KR20160021037A - 익모초 특정 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 익모초 특정 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 익모초 특정 추출물을 대상으로 호염기성 백혈구 세포를 이용한 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용 실험; RAW 264.7 세포를 이용한 NO(Nitrite) 생성 억제 활성실험; LPS 유발 폐손상 BALB/c 마우스모델을 이용한 호흡기 급성 염증에 대한 억제 활성실험; BALB/c 마우스모델을 이용한 알러지성 천식 억제 활성실험; 복귀돌연변이 독성시험을 통하여 안전하면서 선행문헌에 기재된 익모초 물추출물보다 호흡기염증 질환에 대한 탁월한 강력한 치료효능을 확인함으로서 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로서 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

익모초 특정 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {the composition comprising the specific extract isolated from Leonurus sibiricus as an active ingredient for preventing or treating respiratory inflammatory disease}

본 발명은 익모초 특정 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104.

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본 발명은 익모초 특정 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 호흡기 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반응과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포, 면역관여 세포 등이 포함된다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다.

알러지 반응은 그 반응 형태에 의해 I형, II형, III형 및 IV형의 4 가지 유형으로 분류될 수 있고, 또는 항원에 의한 재감작(感作) 후 발증까지의 시간에 의해서 I형, II형 및 III형 알러지는 즉시형 알러지라고 불리며, IV형 알러지는 지연형 알러지로 분류될 수 있다.

이 중, I형 알러지는 IgE 항체가 관여하는 반응으로서, 아나필락시형 알러지라고 불리우며, 여기에는 기관지 천식, 아토피성 질환(피부염, 장염 등), 화분증 등의 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 음식물 알러지 등이 포함된다.

천식(asthma)이란 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민성을 그 특징으로 하는 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 알러지성이며, 만성 기도염증(chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104).

천식은 그 원인에 따라 외인성 천식과 내인성 천식으로 나누어질 수 있다. 외인성 천식의 경우 원인 항원에 노출되었을 때 증상이 나타나는 천식을 말한다. 원인 항원에 대한 피부시험이나 기관지 유발시험이 양성반응을 보이며 발병 연령이 어린 것이 일반적이다. 집 먼지, 진드기가 가장 많은 원인 항원이며, 그밖에 꽃가루, 동물의 상피, 곰팡이 등이 원인 항원으로 작용한다. 내인성 천식의 경우에는 상기도 감염, 운동, 정서불안, 한랭 기후 및 습도의 변화 등이 천식을 유발하거나 악화시키는 경우인데, 성인형 천식에서 흔히 볼 수 있다. 그 외에도 약물에 의해 유발되는 천식, 운동 유발성 천식 및 직업성 천식 등이 있다.

천식은 TH2(T helper 2) 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 천식을 앓고 있는 환자의 기관지에서 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포는 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용에 관여한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998).

따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알러지 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다.

