KR102066113B1 - Markers for origin discrimination of the marsh clam, Corbicula japonica, and a method using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재첩류 원산지 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법에 관한 것으로 더 상세하게는 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 재첩류 원산지 판별용 PCR 키트를 제공한다. The present invention relates to a relapsing origin determining marker and a method for determining origin using the same, and more particularly, comprising: a first forward primer consisting of a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1; A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; And a universal reverse primer comprising a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, which provides a PCR kit for determining the origin of relapsing origin.

Description

재첩류 원산지 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법{Markers for origin discrimination of the marsh clam, Corbicula japonica, and a method using the same}Markers for origin discrimination of the marsh clam, Corbicula japonica, and a method using the same

본 발명은 재첩류 원산지 판별 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 재첩류 원산지 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법에 관한 것이다. The present invention relates to a relapsing origin discrimination marker, and more particularly, to a relapsing origin discriminating marker and a method of determining origin using the same.

재첩 속(genus Corbicula) 조개는 아시아가 원산지이지만 일부 종은 북아메리카, 남아메리카 및 유럽으로 전파되었다. 이러한 재첩 종에 의한 전파는 생물 오염(macrofouling) 가능성과 토착종(native species)의 이동으로 인해 생태학적 및 경제적 문제를 야기할 수 있고(Darrigran, Biol Invasions, 4:145-156, 2002), 특히 다량의 조개류 제품의 도입은 수출국과 수입국에서 동일하거나 유사한 종의 가치가 다른 경우 그 원산지 허위표시를 포함하는 심각한 경제적 문제를 야기할 수 있다. 동아시아에서는 9종의 재첩(Corbicula)이 서식하지만, 그중에서도 일본 재첩(C. japonica)이 한국에서 가장 많이 소비되고 있는 것으로 알려져 있다(Lee et al., Korean J Syst Zool, 13(3):233-246, 1997). 그러나 C. japonica의 국내 생산은 과도한 수확, 서식지 파괴 및 오염으로 급격히 감소하였고 현재 재첩 국내 생산량은 연간 약 1000톤으로 수요를 충족시키기에는 부족하여 4000톤 이상은 중국과 일본에서 가공된 형태로 수입된다(http://www.mof.go.kr). 이에 따라 재첩의 가격 불균형 및 원산지 허위표시에 대한 통제가 필요하지만 재첩 속(the genus Corbicula) 종은 형태학적으로 매우 유사하여 분류키인 껍데기 모양, 색 및 패각의 차이로 종을 구분하는 것은 어려우며, 특히 동일한 종일 경우 형태학적으로 원산지를 판별하는 것은 거의 불가능하다. 이에 동일종의 원산지 판별은 유전자 분석을 이용한 방법의 활용이 필요하나 유전자 서열 분석을 위해서는 많은 시간과 비용이 요구되므로 서열 분석 이전의 단계에서 원산지 식별을 위한 쉽고 효율적인 방법이 필요하다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2014-0068635호는 바지락의 원산지를 판별하는 단일염기다형성 마커들 및 이들을 사용하는 바지락의 판별 방법에 대해 개시하고 있다. Genus Corbicula clams are native to Asia, but some species have spread to North America, South America, and Europe. Propagation by these species can lead to ecological and economic problems due to the potential for macrofouling and migration of native species (Darrigran, Biol Invasions , 4: 145-156, 2002), in particular The introduction of large quantities of shellfish products can cause serious economic problems, including misrepresentation of origin if the value of the same or similar species differs in the exporting and importing countries. Nine species of Corbicula inhabit in East Asia, but among them, Japanese C. japonica is known to be the most consumed in Korea (Lee et al., Korean J Syst Zool , 13 (3): 233-). 246, 1997). However, domestic production of C. japonica has declined sharply due to excessive harvesting, habitat destruction, and pollution. Currently, domestic production of sewage is about 1000 tons per year, which is insufficient to meet demand, and more than 4000 tons are imported from China and Japan in processed form. (http://www.mof.go.kr). As a result, it is necessary to control the price imbalance and misrepresentation of origin, but the genus Corbicula species is very similar in morphology, making it difficult to distinguish species by the difference in shell shape, color, and shell. It is almost impossible to determine the origin morphologically, especially for the same species. In order to determine the origin of the same species, it is necessary to use a method using genetic analysis, but since the gene sequence analysis requires a lot of time and cost, an easy and efficient method for identifying the origin at the stage before sequencing is required. In this regard, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0068635 discloses monobasic polymorphic markers for determining the origin of clam and a method for determining clam using the same.

그러나 상기 선행기술의 경우, 바지락의 원산지를 판별하는 SNP 마커로서 아직까지 재첩류 원산지 판별 마커 및 판별방법은 존재하지 않고 있다. However, in the case of the prior art, as the SNP marker for determining the origin of the clam, there are no reflow origin determination markers and discrimination methods.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 재첩류(Corbicula japonicus)의 원산지를 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.Disclosure of Invention The present invention has been made to solve various problems including the above problems, and a discriminating marker capable of detecting the origin of Corbicula japonicus accurately and quickly using a multiplex PCR method and a method of determining origin using the same. The purpose is to provide. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 재첩류 원산지 판별용 PCR 키트가 제공된다. According to one aspect of the invention, the first forward primer consisting of a nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1; A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; And a universal reverse primer composed of a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a PCR kit for determining the origin of relapsing origin is provided.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 재첩으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 재첩류의 원산지 판별방법이 제공된다. According to another aspect of the invention, the genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the repetition; DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted with the PCR kit; An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing the band pattern of the electrophoretic DNA.

