KR101380779B1 - Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same - Google Patents
Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR101380779B1 KR101380779B1 KR1020120077094A KR20120077094A KR101380779B1 KR 101380779 B1 KR101380779 B1 KR 101380779B1 KR 1020120077094 A KR1020120077094 A KR 1020120077094A KR 20120077094 A KR20120077094 A KR 20120077094A KR 101380779 B1 KR101380779 B1 KR 101380779B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- loach
- domestic
- chinese
- origin
- primer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 241000332718 Misgurnus mizolepis Species 0.000 title description 2
- 241000252185 Cobitidae Species 0.000 claims abstract description 83
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 101100329008 Artemia franciscana COI gene Proteins 0.000 abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 abstract description 4
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 abstract 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 abstract 1
- 241000797800 Oxidae Species 0.000 abstract 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000008676 import Effects 0.000 description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000252206 Cypriniformes Species 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 235000011447 Geum Nutrition 0.000 description 1
- 241000220313 Geum Species 0.000 description 1
- 241001670157 Gymnura Species 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/12—Meat; Fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
국내산 미꾸라지와 중국산 미꾸라지의 식별을 위한 과학적인 판별기술 개발에 대한 필요성과 중요성이 대두되고 있는 시점에서, 본 발명은 미꾸라지의 미토콘드리아 DNA의 D-loop 유전자와 cytochrome c oxidae I (COI) 유전자의 국내산과 중국산 미꾸라지의 집단 특이 변이 사이트를 이용하여 경제적이면서 간편한 국내산과 중국산 미꾸라지 식별을 위한 프라이머를 개발하였다. 본 발명을 위하여 먼저 국내산과 중국산 미꾸라지로부터 genomic DNA를 분리한 후, D-loop과 COI 유전자의 염기서열을 분석하여 국내산과 중국산 집단간에 차이를 보이는 집단 특이 변이 사이트를 탐색하고, 이에 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작하여 국내산 미꾸라지에서만 증폭이 일어나고 중국산 미꾸라지에서는 증폭이 일어나지 않도록 구성하였다. 개발된 프라이머를 검증한 결과 PCR 및 전기영동만으로 신속하고 정확하게 국내산과 중국산 미꾸라지 원산지를 식별할 수 있음을 확인하였다.At the time when the necessity and importance of the development of scientific discrimination technology for the identification of domestic and Chinese loach are emerging, the present invention provides the D-loop and cytochrome c oxidae I (COI) genes of mitochondrial DNA of loach. Using the site-specific mutation sites of Chinese loach, we developed primers for the identification of economic and convenient domestic and Chinese loach. For the present invention, first, genomic DNA is isolated from domestic and Chinese loach, and then the nucleotide sequences of the D-loop and CO I genes are analyzed to search for population specific site showing differences between domestic and Chinese populations. By constructing a primer to bind amplification occurs only in domestic loach, it is configured so that amplification does not occur in Chinese loach. As a result of verifying the developed primers, it was confirmed that the origin of domestic and Chinese loach can be identified quickly and accurately only by PCR and electrophoresis.
Description
본 발명은 미꾸라지 원산지 식별용 프라이머 및 이를 이용한 식별방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 국내산 미꾸라지와 중국산 미꾸라지의 원산지 식별을 위한 프라이머와 상기 프라이머를 이용하여 국내산 미꾸라지와 중국산 미꾸라지의 원산지를 식별할 수 있도록 한 미꾸라지의 원산지 식별용 프라이머 및 이를 이용한 식별방법에 관한 것이다.The present invention relates to a primer for identifying loach origin and a method for identifying same using loach, and more specifically, to identify the origin of domestic loach and Chinese loach using the primer and the primer for identifying the origin of domestic loach and Chinese loach. It relates to a primer for identifying the origin of a loach and an identification method using the same.
