KR101993488B1 - 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법 - Google Patents

한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제 1의 일정한 공급 속도 단계 및 제 2의 조절된 공급 속도 단계를 갖는 배치 농축 방식으로 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법{METHOD FOR PREPARING A COMPOSITION COMPRISING HIGHLY CONCENTRATED ANTIBODIES BY ULTRAFILTRATION}
본 발명은 생물 과학 분야, 보다 구체적으로 항체 제조 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 사용된 방법은 항체 요법이 주변 온도에서 고농도 제형, 예를 들어 100 g/ℓ 이상, 바람직하게는 200 g/ℓ 이상, 특히 바람직하게는 250 g/ℓ 이상의 고농도 제형을 획득할 수 있게 한다.
외래 치료를 제공함으로써 환자의 편의성과 복약순응성을 개선시키기 위해, 특히 만성 질병 치료 분야에서, 고도로 농축된 적은 부피의 피하 투여용 항체 요법 제형에 대한 수요가 점점 증가하고 있다.
항체 약물 물질 제조의 경우, 한외여과/정용여과(UF/DF)가 전형적으로 최종 공정 단계이다. 한외여과는 크기를 기준으로 용액 중 분자를 분리시키는 막-기반 분리 공정이다. 정용여과 (diafiltration)는 수성 완충제를 여과잔류물(retentate)에 가하는 한외여과의 특수 유형이다. 이 단계에서, 정제된 약물 물질이 농축되며 약품 제형에 필요한 단백질 농도 및 부형제 조성으로 바뀐다.
한외여과/정용여과(UF/DF) 공정을 위해 산업상 널리 사용되는 기술은 접선유동여과(TFF)의 한 형태이다(일반적으로 문헌[Shiloach J. et al., 1988, Van Reis R. et al., 2001]을 참조하시오). 상기 기술에서, 단백질 용액을 가압 하에서 한외여과 막에 접선방향으로 재순환시킨다. 상기 TFF 접근법은 저농도 내지 중간 농도의 약물 물질에 작 적용되며 대부분의 경우에 하나의 항체에 대한 UF/DF 공정은 최소의 변화로 또 다른 항체에 매우 적합할 수 있다. 그러나, 높은 단백질 농도의 상황에서, 공정 성능에 일련의 기술적인 도전이 도래하였다(일반적으로 문헌[Shire SJ. et al., 2004], [Luo R. et al., 2006], [Shire SJ., 2009]을 참조하시오).
TFF 기술에 의한 고농도 제형의 획득은, 고도로 농축된 단백질 용액이 감소된 유량 및 최종적인 막 오염으로 인해 제한된 물질 이동에 이를 수 있기 때문에, 어려울 수 있다(예를 들어 문헌[Suki A. et al., 1984, 1986], [Kim KJ. et al., 1992]을 참조하시오). 이는 상기 막 표면적을 증가시키거나 상기 막을 교체함으로써 극복될 수 있지만, 보다 낮은 수율에 이를 수 있다. 또 다른 한계는 높은 공급 압력을 도출할 수도 있는 높은 점도이며, 이는 상기 공정 중 막 보전에 대한 상한을 초과할 수 있다(예를 들어 문헌[Turker M. et al., 1987, Liu J. et al., 2005]을 참조하시오). 이온 강도의 증가 또는 특정 화합물의 첨가와 같은 적합한 제형화 설계의 실행이 점도의 감소를 도울 수 있지만(예를 들어 문헌[Liu J. et al., 2006]을 참조하시오), 안정한 제형 조성물을 보장하면서 상기 점도를 감소시키는 것은 도전적인 과제일 수 있다. 보다 큰 점도 감소가 요구되는 상황에서, 상기 상황을 승온에서의 처리에 의해 다룰 수 있다(예를 들어 문헌[Winter C., 2009]을 참조하시오). 그러나, 상기와 같은 경우에, 단백질 안정성이, 보다 높은 온도에 대한 연장된 노출에 의해 손상될 수도 있다.
따라서, 본 발명에 의해 해결되어야 할 문제는 다른 공정 매개변수들을 조작함으로써 높은 단백질 농도를 성취하는 신규의 처리 방법을 제공하는 것이다.
인용 문헌
특허 문헌
Figure 112014030530516-pct00001
비특허 문헌
Figure 112014030530516-pct00002
Figure 112014030530516-pct00003
발명의 요약
단백질을 제조 규모로 농축시키기 위한 산업 표준 기술은 접선 유동 (tangential flow)에 의한 한외여과이다. 높은 최종 농도를 갖는 생성물을 위한 핵심적인 도전은 막 오염을 막고 높은 공급 압력을 극복하는 것이다.
일반적으로, 본 명세는 단백질, 예를 들어 항체 제제, 상기와 같은 제제를 함유하는 약학 제형의 성공적인 농축을 위한 특별한 공정 매개변수들의 조작, 및 인간 요법 또는 동물 요법에 있어서 이의 용도를 개시한다.
실시태양들에서, 본 명세는 최적의 단백질 농도가 보다 낮은 값으로 감소되어 추가의 농축을 계속할 때까지 공급 유량 (feed flow rate)을 높은 유량으로 유지시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 여과잔류물 용액이 200 g/ℓ(여기에서 공급 압력은 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력을 85 내지 100%까지 형성한다)를 초과하는 단백질 농도로 농축될 때까지 농축을 200 LMH 이상의 공급 유량으로 수행하고, 이어서 120 LMH 이하의 공급 유량으로 추가의 농축을 계속한다. 상기 작동 한계 내에서 획득할 수 있는 단백질 농도는, 일정한 공급 유량을 갖는 한 단계 또는 조기 이행 시 단계식 감소 (step-down)로 공급 유량을 조절하는 두 단계를 포함하는 통상적인 공정보다 더 높다.
본 명세는 또한, 실시태양들에서, 공급 유량을 상기 농축 공정의 종료시까지 가능한 한 높게 유지시키는 보다 바람직한 방법을 제공한다. 예를 들어, 공급 유량은, 일단 공급 압력이 일정한 공급 유량 하에서 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력 (specified maximum feed pressure)의 85 내지 100%에 도달하면 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내에서 공급 압력을 유지시키는 방식으로 자동적으로 조절된다.
본 명세는 또한, 실시태양들에서, 농축 공정의 중간에 삽입된 순환 단계의 유효성을 제공한다. 예를 들어, 일단 공급 압력이 일정한 공급 유량 하에서 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%에 도달하면 10 내지 80 LMH의 공급 유량으로 20 분 순환을 삽입한다. 상기 순환 단계는 상기 공급 압력 형성을 후속의 한외여과 공정 동안 경감시킬 수 있다.
요약하면, 본 발명의 목적은 하기 [1] 내지 [33]을 제공하는 것이다.
