KR101990545B1 - 가수분해효소처리 황칠나무 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 및 치료용 cGMP 특이적 PDE 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PDE 억제작용을 하는 황칠나무 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가수분해 효소인 프로테아제, 트립신, 브로멜라인 및 파파인으로 가수분해처리되어 L-아르기닌과 가바 함량이 동시 증폭된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 혈관이완 작용이 현저하게 증진된 cGMP 특이적 PDE 억제제에 관한 것이다.

Description

가수분해효소처리 황칠나무 추출물을 포함하는 혈관질환 예방 및 치료용 cGMP 특이적 PDE 억제제{CGMP-SPECIFIC PDE INHIBITOR COMPRISING HYDROLYZED EXTRACT OF DENDROPANAX MORBIFERA FOR PREVENTING AND TREATING VASCULAR DISEASE}

본 발명은 PDE 억제작용을 하는 황칠나무 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 가수분해 효소 처리되어 L-아르기닌과 가바 함량이 동시 증폭된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하며 cGMP 특이적 PDE 활성을 선택적으로 억제할 수 있는 PDE 억제제에 관한 것이다.

사이클릭 뉴클레오타이드인 cAMP와 cGMP는 세포 내 신호 전달 체계에서 이차 신호 전달 물질로서 사용된다. 상기 cAMP 와 cGMP는 각각 AMP 와 GMP로부터 뉴클레오타이드 사이클라제인(아데닐사이클라제 또는 구아닐사이클라제)에 의해 합성된다. 신경전달 물질 혹은 호르몬과 빛, 냄새 등 외부신호들은 G-단백질 결합수용체를 통하여 사이클라제의 활성을 변화시키고, cAMP 및 cGMP의 양을 조절하여 세포 내부로 신호를 전달하게 된다. 상기와 같이 생성된 세포 내 2차 신호 전달물질인 사이클릭뉴클레오타이드는 세포 내의 여러 단백질의 기능을 조절하게 된다. 즉 cAMP의 증가로 cAMP(cGMP) 의존성 키나제(protein kinase A; 이하 PKA)의 활성이 유도되며, 상기 PKA는 인산화 과정을 통해 이온채널, 효소와 여러 가지 전사인자 등과 같은 단백질의 활성 및 기능을 조절하게 된다. 또한, 구아닐사이클라제는 그 존재 형태에 따라 각각 차별화된 활성화 과정을 갖는다.

사이클릭 뉴클레오타이드 포스포디에스테라제(Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase; 이하 PDE라 함)는 상기 cAMP와 cGMP를 가수분해하여 아데노신모노포스페이트(AMP)와 구아노신모노포스페이트(GMP)를 만드는 반응에 관여한다. PDE는 카르복실기 말단 쪽의 촉매활성 도메인과 아미노기 말단 쪽의 조절도메인으로 구성되어 있고, 20종 이상의 다른 유전자로부터 11종의 PDE 단백질 그룹이 만들어지는 것으로 알려져 있다. 이들 11종의 PDE 단백질그룹은 특정한 아미노산 서열, 촉매 조절 작용, 저분자 저해제에 대한 민감성 등에 따라 분류될 수 있다. 상기 11종류의 PDE 단백질 그룹은 중추신경계를 포함하여 신체 각 기관에서 다양하게 발현되며 각각의 단백질들이 다른 조직에서 발현됨으로써 서로 상이한 생리학적 기능을 수행할 수 있다.

PDE의 효소기능은 여러 가지 다양한 기작에 의하여 조절된다. PKA에 의한 인산화, 칼슘 이온, 포스파티딕산(phosphatidic acid)과 같은 저분자 신호전달 물질들과의 결합, 칼모듈린(Calmodulin)과 같은 신호전달 단백질과의 결합 등에 의하여 PDE 효소기능 및 이를 통한 사이클릭 뉴클레오타이드의 세포 내 농도가 조절된다고 알려져 있다. 이러한 조절물질들이 주로 결합하는 부위는 PDE의 N-말단 조절 도메인(N-terminal regulatory domain)으로, PDE의 조절 도메인은 각 패밀리별로 크게 다른 길이와 아미노산 서열을 가지고 있다.