미꾸라지(Misgurnus mizolepis)는 분류학적으로 잉어목(order Cypriniformes), 미꾸리과(family Cobotidae)에 속하는 소형 담수 어종으로서, 중국, 타이완 그리고 우리나라 전역에 서식하고 있다. 미꾸라지는 미꾸리와 더불어 예부터 식용으로 이용되어 왔으나, 하천의 오염과 농약의 남용으로 인하여 국내의 생산량은 2005년 이후부터 점점 줄어들고 있는 실정이다. 게다가 중국산 미꾸라지가 수입되기 시작하여 1990년대 후반부터는 수입량이 큰 폭으로 늘어 국내시장을 완전히 장악했다. 단적으로 미꾸라지 수입 물량은 2008년 약 10,500여 톤, 약 450억 원에 달하지만 국내 생산 물량은 432톤에 불과하다. 더욱이 국내 생산량의 일부는 중국산 미꾸라지를 수입해 국내 양식장에 종묘로 입식, 3개월간 축양하여 국내산으로 판매하는 등의 형태이기 때문에 실질적인 국내산 미꾸라지의 생산량은 극히 일부인 실정이다. 위와 같은 현상에 따라 국내의 미꾸라지 종묘생산업이 경쟁력을 상실하는 수준까지 도달하였다. Misgurnus mizolepis ) is a small class of freshwater fish belonging to the taxonomy of Order Cypriniformes and Family Cobotidae, inhabiting China, Taiwan and all over Korea. Loach has been used for food along with loach, but domestic production has been decreasing since 2005 due to river pollution and abuse of pesticides. In addition, Chinese loach began to be imported, and from the late 1990s, imports increased dramatically and completely dominated the domestic market. In 2008, loach imports amounted to about 10,500 tons and 45 billion won, but domestic production is only 432 tons. In addition, since some of the domestic production is imported from Chinese loach, stocked as stock seedlings in domestic farms, and raised for three months to sell domestically, actual production of domestic loach is very small. According to the above phenomenon, the loach seedling industry in Korea has reached the level of losing competitiveness.
최근에는 전 세계의 자유무역 체제 전환으로 인해 고율의 관세가 철폐되거나 낮아지고 있어 더욱 국내산의 경쟁력이 크게 악화되고 있다. 더욱이 다수의 소비자들은 국내산 선호현상에 따라 가격이 높음에도 불구하고 국내산 수산물을 선택하기 때문에, 값싼 중국산 미꾸라지를 수입한 뒤 원산지를 허위 기재하여 국내산으로 둔갑시켜 막대한 차익을 얻거나 불법 유통하는 업체가 있어 그 피해는 그대로 소비자에게 돌아가고 있다. 뿐만 아니라 중국산 미꾸라지의 대량 수입으로 인해 시장에 공급되는 대부분의 미꾸라지는 중국산으로서, 이는 방생을 통해 인위적으로 자연에 유입되어 우리나라 미꾸라지와 교잡하여 유전적 오염을 일으킬 가능성이 높으며, 서식지가 달라 중국산 고유의 질병을 옮길 가능성 또한 높아 수산생태계의 혼란을 야기할 수도 있다.Recently, due to the change of the world's free trade system, high-rate tariffs are being abolished or lowered, making domestic competitiveness even worse. Moreover, many consumers select domestic fishery products despite the high price according to domestic preferences.Therefore, there are companies that import cheap Chinese loach and make huge profits by misrepresenting their origin and domestically importing them. The damage is still going to consumers. In addition, most of the loach supplied to the market due to the mass import of Chinese loach is made in China, which is artificially introduced into nature through fire prevention, which is highly likely to cause genetic pollution by hybridizing with our loach. It is also highly likely to spread the disease, which can lead to fisheries disruption.
선진국의 경우 고유의 어종에 관한 정부의 적극적인 관심으로 일본의 경우 수입산 및 자국산 고등어의 rapid PCR-RFLP method로 연안산과 대서양산의 식별 기술 개발(Futoshi Aranishi, Marine Biotechnology, 2005, Vol. 7, No. 6, pp 571-575), 수입산 갈치의 mtDNA 분석 등을 통해 자국 내 수입어류에 관한 원산지 식별 기술 개발(Chakraborty et al., Zoological Studies, 2006, Vol. 45, No. 3, pp 419-427) 등을 이룬 바 있으며, 미국의 경우도 농무성 산하 FAS (Foreign agricultural service)에서 정보관리를 하는 등 정부 기관 운영 하에 원산지 식별 기술에 노력을 기울이고 있다.In developed countries, due to the government's active interest in indigenous fish species, in Japan, the rapid PCR-RFLP method of imported and domestic mackerel developed coastal and atlantic ocean identification technology (Futoshi Aranishi, Marine Biotechnology, 2005, Vol. 7, No. 6, pp 571-575), Development of country identification technology for imported fish in Korea through analysis of mtDNA of imported cutlass (Chakraborty et al., Zoological Studies, 2006, Vol. 45, No. 3, pp 419-427) In the case of the United States, the government is making efforts to identify the country of origin under the operation of government agencies, such as managing information in the Foreign Agricultural Service (FAS) under the USDA.