상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 멀티플렉스 PCR 방법을 통한 재첩류 원산지 판별 마커를 이용하여 재첩의 원산지를 간편하고 신속하게 판별할 수 있으므로 원산지 판별에 있어서 판별 효율 향상에 따른 비용과 시간이 감소되는 효과가 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.As described above, according to one embodiment of the present invention, since the origin of reseparation can be easily and quickly determined using the relapsing origin discrimination marker through the multiplex PCR method, the cost according to the improvement of the discrimination efficiency in determining the origin and The effect is that the time is reduced. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 중국, 일본 및 한국의 재첩(Corbicula)에서 유래된 미토콘드리아 16S rRNA 유전자의 500 bp 단편을 기반으로 한 계통수(Neighbor-joining tree) 분석을 나타내는 개요도이다. 괄호 안의 숫자는 각 위치에서 해당 하플로타입을 가진 개체의 수를 나타낸다.
도 2는 C. japonica의 16S rRNA 유전자의 염기서열과 프라이머 디자인 정보를 나타내는 개요도이다. Hap_1-Hap_2, Hap_3-Hap_6 및 Hap_7-Hap_10은 각각 한국, 중국 및 일본에 포함되었고 상자 안의 서열은 설계된 프라이머를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 다중 PCR을 통해 C. japonica의 원산지를 확인한 겔사진이다. 레인:(M) 100-bp DNA 레더(iNtRON, 한국); (1)한국 C. japonica(384, 283 및 100 bp)의 3개 밴드; (2)중국 C.japonica(384 bp)의 1개 밴드; 및 (3) 일본 C. japonica (384 및 100 bp)의 2개 밴드.1 is a schematic diagram illustrating a neighbor-joining tree analysis based on 500 bp fragments of mitochondrial 16S rRNA genes derived from Corbicula of China, Japan, and Korea according to an embodiment of the present invention. The numbers in parentheses indicate the number of objects with the corresponding haplotype at each location.
Figure 2 is a schematic diagram showing the nucleotide sequence and primer design information of 16S rRNA gene of C. japonica . Hap_1-Hap_2, Hap_3-Hap_6 and Hap_7-Hap_10 are included in Korea, China, and Japan, respectively, and the sequences in the boxes represent the designed primers.
Figure 3 is a gel photograph confirming the origin of C. japonica through multiple PCR of the present invention. Lanes: (M) 100-bp DNA leather (iNtRON, Korea); (1) three bands of Korean C. japonica (384, 283 and 100 bp); (2) one band of Chinese C. japonica (384 bp); And (3) two bands of Japanese C. japonica (384 and 100 bp).

용어의 정의:Definition of Terms:

본 문서에서 사용되는 "하플로타입(haplotype)"은 동일한 유전자 영역내에 통계적으로 연관된 단일 핵산염기 다형현상(SNP, Single Nucleotide Polymorphis) 집합을 의미하며, 유사한 하플로타입간의 유전적 변이분석을 통해 유전 집단을 정의하는데 활용된다.As used herein, the term "haplotype" refers to a single Nucleotide Polymorphis (SNP) set that is statistically related within the same gene region, and through genetic variation analysis between similar haplotypes. It is used to define groups.

본 문서에서 사용되는 "재첩(Corbicula fluminea)"은 모래가 많은 진흙 바닥에 서식하는 백합목 재첩과의 민물조개로 현재는 대부분이 섬진강 유역에서 채취되며 껍질째 삶아 만든 국이 유명하다. 크기는 각장 34 mm, 각고 30 mm 정도이고, 패각은 삼각형으로 두껍고 단단하며 황갈색이지만 서식환경에 따라 차이가 있다. The term " corbicula fluminea " used in this document is a freshwater clam with a lily-timber conifer that inhabits sandy mud floors. Currently, most of them are harvested from the basin of the Seomjin River and are made from boiled shells. The size is 34mm long and 30mm high, and the shell is triangular, hard, yellowish brown, but varies depending on the habitat.

발명의 상세한 설명:Detailed description of the invention:

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 재첩류 원산지 판별용 PCR 키트가 제공된다. According to one aspect of the invention, the first forward primer consisting of a nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 1; A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; And a universal reverse primer composed of a nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, a PCR kit for determining the origin of relapsing origin is provided.

상기 재첩류 원산지 판별용 PCR 키트에 있어서, 국내 유통되는 재첩 중 한국, 일본 및 중국으로 구성되는 군으로부터 선택되는 원산지 여부를 판별하기 위함일 수 있다. In the PCR kit for determining the origin of reclosing, it may be to determine whether the origin selected from the group consisting of Korea, Japan and China among the spies in the domestic distribution.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 재첩으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 재첩류의 원산지 판별방법이 제공된다.According to another aspect of the invention, the genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the repetition; DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted with the PCR kit; An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing the band pattern of the electrophoretic DNA.

상기 재첩류의 원산지 판별방법에 있어서, 상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 100, 283 및 384 bp의 밴드가 확인되면 한국산으로 결정하고 100 및 384 bp의 밴드가 확인되면 일본산으로 결정하며 384 bp의 밴드가 확인되면 중국산으로 결정함으로써 수행될 수 있고 멀티플렉스(Multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭할 수 있다. In the method of determining the origin of the relapsing species, the step of analyzing the band pattern of the DNA is determined to be made in Korea when the band of 100, 283 and 384 bp is confirmed, and determined to be made in Japan when the band of 100 and 384 bp is confirmed. Once the band of bp is identified, it can be performed by determining that it is made in China and amplifying genomic DNA by multiplex PCR.