PDE 억제제는 세포 내 사이클릭 뉴클레오타이드 농도를 높이 유지하여 줌으로써 심혈관질환, 천식, 성기능장애, 염증, 우울증 등과 같은 다양한 질환의 치료를 위한 치료제로 사용되고 있다. 천식치료제로 오랫동안 사용되어 왔던 테오필린(Theophylline)은 비특이적 PDE 억제제로 대부분의 PDE 패밀리의 효소기능을 억제하나, 이런 비특이적 억제제는 많은 부작용을 동반하는 것이 지적되어 최근은 선택적인 억제제에 관한 연구 및 개발이 이루어지는 추세이다. PDE3 특이적 억제제들은 혈관확장 효과를 가져 주로 심혈관 질환치료에 이용되고 있다. PDE4 특이적 억제제들은 우울증, 알츠하이머, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 염증 질환의 치료제로, PDE5 특이적 억제제들은 성기능 장애 치료제로 적용되고 있다. PDE7 특이적 억제제는 건선, 염증질환, 골다공증 질환의 치료제로 개발되고 있다.

순환기 질환 중 매우 흔한 빈도를 차지하는 고혈압과 허혈성 심장질환은 주로 동맥경화 및 혈관 이완기능 장애에 기인한다. 이러한 혈관, 특히 동맥의 생리적 조절에 관여하는 요인들 중 혈관 이완 물질과 수축 물질간의 균형은 매우 중요하다. 혈관 평활근의 수축은 세포내 유리 칼슘이온 농도에 의해 조절되는데 혈관 수축 물질(Ang II, endothelin-1, 노르에피네프린 등)이 세포내 칼슘이온의 농도를 증가 시키게 된다. 한편, 혈관의 이완을 조절하는 기전 중 NO/cGMP의 역할이 매우 중요 하다는 것은 이미 잘 알려져 있다. 다양한 체내, 체외 물질에 의해 분비된 NO는 soluble guanylyl cyclase(sGC)를 활성화 시켜 cGMP 생성을 촉진시키고, 이렇게 생성된 cGMP는 sarcoplasmic reticulum으로 부터의 칼슘이온 유리를 억제하고 세포 외부의 칼슘이온 투과성을 떨어뜨려 세포내 칼슘이온의 농도를 감소시킴으로써 혈관을 확장시킨다. 이 같은 혈관 이완에 관여하는 cGMP 수치를 조절하는 효소들 중 생성에 관여하는 sGC와 분해를 담당하는 PDE의 역할은 매우 중요하다. PDE1, PDE3, PDE4 및 PDE5 등이 포유류 혈관에 분포하는 것으로 알려져 있다.

NO는 혈관 평활근을 이완시켜 혈관을 확장함으로써 혈압을 조절하여 고혈압을 예방하고, 뇌졸중과 심장발작을 유발하는 혈전 형성을 예방하고, 혈관을 부드럽게 하여 동맥경화증을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 NO는 L-아르기닌(L-arginine)이 NOS 합성효소(Nitric Oxide Synthase)에 의해 분해되어 생성되게 된다.

감마아미노산부티르산(Gamma-Amino Butyric Acid; 이하 GABA라 함)은 비단백질 아미노산의 일종으로 포유류의 신경전달물질이다. 뇌의 혈류를 개선하고 혈관중추에 작용하여 항이뇨호르몬의 분비를 억제하고 혈관을 확장시켜 혈관을 낮춤으로 고혈압을 예방하는 효과가 보고되어 있다.

혈관수축은 혈관벽이 수축되면서 대동맥, 소동맥 및 정맥을 포함하는 혈관이 좁아지는 현상이다. 혈관의 수축에 따라 발생하는 혈관 장애 질환으로는 동맥경화, 혈액순환 장애, 고혈압, 두통, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 심근경색 및 심부전 등이 있다. 이러한 질환의 치료를 위하여는 혈관 이완제를 투여하고 있다. 그러나 종래 화학적 혈관 이완제는 생체 내에 내피손상, 용혈, 급성 독성이나 어독성, 급성 신장염 또는 심장마비 등의 부작용을 초래하는 경우가 있었으며, 생산 공정이 까다로워 대량 생산이 용이하지 못하다는 문제점이 있었다.

생약(Crude drugs)은 의약품의 일종으로, 천연으로 산출되는 자연물을 날로 또는 가공하여 의약품으로 사용하거나 그 원료로 삼는 것이다. 단일 성분의 화합물로 된 의약품과는 달리 많은 종류의 성분이 혼재하고 있어 그 효과가 복합적이고 상대적으로 부작용이 적다고 알려져 있다. 황칠나무(Dendropanax morbifera Lev .)는 우리나라의 남부 해안 지역과 제주도에서 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠이라고 한다. 황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있으며 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다. 이시진의 본초강목에는 황칠나무가 번열 제거, 안질 및 화상치료, 나병에 효과가 있으며 무해하다고 기록되어 있으며, 최근 차 등 식용으로 이용되고 있다.