물론 국내의 경우도 최근 들어 수산물의 원산지 식별 기술 개발에 관심을 보이고 있으며, 아귀 원산지 판별용 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 아귀 원산지 판별방법(국내특허출원 10-2011-0121083), 홍어과 또는 가오리류에 속하는 어류의 분류체계 결정 방법과 이와 관련된 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트(국내특허출원 10-2006-0073749) 등이 특허출원된 바 있다. 이 외 갈치(등록특허공보 10-1131789), 고등어, 낙지, 뱀장어, 옥돔 등에서 유전자를 이용한 원산지 식별 기술이 개발되고 있으나, 옥수수, 벼와 같은 작물이나 한우와 같은 축산물에 비해 수산물의 원산지 식별 기술은 그 수준이 미비한 실정이며, 미꾸라지의 원산지 식별에 관해 인식한 연구는 아직까지 없는 실정이다.Of course, in Korea, the interest of developing the country of origin identification technology in recent years, and the polynucleotide for determining the origin of the devil and the method of determining the devil's origin using the same (domestic patent application 10-2011-0121083), the fish belonging to the skate family or stingray The method of determining the classification system of the polynucleotide probes, DNA chips and kits related thereto (Korean patent application 10-2006-0073749), and the like has been patented. In addition, origin identification technology using genes has been developed in cutlass (registered patent publication No. 10-1131789), mackerel, octopus, eel, jade dome, etc. The level is inadequate, and there are no studies that have recognized the origin of loach.
현재까지 국내산 미꾸라지와 중국에서 수입된 중국산 미꾸라지는 체장, 체고 등의 차이로 간단한 비교 형태학적 분류법으로 구분하는 방법만이 사용되고 있다. 종의 분류에 있어 비교 형태학적 분류법은 오랜 역사를 가지고 있기 때문에 비교적 정확한 편이지만 미꾸라지처럼 연구가 미진한 분류군, 형질확인이 어려운 소형 분류군, 식별 형질을 확보하기 어려울 정도로 형태적 특성이 단순하거나 변이성이 큰 분류군의 경우는 형태적 형질에만 의존할 경우 여전히 심각한 분류학적 오류가 생길 수 있고, 두 집단 간의 경계 설정에 어려움이 있어 분류 자체의 정확성이 크게 떨어질 수도 있다.To date, only domestic loach and Chinese loach imported from China are used by simple comparative morphological taxonomy due to differences in body length and height. Comparative morphological taxonomy is relatively accurate in the classification of species, but it is relatively inexpensive, such as loach, a small taxa that is difficult to identify, and its morphological characteristics are simple or mutant enough to make it difficult to obtain identification traits. In the case of taxonomic groups, relying only on morphological traits can still lead to serious taxonomic errors and the difficulty of demarcation between the two groups can significantly reduce the accuracy of the classification itself.
이러한 비교 형태학적 분류법의 문제를 해결하기 위하여, 최근에는 생물이 가지고 있는 유전자의 염기서열을 분석하여 생물의 계통을 추론하는 분자계통학을 이용한 분자계통분석법이 가장 강력한 생물 계통 추적법의 하나로 인정되어 널리 활용되고 있다. 이러한 분자계통분석법은 종간의 정확한 동정 및 계통 분석이 가능하다는 장점이 있어, 관련 연구자들로부터 DNA taxonomy란 개념이 제기되면서 많은 주목을 받고 있으며, 이미 이를 활용하여 다양한 종 또는 계통을 구분할 수 있는 분자 마커 기술이 개발되고 있다.In order to solve the problem of comparative morphological taxonomy, molecular system analysis using molecular systemology that infers the lineage of a gene by analyzing the nucleotide sequence of the organism has recently been recognized as one of the most powerful biological lineage tracking methods. It is widely used. Such molecular system analysis has the advantage of being able to accurately identify and analyze lineages, which has attracted a lot of attention as the concept of DNA taxonomy has been raised by related researchers, and molecular markers can be used to distinguish various species or lines already. Technology is being developed.
따라서 본 발명에서는 국내산과 중국산 미꾸라지의 원산지 식별을 위하여 분자계통학적, 집단유전학적 기법을 이용하여 신속하고 간편하며 정확한 미꾸라지 원산지 식별용 프라이머를 개발하고자 하였다.Therefore, in the present invention, to identify the origin of domestic and Chinese loach, we tried to develop a rapid, simple and accurate primer for identifying loach origin.
본 발명의 목적은 상기한 바와 같이 중국산 미꾸라지의 수입으로 인한 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 국내산 및 중국산 미꾸라지 상호 간에 원산지 식별이 가능한 프라이머 및 상기 프라이머를 이용한 국내산 미꾸라지와 중국산 미꾸라지의 원산지 식별 방법을 제공함에 있다.An object of the present invention has been proposed to solve the problems caused by the import of Chinese loach as described above, the domestic and Chinese loach, the origin of the identification between each other and the method of identifying the origin of domestic loach and Chinese loach using the primer In providing.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 미꾸라지의 D-loop 유전자 또는 CO I 유전자 내에서 탐색된 국내산 미꾸라지와 중국산 미꾸라지의 집단 특이 변이 사이트를 이용하여 미꾸라지 원산지 식별을 위한 프라이머 세트를 개발해내었다.In order to achieve the above object, the present invention has developed a primer set for identifying loach origin by using population-specific mutation sites of domestic loach and Chinese loach searched within D-loop gene or CO I gene of loach.