최근 해산물에 대한 및 식품 규제 관리 및 원산지 허위 표시를 방지하기 위한 원산지 판별 기술이 주목받고 있다. 종래에는 뱀장어 (Yamashita et al., Fish Sci, 72(5):1109-1113, 2006)와 참치(Rooker et al., Fish Oceanogr, 12:75-84, 2003)와 같은 어류를 수출하는 국가를 확인하기 위해 다가철 금속(multivalent trace metal) 분석에 근거한 원산지 식별 기술이 개발되었다. 그러나 상기 미량 원소 분석 방법은 시간이 많이 소요되고 제한된 수의 표적 종에만 적용할 수 있어 이에 대한 대안으로 해양 생물 종의 원산지를 확인하기 위해 DNA 기반 기술이 적용되었다. 그 중 인구 밀도가 높고 다양성 때문에 인구 유전학에서 널리 사용되는 미세위성(microsatellite) DNA 마커의 경우 7개의 미세위성 마커를 이용하여 일본 재첩(C. japonica) 4개 개체군을 판별하였다. 그러나 상기 미세위성 마커는 20년 이상 유전자 마커로 사용되어 왔지만, 대립 유전자 크기(allele size calling)의 불일치 및 크기 결정 오류(errors in size determination)와 같은 단점이 있으며 적절한 소프트웨어 또는 기타 자동화된 방법을 사용하여 숙련된 인원이 분석하는데 많은 시간이 소요된다. 최근에는 고속 대량 스크리닝(high-throughput screening)을 이용한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs)의 위치 파악 및 유전자형(genotyping) 분류의 진보로 인해 발견 시간과 유전자형 비용이 감소되어 SNP의 사용이 더욱 활발해졌다. 이외에도 SNP는 더 많은 양, 간단한 명명법, 자동화된 분석 및 데이터 해석에 대한 적합성 등의 장점을 가지고 있다. Recently, the country of origin identification technology for seafood and food regulatory management and prevention of false labeling of the country of origin has attracted attention. Conventionally , countries exporting fish such as eel (Yamashita et al., Fish Sci, 72 (5): 1109-1113, 2006) and tuna (Rooker et al., Fish Oceanogr, 12: 75-84, 2003) To identify, a country of origin identification technique based on multivalent trace metal analysis has been developed. However, the trace element analysis method is time-consuming and can be applied only to a limited number of target species. As an alternative thereto, DNA-based techniques have been applied to identify the origin of marine species. Among the microsatellite DNA markers widely used in population genetics due to their high population density and diversity, four populations of C. japonica were identified using seven microsatellite markers. However, although the microsatellite markers have been used as genetic markers for over 20 years, they have disadvantages such as mismatches in allele size calling and errors in size determination and use appropriate software or other automated methods. Therefore, it takes a lot of time for skilled personnel to analyze. Recently, advances in localization and genotyping classification of single nucleotide polymorphisms (SNPs) using high-throughput screening have reduced discovery time and genotyping costs, making SNPs more active. In addition, SNPs have advantages such as greater volume, simple nomenclature, and suitability for automated analysis and data interpretation.

이에 본 발명자들은 재첩의 원산지를 결정하기 위해 예의노력한 결과, 16S rRNA 유전자를 이용한 멀티플렉스(multiplex) PCR 방법을 통해 원산지 판별이 가능한 재첩류 원산지 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법을 개발하였다. 미토콘드리아 유전자인 COI, cytochrome b 및 16S rRNA는 각 세포에 많은 복제가 있고 핵 DNA 유전자보다 더 빨리 변이되기 때문에 해양 어류 및 패류의 종을 확인하는 데 유용한 분자 마커이다(Galtier N et al., Mol Ecol, 18(22): 376, 4541-4550, 2009). 본 발명은 미토콘드리아 cytochrome oxidase subunit I(COI) 유전자의 서열 분석을 기반으로 하여 C. japonica로 확인된 한국, 중국, 일본에서 채집된 재첩의 16S rRNA 유전자의 SNP를 분석하고 멀티플렉스 PCR을 통해 각국의 원산지를 간편하고 신속하게 판별할 수 있는 방법을 제공한다. Accordingly, the present inventors have made a diligent effort to determine the origin of the relapsing, and as a result, the inventors have developed a relapsing origin identification marker and a method for determining origin using the multiplex PCR method using the 16S rRNA gene. The mitochondrial genes COI, cytochrome b and 16S rRNA are useful molecular markers for identifying species of marine fish and shellfish because they have many copies in each cell and change more quickly than nuclear DNA genes (Galtier N et al., Mol Ecol). , 18 (22): 376, 4541-4550, 2009). The present invention analyzes the SNPs of 16S rRNA genes of spycles collected from Korea, China and Japan identified as C. japonica based on sequencing of mitochondrial cytochrome oxidase subunit I (COI) genes, It provides a simple and quick way to determine the country of origin.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but can be implemented in various forms, and the following embodiments are intended to complete the disclosure of the present invention, the scope of the invention to those skilled in the art It is provided to inform you completely.

실시예 1: 샘플 및 게놈 DNA 준비 Example 1: Sample and Genomic DNA Preparation

본 발명자들은 재첩 원산지 분석을 위해 아시아 3개국(한국, 일본 및 중국)에서 수집한 237 개체를 사용하였다. 구체적으로 한국산은 하동의 섬진강 상류 및 하류에서 각각 48개체를 채집하였고, 중국산 샘플은 수입업자로부터 원산지가 Wuxi인 96개 및 Rujian인 20개 샘플을 수득하였고 일본산은 2015년 및 2016 년 일본의 소매시장에서 껍데기가 식품 처리를 위해 제거된 원산지 증명서가 있는 재첩을 구입하였으며 이 중 상태가 양호한 25개를 분석에 사용하였다. 상기 수집한 아시아 3개국으로부터 수집한 재첩에 대한 정보를 하기 표 1에 요약하였다. The inventors used 237 individuals collected from three Asian countries (Korea, Japan and China) for analysis of the origin of elution. Specifically, 48 Korean samples were collected from the upstream and downstream of the Sumjin River in Hadong, while Chinese samples obtained 96 samples from Wuxi and 20 Rujian origins from Japan. In Ewha purchased a certificate of origin with shells removed for food processing, of which 25 were in good condition for analysis. The information on the espionage collected from the three Asian countries collected is summarized in Table 1 below.