KR 1020110029653 A

lugnier, C., Pharmacol Ther. 2006 Mar; 109 (3):366-98 Beavo, J.A., Hardman, J.G. and Sutherland, E.W. (1971) J. Biol.Chem. 246, 3841-3846. Korean Circulation J 2003;33(2):130-138

본 발명은 가수분해효소로 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 cGMP 특이적 PDE 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 프로테아제, 트립신, 브로멜라인 및 파파인으로 가수분해처리된 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 cGMP 특이적 PDE 활성 억제제가 제공된다.

또한, 상기 가수분해처리는 황칠나무 원료를 물에 침지하고 프로테아제 및 트립신을 처리하는 제 1단계; 및 상기 제 1단계에서 제조된 황칠나무 침지액에 브로멜라인 및 파파인을 처리하는 제 2단계로 수행될 수 있다.

또한, 상기 황칠나무 추출물은 열수 추출물일 수 있다.

또한, 상기 가수분해처리된 황칠나무 추출물은 L-아르기닌 및 가바 함량이 증가될 수 있다.

또한, 상기 혈관질환은 고혈압, 동맥경화, 말초혈액순환장애, 혈관협착, 뇌경색, 협심증, 심근경색 및 허혈성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 PDE 활성 억제제는 유효성분으로 함유하는 황칠나무 추출물을 가수분해 처리하여 이용함으로써, 일반적인 황칠나무 추출물이 나타내는 cAMP 특이적 PDE 억제활성은 저감시키고 cGMP 특이적 PDE 억제활성은 현저하게 증가시킬 수 있다. 이를 통하여, cGMP 특이적 PDE에 대해 보다 선택적이고 강화된 억제 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 수축된 혈관을 이완시킬 수 있어, 혈관질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 약학 조성물로 이용될 수 있다.

또한, 황칠나무를 가수분해효소로 가수분해처리함으로써 L-아르기닌 및 가바 성분이 동시에 현저하게 증가되어, 보다 향상된 혈관 이완 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 황칠나무 추출물 및 가수분해처리된 황칠나무 추출물의 cGMP 선택적 PDE 억제 활성을 확인한 것이고,
도 2는 황칠나무 추출물 및 가수분해처리된 황칠나무 추출물의 cAMP 선택적 PDE 억제 활성을 확인한 것이고,
도 3 및 4는 황칠나무 추출물 및 가수분해처리된 황칠나무 추출물의 혈관 이완 효과를 기저긴장도 실험으로 확인한 것이다.

본 발명은 프로테아제, 트립신, 브로멜라인 및 파파인으로 가수분해처리된 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관질환의 예방 또는 치료용 cGMP 특이적 PDE 활성 억제제에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.

본 발명의 PDE 활성 억제제는 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함한다.

상기 황칠나무 추출물을 분리할 수 있는 황칠나무의 원료가 되는 부분은 황칠나무의 잎, 가지, 뿌리 및 열매로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 황칠나무의 잎 또는 가지가 선택되는 것이 좋다. 보다 바람직하게는 황칠나무의 잎 또는 어린 가지가 선택되는 것이 좋다. 상기 어린 가지는 1년생 이하의 가지를 의미한다. 이를 통상의 방법에 의하여 절단, 건조 및 분쇄하여 이용할 수 있다. 상기 건조 방법은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 자연건조, 열풍건조 또는 동결건조를 이용할 수 있다.

상기 황칠나무 원료에 가수분해효소를 처리하고 물을 용매로 용매추출하여 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 제조할 수 있다. 본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물의 제조에 있어, 바람직한 일 구현예의 순서는 원료를 침지하고 두 단계로 나누어 가수분해처리한 후 추출 및 효소 불활성화를 수행하는 것으로 이루어질 수 있다. 상기 가수분해처리는 황칠나무 원료를 물에 침지하고 1차 가수분해를 위해 프로테아제 및 트립신을 처리하는 제 1단계; 및 상기 제 1단계에서 제조된 황칠나무 침지액에 2차 가수분해를 위해 브로멜라인 및 파파인을 처리하는 제 2단계로 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 원료의 가수분해처리시 상기와 같이 두 단계로 나누어 수행함으로써, 반응 온도 조건이 상이한 효소들을 각기 최적의 온도에서 반응할 수 있도록 하면서도 반응 최적 온도가 유사하고 서로간의 역반응을 유도하지 않는 효소 그룹을 동일 단계에서 함께 처리하여 반응시간을 단축시킬 수 있다. 상기 가수분해처리시 첨가 처리되는 효소는 용매에 녹인 효소액의 형태로 처리될 수 있다.