또한, 본 발명에서는 미꾸라지의 genomic DNA를 분리하는 단계; 상기 DNA를 미꾸라지 원산지 식별용 프라이머에 결합시키는 단계; 상기 결합 여부에 따라 미꾸라지 원산지를 식별하는 단계를 포함하는 미꾸라지의 원산지 식별 방법을 개발해내었다.In addition, the present invention comprises the steps of separating genomic DNA of loach; Binding the DNA to a loach origin identifying primer; The origin identification method of loach has been developed, comprising the step of identifying loach origin according to the binding.
본 발명에 따른 국내산과 중국산 미꾸라지의 원산지 식별 방법은 분자생물학적인 기술을 이용하는 것으로서, 기존의 형태적 형질에만 의존할 경우 생길 수 있는 분류학적 오류를 줄일 수 있다. 또한, 단 한번의 PCR 증폭 및 전기영동을 통하여 국내산과 중국산 미꾸라지를 식별할 수 있으므로, 신속하고 간편하며 정확성이 높아 원산지 식별의 효율성과 실용성을 극대화할 수 있는 장점이 있다.The method for identifying the origin of domestic and Chinese loach according to the present invention uses molecular biological techniques, and can reduce the taxonomic error that may occur when relying only on existing morphological traits. In addition, since domestic and Chinese loach can be identified through a single PCR amplification and electrophoresis, it is quick, easy and accurate, and has the advantage of maximizing efficiency and practicality of origin identification.
본 발명에 따라 신속하고 정확한 미꾸라지 원산지 식별이 이루어지면 중국산 미꾸라지의 유통경로가 투명화됨으로써 소비자의 알권리의 충족과 수산물 이용에 대한 인식 개선이 이루어질 것이다. 또한, 원가경쟁을 위해 국내 미꾸라지의 고품질화도 자연스럽게 진행될 것이며, 우리나라의 고유 어종에 대한 정확한 동정 및 보호를 위한 기초적인 개발이 될 것이다.According to the present invention, if the origin of the loach is quickly and accurately identified, the distribution path of the loach made in China becomes transparent, thereby improving the awareness of the consumer's right to know and the use of aquatic products. In addition, the quality of domestic loach will be naturally progressed for cost competition, and it will be a basic development for accurate identification and protection of native fish species in Korea.
도 1은 본 발명의 프라이머를 이용하여 획득한 multiplex PCR 산물의 전기영동 사진이다.
96nd : 1996년산 낙동강, gr : 금강, dj : 동진강, mk : 만경강, nd : 낙동강, sj : 섬진강, ys : 영산강, hr : 한강 미꾸라지1 is an electrophoretic photograph of a multiplex PCR product obtained using the primer of the present invention.
96nd: Nakdong River from 1996, gr: Geum River, dj: Dongjin River, mk: Mangyeong River, nd: Nakdong River, sj: Seomjin River, ys: Yeongsan River, hr: Han River Mudfish
이하에서 본 발명의 실시예를 참고로 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments of the present invention.
<실시예 1 : 미꾸라지 지느러미 조직으로부터 genomic DNA 추출>Example 1 Genomic DNA Extraction from Loach Fin Tissue
프라이머를 개발하기 위한 재료로서, 중국산 미꾸라지는 2009년 5월 중국 청도 자연에서 수집하여 생산된 양식산 개체와 2009년 12월 상해시장에서 구입한 개체 및 2011년 3월에 중국 연운강에서 수입된 개체 중 10마리를 사용하였으며, 국내산 미꾸라지는 부경대학교에서 기증받은 1996년 낙동강에서 채집된 5개체와 2010년에 낙동강에서 채집한 5개체를 이용하였다. Genomic DNA의 추출은 각 개체의 꼬리지느러미를 약 1 cm2 정도 절단하여 통상적인 페놀 추출법을 이용하여 추출하였으며, 이를 희석하여 100 ng/㎕로 정량하였다.