만성폐쇄성 폐질환 (Chronic Obstructive pulmonary disease, COPD)는 전세계적으로 해마다 증가하고 있는 질환으로, 인류의 건강을 위협하는 원인 중 하나이다. 현재, 만성폐쇄성 폐질환은 많은 나라에서 사망의 주요원인으로 주목되고 있으며, 특히 2020년에는 만성폐쇄성 폐질환이 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측되고 있다 (Vestbo, J., Hurd, S.S., Agusti, A.G., Jones, P.W., Vogelmeier, C., Anzueto, A., Barnes,P.J., Fabbri, L.M., Martinez, F.J., Nishimura, M., Stockly, R.A., Sin.D.D., Rodriguez-Roisin, R., 2013. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 347-365.). 일반적으로 만성폐쇄성 폐질환은 지속적인 폐조직내 공기흐름을 억제 및 폐쇄시켜 결국 환자를 사망에 이르게 한다 (Le, A., Zielinski, R., He, C., Crow, M.T., Biswal, S., Tuder, R.M., 2009. Pulmonary epithelial neutrophilin-1 deletion enhances development of cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 396-406.). 이러한 만성폐쇄성 폐질환은 담배연기, 먼지, 화학물질, 대기오염, 세균감염 등의 다양한 원인에 의해서 발생된다 (Li, Y., Li, S.Y., Li, J.S., Deng, L., Tian, Y.G., Jiang, S.L., Wang, Y., Wang, Y.Y., 2012. A rat model for stable chronic obstructive pulmonary disease induced by cigarette smoke inhalation and repetitive bacterial infection. Biol. Pharm. Bull. 35, 1752-1760.). 특히, 흡연은 만성폐쇄성 폐질환의 가장 큰 원인으로 간주되고 있으며, 실제 만성 폐쇄성 폐질환에 걸린 환자의 80% 이상이 흡연자로 밝혀졌다 (Rabe et al., 2007). 담배연기에는 수많은 독성화학물질 포함되어 있어, 흡연시에폐조직 내 해로운 변화를 야기한다 (Stampfli, M.R., Anderson, G.P., 2009. How cigarette smoke skews immune responses to promote infection, lung disease and cancer. Nat. Rev. Immunol. 9, 377-384.). 이러한 독성화학물질은 폐조직내호중구 (Neutrophils) 를 비롯한 다양한 염증세포의 침윤을 일으키고, 이로 인하여 폐염증이 발생하게 된다 (Terashima, T., Wiggs, B., English, D., Hogg, J.C., van Eeden, S.F., 1997.Phargocytosis of small carbon particles (PM10) by alveolar macrophages stimulated the relaease of polymorphonuclear leukocytes from bone marrow. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155, 1441-1447). 임상연구에서도 만성폐쇄성 폐질환 환자의 기관지폐포세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 혹은 객담 (Sputum) 에서 호중구 및 대식세포 (Macrophages)의 수가 현저하게 증가하였다 (O’Donnell, R., Breen, D., Wilson, S., Djukanovi, R., 2006. Inflammatory cells in the airway in COPD. Thrax 61, 448-454.). 이러한 염증세포들은 활성산소족 (Reactive oxygen species), 염증성싸이토카인 (Cytokines), 케모카인 (Chemokines), 및 조직손상을 야기하는 다양한 효소를 생산한다 (Profita, M., Sala, A., Bonanno, A., Riccobono, L., Ferraro, M., La Grutta, S., Albano, G.D., Montalbano, A.M., Gjomarkaj, M., 2010. Chronic obstructive pulmonary disease and neutrophil infiltration: role of cigarette smoke and cyclooxygenase products. Am. J. Physiol. Lung Cell.Mol. Physiol. 298, L262-L269.). 특히, 호중구는 만성폐쇄성 폐질환이 발병하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Hiemstra, P.S., van Wetering, S., Stolk, J., 1998. Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructive pulmonary disease: effects on pulmonary epithelium. Eur. Respir. J. 12, 1200-1208.). 호중구는 많은 염증성싸이토카인, 케모카인 및 화학주성인자를 생성할 뿐만아니라, 엘라스틴 분해효소 (Elastase)를 분비하여, 정상적인 폐포형태를 파괴하고 결국에는 폐기종 (Emphysema)을 야기한다 (Hoenderdos, K., Condliffe, A., 2013. The neutrophils in chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 48, 531-539.). 따라서, 담배연기로 인한 염증세포 특히 호중구의 침윤을 억제하는 것은 만성폐쇄성 폐질환의 치료에 있어 매우 중요한 치료수단으로 인식되고 있다.

따라서, 만성 폐쇄성 폐질환은, 가역적인 기류 폐쇄와 알러지성 기관지 염증 반응을 주된 특징으로 나타내는 천식과는 구분되어서 적합하게 치료되어야 하지만, 현재의 치료법은 단지 증상의 경감을 제공함에 불과하고, 최근 치료법 중 어느 것도 만성 폐쇄성 폐질환의 근본적인 치료 효과를 임상적인 결과로 나타내지 못하고 있다 (Hele DJ, Belvisi MG. 2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway diseases. Expert Opin Investig Drugs 12: 5-18; Fox JC, Fitzgerald MF. 2009. The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of COPD. Curr Opin Pharmacol. 9: 231-242)

천식과 COPD는 원칙적으로 상이한 병리기전을 나타내는데, 예를 들어, (1) 염증세포 면에서, 천식은 비만세포(mast cell), 호산구(Eosinophils), CD4+ 세포 (Th2), 대식세포(Macrophages) 등이 주로 작용하는데 반하여, COPD는 호중구(Neutrophils), CD8+ 세포 (Tc) 등이 주로 작용한다는 점에서 상이하며; (2) 염증매개인자 면에서, 천식은 류코트리엔(Leukotriene B), 히스타민(Histamine), IL-4, IL-5, IL-13, 에오탁신(Eotaxin), RANTES, 산화적 스트레스(Oxidative stress) 등이 주로 관여되는데 반하여, COPD는 TNF-alpha, IL-8, GRO-alpha 등이 주로 관여된다는 점에서 상이하며; (3) 염증현상 면에서, 천식은 전체 기도에 작용하여, AHR(기도과민반응 과민), 상피성 쉐딩(Epithelial shedding), 섬유증(Fibrosis), 조직질실상 발전이 없으며(no parenchymal involvement), 점액분비(muscus secretion), 비교적 가역적 기류장애 현상, 기침, 재채기, 호흡곤란(dyspnea)를 주로 어린 시기에 발생하는 데 반하여, COPD는 말초 기도에 작용하여, 상피성 변성(Epithelial metaplasia), 조직질실상 손상 (parenchymal destruction), 비교적 비가역적 기류장애 현상, 만성 기관지염, 폐기종을 주로 성인기에 발생하는 점에서 상이한 점 등의 별개의 병리기전을 갖는 것으로 알려져 있다 (Barnes PJ. 2000. Mechanisms in COPD: differences from asthma. Chest 117: 10S-14S; Seatta M, Turato G, Maestrelli P, Mapp CE, Fabbri LM. 2001. Cellular and structural base of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 163: 1304-1309)

또한, 익모초를 대상으로 특정추출법, 즉, 전출추출법으로 제조한 익모초 측정 물추출물(MW)에 대한 항염 활성을 보고된 바가 있다(Hye-Young Shin, Sang-Hyun Kim, Sin-Myoung Kang, Ik-Jun Chang, Sang-Yong Kim, Hoon Jeon, Kang-Hyun Leem, Won-Hwan Park, Jong-Pil Lim, and Tae-Yong Shin, 2009Anti-inflammatory activity of Motherwort (Leonurus sibiricus L.). Immunopharmacology and Immunotoxicology 31: 209-213).