상기 가수분해처리의 제 1단계에서, 먼저 황칠나무 원료를 물에 침지하고 1차 가수분해처리를 위하여 프로테아제(protease) 및 트립신(trypsin)을 황칠나무가 침지된 물인 황칠나무 침지액에 첨가하여 처리할 수 있다. 상기 물은 침지 용매이자 효소반응을 위한 반응 풀(pool)을 형성하며, 황칠나무 원료 중량 대비 7 내지 15배수로 사용될 수 있다. 상기 제 1단계는 황칠나무 원료에 단백질 분해효소를 처리하는 단계로 수행될 수 있다. 상기 프로테아제는 황칠나무 원료에서 단백질 용출량을 증가시키기 위해 첨가될 수 있으며, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 프로테아제가 선택되는 것이 바람직하다. 상기 트립신은 황칠나무 유래 단백질을 폴리펩타이드와 소수의 아미노산으로 분해시키기 위하여 첨가될 수 있다. 상기 제 1단계에서 처리되는 프로테아제 및 트립신은 황칠나무 원료를 총 100중량% 기준으로 하여 각 0.1 내지 1 중량% 함량으로 처리될 수 있다. 상기 제 1단계는 40 내지 50℃에서 5 내지 15시간동안 처리하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 42 내지 47℃에서 6 내지 10시간동안 처리하여 수행되는 것이 좋다.

다음으로, 상기 가수분해처리의 제 2단계가 수행될 수 있다. 상기 제 2단계는 단백질 분해효소가 처리된 황칠나무 원료에 아미노펩타이드 분해 효소를 처리하는 단계로, 상기 제 1단계에서 제조된 프로테아제 및 트립신이 처리된 황칠나무 침지액에 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)을 첨가하여 처리함으로써 수행될 수 있다. 상기 제 2단계에서 처리되는 브로멜라인 및 파파인은 황칠나무 원료의 중량 기준으로 각 0.1 내지 1 중량% 함량으로 처리될 수 있다. 상기 제 2단계는 50 내지 60℃에서 12 내지 20시간동안 처리하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 53 내지 57℃에서 14 내지 18시간동안 처리하여 수행되는 것이 좋다. 상기 제 2단계에서, 브로멜라인 및 파파인은 용매에 녹인 효소액으로 제조되어 처리될 수 있으며, 효소액을 제조하기 위한 용매는 황칠나무 원료 중량의 0.5 내지 2배수로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

다음으로, 상기 제 1 및 제 2단계를 포함하는 방법으로 가수분해처리된 황칠나무 침지액에 대하여, 처리된 효소를 불활성화시키는 동시에 유용성분인 황칠나무 추출물을 분리하기 위한 열수추출을 수행할 수 있다. 이를 통하여, 하나의 공정으로 황칠나무 추출물의 제조 및 효소의 불활성화가 이루어지게 되어 생산 공정 중 편의성을 향상시키면서 제조시간 및 노력을 저감시켜 제조시 생산성을 증대시킬 수 있다. 열수추출시 처리 온도는 80 내지 120℃일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 120℃인 것이 좋다. 상기 온도범위 내에서 1 내지 72시간 동안 추출하여 황칠나무 추출물의 분리 및 효소 불활성화가 수행될 수 있다. 바람직하게는 2 내지 12시간, 보다 바람직하게는 3 내지 7시간 동안 추출할 수 있다. 필요에 따라, 추출수율을 증가시키기 위해 황칠나무 원료 중량 기준 8 내지 12배수의 물을 더 첨가한 후 열수추출을 수행할 수 있다. 열수추출을 통해 제조된 가수분해처리된 황칠나무 추출물은 이후 여과, 농축 또는 건조과정을 통해 용매를 제거함으로써 농도가 조절된 액체 또는 고체 분말의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물은 cGMP 특이적 PDE 활성 억제 효과를 가진다. 상세하게는, 황칠나무 원료를 가수분해처리함으로써 황칠나무 원료의 cAMP 특이적 PDE 억제 활성은 저감시키면서 cGMP 특이적 PDE 억제 활성은 증가시켜, cGMP 특이적 PDE 에 대하여 보다 선택적이고 강화된 억제 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물은 가수분해처리를 통해 유용성분인 L-아르기닌 및 가바(GABA)의 함량을 동시에 현저히 증가시킴으로써 우수한 혈관 이완 효과를 가진다. 이를 통하여, 혈관 수축과 연관된 혈관 장애 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 고품질 및 고효율의 조성물로 이용될 수 있다. 상기 혈관 장애 질환으로는 예를 들면, 고혈압, 동맥경화, (말초)혈액순환장애, 혈관협착, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 협심증, 심근경색 또는 허혈성 뇌질환이 있다.