[1] 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법으로, 상기 방법은
1) 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값이 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%까지 증가하도록 공급 유량을 조절하고;
2) 상기 단계 (1) 후에 상기 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 유지하거나 또는 감소시키기 위해 상기 공급 유량을 감소시키는
단계들을 포함한다.
[2] [1]의 방법에서, 항체 제제(preparation)를 주변 온도에서 처리한다.
[3] [1]의 방법에서, 항체 제제를 10 내지 30 ℃의 온도에서 처리한다.
[4] [1]의 방법에서, 항체 제제를 15 내지 30 ℃의 온도에서 처리한다.
[5] [1]의 방법에서, 고도로 농축된 항체는 100 g/L 이상의 고 농도 또는 2 mPa.s 이상의 점도를 갖는다.
[6] [1]의 방법에서, 고도로 농축된 항체는 200 g/L 이상의 고 농도 또는 10 mPa.s 이상의 점도를 갖는다.
[7] [1]의 방법에서, 고도로 농축된 항체는 250 g/L 이상의 고 농도 또는 40 mPa.s 이상의 점도를 갖는다.
[8] [1]의 방법에서, 단계 (1)에서 공급 유량을 200 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시킨다.
[9] [1]의 방법에서, 단계 (1)에서 공급 유량을 250 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시킨다.
[10] [1], [8] 및 [9]의 방법에서, 단계 (1)에서 공급 유량을 일정한 속도로 유지시킨다.
[11] [1]의 방법에서, 단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값은 2.0 바 내지 4.0 바이다.
[12] [1]의 방법에서, 단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값은 3.5 바이다.
[13] [1]의 방법에서, 단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값은 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%이다.
[14] [1]의 방법에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 200 g/L를 초과하는 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다.
[15] [1]의 방법에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 220 g/L 이상의 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다.
[16] [1]의 방법에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 240 g/L와 동등한 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다.
[17] [13]의 방법에서, 공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 일정한 속도로 유지시킨다.
[18] [13] 또는 [17]의 방법에서, 공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 120 LMH(L/㎡/시간) 이하로 유지시킨다.
[19] [13] 또는 [17]의 방법에서, 공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 80 LMH(L/㎡/시간) 이하로 유지시킨다.
[20] [1]의 방법에서, 단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 일정한 값으로 유지시킨다.
[21] [1]의 방법에서, 단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을, 공급 유량을 하강시킴으로써 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시킨다.
[22] [20] 또는 [21]의 방법에서, 공급 유량을, 공급 압력과 공급 유량 간의 피드백 조절에 의해 상기 공급 압력을 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시키는 방식으로 자동적으로 조절한다.
[23] [1]의 방법에서, 단계 (1)과 단계 (2) 사이에, 하기의 단계를 또한 포함하는 방법:
3) 항체 제제를, 투과물 밸브를 폐쇄시켜 막을 통해 재순환시키는 단계.
[24] [23]의 방법에서, 항체 제제를, 여과잔류물 압력 조절 밸브를 완전히 개방시켜 재순환시킨다.
[25] [23]의 방법에서, 단계 (3)에서 공급 유량을 5 내지 120 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 유량으로 유지시킨다.
[26] [23]의 방법에서, 단계 (3)에서 공급 유량을 10 내지 80 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 유량으로 유지시킨다.
[27] [1]의 방법에서, 항체 제제의 완충제 조성은 10 내지 30 mmol/L의 히스티딘이다.
[28] [1]의 방법에서, 항체 제제의 완충제 조성은 20 mmol/L 히스티딘이다.
[29] [1]의 방법에서, 항체 제제의 pH는 pH 3.0 내지 pH 10.0이다.
[30] [1]의 방법에서, 항체 제제의 pH는 pH 5.5 내지 pH 6.5이다.
[31] [1]의 방법에서, 항체 제제의 pH는 pH 6.0이다.
[32] [1]의 방법에서, 한외여과 막은 50 kDa 이하의 분자량 컷오프를 갖는다.
[33] [1]의 방법에서, 한외여과 막은 30 kDa 이하의 분자량 컷오프를 갖는다.
[34] [1]의 방법에서, 조성물은 고도로 농축된 항-인간 인터류킨-6 수용체 단클론 항체를 포함한다.
[35] [34]의 방법에서, 조성물은 고도로 농축된 토실리주맵을 포함한다.
[36] [1]의 방법에 의해 제조된 고도로 농축된 항체를 포함하는 액체 조성물.
[37] [1]의 방법에 의해 제조된 고도로 농축된 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 액체 조성물.
[38] 한외여과에 의해 고도로 농축된 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법으로, 상기 방법은
1) 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값이 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%까지 증가하도록 공급 유량을 조절하고;
2) 상기 단계 (1) 후에 상기 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 유지하거나 또는 감소시키기 위해 상기 공급 유량을 감소시키는
단계들을 포함한다.
본 발명의 상기 요약 및 하기의 상세한 설명을 모두 예시된 실시태양에 관한 것이며, 본 발명의 제한이거나 본 발명의 다른 대안적인 실시태양은 아님을 또한 알 것이다. 본 발명의 다른 목적들 및 특징들은 하기의 상세한 설명을 첨부된 도면 및 실시예와 함께 판독할 때 보다 충분히 자명해질 것이다. 특히, 본 발명을 다수의 특정한 실시태양들을 참조하여 본 원에 개시하지만, 상기 설명은 본 발명을 예시하는 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안 됨을 알 것이다. 첨부된 청구의 범위에 의해 개시되는 바와 같은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이, 다양한 변경 및 적용들이 당해 분야의 숙련가들에게 떠오를 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 다른 목적, 특징, 이득 및 이점들은 상기 요약 및 하기에 개시되는 몇몇 실시태양들로부터 자명해질 것이며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이다. 상기와 같은 목적, 특징, 이득 및 이점들은 단독으로 또는 본 발명에 인용된 참고문헌들을 고려하여, 첨부된 실시예, 데이터, 도면 및 이들로부터 추론되는 모든 타당한 추측들과 함께 상기로부터 자명할 것이다.
본 발명의 다양한 태양 및 용도는 하기 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 그의 바람직한 실시태양을 고려할 때 숙련가에게 자명해질 것이다:
도 1은 본 명세의 실시태양들에서, UF/DF 공정에 대한 장치를 나타낸다.
도 2는 실험 규모 (lab scale)로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 공급 유량을 전체 공정 동안 250 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 속도로 설정하였다.
도 3은 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 여과잔류물 부피가 100 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 상기 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다.
도 4는 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 여과잔류물 부피가 200 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 상기 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다.
도 5는 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 공급 압력이 240 g/L의 단백질 농도에 상응하는 3.5 바를 초과했을 때 상기 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다.
도 6은 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 일단 상기 공급 압력이 250 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 3.5 바를 초과했으면, 상기 공급 유량을 3.5 바의 공급 압력을 유지시키는 방식으로 자동 유동 조절되도록 설정하였다. 상기 작동은 상기 공급 유량이 80 LMH로 감소했을 때 종결시켰다.