한국, 일본 및 중국으로부터 수집한 재첩의 세부 정보 Details of the spy collected from Korea, Japan, and China 번호number 원산지origin 샘플링 날짜Sampling date 샘플 크기Sample size 지역성Locality 종Bell 1One 한국Korea 2016년 5월May 2016 4848 섬진강 하류Seomjin River downstream Corbicula japonicaCorbicula japonica 22 한국Korea 2017년 3월March 2017 4848 섬진강 상류Sumjin River Upstream Corbicula sp. Corbicula sp. 33 중국China 2016년 5월May 2016 9696 WuxiWuxi Corbicula japonicaCorbicula japonica 44 중국China 2016년 6월June 2016 2020 FujianFujian Corbicula sp. Corbicula sp. 55 일본Japan 2015년 10월Oct 2015 2020 -- Corbicula japonicaCorbicula japonica 66 일본Japan 2016년 10월Oct 2016 55 -- Corbicula japonicaCorbicula japonica

실시예 2: 게놈 DNA 준비 Example 2: Genomic DNA Preparation

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 수득한 재첩 샘플을 실험실로 이송한 후, 개별 표본의 맨틀 조직을 제거하고 DNA 추출 전에 100% 에탄올로 보존하였다. 그 후, MagExtractor MFX-6100 자동 DNA 추출 시스템(Toyobo, Osaka, Japan)을 사용하여 게놈 DNA를 추출하였고 상기 추출된 게놈 DNA를 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA)를 이용하여 정량하였으며, 분석에 사용하기 전까지 20℃에서 보관하였다. The inventors of the present invention were transferred to the laboratory, the sample obtained in Example 1, the mantle tissue of the individual samples were removed and stored in 100% ethanol before DNA extraction. Thereafter, genomic DNA was extracted using a MagExtractor MFX-6100 automated DNA extraction system (Toyobo, Osaka, Japan), and the extracted genomic DNA was subjected to NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA). Quantitation was carried out and stored at 20 ° C. until used for analysis.

실시예 3: 16S rRNA 유전자의 분석 Example 3: Analysis of 16S rRNA Genes

본 발명에서 수행한 16S rRNA 유전자 단편의 증폭은 범용 프라이머 16Sar(서열번호 4) 및 16Sbr(서열번호 5)(Ivanova et al., Mol Ecol Resour, 7(4):544-548,2007)을 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭하였다.Amplification of the 16S rRNA gene fragment carried out in the present invention uses the universal primers 16Sar (SEQ ID NO: 4) and 16Sbr (SEQ ID NO: 5) (Ivanova et al., Mol Ecol Resour, 7 (4): 544-548,2007). Amplification by polymerase chain reaction (PCR).

구체적으로 게놈 DNA 20 ng, DNA Taq(Anti-HS Taq, TNT Research, Seoul, Korea) 0.5 unit, 각 dNTP 250 μM, 2 mM MgCl2를 포함하는 1 x PCR 완충액 및 프라이머(표 2 참조) 10 pmol을 포함하는 20-μL 총 볼륨을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 또한, PCR 증폭 조건은 ABI 2720 Thermocycler를 사용하여 95℃에서 10분간 변성, 94℃에서 45초, 52℃에서 45초, 72℃에서 45초로 35 사이클로 진행하였고 72℃에서 마지막 5분 연장을 수행하였다. 그 후, PCR 산물은 제조사의 지침에 따라 2% 아가로스 겔에서 시각화하였고 Expin PCR SV로 정제하였다(GeneAl l Biotechnology, Seoul, Korea). 상기 정제된 PCR 산물은 ABI BigDye Terminator ver. 3.1 사이클 시퀀싱 키트(Applied Biosystems, Foster, CA, USA) 및 ABI 3730XL DNA 분석기(Applied Biosystems, Foster, CA, USA)로 상기 PCR 증폭을 위해 사용된 2개의 프라이머의 염료 종결 반응(dye-termination reaction)을 사용하여 염기 서열을 결정하였다. 또한, DNA Star SeqMan 소프트웨어(DNASTAR, USA)를 사용하여 상기 수집한 양방향 서열을 분석하였고, DnaSP v5.1(http://www.ub.es/dnasp)을 이용하여 하플로타입 수, 다형성 부위 수, 하플로타입 다양성 및 뉴클레오타이드 다양성을 추정하였다. 한편, 부트스트랩(bootstrap) 분석을 통한 계통수(neighbor-joining tree)는 MEGA 프로그램(Kimura 1980)과 Kimura 2-parameter 거리를 기반으로 1000번 반복하여 구축하였다. 상기 PCR 증폭 및 본 발명에 사용된 모든 프라이머에 대한 정보를 하기 표 2에 요약하였다. Specifically, 10 pmol of genomic DNA 20 ng, DNA Taq (Anti-HS Taq, TNT Research, Seoul, Korea) 0.5 unit, 1 x PCR buffer and primer containing 250 μM of each dNTP, 2 mM MgCl 2 (see Table 2) PCR amplification was performed using a 20-μL total volume containing. In addition, PCR amplification conditions were carried out in 35 cycles of 10 minutes denaturation at 95 ° C., 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 52 ° C., 45 seconds at 72 ° C., and an extension of 5 minutes at 72 ° C. using an ABI 2720 Thermocycler. . The PCR product was then visualized on a 2% agarose gel according to the manufacturer's instructions and purified by Expin PCR SV (GeneAl Biotechnology, Seoul, Korea). The purified PCR product was ABI BigDye Terminator ver. 3.1 dye-termination reaction of the two primers used for PCR amplification with a cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) and an ABI 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) The base sequence was determined using. In addition, the collected bidirectional sequences were analyzed using DNA Star SeqMan software (DNASTAR, USA), and Haplotype number, polymorphic sites using DnaSP v5.1 (http://www.ub.es/dnasp). Number, haplotype diversity, and nucleotide diversity were estimated. Meanwhile, the neighbor-joining tree through bootstrap analysis was constructed 1000 times based on MEGA program (Kimura 1980) and Kimura 2-parameter distance. Information on the PCR amplification and all primers used in the present invention are summarized in Table 2 below.