그러나 상기 문헌의 어디에도 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물, 이로부터 분리된 정제분획물들의 호흡기염증 질환에 대한 치료효과에 대한 언급 또는 개시된 바가 없다.

익모초 (Leonurus sibiricus)는 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 1년 또는 1년생 초본으로서, 한국 각지에 분포하며, 그 전초를 익모초라 지칭하며, 알려진 성분으로는 레오누린 (Leonurine), 스타키드린(stachydrine), 레오누리딘(leonuridine), 레오누리닌(leonurinine), 등의 알칼로이드(Alkaloid), 라우인산(lauric acid), 레놀렌산(linolenic acid), 올레산(oleic acid), 스테롤 (Sterol), 루틴(rutin) 등의 성분이 알려져 있으며, 예로부터 월경불순, 출산 출혈 등의 치료에 사용되어 왔다 (정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, pp848-849, 1998년).

이에, 본 발명자들은 호흡기염증 질환에 유효한 천연물 자원을 이용한 치료제 개발을 수행한 바, 익모초 특정 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들을 대상으로 호염기성 백혈구 세포를 이용한 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용 실험; RAW 264.7 세포를 이용한 NO(Nitrite) 생성 억제 활성실험; LPS 유발 폐손상 BALB/c 마우스모델을 이용한 호흡기 급성 염증에 대한 억제 활성실험; BALB/c 마우스모델을 이용한 알러지성 천식 억제 활성실험; 복귀돌연변이 독성시험을 통하여 안전하면서 선행문헌에 기재된 익모초 물추출물보다 호흡기염증 질환에 대한 탁월한 강력한 치료효능을 확인함으로서 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물, 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 추출물로부터 분리되는 정제분획물은 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 추출물을 물에 현탁한 후에 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 또는 에틸아세테이트 용매 등의 비극성 용매를 가하여 분획하여 얻은 비극성용매에 가용한 정제 분획물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 "호흡기염증 질환"이란 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 염증, 알러지 또는 천식을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 익모초 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 익모초를 세척 및 세절 후 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올을 수회 섞은 다음에 30 ℃ 내지 150 ℃, 바람직하게는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 30 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 5배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 비극성용매에 가용한 정제 분획물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 10 내지 60% 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물 중량의 약 0.05 내지 50배, 바람직하게는 0.5 내지 5배 부피 (v/w%)의 물을 가하여 얻은 현탁물에 한 후, 현탁물 부피의 0.1 내지 20배, 바람직하게는 1 내지 10배 부피의 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 또는 에틸아세테이트 용매 등의 비극성 용매를 가하여 분획공정을 수행하여 본 발명의 비극성용매에 가용한 정제 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 추출물을 대상으로 호염기성 백혈구 세포를 이용한 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용 실험, RAW 264.7 세포를 이용한 NO(Nitrite) 생성 억제 활성실험; LPS 유발 폐손상 BALB/c 마우스모델을 이용한 호흡기 급성 염증에 대한 억제 활성실험; BALB/c 마우스모델을 이용한 알러지성 천식 억제 활성실험: 복귀돌연변이 독성시험 및 세포독성시험을 통하여 강력한 호흡기염증 질환 치료 효과를 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 호흡기염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물, 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

또한, 익모초는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 익모초 추출물도 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 (0.0001~100) mg/kg으로, 바람직하게는 (0.001~100) mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 (0.0001~50) 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물, 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 및 개선용 건강기능 식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올, 바람직하게는 20~50 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물, 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품 또는 식품첨가물을 제공한다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 추출물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 정제물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 (1~20) g, 바람직하게는 약 (5~12) g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 mL를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명에 따른 익모초 추출물을 대상으로 호염기성 백혈구 세포를 이용한 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용 실험, RAW 264.7 세포를 이용한 NO(Nitrite) 생성 억제 활성실험 ; LPS 유발 폐손상 BALB/c 마우스모델을 이용한 호흡기 급성 염증에 대한 억제 활성실험; BALB/c 마우스모델을 이용한 알러지성 천식 억제 활성실험: 복귀돌연변이 독성시험을 통하여 안전하면서 호흡기염증 질환에 대한 강력한 치료효능을 확인함으로서 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 익모초 EA 분획물에 대한 HPLC 크로마토그램(210 nm)를 나타낸 도이며;
도 2는 루틴(Rutin), 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 UV 스펙트럼을 나타낸 도이며;
도 3은 익모초 EA 분획물에 대한 주요 성분(Rutin 및 Isoquercitrin)을 UV 스펙트럼으로 확인한 도이며;
도 4는 익모초 50% 주정 추출물의 270 nm에서 크로마토그램 profile을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

비교예 1: 익모초 침출 추출물 제조

건조된 익모초(Leonurus sibiricus) 전초(휴먼허브) 500 g을 고루 섞은 후, 선행논문(Immunopharmacology and Immunotoxicology, 2009; 31(2): 209.213)에 기재된 전출 방법(decoction method)으로 익모초 추출물을 제조하여 분말상태의 익모초 물 추출물 62.5 g을 얻었다(이하, CMW라 함).