As a material for developing primers, Chinese loach was collected from aquaculture in Qingdao, China in May 2009, purchased from Shanghai market in December 2009, and imported from Lianyungang in March 2011. Ten animals were used, and five Korean loach were collected from the 1996 Nakdong River donated by Pukyong National University and five from the Nakdong River in 2010. Genomic DNA extraction was performed by cutting the tail fin of each individual by about 1 cm 2 and extracting it using a conventional phenol extraction method.
<실시예 2 : 미꾸라지 미토콘드리아 DNA의 D-loop 및 COI 유전자의 증폭>Example 2 Amplification of D-loop and CO I Genes of Loach Mitochondrial DNA
먼저 미꾸라지의 미토콘드리아 DNA의 D-loop 유전자와 COI 유전자를 증폭하기 위하여, 원산지와 상관없이 미꾸라지의 D-loop 유전자와 COI 유전자를 각각 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 GenBank에서 이용 가능한 다양한 어종들의 유전정보를 내려받은 후, 이를 BioEdit 7.0.1의 ClustalW를 이용하여 다중서열정렬을 수행하여 보존성이 높은 부분의 염기서열 정보를 바탕으로 제작하였다. 미꾸라지의 D-loop 유전자와 COI 유전자 증폭에 각각 이용된 프라이머 염기서열은 표 1에 제시하였다.
First, in order to amplify the D-loop gene and CO I gene of the loach mitochondrial DNA, primers for amplifying the D-loop gene and the CO I gene of loach regardless of origin were prepared. After the primers have downloaded the genetic information of the various fish species available in GenBank, they were multi-sequenced using ClustalW of BioEdit 7.0.1 and prepared based on the highly conserved nucleotide sequence information. Primer sequences used for amplification of D-loop and CO I genes in loach are shown in Table 1.
D-loop RD-loop F
D-loop R
TGCGGAGRCTTGCATGTGTAGCATCGGWCTTGTAATCCGA
TGCGGAGRCTTGCATGTGTA
2020
20
COI R CO I F
CO I R
CCAACKGTGAACATGTGATGGCGTCTYTGGATTTGCAATC
CCAACKGTGAACATGTGATG
2020
20
PCR 반응은 20㎕ 용적의 AccuPower PCR Premix Kit(Bioneer, Korea)에 실시예 1에서 추출된 각 개체별 genomic DNA 1㎕와 10 pmole의 프라이머 1㎕를 넣은 후, 94℃에서 4분간 초기 열변성 반응을 시킨 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분의 순환 반응을 35회 실시하였다. 최종적으로 72℃ 7분간의 신장 반응을 시킨 후, PCR 반응의 성공 여부를 GelRed (Invitrogen, USA)로 염색된 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
PCR reaction with 20µl AccuPower 1μl of each genomic DNA extracted from Example 1 and 1μl of 10 pmole primer were added to PCR Premix Kit (Bioneer, Korea), and then subjected to an initial heat denaturation reaction at 94 ° C. for 4 minutes, followed by 94 ° C. for 30 seconds. , 55 ° C 30 seconds, 72 ° C 1 minute circulation reaction was carried out 35 times. Finally, the stretch reaction was performed at 72 ° C. for 7 minutes, and the success of the PCR reaction was confirmed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel stained with GelRed (Invitrogen, USA).
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 기재한 바와 같은 미꾸라지의 genomic DNA를 추출하는 방법이나, 미꾸라지의 미토콘드리아 DNA 중 D-loop 유전자나 COI 유전자를 PCR로 증폭하는 방법은 하나의 예시일 뿐, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 다른 DNA 추출 방법이나, 표 1에 제시된 프라이머 이외에 알려진 D-loop 유전자나 COI 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하는 방법이나, 변형된 PCR 증폭 조건 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백할 것이다.
The method of extracting genomic DNA of loach as described in Examples 1 and 2, or the method of amplifying D-loop gene or CO I gene in mitochondrial DNA of loach by PCR is just one example. It is not limited. Other DNA extraction methods known to those skilled in the art, methods using a primer capable of amplifying known D-loop genes or CO I genes in addition to the primers shown in Table 1, or modified PCR amplification conditions It will also be apparent that they fall within the scope of the invention.
<실시예 3 : 증폭된 유전자의 염기서열 분석>Example 3 Sequence Analysis of Amplified Genes
실시예 2에서 각각 증폭된 국내산과 중국산 미꾸라지의 D-loop 유전자와 COI 유전자가 증폭된 산물을 각각 AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer)를 이용하여 정제한 후, 자동염기서열분석기(ABI 3700; Perkin Elmer)를 통한 Direct_sequencing 방법으로 각 유전자의 염기서열을 결정하였다. AccuPrep amplified products of D-loop and CO I genes of domestic and Chinese loach, respectively, amplified in Example 2, respectively. After purification using PCR Purification Kit (Bioneer), the nucleotide sequence of each gene was determined by Direct_sequencing method using an automatic base sequencer (ABI 3700; Perkin Elmer).