도 7은 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 일단 상기 공급 압력이 3.5 바를 초과했으면 상기 유동 경로를 순환 방식으로 전환시켰다. 80 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 20 분 동안 순환 후에, 동일한 공급 유량 하에서 한외여과를 재개하였다.
도 8은 실험 규모로, 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 순환을 10 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 수행하였다.
도 9는 본 명세의 실시태양들에서, 실험 규모에서 회수된 풀의 단백질 농도를 요약한다.
도 10은 본 명세의 실시태양들에서, 농축된 인간화된 IL-6R 단클론 항체의 점도 프로파일을 나타낸다.
도 11은 파일럿 규모로, UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 12는 파일럿 규모로, UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 13은 파일럿 규모로, UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 14는 파일럿 규모로, UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 15는 제조 규모 (manufacturing scale)로, UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 16은 제조 규모로, UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 17은 제조 규모로, UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 18은 제조 규모로, UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 19는 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 여과잔류물 부피가 60 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 상기 공급 유량을 250 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 속도에서 실행시키고 이어서 80 LMH로 감소시켰다.
도 20은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 상기 공급 압력이 3.5 바를 초과했을 때 상기 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다. 상기 시점에서 상기 여과잔류물 부피의 값은 145 g/L의 단백질 농도에 상응한다.
도 21은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 일단 상기 공급 압력이 250 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 3.5 바를 초과했으면, 상기 공급 유량을 3.5 바의 공급 압력을 유지시키는 방식으로 자동 유동 조절되도록 설정하였다. 상기 작동은 상기 공급 유량이 80 LMH로 감소했을 때 종결시켰다.
본 발명에 개시된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질들을 본 발명의 실시태양들의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 이제 바람직한 방법들을 개시한다. 그러나, 본 발명의 방법을 개시하기에 앞서, 본 발명이 본 원에 개시된 특정한 크기, 모양, 치수, 물질, 방법, 프로토콜 등(이들은 통상적인 실험 및 최적화에 따라 변화될 수 있다)으로 제한되지 않음은 물론이다. 본 명세에 사용된 용어는 단지 특정한 버전이나 실시태양을 개시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위(이는 오직 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 것이다)를 제한하고자 하는 것은 아님도 또한 물론이다.
본 명세서에서 언급된 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원의 명세는 그 전체가 본 발명에 참고로 구체적으로 인용된다. 그러나, 본 발명이 선행 발명에 의해 상기와 같은 명세에 앞서는 자격을 받지 못한다는 승인으로서 해석되는 것은 결코 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하여 본 명세서가 우위에 있을 것이다. 또한, 상기 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적일뿐이며 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명은 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 한외여과 막에 적용되는 공급 유량 및 공급 압력이 여과 공정 동안 가변적이고 변화하는, 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양을 하기에 나타낸다.
한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법으로, 상기 방법은
1) 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값이 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%까지 증가하도록 공급 유량을 조절하고;
2) 상기 단계 (1) 후에 상기 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 유지하거나 또는 감소시키기 위해 상기 공급 유량을 감소시키는
단계들을 포함한다.
본 발명 내에서 사용되는 "한외여과"란 용어는 크기를 기준으로 용액 중의 분자를 분리시키는 막-기반 분리 공정을 나타낸다. "접선유동여과(TFF)"란 용어는 유체가 막에 접선방향으로 유동하는 특수 여과 방법을 나타낸다. 단백질 분자를 함유하는 용액을 가압 하에 한외여과 막의 표면을 따라, 즉 상기 표면에 접선으로 유동시킴으로써 농축시킨다. 상기 한외여과 막은 일정한 컷오프 값을 갖는 기공 크기를 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 컷오프 값은 50 kDa 이하, 바람직하게는 30 kD 이하의 범위이다.
"공급물 유동 (feed flow)"이란 용어는 공급 펌프로부터 막으로의 유체의 흐름을 나타낸다. "공급 유량 (feed flow rate)"이란 용어는 상기 용액의 상기 막으로의 흐름의 체적비를 나타낸다. 상기 공급 유량은 대개 리터/분으로서 단위 시간당 부피에 의해 주어지며 리터/㎡/h(LMH)로서 단위 시간당 단위 막 면적당 부피에 의해 표준화된다. "유량 (flux)"이란 용어는 리터/㎡/h(LMH)로서 단위 시간당 단위 막 면적당 부피에 의해 상기 막을 통한 표준화된 투과물 흐름을 나타낸다.
"공급 압력"이란 용어는 한외여과 막의 유입구에 적용되는 압력을 나타낸다. "최대 공급 압력"이란 표현은 상기 한외여과 막의 제품사양으로서 판매자에 의해 명시되는 공급 압력의 허용 가능한 최대값을 나타낸다. "여과잔류물 압력"이란 용어는 한외여과 막의 유출구에 적용되는 압력을 나타낸다. "투과물 압력"이란 용어는 한외여과 막의 투과물쪽에 적용되는 압력을 나타낸다. "막관통 압력(TMP)"이란 용어는 유체가 한외여과 막을 가로질러 여과되게 하는 압력을 나타낸다. TMP의 값을 하기와 같이 계산할 수 있다:
TMP = (P공급물 + P여과잔류물)/2 - P투과물
TMP는 상기 TFF 장비에서 상기 투과물 쪽이 개방된 경우에 공급 압력과 여과잔류물 압력의 평균이다. 상기 압력값은 대개 "바" 또는 "MPa" 또는 "psi"에 의해 주어진다.
"항체"란 용어는 항원을 특이적으로 인식하는 단백질을 지칭한다. 상기 항체는 단클론 또는 다클론일 수 있다. 상기 항체는 다양한 포맷, 예를 들어 Fv, Fab, 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄(scFv) 또는 다이아바디로 존재할 수 있다. 더욱 또한, 상기 항체의 임의의 단편 또는 변형(예를 들어 키메릭 항체, 인간화된 항체 등)을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이러한 종류의 항체의 제조 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 상기와 같은 항체 및 그의 단편을 제조하기 위한 임의의 방법을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 단클론 항체는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 양, 낙타 및 원숭이와 같은 동물로부터 유래되는 것들뿐만 아니라 인공적으로 변형된 유전자 재조합 항체, 예를 들어 키메릭 항체, 인간화된 항체, 및 이중특이성 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 혈중 지속성 및 생체내 약동학을 개선시킬 목적으로 상기 항체 분자의 물성을 변경(구체적으로, 등전점(pI)의 변경, Fc 수용체의 친화성의 개선 등)시키기 위해 상기 항체 불변 영역을 인위적으로 변형시킴으로부터 생성되는 유전자 재조합 항체를 포함한다.