실시예 1: 익모초 추출물

1-1. 30 % 주정 추출물의 제조

건조된 익모초(Leonurus sibiricus) 전초(휴먼허브) 500 g을 고루 섞은 후, 증류수와 혼합된 30 % 주정 10 L를 가해 80 ℃에서 2.5 시간 열탕 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 10 L의 30 % 주정을 가해 2.5 시간 재열탕 추출한 후 여액을 모두 합하여 45 ℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하였다. 최종적으로 약 2 L의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 익모초 추출물 67 g을 얻었다(이하, LS30E라 함). 건조된 익모초 건초 대비 추출물의 수율은 13.4 %인 것으로 나타났다.

1-2. 50 % 주정 추출물의 제조

건조된 익모초(Leonurus sibiricus) 전초(휴먼허브) 500 g을 고루 섞은 후, 증류수와 혼합된 50 % 주정 10 L를 가해 80 ℃에서 2.5 시간 열탕 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 10 L의 50 % 주정을 가해 2.5 시간 재열탕 추출한 후 여액을 모두 합하여 45 ℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하였다. 최종적으로 약 2 L의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 익모초 추출물 64 g을 얻었다(이하, LS50E라 함). 건조된 익모초 건초 대비 추출물의 수율은 12.8 %인 것으로 나타났다.

1-3. 70 % 주정 추출물의 제조

건조된 익모초(Leonurus sibiricus) 전초(휴먼허브) 500 g을 고루 섞은 후, 증류수와 혼합된 70 % 주정 10 L를 가해 80 ℃에서 2.5 시간 열탕 추출하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 대해서는 10 L의 70 % 주정을 가해 2.5 시간 재열탕 추출한 후 여액을 모두 합하여 45 ℃로 생약 추출물이 건조될 때까지 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하였다. 최종적으로 약 2 L의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 익모초 추출물 65 g을 얻었다(이하, LS70E라 함). 건조된 익모초 건초 대비 추출물의 수율은 10.3 %인 것으로 나타났다.

주정 함량별 익모초 추출물 수율

추출 수율
주정 30 %	주정 50 %	주정 70 %
13.4 %	12.8 %	10.3 %

실시예 2: 익모초 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 분획물의 제조

상기 실시예 1의 50 % 주정 조추출물 20 g을 1차 증류수 2 L와 함께 잘 섞어 초음파기(Branson 5510)를 이용하여 초음파로 완전 용해시킨 후 분액 여두에 넣고 에틸아세테이트(Ethy acetate; EA) 용액 2 L와 잘 희석 시킨 후 EA와 물층이 분리될 때까지 3-4시간 동안 방치하고 기다렸다. 분리된 상층의 EA 분획물을 취득한 다음 다시 1 L의 EA를 분리한 물층과 희석 후 2차 반복, 3차 반복까지 실행 후 총 EA 분획물 3 L를 감압 농축하여 곰보배추 EA 분획물 3.4 g(추출 수율 : 17 %, 이하 “LSEA”라 함 )을 수득하였다. 건조 분획물들은 4 ℃ 에 보관하고 필요한 농도로 녹여 사용하였다.

실험예 1: 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용

상기 실시예 시료의 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 작용을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다 (Jennifer L. Gould, Robert S. Byrum, Mikelle L. Key, MyTrang Nguyen, Victoria A. Wagoner, and Beverly H. Koller, 2000 Genetic factors determine the contribution of leukotrienes to acute inflammatory response J. Immunology 164: 4899-4907)

실시예에서 제조된 익모초 추출물의 천식 주요 발병기전인 류코트리엔 분비에 대한 억제능을 평가하기 위해 세포를 이용하여 다음의 방법으로 실시하였다.

랫드 말초 혈액의 호염기성 백혈구 세포(Rat Basophilic Leukemia Cell, RBL-2H3 Cell, CRL-2256, ATCC)를 배양액(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) 상에서 37 ℃로 24시간동안 안정화시킨 후, 다양한 추출용매별 익모초 추출물(10, 50, 100) μg/mL를 넣고 15분간 반응시켰다.

여기에 Inophore로서 A23187(C7522, Sigma)을 넣어 15분간 류코트리엔 분비를 유발시켰다. 생성된 시스테닐 류코트리엔(Cystenyl Leukotriene)의 양은 효소-면역 분석(Enzyme immuno assay, EIS, ADI-901-070, Enzo life science) 키트를 이용해 측정하였다.

