specificity and sensitivity, so it can be used as an effective method that enables accurate labeling of the import and export and distribution management of aquatic products for future food safety.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above-described embodiments, these are merely exemplary, and it will be understood by those skilled in the art that various modifications and equivalent other embodiments are possible. Therefore, the true technical protection scope of the present invention will be defined by the technical spirit of the appended claims.
<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Genetic markers and methods for identifying species belong to Myxinidae <130> PD18-5680 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eb-F <400> 1 cttcatagtt ataccaatta tg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Es-F <400> 2 tcccattatt tgtatgatca atc 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ec-F <400> 3 agatttaacc attttttcac tt 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MI-F <400> 4 ttgcccccat cacttata 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hag-F <400> 5 aggrycytta mtyaayaat 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hag-R <400> 6 cgatcagtka gtaytatagt 20 <110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Genetic markers and methods for identifying species belong to Myxinidae <130> PD18-5680 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eb-F <400> 1 cttcatagtt ataccaatta tg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Es-F <400> 2 tcccattatt tgtatgatca atc 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ec-F <400> 3 agatttaacc attttttcac tt 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MI-F <400> 4 ttgcccccat cacttata 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hag-F <400> 5 aggrycytta mtyaayaat 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hag-R <400> 6 cgatcagtka gtaytatagt 20
Claims (5)
서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머;
서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머;
서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제4포워드 프라이머; 및
서열번호 6으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 국내 유통되는 먹장어 중 국내 먹장어(Eptatretus burgeri), 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii), 뉴질랜드 먹장어(Eptatretus cirrhatus) 및 캐나다 먹장어(Myxine limosa)로 구성되는 군으로부터 선택되는 꾀장어과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트.A first forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
A fourth forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; And
Among domestically available eel, Eptatretus burgeri , Pacific eel ( Eptatretus stoutii ), New Zealand eel ( Eptatretus cirrhatus ) and Canadian eel ( Myxine limosa ) Species specific PCR kit for determining the eel and fish species selected from the group consisting of.
제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 국내 유통되는 먹장어 중 국내 먹장어(Eptatretus burgeri), 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii), 뉴질랜드 먹장어(Eptatretus cirrhatus) 및 캐나다 먹장어(Myxine limosa)로 구성되는 군으로부터 선택되는 꾀장어과 어종 판별방법. A genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the eel;
DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted by the PCR kit of claim 1;
An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing the band pattern of the electrophoretic DNA, which comprises domestic eel ( Eptatretus burgeri ), Pacific eel ( Eptatretus stoutii ), New Zealand eel ( Eptatretus cirrhatus ), and Canadian eel ( Myxine limosa ). Method of discriminating eels and fish species selected from the group to be.
상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 437 bp의 밴드가 확인되면 국내 먹장어(Eptatretus burgeri), 96 bp가 확인되면 태평양 먹장어(Eptatretus stoutii), 209 bp가 확인되면 뉴질랜드 먹장어(Eptatretus cirrhatus), 및 325 bp가 확인되면 캐나다 먹장어(Myxine limosa)로 결정함으로써 수행되는, 방법. The method of claim 3,
The step of analyzing the DNA band pattern is 437 bp band is confirmed domestic eel ( Eptatretus burgeri ), 96 bp is confirmed Pacific eel ( Eptatretus stoutii ), 209 bp is confirmed New Zealand eel ( Eptatretus cirrhatus ), and 325 The method is performed by determining the Canadian eel ( Myxine limosa ) once the bp is identified.
멀티플렉스(multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭하는, 방법.The method of claim 3,
Amplification of genomic DNA by multiplex PCR.
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