프라이머에 대한 세부 정보 Details about the primer 올리고 IDUpload ID 서열(5′-->3′)Sequence (5 ′-> 3 ′) 타겟target 생산물 크기(bp)Product size (bp) 방향direction 서열번호SEQ ID NO: K142FK142F CCCCGTCGAGCTTAATTACCCCCGTCGAGCTTAATTAC 한국Korea 283283 포워드Forward 1One KJ325FKJ325F GCTACCTCGATGTTGGATTAAGCTACCTCGATGTTGGATTAA 한국 및 일본Korea and Japan 100100 포워드Forward 22 KCJ86FKCJ86F GAGAGAATGAATGGTTTGACGGTGAGAGAATGAATGGTTTGACGGT 한국, 중국 및 일본Korea, China, and Japan 384384 포워드Forward 33 16Sar F16Sar F CGCCTGTTTATCAAAAACATCGCCTGTTTATCAAAAACAT -- -- 포워드Forward 44 16Sbr R16 Sbr R CCGGTCTGAACTCAGATCACGTCCGGTCTGAACTCAGATCACGT -- -- 리버스Reverse 55

실시예 4: 다중 하플로타입-특이적 PCR Example 4: Multiple Haplotype-Specific PCR

본 발명의 일 실시예에 따라 분석한 16S rRNA 유전자 서열의 10 개의 하플로타입에 있는 9개의 다형성 부위 중 195 및 380 위치에 있는 두 개의 SNP가 원산지 국가별 판별 마커로 확인되었다(표 3 및 4 참조). 프라이머 K142F(서열번호 1)와 KJ325F(서열번호 2)는 개체를 한국 또는 일본과 중국을 구분할 수 있도록 디자인하였다(표 2 및 도 2 참조). 상기 프라이머와 16Sbr 리버스 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 위한 최적 온도를 찾기 위해 56℃에서 64℃까지의 9가지 어닐링(annealing) 온도에서 증폭을 수행하였고 상기 3개국의 모든 개체로부터 16S rRNA 유전자 단편을 증폭시키기 위해 제3 포워드 프라이머인 KCJ86F(서열번호 3)를 디자인하였다. 상기 3개의 포워드 프라이머 및 범용 역방향 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR의 증폭 조건은 94℃에서 초기 5분 변성 및 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 45초간 35사이클로 수행하였고 최종 72℃에서 10분간 수행하였다. 그 후, PCR 산물은 크기 표지로서 100 bp DNA 레더(Bioneer, 한국)를 포함하는 1.8% 아가로즈 겔에서 분리하였고 전기영동 후, 장파장(long-wavelength) 자외선 하에서 멀티플렉스 밴드(multiplex bands)를 확인하였다.According to an embodiment of the present invention, two SNPs at positions 195 and 380 of nine polymorphic sites in ten haplotypes of the 16S rRNA gene sequence analyzed according to the present invention were identified as country-specific discriminating markers (Tables 3 and 4). Reference). Primers K142F (SEQ ID NO: 1) and KJ325F (SEQ ID NO: 2) were designed to distinguish individuals from Korea or Japan and China (see Table 2 and Figure 2). The primers and 16Sbr reverse primers were used to amplify at 9 different annealing temperatures from 56 ° C. to 64 ° C. to find the optimal temperature for multiplex PCR, and 16S rRNA gene fragments were obtained from all individuals in the three countries. A third forward primer, KCJ86F (SEQ ID NO: 3), was designed for amplification. The amplification conditions of the multiplex PCR using the three forward primers and the universal reverse primer were performed in 35 cycles of initial 5 min denaturation at 94 ° C. and 45 seconds at 94 ° C., 45 seconds at 60 ° C., and 45 seconds at 72 ° C., and the final 72 ° C. 10 minutes at. The PCR product was then isolated from a 1.8% agarose gel containing 100 bp DNA leather (Bioneer, Korea) as a size marker, and after electrophoresis, multiplex bands were identified under long-wavelength ultraviolet light. It was.