본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 PDE 억제제는 혈관질환의 예방 또는 치료용도로 적용하기 위한 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.

필요에 따라, 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

필요에 따라, 본 발명의 약제학적 제제는 상기 성분들 이외에 당업계에 공지된 첨가물을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 제제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 피부 도포, 직장 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 조절될 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001㎎/㎏ 내지 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1g/㎏일 수 있다. 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 숙련된 의사에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 PDE 억제제는 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품이란 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 식품소재에 첨가하여 제조된 식품이거나, 이를 캡슐, 분말, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 통상적인 의미의 건강 식품을 포함한다. 상기 식품의 종류로는, 예를 들면, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디, 스넥, 과자, 피자, 면류, 껌, 아이스크림, 스프, 음료, 차, 비타민 복합제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

필요에 따라, 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산, 펙트산염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제, 과육 등을 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 기능성 식품은 드링크제일 수 있다. 상기 드링크제는 향미제 또는 천연 탄수화물을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예

<황칠나무 추출물의 제조>

황칠나무 잎 끝을 기준으로 50㎝이내의 녹지 부분까지의 잎을 원료로 2㎝ 내외로 세절하여 열풍건조를 진행하였다. 황칠나무 잎 원료 중량을 기준으로 20배수의 증류수를 첨가하고 100℃에서 4시간동안 열수추출을 진행한 후 30brix 이상의 농도로 농축시키고 동결건조하여 분말 형태의 열수추출물을 얻었다. 2.5㎏의 원료를 이용하여 521.55g의 추출물을 얻었으며, 수율은 20.9%(w/w)인 것으로 나타났다.

<가수분해처리된 황칠나무 추출물의 제조>

건조세절한 황칠나무 잎 1㎏을 원료로, 원료 중량기준 9배수 양의 증류수를 원료에 첨가하여 침지하였다. 프로테아제 1g 및 트립신 1g을 증류수에 녹여 처리하고 45℃에서 8시간동안 원료의 침지 추출 및 1차 가수분해를 동시 실시하였다. 1차 가수분해 종료 후 원료 중량을 기준으로 별도 1배수 양의 증류수에 브로멜라인 1g 및 파파인 1g을 녹여 효소액으로 제조하여 침지액에 처리하고, 55℃에서 16시간동안 2차 가수분해를 실시하였다. 2차 가수분해 종료 후 원료 중량기준 10배수 양의 증류수를 추가로 첨가하여 원료 중량기준 총 20배수 양의 증류수에 황칠나무 원료를 침지한 상태로 100℃에서 4시간동안 열수 추출하는 동시에 효소불활성화를 수행하는 과정을 거쳤다. 이후 30brix 이상의 농도로 농축시키고 동결건조하여 분말 형태의 열수추출물을 얻었다.