상기 실험 결과, 표 2 및 표 3에 개시된 바와 같이, 실시예의 익모초 주정추출물들은 비교예로 실험한 익모초 물추출물(CMW)보다 호염기성 백혈구 세포로부터 염증 유발 물질인 류코트리엔(Leukotriene)생성을 농도 의존적으로 약 4배 내지 7배 보다 탁월하게 억제시켰으며, 이를 통해 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase, 5-LO) 억제 효과가 있음을 확인 할 수 있다.

익모초 추출물들에 대한 류코트리엔 발현 억제 효과

처리군	Leukotriene 농도 (% of Control)	대조군 대비 억제율 (%)
정상군	6.9±4.3
대조군	100±19.6	-
양성대조군(Montelukast 100 μM)	39.2±6.8	60.8
비교예 CMW - 100 μg/mL	89.3±7.2	10.7
주정 30 % Ext - 100 μg/mL	40.4±3.8	59.6
주정 50 % Ext - 100 μg/mL	21.0±7.7	79.0
주정 70 % Ext - 100 μg/mL	42.1±4.5	59.9

익모초(50 % 주정) 추출물 농도별 류코트리엔 발현 억제 효과

처리군	류코트리엔 농도 (% of Control)	대조군 대비 억제율 (%)
정상군	5.2 ± 0.6
대조군	100 ± 3.1	-
양성대조군(Montelukast 100 μM)	35,6 ± 1.3	64.4
비교예 CMW Ext - 100 μg/mL	90.6 ± 1.3	9.4
익모초 추출물 10 μg/mL	82.5 ± 6.2	17.5
익모초 추출물 50 μg/mL	68.2 ± 6.3	31.8
익모초 추출물 100 μg/mL	34.7 ± 2.6	65.3

실험예 2: NO(Nitrite) 생성 억제 작용

상기 실시예 시료의 NO(Nitrite) 생성 억제 작용을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다 (Green LC, Wanger DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, and Tannenbaum SR, 1982 Analysis of nitrate, nitrite and[15N] nitrate in biologic fluids. Anual. Biochem 126: 131)

RAW 264.7 세포(ATCC)는 10% FBS (fetal bovine serum)와 penicillin (100 units/㎖)/streptomycin (100 ㎍/㎖)이 첨가된 RPMI 배지(media) (11875-093, GIBCO, USA)로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포(Cell)는 디쉬 (70075, 75 cm² culture dish, SPL, Korea)에서 충분히 증식시킨 후, 7일 간격으로 계대 배양하였다.

RAW 264.7 세포를 48-well 세포배양 dish에 well 당 2×10⁵/250 μL개로 분주하고 37 ℃의 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, LPS 1 μg/mL(Sigma, L2880)와 익모초 추출물을 농도별로 처리해서 24시간 배양하였다. 배양액중의 NO는 50 μL의 배양 상등액을 동량의 Griess 시약(G2930, Promega)과 섞어 550 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 이때 표준물질로는 소듐 니트라이트(sodium nitrite, G296A, Promega)를 사용했다.

상기 실험 결과, 표 4에 개시된 바와 같이, 익모초 50 % 주정 추출물은 대식세포로부터 염증 유발 물질인 NO생성을 농도 의존적으로 억제시켰으며, 이를 통해 염증 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

익모초 추출물(LS50E)의 대식세포 NO 발현 억제 효과

처리군		NO release (μM)	Inhibition ratio (% of control))
정상군		8 ± 4	-
대조군(LPS 1μg/ml처리)		40 ± 7	-
시험군 (LPS+익모초)	10 μg/ml	35 ± 9	12.5
	50 μg/ml	31 ± 6	22.5
	100 μg/ml	25 ± 5	37.5

실험예 3: 익모초 EA 분획물에 대한 류코트리엔 억제 효과 비교

상기 실험예 1의 방법에 따라, 익모초 주정 추출물 및 EA 분획물에 대한 류코트리엔 분비 억제능을 평가하였다.

상기 실험 결과, 하기 표 5에 개시된 바와 같이, 익모초로부터 주정 추출물 및 EA 분획물에 대한 농도별(10, 25, 50 μg/mL) 루코트리엔 분비에 대한 억제능 평가를 실시한 결과, 모든 시료에서 호염기성 백혈구 세포로부터 염증 유발 물질인 류코르리엔(Leukotriene) 생성을 억제하였으나, 특히 EA 분획에서 약 80 % 억제 활성을 보였으며, 이는 주정(EtOH) 추출물 대비 3.8배 높은 활성을 나타낸 것이다.

실험예 4: 익모초 활성 분획으로부터 주요성분 구명

상기 실시예의 익모초 EA 분획물들에 대한 파장별 스펙트럼 패턴과 HPLC 수행을 통해서 주요 성분을 확인하였다.

1) LC 분석조건

- Column : Phenomenex Luna C18 5μm, 250 mm X 4.6 mm

- Column Temperature : 40 ℃

- Injection Volume : 10 μL

- Flow rate : 1.0 mL/min

- Eluent : gradient

A - 0.1 % Formic acid in H₂O

B - Acetonitrile

- Detector : PDA 210 nm

2) 주요 성분 구명(분석 결과)

상기 실험 결과, 위의 그림에 나타난 바와 같이, 파장별 스펙트럼 패턴과 HPLC 수행을 통해서 EA 분획물에 대한 주요 성분을 구명 하였다. EA 분획물에 존재하는 주요 성분은 루틴과 아이소커시트린(Rutin, Isoquercitrin) 인 것으로 나타났다(도 1, 도 2, 도 3, 도 4 참조).