본 발명에 사용되는 항체의 면역글로불린 부류는 특별히 제한되지 않으며; 상기 부류는 IgG, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA, IgD, IgE, 및 IgM을 포함한 임의의 부류일 수 있다. 그러나, IgG 및 IgM이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 항체는 비제한적으로 항-조직 인자 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-IL-6 항체, 항-HM1.24 항원 단클론 항체, 항-부갑상선 호르몬-관련된 펩타이드 항체(항-PTHrP 항체), 항-글리피칸-3 항체, 항-강글리오사이드 GM3 항체, 항-TPO 수용체 작용물질 항체, 응고인자 VIII에 대한 작용 대체물로서 항체, 항-IL31 수용체 항체, 항-HLA 항체, 항-AXL 항체, 항-CXCR4 항체, 항-NR10 항체, 및 인자 IX 및 인자 X에 대한 이중특이성 항체를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바람직한 인간화된 항체는 항-인간화된 인터류킨 6(IL-6) 수용체 항체(토실리주맵, hPM-1, 및 MRA)(WO 92/19759 참조), 인간화된 항-HM1.24 항원 단클론 항체(WO 98/14580 참조), 인간화된 항-부갑상선 호르몬-관련된 펩타이드 항체(항-PTHrP 항체)(WO 98/13388 참조), 인간화된 항-조직 인자 항체(WO 99/51743 참조), 인간화된 항-글리피칸-3 IgG1카파 항체(PCT/JP05/013103 참조), 및 항-NR10 인간화된 항체(WO2009/072604 참조)를 포함한다. 본 발명에 사용되는 특히 바람직한 인간화된 항체는 인간화된 항-IL-6 수용체 항체이다.
바람직한 인간 IgM 항체는 재조합 인간 항-강글리오사이드 GM3 IgM 항체를 포함한다(WO 05/05636 참조).
바람직한 미니바디는 항-TPO 수용체 작용물질 다이아바디(WO 02/33072 참조) 및 항-CD47 작용물질 다이아바디(WO 01/66737 참조)를 포함한다.
더욱 또한, 개선된 등전점을 갖는 항체는 예를 들어 WO 2011/090088에 개시된 항-IL-6 수용체 항체인 Mab1(이중에서 H 쇄/서열번호 1; 이중에서 L 쇄/서열번호 2), 및 WO2009/072604의 실시예 12에 개시된 방법에 의해 생성된, 항-NR10 인간화된 항체인 완전히 인간화된 NS22 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 한외여과에 의한 항체 이외의 고도로 농축된 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 한외여과 막에 적용되는 공급 유량 및 공급 압력이 여과 공정 동안 가변적이고 변화하는, 한외여과에 의해 고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본 발명에 사용되는 단백질은 비제한적으로 효소, 사이토킨, 및 펩타이드 앱타머(aptamer)를 포함한다.
본 출원 내에서 사용되는 바와 같은 "고도로 농축된 항체를 포함하는 조성물"이란 표현은 상기 고도로 농축된 항체를 함유하는 수성의 완충된 용액을 나타낸다. 본 출원 내에서 사용되는 바와 같은 "완충제"란 용어는 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 완충제 물질에 의해 균등화 되는 용액을 나타낸다. 상기와 같은 효과를 생성시키는 임의의 완충제 물질을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 약학적으로 허용 가능한 완충제 물질, 예를 들어 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모폴린 또는 그의 염, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 또는 그의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 그의 염이 사용된다. 바람직한 실시태양에서 상기 항체 제제의 완충제 조성은 10 내지 30 mmol/L 히스티딘이다. 보다 바람직한 실시태양에서 상기 항체 제제의 완충제 조성은 20 mmol/L 히스티딘이다.
임의로 상기 완충된 용액은 추가적인 염, 예를 들어 염화 나트륨, 및/또는 황산 나트륨, 및/또는 염화 칼륨, 및/또는 황산 칼륨, 및/또는 시트르산 나트륨 및/또는 시트르산 칼륨을 포함할 수도 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 항체 제제의 pH는 pH 3.0 내지 pH 10.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 6.5, 보다 바람직하게는 pH 6.0이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 항체 제제는 주변 온도에서, 바람직하게는 10 내지 30 ℃의 온도에서, 보다 바람직하게는 15 내지 30 ℃의 온도에서 처리된다.
하나의 실시태양에서, 상기 고도로 농축된 항체는 100 g/L 이상의 단백질 농도 또는 2 mPa.s 이상의 점도를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 상기 고도로 농축된 항체는 200 g/L 이상의 단백질 농도 또는 10 mPa.s 이상의 점도를 갖는다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 고도로 농축된 항체는 250 g/L 이상의 단백질 농도 또는 40 mPa.s 이상의 점도를 갖는다.
하나의 실시태양에서, 상기 단계 (1)에서 공급 유량을 200 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시킨다. 바람직한 실시태양에서, 상기 단계 (1)에서 공급 유량을 250 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시킨다. 이들 실시태양에서, 상기 단계 (1)에서 공급 유량을 일정한 속도로 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대값은 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 공급 압력의 최대값은 2.0 바 내지 4.0 바이다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대값은 3.5 바이다.
하나의 실시태양에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 200 g/L를 초과하는 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다. 바람직한 실시태양에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 220 g/L 이상의 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다. 보다 바람직한 실시태양에서, 단계 (1)은 여과잔류물 용액이 240 g/L와 동등한 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행된다.
상기 실시태양에서, 상기 공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 일정한 속도, 바람직하게는 120 LMH(L/㎡/시간) 이하, 또는 보다 바람직하게는 80 LMH(L/㎡/시간) 이하로 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 일정한 값으로 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을, 공급 유량을 하강시킴으로써 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 공급 유량을, 공급 압력과 공급 유량 간의 피드백 조절에 의해 상기 공급 압력을 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시키는 방식으로 자동적으로 조절한다.
본 발명에 따른 제조 방법의 하나의 실시태양에서, 단계 (1)과 단계 (2) 사이에, 하기의 단계를 또한 포함한다:
3) 항체 제제를, 투과물 밸브를 폐쇄시켜 막을 통해 재순환시키는 단계.
상기 실시태양에서, 상기 항체 제제를, 여과잔류물 압력 조절 밸브를 완전히 개방시켜 재순환시킨다.
상기 실시태양에서, 상기 단계 (3)에서 공급 유량을 5 내지 120 LMH(L/㎡/시간), 및 보다 바람직하게는 10 내지 80 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 유량으로 유지시킨다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 고도로 농축된 항체를 포함하는 액체 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약학 액체 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 액체 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 약학 액체 조성물은 통상적으로 질병의 치료, 예방, 시험 또는 진단을 위한 약제를 지칭한다.