<황칠나무 추출물의 L-아르기닌 및 가바 함량 확인>

황칠나무 추출물 및 가수분해처리된 황칠나무 추출물에 대하여 L-아르기닌 및 가바의 함량을 분석하여 가수분해처리로 인한 유용성분 증폭률을 확인하였다. 황칠나무 추출물을 비교예로, 본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 실시예로 하였다. L-아르기닌 및 가바 함량 분석에는 1200 series LC (Agilent, USA)와 결합된 6410A triple quadrupole mass spectroscopy　(Agilent, USA)를 사용하였다. Positive electro-spray ionization (+ESI) 장치로 시료를 이온화시킨 후 multiple reaction monitoring (MRM) mode에서 분석을 실시하며, nebulizer 압력, N₂ gas 유속 및 온도는 각각 40 psi, 10 L/min, 310℃로 설정하고 capillary voltage는 4kV를 유지하였다. Column으로 Gemini-NX C18 (4.6 × 150 mm, 3 μm, Phenomenex)을 사용하며, 시료 주입량은 5㎕, column oven은 35℃를 유지하였다. 이동상으로 5 mM ammonium acetate와 0.1%(v/v) formic acid가 혼합된 water (A)와 methanol (B)을 사용하여 초기 0%(v/v) B에서 시작하여 95%(v/v) B까지 순차적으로 변화시킨 후 다시 0%(v/v) B로 낮춰서 30분간 분석을 실시하며, 유속은 0.5 ㎖/min으로 유지하였다. 각 시료에 대한 분석은 2회 반복 측정하였으며 그 결과는 하기 표 1 에 나타냈다. 하기 표 1에서, L-아르기닌 및 가바 함량 단위는 ㎎/g이다.

구분	측정 반복	L-아르기닌 (㎎/g)	가바 (㎎/g)
비교예	1회	3.45	19.975
	2회	2.903	18.017
	평균	3.177	18.996
실시예	1회	16.840	25.176
	2회	18.730	30.450
	평균	17.770	27.813

표 1을 참고하면, 황칠나무 추출물에 비해 가수분해처리된 황칠나무 추출물의 L-아르기닌 및 가바 함량이 모두 증가된 것을 확인할 수 있다. 비교예를 기준으로 했을 때, 실시예의 L-아르기닌 함량 평균 증폭률은 559%(w/w), 가바 함량 평균 증폭률은 146%(w/w)인 것으로 나타났다.

<cGMP 선택적 포스포디에스테라아제 억제 활성 확인>

cGMP 선택적 포스포디에스테라아제(PDE) 억제 활성 실험은 PDE Activity Assay Kit (Colorimetric) (ab139460, Cambridge, UK)를 이용하였다. cGMP 선택적 포스포디에스테라아제 억제 활성 분석을 위해 cGMP의 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제에 의한 cGMP의 분해를 측정하는 방법을 사용하였다. 포스포디에스테라아제에 의해 방출된 5'-뉴클레오타이드는 추가로 5'-뉴클레오티다아제 효소에 의해 뉴클레오사이드와 인산염으로 절단되는데, 효소 절단으로 인해 방출되는 인산염은 녹색으로 색 변환이 되는 Green Assay Reagent를 사용하여 620nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 비교예 및 실시예에 대한 cGMP 선택적 포스포디에스테라아제 활성 저해 효과를 측정하여 정량적 분석을 실시하여 억제효과를 비처리군 대비 %로 환산하였으며, 이를 표 2 및 도 1에 나타내었다. 측정은 각 3회씩 수행하였으며, 효소 활성 억제 효과의 비교를 위한 대조군으로는 비특이적인 사이클릭 뉴클레오티드포스포다이스트에스터 억제제인 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)을 사용하였다. 대조군으로서 IBMX의 억제효과인 IC₅₀은 약 25μM이었다. 도 1에서, (A)는 비교예의 측정 결과이고 (B)는 실시예의 측정결과이다.

조건	농도 (μg/ml)	측정반복	억제효과 (%)	측정반복	억제효과 (%)	측정반복	억제효과 (%)
비교예	0.1	1회차	19.91	2회차	19.91	3회차	19.91
	0.3	1회차	20.38	2회차	19.43	3회차	20.38
	1	1회차	64.93	2회차	62.09	3회차	61.14
	3	1회차	67.30	2회차	68.25	3회차	70.14
	10	1회차	89.57	2회차	87.20	3회차	86.26
실시예	0.1	1회차	29.86	2회차	30.33	3회차	30.81
	0.3	1회차	47.87	2회차	47.87	3회차	49.29
	1	1회차	80.57	2회차	81.04	3회차	82.46
	3	1회차	127.49	2회차	127.96	3회차	140.28
	10	1회차	110.90	2회차	117.06	3회차	129.86

도 1 및 표 2를 보면, 비교예에 비해 실시예의 cGMP 선택적 PDE 억제 활성 효과가 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있다. 이를 통하여, 혈관이완을 통한 혈관질환, 예를 들면, 고혈압의 치료 목적으로 유용하게 활용될 수 있다.