염기서열 분석 결과 D-loop 유전자는 970 bp가 모든 개체에서 성공적으로 증폭되었고, CO I 유전자도 1551 bp가 모든 개체에서 성공적으로 증폭되었다. 분석된 염기서열을 BioEdit 7.0.1의 ClustalW를 이용하여 다중서열정렬을 수행하였으며, 이를 통해 국내산 미꾸라지의 D-loop 유전자의 염기서열(서열번호 1), 중국산 미꾸라지의 D-loop 유전자의 염기서열(서열번호 2), 국내산 미꾸라지의 COI 유전자의 염기서열(서열번호 3), 중국산 미꾸라지의 COI 유전자의 염기서열(서열번호 4)을 최종 결정하였다.
Sequencing showed that the D-loop gene successfully amplified 970 bp in all subjects. I gene was also successfully amplified 1551 bp in all individuals. The analyzed sequences were subjected to multiple sequence alignment using ClustalW of BioEdit 7.0.1. Through this, the nucleotide sequence of the D-loop gene of domestic loach (SEQ ID NO: 1) and the base sequence of the D-loop gene of Chinese loach ( SEQ ID NO: 2), the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the CO I gene of domestic loach, and the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) of the CO I gene of Chinese loach.
<실시예 4 : 국내산과 중국산 미꾸라지의 집단 특이 변이 사이트 검출>Example 4 Detection of Group-Specific Mutation Sites of Domestic and Chinese Loach
실시예 3에서 최종 결정된 염기서열들을 비교 검토한 결과, D-loop 유전자인 서열번호 1과 서열번호 2는 99% 이상이 일치하는 것으로 나타났으나, 그 중 70번째, 608번째, 844번째 염기서열이 국내산과 중국산 미꾸라지 집단 특이 변이 사이트임을 발견하였다. COI 유전자의 경우도 서열번호 3과 서열번호 4는 99% 이상이 일치하는 것으로 나타났으나, 그 중 315번째, 1475번째 염기서열이 국내산과 중국산 미꾸라지 집단 특이 변이 사이트임을 발견하였다.As a result of comparing and comparing the nucleotide sequences finally determined in Example 3, it was found that more than 99% of the D-loop genes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were identical, but 70, 608, and 844 nucleotide sequences among them. It was found that this is a site specific mutation site for domestic and Chinese loach. In the case of the CO I gene, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were found to be more than 99% identical, but among them, the 315th and 1475th sequences were found to be site-specific mutation sites of domestic and Chinese loach.
상세한 집단 특이 변이 사이트의 정보는 표 2에 제시하였다.Details of the population specific variation sites are shown in Table 2.
<실시예 5 : 집단 특이 변이 사이트를 이용한 프라이머 제작>Example 5 Preparation of Primer Using Group Specific Mutation Sites
실시예 4에서 발견된 집단 특이 변이 사이트 중 서열번호 1의 608번째 사이트와 결합하는 22 mer의 forward 프라이머(서열번호 5)와 서열번호 1의 844번째 사이트와 상보적으로 결합하는 19 mer의 reverse 프라이머(서열번호 6)를 제작하였다. 이는 국내산 미꾸라지의 D-loop 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 프라이머 세트로서, 국내산 미꾸라지에서는 증폭이 일어나고, 중국산 미꾸라지에서는 증폭이 일어나지 않도록 제작되었다.Of the population specific mutation sites found in Example 4, 22 mer forward primer (SEQ ID NO: 5) that binds to the 608th site of SEQ ID NO: 1 and 19 mer reverse primer that complementarily binds to the 844 site of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 6) was produced. It is a pair of primer sets that can amplify a part of D-loop gene of domestic loach, and it is designed so that amplification occurs in domestic loach and no amplification occurs in Chinese loach.
이와 더불어 실시예 4에서 발견된 집단 특이 변이 사이트 중 서열번호 3의 315번째 사이트와 결합하는 19 mer의 forward 프라이머(서열번호 7)와 서열번호 3의 1475번째 사이트와 상보적으로 결합하는 15 mer의 reverse 프라이머(서열번호 8)를 제작하였다. 이는 국내산 미꾸라지의 COI 유전자 일부를 증폭시킬 수 있는 한 쌍의 프라이머 세트로서, 국내산 미꾸라지에서는 증폭이 일어나고, 중국산 미꾸라지에서는 증폭이 일어나지 않도록 제작되었다.In addition, 19 mer forward primer (SEQ ID NO: 7) that binds to the 315th site of SEQ ID NO: 3 and 15 mer of 15 mer that complementarily bind to the 1475 th site of SEQ ID NO: 3 among the population specific mutation sites found in Example 4 A reverse primer (SEQ ID NO: 8) was prepared. This is a pair of primer sets that can amplify a portion of the domestic I loach CO I gene, it was designed to amplify in domestic loach, but not amplification in Chinese loach.