본 발명의 약학 액체 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 제형화할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 물 또는 다른 약학적으로 허용 가능한 액체를 포함하는 멸균 용액 또는 현탁액의 주사의 형태로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 액체 조성물을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 매질, 구체적으로 멸균수, 생리식염수, 식물성 오일, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 풍미제, 부형제, 비히클, 보존제, 결합제 등과 적합하게 배합함으로써 일반적으로 승인된 약물 제조 실행에서 요구되는 단위 용량의 형태로 혼합함으로써 제형화할 수 있다. 상기와 같은 제형에서, 활성 성분의 양을, 소정 범위의 적합한 양을 획득하기 위해 조절한다.
멸균 주사용 조성물을 표준 제형화 실행에 따라, 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 제형화할 수 있다.
주사용 수용액은 예를 들어 생리식염수 및 덱스트로스 또는 다른 보조제(예를 들어 D-솔비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화 나트륨)를 함유하는 등장성 용액을 포함한다. 적합한 용해제, 예를 들어 알콜(에탄올 등), 폴리알콜(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 비-이온성 계면활성제(폴리솔베이트 80(상표), HCO-50 등)를 함께 사용하는 것도 또한 가능하다.
오일은 참깨 오일 및 대두 오일을 포함한다. 벤질 벤조에이트 및/또는 벤질 알콜을 용해제로서 함께 사용할 수 있다. 완충제(예를 들어 포스페이트 완충제 및 나트륨 아세테이트 완충제), 진정제(예를 들어 프로카인 하이드로클로라이드), 안정제(예를 들어 벤질 알콜 및 페놀), 및/또는 산화방지제를 병용하는 것도 또한 가능하다. 적합한 앰풀을 상기 제조된 주사액으로 충전한다.
본 발명의 약학 액체 조성물을 바람직하게는 비경구에 의해 투여한다. 예를 들어, 상기 액체 조성물은 주사, 경비 투여, 경폐 투여, 또는 경피 투여를 위한 투여형 중에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물을 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신으로 또는 국소로 투여할 수 있다.
투여 방법은 환자의 연령 및 증상을 고려하여 적합하게 선택될 수 있다. 항원-결합 분자를 함유하는 약학 액체 조성물의 용량은 예를 들어 각각의 투여에 대해서 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏일 수 있다. 한편으로, 상기 용량은 예를 들어 환자당 0.001 내지 100,000 ㎎일 수 있다. 그러나, 본 발명은 상술한 수치들에 의해 제한되지 않는다. 상기 용량 및 투여 방법들은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 다양하다. 당해 분야의 숙련가들은 상술한 인자들을 고려하여 적합한 용량 및 투여 방법들을 정할 수 있다.
실시예
하기의 실시예들은 상술한 명세를 사용하는 방식을 보다 충분히 개시할뿐만 아니라 상기 명세의 다양한 태양들을 수행하기 위해 고려되는 최선의 방식을 나타내기 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 명세의 진정한 범위를 결코 제한하고자 하는 것이 아니라, 오히려 예시를 목적으로 제공되는 것으로 생각된다.
비교 실시예 1
도 1은 한외여과 공정을 수행하기 위해 사용되는 장치의 주요부품을 예시한다. 재순환 탱크는 초기 물질 및 여과잔류물을 함유한다. 혼합 장치는 운반 라인을 통해 첨가되는 초기 풀과 한외여과 막으로부터 상기 재순환 탱크로 다시 복귀하는 여과잔류물 간의 균일한 혼합을 보장한다. 공급 펌프는 상기 막 위에서 접선유동을 생성시킨다. 공급 압력을 상기 막의 유입구에서 측정한다. 여과잔류물 압력 조절 밸브를, 예를 들어 막관통 압력(TMP) 조절 하에서 상기 막의 하류에 있는 상기 여과잔류물 쪽에서 사용하여 여과잔류물 압력을 조절한다. 상기 막과 여과잔류물 압력 조절 밸브 사이에서, 압력 센서가 여과잔류물 압력을 측정한다. 상기 막의 투과물 쪽에서, 상기 막을 통해 여과된 액체의 압력을 투과물 압력 센서에 의해 모니터한다.
실험 규모의 한외여과 처리를 위해서 자동화된 TFF 시스템 AKTA크로스플로우(crossflow)(GE 헬쓰케어(Healthcare), 미국 소재)를 사용하였다. 상기 한외여과 공정을 재생 셀룰로스의 하이드로사트(Hydrosart) 멤브레인, 30 kDa의 공칭 분자량 컷오프 및 4.0 바의 최대 공급압력 사양을 갖는 0.02 ㎡ 사토콘(Sartocon) 슬라이스 카세트(사토리우스(Sartorius), 독일 소재)를 사용하여 수행하였다.
사용전에, 상기 멤브레인 카세트를 1 mol/L의 수산화 나트륨으로 세척하고 정제수로 세정하였다. 필적하는 막 성질을 보장하도록 표준화된 유량을 측정하였다. 상기 멤브레인 카세트를 공정 전에 30 mmol/L 히스티딘 완충제로 평형화하였다. 한외여과를 주변 온도에서 실행하였다.
상기 출발 물질을 인간화된 항-인간 인터류킨-6 수용체(IL-6R) 단클론 항체(토실리주맵(등록상표: ACTEMRA, RoACTEMRA) PCT 공보 제 WO92/19759 호, 미국 특허 제 5795965 호를 참조하시오)의 정제된 풀로부터 제조하였다. 상기 정제된 풀을 60 ㎎/㎖ 까지 농축시키고 30 mmol/L 히스트딘 완충제 pH 5.8로 완충제 교환하였다.
상기 완충제 교환된 풀(DF 풀)을 625 g 항체/㎡를 갖는 TFF 시스템에 로딩하였다. 상기 공급 유량을 전체 공정 동안 250 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 속도로 설정하였다. 상기 TMP를 상기 여과잔류물 압력 조절 밸브가 완전히 개방될 때까지 1.0 바에서 조절하였다. 상기 한외여과 공정을 상기 투과물쪽의 단부를 개방하여 실행하였다. 공급 압력이 3.5 바를 초과했을 때 상기 작동을 종결시켰다. 한외여과 처리 후에, 농축된 용액을 10 ㎖/분의 일정한 여과잔류물 유량 하에서 15 분간 투과물 쪽을 폐쇄하여 순환시키고 이어서 눈금 실린더로 회수하였다. 상기 회수된 풀을 가시적으로 균질해질 때까지 교반하였다.
단백질 농도 측정을 위해서, 상기 회수된 풀을 밀도계 DMA 4500(안톤 파르(Anton Parr), 오스트리아 소재)에 의해 측정된 밀도값을 사용하여 중량측정에 의해 희석하였다. 280 ㎚에서의 UV 흡광도를 UV/Vis 분광광도계 DU800(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 미국 소재)에 의해 측정하였다.
도 2는 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 1은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 53.0
회수된 풀 209
비교 실시예 2
비교 실시예 1을 하기를 제외하고 반복하였다. 여과잔류물 부피가 100 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다.