<cAMP 선택적 포스포디에스테라아제 억제 활성 확인>

cAMP 선택적 포스포디에스테라아제(PDE) 억제 활성 실험은 PDE Activity Assay Kit (Colorimetric)(ab139460, Cambridge, UK)를 이용하였다. cAMP 선택적 포스포디에스테라아제 억제 활성 분석을 위해 cAMP의 사이클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제에 의한 cAMP의 분해를 측정하는 방법을 사용하였다. 포스포디에스테라아제에 의해 방출된 5'-뉴클레오타이드는 추가로 5'-뉴클레오티다아제 효소에 의해 뉴클레오사이드와 인산염으로 절단되는데, 효소 절단으로 인해 방출되는 인산염은 녹색으로 색 변환이 되는 Green Assay Reagent를 사용하여 620nm에서 흡광도를 측정하여 정량화 하였다. 비교예 및 실시예에 대한 cAMP 선택적 포스포디에스테라아제 활성 저해 효과를 측정하여 정량적 분석을 실시하여 억제효과를 비처리군 대비 %로 환산하였으며, 이를 표 3 및 도 2에 나타내었다. 측정은 각 3회씩 수행하였으며, 효소 활성 억제 효과의 비교를 위한 대조군으로는 비특이적인 사이클릭 뉴클레오티드포스포다이스트에스터 억제제인 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)을 사용하였다. 대조군으로서 IBMX의 억제효과인 IC₅₀은 약 25μM이었다. 도 2에서, (A)는 비교예의 측정 결과이고 (B)는 실시예의 측정결과이다.

조건	농도 (μg/ml)	측정반복	억제효과 (%)	측정반복	억제효과 (%)	측정반복	억제효과 (%)
비교예	0.1	1회차	21.93	2회차	21.93	3회차	21.39
	0.3	1회차	22.99	2회차	23.53	3회차	25.13
	1	1회차	59.89	2회차	65.78	3회차	59.36
	3	1회차	71.66	2회차	74.33	3회차	62.57
	10	1회차	90.37	2회차	90.37	3회차	89.84
실시예	0.1	1회차	29.95	2회차	28.88	3회차	31.02
	0.3	1회차	40.11	2회차	42.25	3회차	41.18
	1	1회차	43.32	2회차	41.71	3회차	37.97
	3	1회차	57.22	2회차	54.01	3회차	51.34
	10	1회차	64.71	2회차	65.78	3회차	63.10

도 2 및 표 3을 참고하면, 비교예 및 실시예는 약한 cAMP 선택적 PDE 억제 활성을 나타냈으며, 실시예의 cAMP 선택적 PDE 억제 활성 효과는 비교예에 비해 상대적으로 저감된 것으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물은 가수분해처리하지 않은 일반적인 황칠나무 추출물과 다르게 cGMP 특이적 PDE에만 선택적으로 강한 억제활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

<흉부대동맥 혈관이완에 따른 혈압 저하효과 평가>

실험 수행을 위해 쥐의 혈관조직절편을 제작하였다. 160 내지 200g 내외의 스프라그-다우리 계(Sprague-Dawley) 흰쥐(샘타코, 한국)를 고형사료(LabDiet 5L79, 오리엔트바이오, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 사육실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 쥐를 기절시킨 후 즉시 방혈한 다음 복부중앙선을 따라 개복하고 하행흉부대동맥(thoracic aorta)을 분리하여 길이 약 2mm의 링(ring) 형태로 잘랐으며, 산소가 포화된 4℃의 크랩스용액(Krebs buffer(mM/L); 118.4 NaCl, 25 NaHCO₃, 11.66 glucose, 4.7 KCl, 1.18 MgSO₄ ·7H₂O, 2.5 CaCl₂ · 2H₂O, 1.19 KH₂PO₄, pH7.4)에 침지시켰다. 산소를 계속 공급하면서 주위의 지방조직과 결체조직을 깨끗이 제거한 다음 약 2mm의 길이가 되도록 횡으로 절단하여 고리절편을 만들었다.