상세한 프라이머 정보는 표 3에 제시하였다.
Detailed primer information is shown in Table 3.
유전자origin
gene
프라이머 이름For identification of origin
Name of the primer
(5'→3')Pry and nucleotide sequence
(5 '→ 3')
(bp)Amplification Size
(bp)
<실시예 6 : 개발된 프라이머의 검증>Example 6 Verification of Developed Primer
실시예 5에서 개발된 두 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 효과적으로 국내산과 중국산 미꾸라지의 원산지를 식별할 수 있는지 검증하고자 하였다. 국내산 미꾸라지로는 1996년 낙동강, 금강, 동진강, 만경강, 낙동강, 섬진강, 영산강, 한강에서 채집된 1개체씩 총 8마리를 이용하였으며, 중국산 미꾸라지는 2009년 12월 상해시장에서 구입한 개체 8마리를 이용하였다.Two pairs of primer sets developed in Example 5 were used to verify whether the origin of domestic and Chinese loach can be effectively identified. For domestic loach, 8 dogs were collected from Nakdong, Geum, Dongjin, Mangyeong, Nakdong, Seomjin, Yeongsan, and Han rivers in 1996.The Chinese loach was 8 individuals purchased at the Shanghai market in December 2009. Was used.
Genomic DNA 추출은 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였으며, PCR 반응은 실시예 2와 동일한 방법을 사용하되 프라이머로 실시예 5에서 개발된 두 쌍의 프라이머 세트를 각각 이용하였다. PCR 반응의 성공 여부는 GelRed (Invitrogen, USA)로 염색된 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동하여 확인하였다. 먼저 서열번호 5와 6으로 구성된 프라이머 세트를 이용한 경우, 국내산 미꾸라지 8개체에서만 274 bp 크기에서 PCR 산물을 확인할 수 있었으며, 서열번호 7과 8로 구성된 프라이머 세트를 이용한 경우도 국내산 미꾸라지 8개체에서만 1192 bp 크기에서 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 따라서 두 쌍의 프라이머 세트 중 한 쌍의 프라이머 세트만 각각 사용하더라도 충분히 밴드의 유무로 원산지를 정확하게 식별할 수 있음을 확인하였다.Genomic DNA extraction was performed in the same manner as in Example 1, and PCR reaction was performed in the same manner as in Example 2, but each of two pairs of primer sets developed in Example 5 were used as primers. The success of the PCR reaction was confirmed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel stained with GelRed (Invitrogen, USA). First, in case of using the primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6, PCR products were identified at 274 bp in only 8 loach loach in Korea, and 1192 bp only in 8 loach loach in Korea. PCR products were identified in size. Therefore, it was confirmed that even if only one pair of primer sets of the two pairs of primer sets were used, the origin could be accurately identified with or without bands.
바람직한 실시예로, 본 발명에서는 더 정확하게 미꾸라지의 원산지를 식별할 수 있도록, 두 쌍의 프라이머 세트를 모두 사용하여 Multiplex PCR 반응을 한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 국내산 미꾸라지 8개체에서만 274 bp와 1192 bp 크기에서 이중 증폭된 multiplex DNA 산물을 확인할 수 있었으며, 중국산 8개체에서는 multiplex DNA 산물이 확인되지 않아 더욱 정확하고 간편한 Mizol_Multi 마커가 개발되었음을 확인하였다.
In a preferred embodiment, in the present invention, in order to more accurately identify the origin of the loach, multiplex PCR reaction using both pairs of primer sets results in only 274 bp and 1192 of 8 domestic loach as shown in FIG. Multiplex DNA products double-amplified at bp size were identified, and multiplex DNA products were not identified in eight Chinese products, confirming that a more accurate and convenient Mizol_Multi marker was developed.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (2)
상기 DNA를 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열 중에서 선택된 하나의 염기서열로 이루어진 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머에 결합시키는 단계; 및
상기 결합 여부에 따라 미꾸라지 원산지를 식별하는 단계;를 포함하는 미꾸라지 원산지 식별 방법.