실험예 5: 활성 분획물내 존재하는 주요 성분에 대한 류코트리엔 억제 효과 검증

익모초에 대한 유효성분 설정을 위해, 활성 분획물내 존재하는 주요 성분인 루틴(Rutin), 및 아이소커시트린(Isoquercitrin)에 대한 루코트리엔 분비에 대한 억제능 평가를 실험예 1와 같은 방법으로 실시하였다.

본 실험 결과, 표 6에 기재된 바와 같이, 익모초 활성 분획물의 주요성분인 루틴(Rutin) 및 아이소커시트린(Isoquercitrin)은 호염기성 백혈구 세포로부터 염증 유발 물질인 류코트리엔(Leukotriene) 생성을 농도 의존적으로 억제 하였다. 특히 아이소커시트린(Isoquercitrin) 50 μg/mL, 처리시 양성대조물질과 비슷한 수준으로 억제시켰다. 이를 통해 익모초의 주요 성분인 루틴 및 특히 아이소커시트린은 5-리포옥시게나제(Lipoxigenase) 억제 효과가 있음을 확인 할 수 있다.

활성 분획물의 주요성분에 대한 농도별 류코트리엔 발현 억제 효과

처리군		Leukotriene 농도 (% of Control)	대조군 대비 억제율 (%)
정상군		4.7 ± 3.6
대조군		100 ± 1.0	-
양성대조군(Montelukast 100 μM)		37.2 ± 6.8	62.8
Rutin	10 μg/ml	99.9 ± 6.8	0.1
	25 μg/ml	94.5 ± 3.1	5.5
	50 μg/ml	89.1 ± 7.7	10.9
Isoquercitrin	10 μg/ml	57.9 ± 9.4	42.1
	25 μg/ml	48.7 ± 7.2	51.3
	50 μg/ml	36.2 ± 3.8	63.8

실험예 6: 익모초 추출물 종류별 유효 성분 함량분석

상시 실시예 추출물들의 유효성분인 루틴(Rutin)과 아이소커시트린(Isoquercitrin)의 함량을 확인하기 위하여 하기 조건으로 HPLC를 수행하였다.

1) LC 분석조건

- Column : Waters Sunfire C18 Sum, 250 mm * 4.6 mm

- Column Temperature : 25 ℃

- Injection Volume : 10 μL

- Eluent : gradient

A - 0.1 % Formic acid in H₂O

B - 0.1 % Formic acid in ACN

- Detector : PDA 270 nm(정량)

2) 분석 결과

상기 실험 결과, 도 4 및 표 7에 나타난 바와 같이, 익모초 추출물로부터 주요성분인 루틴(Rutin) 및 아이소커시트린(Isoquercitrin)의 함량을 조사한 결과, 루틴은 4.3～8.0 mg/g, 아이소커시트린은 1.3～1.8 mg/g 수준 이었다.

상기 성분 분석 실험 결과, 50 % 주정 조추출물 20 g로부터 Ethy acetate(EA) 용액을 이용해서 제조된 익모초 EA 분획물에 대한 루틴(Rutin) 및 아이소커시트린(Isoquercitrin)의 함량을 분석한 결과, 루틴 및 아이소커시트린의 함량은 각각 13.6 mg/g 및 9.8 mg/g 이었다. 이와 같은 결과로부터 에틸아세테이트 분획을 통해서 익모초 유효 성분인 루틴은 1.7배, 아이소커시트린은 5.4배 높은 농도로 포함된 조성물을 얻을 수 있었다.

실험예 7: 호흡기 급성 염증 억제 실험

상기 실시예 시료의 호흡기 급성 염증에 대한 억제 작용을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 LPS 유발 폐손상 모델을 이용한 Vernooy 등의 방법을 일부 수정하여 실험하였다(Vernooy JH, Dentener MA, van Suylen RJ, Buurman WA, Wouters EF. Long-term intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002;26(1):152-9.)

생리식염수로 희석된 LPS 용액(0.5 mg/3mL, L2880, Sigma)을 초음파(Nebulizer control 10, BUXCO)를 이용해 에어로졸을 생성시킨 후, 7주령 BALB/c 수컷 마우스(오리엔트 바이오, 한국)에 10분간 흡입시킨 후, 2일 동안 경과를 지켜본 후 폐기관지 세정액 중 염증성 세포를 측정하여 급성 염증을 확인하였다.

염증 유발 48시간 후에 폐기관지를 인산완충용액(10010-023, GIBCO) 3.0 mL를 이용하여 폐기관지를 세척하여 세척액을 모았다. 세척액 중의 단핵세포(mononuclear cells, 림프구, 단핵구)와 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte, 대부분이 호중구, neutophil)수를 분별 계수하였으며, 호중구(neutrophil)의 수의 증가를 염증유발의 지표로 삼았다. 익모초 추출물(LS50E 또는 CMW, 200 mg/kg BW)은 LPS 흡입 전날부터 3일간 3회 경구 투여하였다. 정상군과 대조군은 3일간 증류수를 300 μL를 경구 투여하였으며, 양성 대조 약물은 LPS 흡입 후 2시간 후 10 mg/kg BW의 용량으로 1회 경구 투여 하였다.