쥐 흉부대동맥 혈관조직의 이완능력에 일반 황칠나무 추출물과 가수분해처리된 황칠나무 추출물이 미치는 영향을 분석하기 위해 먼저 쥐 혈관대동맥 혈관조직의 기능적 활성을 측정하였다. 근실(organ chamber)내의 용액은 37℃, pH 7.4에서 95%의 산소(O₂)-5%의 이산화탄소(CO₂)혼합기체로 통기상태를 유지시켰다. 혈관의 장력은 등장성 변환기(isometric transducer (MLT0201, Panlab, Cornella, Spain))가 연결된 다원기록 장치(polygraph system(PowerLab 8/35, ADInstruments, Dunedin, New Zealand))와 컴퓨터 분석기(computer analyser(LabChart Pro V8-MLS260/8, ADInstruments, Dunedin, New Zealand))로 측정하였다. 약물실험을 하기 전에 흉부대동맥 혈관은 혈관조직의 한쪽 부분을 근실의 아래쪽에 설치된 고리에 걸고 다른쪽 부분은 force-displacement transducer에 매달아 혈관절편에 1g의 힘을 가함으로써 기저긴장도를 부하하였으며, 30분간 평형을 유지시킨 후 일정한 기저선이 유지되면 혈관수축제인 페닐레프린(Phenylephrine) 10^-5M을 투여한 후, 수축된 대동맥에 아세틸콜린(acetylcholine) 10^{- 5}M,10^{- 4}M,10^-3M을 첨가시 완전히 이완됨을 측정하였다. 또한 페닐레프린(Phenylephrine) 10^-5M로 수축 후, 크랩스 용액으로 노출시켰을 때, 반응이 안정됨을 확인하여 기능적 활성의 판정이 가능하였다. 이는 도 3의 (A)에 나타냈다.

쥐 흉부 대동맥 혈관조직의 기능적 활성을 확인한 후 비교예 및 실시예를 이용하여 실험을 수행하였다. 페닐레프린(Phenylephrine) 10^{- 5}M농도로 투여하여 혈관 수축을 유도한 후, 비교예인 일반 황칠나무 추출물을 0.1, 0.3, 1, 3, 10μg/ml로 투여하면서 수축된 혈관에 대한 이완정도를 확인하고 그 결과를 도 3의 (B)에 나타냈다. 또한, 실시예인 가수분해처리된 황칠나무 추출물에 대해 쥐의 흉부 대동맥 혈관이완 반응에 미치는 영향을 분석하기 위해, 대동맥을 수축시킨 후 비교예와 동일한 농도인 0.1, 0.3, 1, 3, 10μg/ml에서 이완반응을 확인하고 그 결과를 도 3의 (C)에 나타냈다. 비교예 및 실시예의 처리농도별 이완효과를 다시 비교한 결과는 도 4에 나타냈다.

도 3 및 4를 참고하면, 비교예의 EC₅₀값은 6.61±0.06μg/ml이고, 실시예의 EC₅₀값은 3.50±0.07μg/ml인 것으로 나타났다. 비교예에 비하여 실시예의 혈관 이완 효과가 2배 우수한 효과를 보이는 것을 확인할 수 있다. IC₅₀값을 비교하면 비교예는 6.61μg/ml이고 실시예는 3.50μg/ml로서, 이 결과는 혈관이완 효과를 보기 위해 본 발명의 가수분해처리된 황칠나무 추출물을 함유하는 PDE 억제제를 섭취하는 경우에, 일반적인 방법으로 단순 추출하여 수득한 황칠나무 추출물으을 이용하는 경우에 비해 그 절반에 해당되는 섭취량을 복용하였을 경우에도 동등 이상의 효과를 볼 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 PDE 활성 억제제는 가수분해효소 처리를 통해 L-아르기닌과 가바가 동시에 증폭된 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 cGMP 특이적 PDE 저해활성이 증가되고 혈관이완 효과가 더욱 증폭되어, 혈관질환의 예방 또는 치료를 위한 고효율의 치료제로 유용하게 적용할 수 있다.

Claims (5)

1. 황칠나무 원료를 물에 침지하고 트립신 및 바실러스 섭틸리스 유래 프로테아제를 처리하는 제 1단계;
   상기 제 1단계에서 제조된 황칠나무 침지액에 브로멜라인 및 파파인을 처리하는 제 2단계; 및
   열수 추출하는 제 3단계; 를 포함하는 제조방법으로 제조되는 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 함유하고, cGMP 특이적 PDE 활성을 억제하는, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
   상기 혈관질환은 고혈압, 동맥경화, 말초혈액순환장애, 혈관협착, 뇌경색, 협심증, 심근경색 및 허혈성 뇌질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1단계는 40 내지 50℃에서 5 내지 15시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 L-아르기닌 및 가바 함량이 증가된 것을 특징으로 하는, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 제 2단계는 50 내지 60℃에서 12 내지 20시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   

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