도 3은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 2는 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 51.2
회수된 풀 230
비교 실시예 3
비교 실시예 1을 하기를 제외하고 반복하였다. 여과잔류물 부피가 200 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다.
도 4는 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 3은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 51.2
회수된 풀 227
실시예 4
비교 실시예 1을 하기를 제외하고 반복하였다. 공급 압력이 3.5 바를 초과했을 때 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다. 상기 시점에서 여과잔류물 부피의 값은 240 g/L의 단백질 농도에 상응한다.
도 5는 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 4는 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 49.5
회수된 풀 263
실시예 5
실시예 4를 하기를 제외하고 반복하였다. 일단 공급 압력이 250 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 3.5 바를 초과했으면, 공급 유량을 3.5 바의 공급 압력을 유지시키는 방식으로 자동 유동 조절되도록 설정하였다. 상기 작동을 상기 공급 유량이 80 LMH로 감소했을 때 종결시켰다.
도 6은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 5는 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 51.2
회수된 풀 273
실시예 6
실시예 4를 하기를 제외하고 반복하였다. 일단 상기 공급 압력이 3.5 바를 초과했으면 상기 유동 경로를 순환 방식으로 전환시켰다. 순환 방식으로, 여과잔류물을, 상기 여과잔류물 압력 조절 밸브를 완전히 개방하고 투과물을 폐쇄하면서 상기 막을 통해 순환시켰다. 80 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 20 분 동안 순환 후에, 동일한 공급 유량 하에서 한외여과를 재개하였다.
도 7은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 6은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 50.0
회수된 풀 268
실시예 7
실시예 6을 하기를 제외하고 반복하였다. 상기 순환을 10 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 수행하였다.
도 8은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 7은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 51.7
회수된 풀 270
도 9는 실시예 1 내지 7에서 회수된 풀의 농도를 요약한다.
실시예 8
인간화된 IL-6R 단클론 항체의 농축된 풀의 점도를 AR1000 유량계(40 ㎜ 직경, 2 도의 각도 및 53 마이크로미터 절두를 갖는 원추 및 판상의 기하학적 형태를 갖는다)(TA 인스트루먼츠(Instruments), 미국 소재)를 사용하여 측정하였다.
도 10은 15 ℃, 25 ℃ 및 35 ℃의 온도에서의 농도에 대한 점도의 플롯을 나타낸다.
비교 실시예 9
규모 확대 연구를 위해서, UF/DF 공정을 파일럿 규모로 수행하였다. 상기 공정을 상이한 크기의 TFF 시스템을 사용하여 2 단계로 실행하였다. 1.20 ㎡ 사토콘 카세트를 사용하는 보다 큰 TFF 시스템을 사용하여 UF1/DF/UF2 단계를 진행시켰다. 0.30 ㎡ 사토콘 카세트를 사용하는 보다 작은 TFF 시스템을 사용하여 UF3/UF4 단계를 진행시켰다. 전체 공정을 주변 온도에서 투과물 쪽을 단부-개방시켜 실행하였다. 상기 사용된 사토콘 카세트는 30 kDa(컷오프) 하이드로사트 멤브레인(사토리우스, 독일 소재)이었다.
사용 전에, 상기 멤브레인 카세트를 1 mol/L의 수산화 나트륨으로 세척하고 정제수로 세정하였다. 필적하는 막 성질을 보장하도록 표준화된 유량을 측정하였다.
처리 전에, 상기 멤브레인 카세트를 각각 상기 큰 시스템에서 30 mmol/L 히스티딘 완충제 pH 5.8 및 상기 작은 시스템에서 20 mmol/L 히스티딘 완충제 pH 6.1로 평형화하였다. 전체 공정을 주변 온도에서 실행하였다.
상기 큰 시스템에서, 인간화된 항-인간 IL-6 단클론 항체의 정제된 풀을 259 g 항체/㎡으로 로딩하였다. 상기 공급 유량을 710 LMH의 일정한 속도로 설정하였다. 상기 TMP를 1.0 바에서 조절하였다. 상기 정제된 풀을 UF1 단계에서 20 g/L로 농축시키고 이어서 7 통과부피(diavolume)의 30 mmol/L 히스티딘 완충제 pH 5.8로 정용여과하였다. 상기 정용여과 후에, 상기 풀을 UF2 단계에서 60 g/L로 추가로 농축시켰다. 상기 UF2 풀을 5 psi의 낮은 차동 압력 하에서 15 분간 상기 막을 통해 순환시키고 이어서 별도의 용기에 회수하였다.
상기 작은 시스템에서, 상기 회수된 UF2 풀을 990 g 항체/㎡으로 로딩하였다. 상기 UF3 단계에서, 상기 공급 유량을 250 LMH의 일정한 속도로 설정하였다. 상기 여과잔류물 부피가 100 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 상기 UF3 단계를 종료하였다. 상기 공급 유량을 UF4 단계에서 80 LMH의 일정한 속도로 설정하였다. 상기 여과잔류물 압력 조절 밸브가 완전히 개방되게 될 때까지 1.0 바에서 조절하였다. 상기 여과잔류물 부피가 240 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값으로 감소했을 때 상기 작동을 종결시켰다. 상기 공급 압력은 상기 여과잔류물 부피가 표적 부피에 도달하기 전에 상한에 접근하고 있는 중이므로 상기 공급 유량을 80 분 후에 수동으로 감소시킨 것은 중요한 의미가 있다.
상기 UF4 풀을 15 psi의 낮은 차동 압력 하에서 15 분간 상기 막을 통해 순환시키고 이어서 별도의 용기에 회수하였다. 상기 회수된 UF4 풀을 상기 용기를 뒤집어 잘 혼합하였다.
단백질 농도 측정을 위해서, 상기 회수된 UF4 풀을 밀도계 덴시토(Densito) 30PX(메틀러 톨레도(Mettler Toledo), 스위스 소재)에 의해 측정된 밀도값을 사용하여 중량측정에 의해 희석하였다. 280 ㎚에서의 UV 흡광도를 UV/Vis 분광광도계 UV-1700(시마츠(Shimadzu), 일본 소재)에 의해 측정하였다.
도 11은 UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 12는 UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
표 8은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
정제된 풀 3.06
회수된 UF2 풀 63.5
회수된 UF4 풀 221
표 9는 단계 수율 계산의 결과를 나타낸다.
단계 수율(%)
정제된 풀 N/A
회수된 UF2 풀 98.8
회수된 UF4 풀 79.8
실시예 10
비교 실시예 9를 하기를 제외하고 반복하였다. UF3/4 단계를 30 kDa 컷오프의 하이드로사트 멤브레인을 갖는 0.40 ㎡ 사토콘 카세트(사토리우스, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. 상기 큰 시스템에서, 상기 정제된 풀을 274 g 항체/㎡로 로딩하였다. 상기 작은 시스템에서, 상기 회수된 UF2 풀을 804 g 항체/㎡로 로딩하였다. 상기 여과잔류물 부피가 220 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 상기 공정이 UF3 단계에서 UF4 단계로 이행되었다.