상기 실험 결과, LPS에 유도된 급성 호흡기 염증의 지표로써, 기관지내 호중구 수의 증가를 측정한 결과, 익모초 추출물 처리에 의해 유의적인 감소 효과를 관찰할 수 있었다. 이를 통해 익모초 추출물은 호흡기 급성 염증억제 효과가 있음을 확인할 수 있다. (표 9)

익모초 추출물의 기관지 염증성 세포(Neutrophil) 감소 효과

처리군		Mononuclear cells (%)	Neutrophil (%)	기관지 염증 억제율 (%)
정상군		99	1
대조군(LPS 처리)		51 ± 10	41 ± 10	-
비교예(LPS+CMW Ext)		63 ± 6	37 ± 6	9.7
시험군(LPS+익모초 LS50E)		71 ± 6	29 ± 6	29.2
양성 대조군	Montelukast	52 ± 8	39 ± 7	4.8
	Dexamethasone	71 ± 10	27 ± 10	34.1
	Roflumilast	57 ± 8	40 ± 8	2.4

실험예 8: 알러지성 천식 억제 시험

상기 실시예 시료의 알러지성 천식 억제 활성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 실험 방법을 일부 수정하여 실험하였다 (Zosky GR, von Garnier C, Stumbles PA, Holt PG, Sly PD, Turner DJ, 2004, The pattern of methacholine responsiveness in mice is dependent on antigen challenge dose. Respir . Res. 2004: 15)

익모초 (LS50E 또는 CMW, 200 mg/kg BW)추출물의 기도염증 억제 활성을 평가하기 위해 감작된 마우스에 항원을 노출시켰을 때 유발되는 폐기관지로의 호산구(eosinophil) 및 호중구(neutrophil) 증가 반응을 이용하여 다음의 방법으로 실시하였다.

BALB/c계 암컷마우스(6주령, 오리엔트 바이오, 한국)에 PBS로 희석된 0.1 mg/mL의 난알부민(Sigma, A5503)과 알룸 (Alum, Pierce, Pro no. 77161)의 1:1 혼합액 0.2 mL를 0, 7 및 14일에 복강 내 투여하여 감작시켰다. 처음 감작 21, 25, 28일 후에 0.7 % 난알부민을 고압의 압축공기를 이용하여 에어로졸로 만들어 50 분간 분무하여 기도염증을 유발하였다.

염증 유발 24시간 후에 폐기관지를 인산완충용액 3 mL를 이용하여 폐기관지를 세척하여 세척액을 모았다. 세척액 중의 세척액 중의 단핵세포(mononuclear cells, 림프구, 단핵구)와 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte, 호중구 [neutrophil], 호산구 [eosinophil])수를 분별 계수하여, 호중구 및 호산구의 양을 천식유발의 지표로 삼았다.

익모초 추출물은 최초 감작 (20∼28)일에 8회 경구 투여하였다. 정상군과 대조군은 8일간 증류수를 300 μL를 경구 투여하였으며, 양성 대조 약물은 처음 감작 21, 25, 28일 후의 0.7 % 난알부민을 흡입 2시간 후 10 mg/kg BW의 용량으로 3회 경구 투여 하였다.

난알부민(OVA)에 유도된 알러지성 천식의 지표로써, 기관지내 호중구 [neutrophil], 호산구 [eosinophil]) 수의 증가를 측정한 결과, 익모초 추출물(LS50E) 처리에 의해 2가지 염증성 세포의 비율이 유의적인 감소 효과를 관찰할 수 있었다. 이를 통해 익모초 추출물은 알러지성 천식 억제 효과가 있음을 확인할 수 있다. (표 10)

익모초 추출물의 알러지성 기관지 천식 억제 효과

처리군	Mononuclear cells(%)		Polymorphonuclear cell(%)		기관지 천식 억제율(%)
	Monocyte	Macrophage	Neutrophil	Eosinophil
정상군	23 ±8	76 ± 10	0	1 ± 1
대조군	36 ± 9	25 ± 6	9 ± 6	31 ± 8	-
비교예 CMW Ext	39 ± 9	26 ± 6	10 ± 6	25 ± 6	12.5
시험군 (익모초 LS50E)	51 ± 5	24 ± 8	8 ± 3	17 ± 8	35

실험예 9: 복귀돌연변이 독성시험

상기 실시예 시료의 복귀돌연변이 시험에 의한 독성을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 Maron과 Ames(1983)이 제시한 방법을 일부 수정하여 실험하였다. (Maron, D.M. and Ames B.N. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutat . Res. 113: 173-215)