실시예 5: 하플로타입 상세 분석Example 5 Haplotype Detailed Analysis

본 발명자들이 종 판별을 위해 생물바코드영역인 COI 유전자 서열을 분석한 결과, 본 발명에 사용된 237개체 중 C. japonica(Acc. No. AB721983)와 99% 이상의 염기서열 상동성(identity)을 나타내는 169종이 C. japonica로 분류되었다. 다른 68 개체는 C. colorata, C. leana 및 C. fluminea 중에서 2종 이상에서 99% 이상의 상동성을 나타내어 종의 판별이 불가능하였다. 종의 분류가 완료된 169개체의 C. japonica를 대상으로 COI유전자에 비해 비교적 종내변이율이 낮은 16s rRNA 유전자영역을 분석하였으며, 분석결과 16s rRNA유전자의 서열은 500 bp 단편에서 서열 변이(sequence variation)가 있는 18개의 부위를 확인하여 11개의 하플로타입을 나타내었다(하기 표 3 내지 7). 한국, 중국, 일본의 샘플에는 각각 2개, 4개, 5개의 하플로타입이 존재하였다. 하기 표 5 내지 7에 나타난 바와 같이, 11개로 확인된 하플로타입의 높은 서열 변이는 원산지 국가의 확인에 적합한 프라이머의 디자인을 어렵게 만들었다. 한국과 중국의 샘플은 159, 210, 237, 354의 위치에서 분명한 차이를 나타내었으나 일본의 샘플은 상기 샘플 모두에서 한국 샘플과 동일한 서열을 나타내었다. 34 및 399 위치의 2개 부위만이 한국과 일본의 샘플 간에 서열 차이를 보였으나, 일본의 샘플은 상기 지점에 2개의 하플로타입을 나타내어 원산지-특이적 프라이머의 디자인을 복잡하게 만들었다. 따라서 16S rRNA 유전자 단편을 분석하여 중국, 일본 및 한국의 C. japonica 원산지에 특이적인 프라이머를 디자인할 수 있는 서열 변화를 확인하였다. 따라서 상기 개체들은 Corbicula sp.로 분류하였고 추가 분석을 위해 세 가지 하플로타입인 H1, H2 및 H3로 분류하였다(도 1). 상기 169 개체의 500bp 16S rRNA 유전자 단편의 서열 분석은 서열 변이가 있는 9개의 부위를 확인하여 10개의 하플로타입(DnaSP ver.5.10.01)을 획득하였다(표 3 및 4). 한국 샘플에는 0.027%의 가장 낮은 뉴클레오타이드 다양성을 갖는 2개의 하플로타입만이 존재하였고 4가지 하플로타입은 각각 0.091과 0.108%의 뉴클레오티드 다양성을 가진 중국과 일본의 샘플에서 확인하였다. 상기 C. japonica의 500bp 16S rRNA 유전자 단편에 대해 99% 이상의 염기서열 상동성을 보인 개체의 서열만을 사용했다는 것을 고려하면 본 발명에서 확인된 10개 하플로타입이 허용 범위 내에 있는 것으로 사료된다. 상기 C. japonica로 확인된 169 개체의 10개 하플로타입과 나머지 68 개체의 임의의 3가지 하플로타입을 일부 참고 서열로 계통 발생 분석(phylogenetic analysis)을 수행한 결과 계통수(phylogenetic tree)에서 10개 C. japonica 하플로타입은 그들의 원산지에 의해 명확하게 구별될 수 있었다(도 1). 한국과 일본에서 유래된 하플로타입간의 유전적 거리(genetic distance)는 0.3%였고 한국과 중국에서 유래된 하플로타입간의 유전적 거리는 0.5%였다. 또한 세 가지 임의의 하플로타입이 상기 10개 하플로타입과 명확하게 구분되었다. 하플로타입 Corbicula sp. H3는 한국과 중국의 66 개체를 포함하고 다른 담수 Corbicula 종과 밀접하게 관련되어있다. As a result of analyzing the COI gene sequence, which is a bio-barcode region for species identification, the present inventors showed sequence identity of 99% or more with C. japonica (Acc. No. AB721983) among 237 individuals used in the present invention. 169 species were classified as C. japonica . Another 68 individuals showed more than 99% homology among two or more of C. colorata , C. leana and C. fluminea , making it impossible to identify species. We analyzed 16s rRNA gene regions with lower species variability compared to COI genes in 169 C. japonica species that had been classified. The analysis showed that the sequence of the 16s rRNA gene was sequence variation in a 500 bp fragment. Eighteen sites were identified with 11 haplotypes (Tables 3 to 7 below). There were two, four and five haplotypes in the samples of Korea, China and Japan, respectively. As shown in Tables 5-7 below, the high sequence variation of the 11 identified haplotypes made designing primers suitable for identification of the country of origin. The samples of Korea and China showed clear differences at the positions of 159, 210, 237, and 354, but the samples of Japan showed the same sequence as the Korean samples in all of the samples. Only two sites at positions 34 and 399 showed sequence differences between the samples in Korea and Japan, but the Japanese sample exhibited two haplotypes at this point, complicating the design of the origin-specific primers. Therefore, 16S rRNA gene fragments were analyzed to identify sequence changes that could design primers specific for C. japonica origins in China, Japan, and Korea. Thus, the subjects were corbicula sp. And three haplotypes, H1, H2 and H3, for further analysis (FIG. 1). Sequence analysis of the 500 bp 16S rRNA gene fragment of the 169 individuals identified 9 sites with sequence variations to obtain 10 haplotypes (DnaSP ver.5.10.01) (Tables 3 and 4). There were only two haplotypes with the lowest nucleotide diversity of 0.027% in the Korean sample, and four haplotypes were identified in samples from China and Japan with nucleotide diversity of 0.091 and 0.108%, respectively. The 10 haplotypes identified in the present invention are considered to be within the allowable range considering that only the sequence of the individual showing more than 99% sequence homology to the 500 bp 16S rRNA gene fragment of C. japonica was used. Phylogenetic analysis of the 10 haplotypes of 169 individuals identified as C. japonica and any 3 haplotypes of the remaining 68 individuals with some reference sequences resulted in 10 in the phylogenetic tree. Dog C. japonica haplotypes could be clearly distinguished by their origin (FIG. 1). The genetic distance between haplotypes originating from Korea and Japan was 0.3% and the genetic distance between haplotypes originating from Korea and China was 0.5%. In addition, three arbitrary haplotypes were clearly distinguished from the ten haplotypes. Haplotype Corbicula sp. H3 contains 66 individuals from Korea and China and is closely related to other freshwater Corbicula species.

또한 16S rRNA 유전자 단편에서 10개의 하플로타입의 상세 분석은 195 및 380 위치에 위치한 두 개의 SNP가 원산지를 구별할 수 있는 것으로 나타났다. 표 3 내지 4에 나타난 바와 같이, 한국의 모든 하플로타입은 195 위치에 C가 있고 일본은 해당 위치에 G가 존재하였다. 따라서 한국과 일본의 개체는 195 위치의 뉴클레오타이드에 의해 구별될 수 있으나 중국 샘플의 195 위치에 G 또는 A가 나타나 상기 위치에 G가 있는 일본과 구별할 수 없었지만 위치 380에서 하플로타입이 다르게 나타났다. In addition, detailed analysis of the 10 haplotypes in the 16S rRNA gene fragment showed that the two SNPs located at positions 195 and 380 can distinguish between origins. As shown in Tables 3 to 4, all Haplotypes in Korea had C at 195 and Japan had G at that position. Thus, Korean and Japanese individuals could be distinguished by nucleotides at position 195, but G or A appeared at position 195 of the Chinese sample, which could not be distinguished from Japan having G at the position, but the haplotype was different at position 380.