도 13은 UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 14는 UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
표 10은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
정제된 풀 1.78
회수된 UF2 풀 65.6
회수된 UF4 풀 231
표 11은 단계 수율 계산의 결과를 나타낸다.
단계 수율(%)
정제된 풀 N/A
회수된 UF2 풀 95.6
회수된 UF4 풀 93.3
실시예 11
실시예 10을 하기를 제외하고 반복하였다. 생산 규모 TFF 시스템을 GMP 제조 설비에서 사용하였다. UF1/DF/UF2 단계를 35.10 ㎡ 사토콘 카세트를 사용하여 수행하고 UF3/4 단계를 30 kDa 컷오프의 하이드로사트 멤브레인을 갖는 17.55 ㎡ 사토콘 카세트(사토리우스, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. 큰 시스템에서, 상기 정제된 풀을 243 g 항체/㎡로 로딩하였다. 작은 시스템에서, 상기 회수된 UF2 풀을 478 g 항체/㎡로 로딩하였다. DF 완충제를 39 mmol/L 히스트딘 완충제 pH 5.8로 교환하였다. UF2 풀의 표적 단백질 농도를 75 g/L로 증가시켰다. 상기 UF2 단계의 종료 시에, 상기 공급 유량을 감소시켜 상기 재순환 탱크에서의 발포를 방지하였다. 상기 회수를 최대화하기 위해서, UF2 풀 및 UF4 풀을 각각 70 L 및 1 L의 완충제 치환으로 회수하였다. 상기 회수된 UF4 풀을 20 mmol/L 히스트딘 완충제 pH 6.0, 30 mmol/L 메티오닌, 100 mmol/L 아르기닌 및 0.2% 폴리솔베이트 80 중에서 180 g/L로 제형화하였다(PCT 공보 제 WO 2009/084659 호를 참조하시오). 단백질 농도 측정을 위해서, UF4 풀 및 회수된 UF4 풀을 밀도 기준을 사용하여 중량측정에 의해 희석하였다. 280 ㎚에서의 UV 흡광도를 UV/Vis 분광광도계 UV-2450(시마츠, 일본 소재)으로 측정하였다.
도 15는 UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 16은 UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
표 12는 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
정제된 풀 2.78
UF2 종료 73.2
회수된 UF2 풀 46.4
UF4 종료 239
회수된 UF4 풀 231
제형화된 벌크 181
표 13은 단계 수율 계산의 결과를 나타낸다.
단계 수율(%)
정제된 풀 N/A
회수된 UF2 풀 99.5
회수된 UF4 풀 90.9
상기 히스티딘 농도를 HPLC 시스템 알리안스(Alliance) 2695(워터스(Waters), 미국 소재) 및 YMC-팩(Pack) ODSA, 250 x 4.6 ㎜ 컬럼(YMC, 일본 소재)을 사용하여 측정하였다. 표 14는 히스티딘 정량분석의 결과를 나타낸다.
히스티딘 농도(mmol/L)
회수된 UF4 풀 17.5
제형화된 벌크 19.9
상기 제조 과정에 있는 풀 중의 단량체 함량을 HPLC 시스템 알리안스 2695(워터스, 미국 소재) 및 TSK G3000SWXL 컬럼(토소(Tosoh), 일본 소재)을 사용하여 측정하였다. 표 15는 SEC 분석의 결과를 나타낸다.
단량체(%)
정제된 풀 99.9
회수된 UF2 풀 99.9
제형화된 벌크 99.7
실시예 12
실시예 11을 하기를 제외하고 반복하였다. 상기 큰 시스템에서, 상기 정제된 풀을 246 g 항체/㎡로 로딩하였다. 상기 작은 시스템에서, 상기 회수된 UF2 풀을 482 g 항체/㎡로 로딩하였다.
도 17은 UF1/DF/UF2 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP 및 여과잔류물 부피에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
도 18은 UF3/UF4 단계에서 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다.
표 16은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
정제된 풀 1.95
UF2 종료 73.7
회수된 UF2 풀 46.0
UF4 종료 239
회수된 UF4 풀 231
제형화된 벌크 180
표 17은 단계 수율 계산의 결과를 나타낸다.
단계 수율(%)
정제된 풀 N/A
회수된 UF2 풀 99.2
회수된 UF4 풀 94.5
상기 히스티딘 농도를 HPLC 시스템 알리안스 2695(워터스, 미국 소재) 및 YMC-팩 ODSA, 250 x 4.6 ㎜ 컬럼(YMC, 일본 소재)을 사용하여 측정하였다. 표 18은 히스티딘 정량분석의 결과를 나타낸다.
히스티딘 농도(mmol/L)
회수된 UF4 풀 17.3
제형화된 벌크 19.4
상기 제조 과정에 있는 풀 중의 단량체 함량을 HPLC 시스템 알리안스 2695(워터스, 미국 소재) 및 TSK G3000SWXL 컬럼(토소, 일본 소재)을 사용하여 측정하였다. 표 19는 SEC 분석의 결과를 나타낸다.
단량체(%)
정제된 풀 99.9
회수된 UF2 풀 99.9
제형화된 벌크 99.7
비교 실시예 13
한외여과 처리를 위해서 자동화된 실험 규모 TFF 시스템 AKTA크로스플로우(GE 헬쓰케어, 미국 소재)를 사용하였다. 상기 한외여과 공정을 재생 셀룰로스의 울트라셀(Ultracel) 멤브레인, 30 kDa의 공칭 분자량 컷오프를 갖는 2 개의 88 ㎠ 펠리콘(Pellicon) 3 카세트(메르크 밀리포어(Merck Millipore), 독일 소재)를 사용하여 수행하였다.
사용전에, 상기 멤브레인 카세트를 0.5 mol/L의 수산화 나트륨으로 세척하고 정제수로 세정하였다. 필적하는 막 성질을 보장하도록 표준화된 유량을 측정하였다. 상기 멤브레인 카세트를 공정 전에 20 mmol/L 트리스, 150 mmol/L 아르기닌 완충제 pH 7.0으로 평형화하였다. 한외여과를 주변 온도에서 실행하였다.
상기 출발 물질을, IgG2의 항체 부류에 속하는 단클론 항-NR10 인간화된 항체(WO 2009/072604의 실시예 12에 나타낸 방법에 따라 제조된 완전히 인간화된 NS22 항체)의 정제된 풀로부터 제조하였다. 이는 pI가 5.6으로 감소되도록 변형시킨 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 정제된 풀을 20 ㎎/㎖ 까지 농축시키고 20 mmol/L 트리스, 150 mmol/L 아르기닌 완충제 pH 7.0으로 완충제 교환하였다.