특정성분들에 대한 돌연변이 유발성 검색을 위해서 균주(Salmonella typhimurium) TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537 균주를 사용하였다. 시험물질의 처리는 대사활성 효소계(S-9 mix)가 적용 또는 미적용된 직접 플레이트 삽입(direct plate incorporation) 방법으로 하였다. 복귀돌연변이 시험에 사용한 Salmonella typhimurium TA98 균주는 Molecular Toxicology Inc.(USA)에서 구입하였다. 균주는 냉동 보관 되어있는 시험균주 용액 50 μL를 25 mL의 액체배지(2.5 % Oxoid Nutrient broth No. 2)에 접종해 진탕 배양기(shaking incubator, VS-8480SFN, (주) 비젼과학)를 이용하여 37 ℃에서 약 10 시간 배양한 후 사용하였다. 최소배지(minimal glucose agar plate)는 1.5 % Bacto agar(214010, BD Difco)와 Vogel-Bonner medium E 및 2 % glucose를 함유해서 만들었고 톱 아가(top agar)는 0.6 % agar와 0.5 % NaCl로 조제하였으며, 톱 아가(top agar)에는 0.05 mM의 histidine(43011, Fluka)-biotin(47868, Supelco)을 첨가하였다.

고압증기 멸균한 톱 아가(top agar)를 건조 배쓰(dry bath, 11-718-4, Fisher Scientific)에서 45 ℃로 예열한 멸균 tube에 2 mL 씩 분주한 다음, 시험물질 용액 0.1 mL과 균배양액 0.1 mL을 톱 아가에 혼합하고 즉시 진탕 혼합기(vortex mixer, 37600, Thermolyne)로 2～3 초간 진탕하여 최소배지(minimal glucose agar plate)에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 부형제군(음성대조군)은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질 용액(2-Aminoanthracene (2AA), 규격 : Sigma A1381)을 같은 방법으로 가하여 실시하였다. 톱 아가가 굳은 후 플레이트 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집어 37 ℃에서 약 48 시간 배양 후 집락을 계수하였다.

상기 실험 결과, 익모초 추출물은 본 시험 조건하에서 사용한 균주에 대해 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료된다.(표 11)

익모초 추출물의 복귀돌연변이 독성 검증

균주	대사활성 효소계	복귀돌연변이 균수/plate
		0 μg/plate	500 μg/plate	1000 μg/plate
TA98	-S9	19±2	15±2	23±4
	+S9	19±1	17±3	16±5
TA100	-S9	87±12	109±24	94±3
	+S9	79±14	81±3	92±4
TA102	-S9	67±10	59±14	73±18
	+S9	83±10	82±13	79±8
TA1535	-S9	7±2	9±3	8±2
	+S9	8±1	7±1	8±3
TA1537	-S9	3±1	4±3	5±3
	+S9	9±1	7±4	8±1

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

LS50E 추출물 -------------------------------- 20 ㎎

유당 --------------------------------------- 100 ㎎

탈크 ---------------------------------------- 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

LS30E 추출물 -------------------------------- 10 ㎎

옥수수전분 --------------------------------- 100 ㎎

유당 --------------------------------------- 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 -------------------------- 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

LS50E --------------------------------------- 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 ---------------------------- 3 ㎎

락토오스 ---------------------------------- 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ---------------------- 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

LS50E 추출물 -------------------------------- 10 ㎎

만니톨 ------------------------------------- 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 ------------------------ 2974 ㎎

Na₂HPO₄12H₂O --------------------------------- 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

LSEA 추출물 -------------------------------- 20 ㎎

이성화당 ------------------------------------ 10 g

만니톨 --------------------------------------- 5 g

정제수 -------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 mL 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

LS50E 추출물 ------------------------------ 1000 ㎎

비타민 혼합물 -------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------- 70 ㎍

비타민 E ----------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁ ---------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B₂ ---------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B₆ ----------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ ---------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ------------------------------------ 10 ㎎

비오틴 -------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ----------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ---------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ------------------------------ 0.5 ㎎

무기질 혼합물 -------------------------------- 적량

황산제1철 --------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 ---------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ------------------------------ 25.3 ㎎

제1인산칼륨 --------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 --------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ---------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ----------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ------------------------------ 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

LS50E --------------------------------------- 100 ㎎

비타민 C -------------------------------------- 15 g

비타민 E(분말) ------------------------------- 100 g

젖산철 ------------------------------------- 19.75 g

산화아연 ------------------------------------- 3.5 g

니코틴산아미드 ------------------------------- 3.5 g

비타민 A ------------------------------------- 0.2 g

비타민 B₁ ----------------------------------- 0.25 g

비타민 B₂ ------------------------------------ 0.3 g

물 -------------------------------------------- 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물; 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물로부터 분리되는 정제분획물은 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 추출물을 물에 현탁한 후에 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트에 가용한 정제 분획물임을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 호흡기염증 질환은 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물; 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 티백제, 침출차, 건강 음료 형태인 건강기능식품.
6. 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물; 또는 이로부터 분리된 정제분획물을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 건강보조식품.
7. 익모초 10~60 % 주정 또는 에탄올에 가용한 조추출물; 또는 이로부터 분리된 정제분획물 을 유효성분으로 포함하는 호흡기염증 질환의 예방 또는 개선용 식품첨가물.

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