아울러, 프라이머의 염기서열중 5'-말단 염기서열의 불일치는 낮은 어닐링온도에서는 증폭이 허용될 수 있지만, 3'-말단 염기서열은 상보성에 대한 요구가 매우 강하다(Thweatt et al., Anal Biochem, 190:314-316, 1990). 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 195 및 380에 위치한 두 개의 SNP가 멀티플렉스 PCR에서 3 ' 불일치에 기초하여 원산지를 확인하기 위한 프라이머 세트를 디자인하였다(도 2). 프라이머 K142F(서열번호 1)는 3 '말단에 C가 있으며, 한국 C. japonica의 283-bp DNA 단편을 16Sbr 리버스 프라이머(서열번호 5)로 증폭시킬 수 있지만 해당 사이트에서 G 또는 A가 있는 일본 또는 중국의 C. japonica는 증폭시킬 수 없었다(표 3 및 4). 또한 프라이머 KJ325F(서열번호 2)는 380번째 위치의 SNP에 상응하는 3 '말단에 A를 가지며, 16Sbr 리버스 프라이머로 한국과 일본의 C. japonica의 100 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었으나 해당 사이트에 G가 있는 중국은 증폭할 수 없었다. 상기 3개국의 C. japonica 원산지를 판별하는 상기 두 가지 프라이머 외에도, 세 번째 범용 포워드 프라이머인 KCJ86F(서열번호 3)는 16Sbr 역방향 프라이머를 이용하여 3개국에서 기원한 모든 C. japonica 개체로부터 384bp의 DNA 단편을 증폭시킬 수 있었다. 멀티플렉스 PCR은 단일 분석에서 다중 표적을 검출하는 데 유용한 기술이지만 멀티플렉스 PCR의 성공 여부는 단일 PCR 조건 하에서 선택적으로 각각의 표적과 어닐링 할 수 있는 프라이머의 능력에 달려있다. 따라서 본 발명자들은 각각의 프라이머 세트를 상이한 어닐링 온도 및 반응 조건에서 단계적인 PCR 반응을 수행하였고 상기 4개의 프라이머로 멀티플렉스 PCR을 위한 최적의 조건을 발견하여 단일 PCR 반응에 의해 확립된 60℃의 어닐링 온도에서 수행하였다. 그 결과, 한국(100, 283 및 384 bp), 중국(384 bp) 및 일본(100 및 384 bp)이 원산지인 C. japonica의 1개, 2개 또는 3개의 특이적 생성물을 확인하였다(도 3). In addition, inconsistency of the 5'-terminal sequence in the primer sequence may allow amplification at low annealing temperature, but the 3'-terminal sequence has a strong demand for complementarity (Thweatt et al., Anal Biochem, 190: 314-316, 1990). Therefore, based on the nucleotide sequence, a primer set was designed to identify the origin of the two SNPs located at 195 and 380 based on the 3 'mismatch in the multiplex PCR (FIG. 2). Primer K142F (SEQ ID NO: 1) has a C at the 3 'end and can amplify 283-bp DNA fragments of C. japonica in Korea with 16Sbr reverse primer (SEQ ID NO: 5), but Japan or G or A at the site Chinese C. japonica could not be amplified (Tables 3 and 4). In addition, primer KJ325F (SEQ ID NO: 2) had an A at the 3 'end corresponding to the SNP at the 380th position, and the 16Sbr reverse primer was able to amplify 100 bp DNA fragments of C. japonica in Korea and Japan, but G at the site. China could not amplify. In addition to the two primers that determine the origin of C. japonica in the three countries, a third universal forward primer, KCJ86F (SEQ ID NO: 3), uses 3SBbp of DNA from all C. japonica individuals from three countries using a 16Sbr reverse primer. Fragments could be amplified. Multiplex PCR is a useful technique for detecting multiple targets in a single assay, but the success of multiplex PCR depends on the ability of the primer to selectively anneal with each target under a single PCR condition. Thus, we performed a stepwise PCR reaction with each primer set at different annealing temperatures and reaction conditions and found the optimal conditions for multiplex PCR with the four primers to anneal at 60 ° C. established by a single PCR reaction. Carried out at temperature. As a result, one, two or three specific products of C. japonica originated from Korea (100, 283 and 384 bp), China (384 bp) and Japan (100 and 384 bp) were identified (FIG. 3). ).

상기 3개국에서 수득한 재첩에서 관찰된 10개 하플로타입 중 16S rRNA 분석을 이용한 가변 뉴클레오타이드 사이트에 관한 정보를 하기 표 3 및 4에 요약하였다. The information on the variable nucleotide sites using 16S rRNA analysis of the 10 haplotypes observed in the repetitions obtained in these three countries is summarized in Tables 3 and 4 below.

16S rRNA 분석을 이용한 가변 뉴클레오타이드 사이트 정보 1Variable Nucleotide Site Information Using 16S rRNA Analysis 1 다형성 부위Polymorphic site 빈도frequency 1One 1111 6161 120120 195195 267267 339339 380380 413413 한국Korea 중국China 일본Japan Hap_1Hap_1 GG AA GG AA CC GG TT AA AA 4545 Hap_2Hap_2 ·· ·· ·· ·· ·· ·· CC ·· ·· 33 Hap_3Hap_3 ·· ·· ·· ·· GG ·· ·· GG ·· 8181 Hap_4Hap_4 ·· ·· ·· ·· AA ·· ·· GG ·· 77 Hap_5Hap_5 ·· ·· ·· GG GG AA ·· GG GG 44 Hap_6Hap_6 ·· ·· ·· ·· GG AA ·· GG 44 Hap_7Hap_7 ·· ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· 1818 Hap_8Hap_8 AA ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· 55 Hap_9Hap_9 ·· GG ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· 1One Hap_10Hap_10 ·· ·· AA ·· GG ·· ·· ·· ·· 1One

16S rRNA 분석을 이용한 뉴클레오타이드 사이트 정보 2Nucleotide Site Information Using 16S rRNA Assay 2 분류Classification 횟수Count 한국Korea 중국China 일본Japan 다형성 사이트의 수 Number of polymorphic sites 1One 44 33 뉴클레오타이드 다양성(%)Nucleotide Diversity (%) 0.0270.027 0.0910.091 0.1080.108 하플로타입 수 Haplotype Number 22 44 44 하플로타입 다양성(h)Haplotype Diversity ( h ) 0.1250.125 0.2670.267 0.4560.456

또한, 한국, 중국 및 일본에서 수득한 C. japonica 개체에서 관찰된 11개 하플로타입 중 COI 분석을 이용한 가변 뉴클레오타이드 사이트에 관한 정보를 하기 표 5 내지 7에 요약하였다. In addition, information on variable nucleotide sites using COI analysis among 11 haplotypes observed in C. japonica individuals obtained from Korea, China and Japan is summarized in Tables 5-7 below.