Separating genomic DNA of loach;
Binding the DNA to one or more primers selected from primers consisting of one nucleotide sequence selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8; And
Identifying loach origin according to the combination; Loach origin identification method comprising a.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120077094A KR101380779B1 (en) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120077094A KR101380779B1 (en) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20140010617A KR20140010617A (en) | 2014-01-27 |
KR101380779B1 true KR101380779B1 (en) | 2014-04-02 |
Family
ID=50143173
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020120077094A KR101380779B1 (en) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101380779B1 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102074139B1 (en) * | 2019-04-17 | 2020-02-06 | 대한민국 | Genetic markers and methods for identifying species belong to Cobitidae |
KR102656519B1 (en) * | 2024-02-07 | 2024-04-15 | 국립군산대학교 산학협력단 | LAMP primer set for identification of Anguilla japonica and method for rapid and accurate identification of Anguilla japonica using the same |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11266869A (en) * | 1998-03-25 | 1999-10-05 | Cti Engineering Co Ltd | Indentification of individual with cytb gene of misgurnus anguillicaudata |
KR101131789B1 (en) | 2009-12-30 | 2012-03-30 | (주)지노첵 | Identifying Method of species or origin about hairtails, Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same |
-
2012
- 2012-07-16 KR KR1020120077094A patent/KR101380779B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11266869A (en) * | 1998-03-25 | 1999-10-05 | Cti Engineering Co Ltd | Indentification of individual with cytb gene of misgurnus anguillicaudata |
KR101131789B1 (en) | 2009-12-30 | 2012-03-30 | (주)지노첵 | Identifying Method of species or origin about hairtails, Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20140010617A (en) | 2014-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101796306B1 (en) | Mircrosatellite marker for detecting Haliotis gigantean and method of detecting Haliotis gigantean using the same | |
KR101474284B1 (en) | Microsatellite Marker for individualization in Korean native chicken and individualizing Method Using the Same | |
CN110305981A (en) | The molecular labeling PG1524 and its detection method of a kind of Apricot Fruit hardness key gene and application | |
Marotta et al. | Alike but different: the evolution of the Tubifex tubifex species complex (Annelida, Clitellata) through polyploidization | |
CN112899373B (en) | SNP (Single nucleotide polymorphism) marker related to milk fat percentage of southern Holstein cows in China and application thereof | |
KR101380779B1 (en) | Primers for distinguishing Misgurnus mizolepis and method using the same | |
CN109234449A (en) | A kind of special codominance KASP molecular labeling of the general 2RL chromosome of rye and its application | |
CN102732514B (en) | Identification method for chemotactic factor acceptor 9 gene used as molecular marker for bovine excellent superovulation trait and application of same | |
Sektiana et al. | Characterization of the complete mitochondrial genome of Mauritian sardinella, Sardinella jussieu (Lacepède, 1803), collected in the Banten Bay, Indonesia | |
Susari et al. | Molecular analysis of Taro and Bali cattle using cytochrome oxidase subunit I (COI) in Indonesia | |
Li et al. | Establishment of molecular identity cards for Cucumis melo cultivars using ssr markers | |
Li et al. | Genetic diversity of nine populations of the black goat (Capra hircus) in Sichuan, PR China | |
KR101428850B1 (en) | Molecular Marker and Analysis Method for Identifiction of River Drainage System of Gobiobotia macrocephala | |
KR102083306B1 (en) | Genetic markers and methods for identifying species belong to Myxinidae | |
Andriyono et al. | Molecular Identification and Phylogenetic Tree Reconstruction of Marine Fish Species from the Fishing Port of Kutaradja, Banda Aceh | |
KR102017236B1 (en) | The primer set for analysis of cephalopods and methods for their qualitativeand quantitative analysis | |
Roch et al. | Endangered spined loach Cobitis species in Southwest Germany: A complex network of native, hybrid and newly emerged populations | |
CN102758022B (en) | Internal transcribed spacer (ITS2) molecular marker identifying method for aquaculture of catfish hybrids | |
CN107119129B (en) | Method for identifying Huai 33 wheat variety | |
CN107447020B (en) | Molecular label for individual identification of sika deer, identification method and application | |
Tian et al. | Identification of species-specific microsatellite markers in three Siniperca species by RNA-Seq | |
Smith et al. | Genetic analyses of carp, goldfish, and carp-goldfish hybrids in New Zealand | |
KR20160025124A (en) | Identification of Cervus nippon hortulorum for DNA testing | |
KR102584621B1 (en) | Genetic markers for discriminating fish species of Lagocephalus and identification method using the same | |
US20240191296A1 (en) | SPECIFIC DNA FRAGMENTS FOR SEX IDENTIFICATION OF MASTACEMBELUS ARMATUS, GENETIC sex MARKER PRIMERS AND APPLICATIONS THEREOF |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170328 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180328 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190328 Year of fee payment: 6 |