상기 완충제 교환된 풀(DF 풀)을 625 g 항체/㎡로 로딩하였다. 상기 공급 유량을 250 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 속도로 실행시키고 이어서 상기 여과잔류물 부피가 60 g/L의 단백질 농도에 상응하는 값에 도달했을 때 80 LMH로 감소시켰다. 상기 TMP를 상기 여과잔류물 압력 조절 밸브가 완전히 개방될 때까지 1.0 바에서 조절하였다. 상기 한외여과 공정을 상기 투과물쪽의 단부를 개방하여 실행하였다. 공급 압력이 3.5 바를 초과했을 때 상기 작동을 종결시켰다. 한외여과 처리 후에, 농축된 용액을 10 ㎖/분의 일정한 공급 유량 하에서 15 분간 투과물 쪽을 폐쇄하여 순환시키고 이어서 눈금 실린더로 회수하였다. 상기 회수된 풀을 가시적으로 균질해질 때까지 교반하였다.
단백질 농도 측정을 위해서, 상기 회수된 풀을 밀도계 DMA 4500(안톤 파르, 오스트리아 소재)에 의해 측정된 밀도값을 사용하여 중량측정에 의해 희석하였다. 280 ㎚에서의 UV 흡광도를 UV/Vis 분광광도계 DU800(벡크만 쿨터, 미국 소재)에 의해 측정하였다.
도 19는 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 20은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 20.6
회수된 풀 222
실시예 14
비교 실시예 13을 하기를 제외하고 반복하였다. 공급 압력이 3.5바를 초과했을 때 공급 유량을 80 LMH로 감소시켰다. 상기 시점에서 여과잔류물 부피의 값은 145 g/L의 단백질 농도에 상응한다.
도 20은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 21은 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 21.7
회수된 풀 236
실시예 15
실시예 14를 하기를 제외하고 반복하였다. 일단 공급 압력이 250 LMH의 일정한 공급 유량 하에서 3.5 바를 초과했으면, 상기 공급 유량을 3.5 바의 공급 압력을 유지하는 방식으로 자동 흐름 조절로 설정하였다. 상기 공급 유량이 80 LMH로 감소되었을 때 상기 작동을 종결시켰다.
도 21은 공급 유량, 공급 압력, 여과잔류물 압력, TMP에 대한 시간에 따라 측정된 공정 값들을 나타낸다. 표 22는 단백질 농도 측정의 결과를 나타낸다.
단백질 농도(g/L)
DF 풀 20.4
회수된 풀 246

Claims (38)

  1. 한외여과에 의해 200 g/L 이상의 농도로 농축된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법으로,
    1) 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값이 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%까지 증가하도록 공급 유량을 조절하고, 여기에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값이 2.0 바 내지 4.0 바이고;
    2) 상기 단계 (1) 후에 상기 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 유지하거나 또는 감소시키기 위해 상기 공급 유량을 감소시키고;
    3) 일정한 여과잔류물 유량 하에서 투과물 쪽을 폐쇄하여 순환시키고 이어서 회수하는
    단계들을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제를 주변 온도에서 처리하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제를 10 내지 30 ℃의 온도에서 처리하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제를 15 내지 30 ℃의 온도에서 처리하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    농축된 항체가 2 mPa.s 이상의 점도를 갖는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    농축된 항체가 10 mPa.s 이상의 점도를 갖는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    농축된 항체가 250 g/L 이상의 고 농도 또는 40 mPa.s 이상의 점도를 갖는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 공급 유량을 200 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시키는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 공급 유량을 250 LMH(L/㎡/시간) 이상으로 유지시키는 방법.
  10. 제 1 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (1)에서 공급 유량을 일정한 속도로 유지시키는 방법.
  11. 삭제
  12. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값이 3.5 바인 방법.
  13. 삭제
  14. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)이, 여과잔류물(retentate) 용액이 200 g/L를 초과하는 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)이, 여과잔류물 용액이 220 g/L 이상의 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행되는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)이, 여과잔류물 용액이 240 g/L와 동등한 단백질 농도로 농축될 때 단계 (2)로 이행되는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 일정한 속도로 유지시키는 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 17 항에 있어서,
    공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 120 LMH(L/㎡/시간) 이하로 유지시키는 방법.
  19. 제 1 항 또는 제 17 항에 있어서,
    공급 압력의 값이 단계 (2)에서 감소된 후에 공급 유량을 80 LMH(L/㎡/시간) 이하로 유지시키는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서,
    단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 일정한 값으로 유지시키는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서,
    단계 (2)에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을, 공급 유량을 감소시킴으로써 상기 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시키는 방법.
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    공급 유량을, 공급 압력과 공급 유량 간의 피드백 조절에 의해 공급 압력을 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100% 이내로 유지시키는 방식으로 자동적으로 조절하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서,
    단계 (1)과 단계 (2) 사이에, 하기의 단계를 또한 포함하는 방법:
    4) 항체 제제를, 투과물 밸브를 폐쇄시켜 막을 통해 재순환시키는 단계.
  24. 제 23 항에 있어서,
    항체 제제를, 여과잔류물 압력 조절 밸브를 완전히 개방시켜 재순환시키는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서,
    단계 (4)에서 공급 유량을 5 내지 120 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 유량으로 유지시키는 방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    단계 (4)에서 공급 유량을 10 내지 80 LMH(L/㎡/시간)의 일정한 유량으로 유지시키는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제의 완충제 조성이 10 내지 30 mmol/L의 히스티딘인 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제의 완충제 조성이 20 mmol/L의 히스티딘인 방법.
  29. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제의 pH가 pH 3.0 내지 pH 10.0인 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제의 pH가 pH 5.5 내지 pH 6.5인 방법.
  31. 제 1 항에 있어서,
    항체 제제의 pH가 pH 6.0인 방법.
  32. 제 1 항에 있어서,
    한외여과 막이 50 kDa 이하의 분자량 컷오프를 갖는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서,
    한외여과 막이 30 kDa 이하의 분자량 컷오프를 갖는 방법.
  34. 제 1 항에 있어서,
    조성물이, 농축된 항-인간 인터류킨-6 수용체 단클론 항체를 포함하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    조성물이 농축된 토실리주맵을 포함하는 방법.
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 한외여과에 의해 200 g/L 이상의 농도로 농축된 단백질을 포함하는 조성물의 제조 방법으로,
    1) 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값이 한외여과 막의 명시된 최대 공급 압력의 85 내지 100%까지 증가하도록 공급 유량을 조절하고, 여기에서 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 최대 값이 2.0 바 내지 4.0 바이고;
    2) 상기 단계 (1) 후에 상기 한외여과 막에 적용되는 공급 압력의 값을 유지하거나 또는 감소시키기 위해 상기 공급 유량을 감소시키고;
    3) 일정한 여과잔류물 유량 하에서 투과물 쪽을 폐쇄하여 순환시키고 이어서 회수하는
    단계들을 포함하는 방법.
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