COI 분석을 이용한 뉴클레오타이드 사이트 정보 1Nucleotide site information using COI analysis 1 다형성 부위Polymorphic site 33 3434 3636 6969 114114 158158 159159 184184 210210 237237 264264 Hap_1Hap_1 TT TT AA CC GG AA AA CC AA GG GG Hap_2Hap_2 ·· ·· ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· ·· Hap_3Hap_3 ·· ·· ·· TT ·· GG GG TT GG AA ·· Hap_4Hap_4 ·· ·· ·· ·· AA GG GG ·· GG AA ·· Hap_5Hap_5 ·· ·· ·· TT ·· GG GG TT GG AA ·· Hap_6Hap_6 ·· ·· ·· TT ·· GG GG TT GG AA ·· Hap_7Hap_7 CC CC ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· ·· Hap_8Hap_8 ·· CC GG ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· ·· Hap_9Hap_9 ·· CC ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· AA Hap_10Hap_10 ·· CC ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· ·· Hap_11Hap_11 ·· ·· ·· ·· ·· GG ·· ·· ·· ·· ··

COI 분석을 이용한 다양한 뉴클레오타이드 사이트 정보 2Diverse Nucleotide Site Information Using COI Analysis 2 다형성 부위Polymorphic site 빈도frequency 279279 285285 297297 321321 330330 354354 399399 한국Korea 중국China 일본Japan Hap_1Hap_1 TT TT AA GG GG AA GG 3535 ·· ·· Hap_2Hap_2 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 1212 ·· ·· Hap_3Hap_3 ·· CC CC ·· ·· GG AA ·· 4848 ·· Hap_4Hap_4 ·· ·· TT AA ·· GG AA ·· 2424 ·· Hap_5Hap_5 ·· CC CC ·· AA GG AA ·· 2121 ·· Hap_6Hap_6 CC CC CC ·· ·· GG AA ·· 33 ·· Hap_7Hap_7 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 1One Hap_8Hap_8 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 1One Hap_9Hap_9 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 1One Hap_10Hap_10 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 99 Hap_11Hap_11 ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· 1313

COI 분석을 이용한 다양한 뉴클레오타이드 사이트 정보 3Diverse Nucleotide Site Information Using COI Analysis 3 분류Classification 횟수Count 한국Korea 중국China 일본Japan 다형성 사이트의 수 Number of polymorphic sites 1One 88 55 뉴클레오타이드 다양성(%)Nucleotide Diversity (%) 0.0840.084 0.0550.055 0.0240.024 일배체형 수 Haplotype 22 44 55 일배체형 다양성(h)Haplotype Diversity ( h ) 0.4170.417 0.6590.659 0.6010.601

결론적으로 본 발명의 재첩류 원산지 판별 마커 및 그를 이용한 원산지 판별방법은 16S rRNA 유전자를 이용한 멀티플렉스 PCR 방법을 통해 한국/중국/일본산 재첩(C. japonica)의 원산지를 정확하고 신속하게 판별할 수 있으므로 수산물에 대한 식품 안전 관리 및 법의학 등 다양한 분야에 적용할 수 있다. In conclusion, the relapsing origin determination marker of the present invention and the origin determination method using the same can accurately and quickly determine the origin of C. japonica from Korea, China, and Japan through multiplex PCR using 16S rRNA gene. Therefore, it can be applied to various fields such as food safety management and forensics for aquatic products.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above-described embodiments, these are merely exemplary, and it will be understood by those skilled in the art that various modifications and equivalent other embodiments are possible. Therefore, the true technical protection scope of the present invention will be defined by the technical spirit of the appended claims.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Markers for origin discrimination of the marsh clam, Corbicula japonica, and a method using the same <130> PD18-5657 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K142F <400> 1 ccccgtcgag cttaattac 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJ325F <400> 2 gctacctcga tgttggatta a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCJ86F <400> 3 gagagaatga atggtttgac ggt 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16Sar F <400> 4 cgcctgttta tcaaaaacat 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16Sbr R <400> 5 ccggtctgaa ctcagatcac gt 22 <110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Markers for origin discrimination of the marsh clam, Corbicula          japonica, and a method using the same <130> PD18-5657 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K142F <400> 1 ccccgtcgag cttaattac 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJ325F <400> 2 gctacctcga tgttggatta a 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCJ86F <400> 3 gagagaatga atggtttgac ggt 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16Sar F <400> 4 cgcctgttta tcaaaaacat 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16 Sbr R <400> 5 ccggtctgaa ctcagatcac gt 22

Claims (5)

서열번호 1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머;
서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머;
서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및
서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 한국, 일본 및 중국으로 구성되는 군으로부터 선택되는 재첩류 원산지 판별용 PCR 키트.A first forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
A second forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2;
A third forward primer consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; And
A PCR kit for determining a residing country of origin selected from the group consisting of Korea, Japan and China, comprising a universal reverse primer consisting of a nucleic acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5. 삭제delete 재첩으로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 한국, 일본 및 중국으로 구성되는 군으로부터 선택되는 재첩류의 원산지 판별방법. A genomic DNA extraction step of extracting genomic DNA from the splice;
DNA amplification step of amplifying the genomic DNA extracted with the PCR kit of claim 1;
An electrophoresis step of performing electrophoresis on the amplified DNA product; And analyzing a band pattern of the electrophoretic DNA, wherein the method of determining the origin of reptiles selected from the group consisting of Korea, Japan, and China. 제3항에 있어서,
상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 100, 283 및 384 bp의 밴드가 확인되면 한국산으로 결정하고 100 및 384 bp의 밴드가 확인되면 일본산으로 결정하며 384 bp의 밴드가 확인되면 중국산으로 결정함으로써 수행되는, 방법. The method of claim 3,
The step of analyzing the band pattern of the DNA is determined to be made in Korea when the band of 100, 283 and 384 bp is confirmed, and made in Japan when the band of 100 and 384 bp is confirmed, and made in China when the band of 384 bp is confirmed Method performed. 제3항에 있어서,
멀티플렉스(Multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭하는, 방법.The method of claim 3,
Amplification of genomic DNA by multiplex PCR.
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