KR101985657B1 - 레인을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 - Google Patents

레인을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 레인(Rhein)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 레인을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 항균 상승 효과를 가지기 때문에 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하고, 인체 부작용이 적은 항균제로 사용될 수 있으며, 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용될 수 있다.

Description

레인을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물{Antibacterial Composition for Antibiotics Resistant Staphylococcusaureus inhibition Comprising Rhein}
본 발명은 레인(Rhein)을 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 항균 상승 효과를 갖는 항균 조성물에 관한 것이다.
자연계에 널리 분포되어 있는 황색포도상구균(Staphylococcusaureus; S. aureus)은 세계적으로 널리 알려진 식중독균 중의 하나로, 황금색 색소를 생성하고 용혈성을 가지며 응고효소(coagulase)를 생성하는 종으로, 화농성질환이나 창상감염 등의 피부감염, 골관절염, 폐렴, 패혈증 등을 일으키는 병원성 높은 대표적인 유해세균으로 알려져 있다(Kim SK et al., The Journal of the Korean Society for Microbiology, 28:251, 1993).
황색포도상구균은 일반적으로 환경에 대한 저항성이 강하여 건강한 성인의 비강, 피부, 구강 등에서도 존재하고 동물의 상처부위를 통한 전염이나 식품의 생산과정, 제조 공정 등의 여러 단계를 거치면서 식품 유통망을 타고 짧은 시간에 전국적으로 전파될 수 있으며, 전파된 황색포도상구균은 사람에게 전이되어 또 다른 매개체가 될 수 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균을 억제하기 위하여 사람과 동물의 질병 치료와 예방에 항생제를 사용하고 있으나, 황색포도상구균에 의한 식중독 발생률은 노로 바이러스와 살모넬라, 병원성 대장균과 함께 꾸준히 높은 수치를 나타내고 있으며 매년 발생이 증가되고 있다 (Lee JH et al., Korean Journal for Food Science of Animal Resources,30:410, 2010).
더욱이 항생제 오남용 등의 원인으로, 최근 미국이나 네덜란드 등의 국가에서는 식품과 관련한 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillinresistant S. aureus; MRSA)의 오염이 보고되고 있으며 1996년에는 반코마이신(vancomycin)에 대하여 저하된 감수성을 나타내는 황색포도상구균이 일본에서 발견된 이후, 여러 나라에서 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin-resistant S.aureus; VRSA)가 나타나기 시작하면서 슈퍼박테리아로 불리기 시작하였다 (Kang TY et al., Journal of Life Science, 2:190, 2010).
MRSA와 VRSA 같은 슈퍼박테리아는 출현 이후 지역사회에 빠르게 증가되고 광범위하게 노출되어있어 그 심각성이 점차 높아지고 있으며, 일반 황색포도상구균과 달리 세팔로스포린(cephalosporin), 암피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin) 등과 같은 베타-락탐(β-lactam) 계열 항생제를 비롯하여 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides) 계열의 항생제에 대해서도내성을 지니고 있는 균주로 발전되어 감염증 치료에 큰 어려움을 겪고 있는 실정이다.
오늘날, 우리나라는 인구 고령화와 웰빙(Well-being)이라는 건강 지향적 트렌드가 자리하면서, 채식위주의 음식문화와 맞물려 가공하지 않는 신선식품으로의 이용이 증가되고 있으나 유통 및 저장과정에서 황색포도상구균 등의 유해미생물 증식에 의해 발생하기 쉬운 오염을 억제하거나 식품으로 전파되는 유해 미생물의 내성 연구는 아직 미흡한 실정이며, 그 중 공중보건학 측면에서 황색포도상구균의 내성수준은 매우 심각한 문제로 보고되고 있다 (Kim KM et al., Korean Journal of Nosocomial Infection Control, 11:79, 2006).
또한, 현재 축산에 사용되는 많은 항생제의 경우 내성률이 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 현재 축산에서 항생제는 주로 사료 첨가제로 또는 육계의 경우 7일에서 10일 사이에 정기적으로 클리닝(Cleaning) 목적으로 사용된다. 보고에 의하면 전국 도축장에 온 소, 돼지, 닭에게서 분리한 살모넬라, 장내구균 따위의 식중독균의 항생제 내성률을 조사한 결과 닭 분변에서 나온 대장균은 퀴놀론계 항생제에 57%를 웃도는 내성률을 보였다. 이와 같이 현재 축산에 사용되고 항생제는 대부분 세균들이 내성을 지니고 있어 축산에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제 개발이 시급하다.
최근에는 유통 및 저장 중 오염 및 품질저하를 방지하기 위하여 가열 처리나 레토르 등의 물리적 방법과 식품보존제 등의 화학합성물질을 첨가하는 방법 등이 널리 이용되고 있으나, 영양성분 파괴, 품질저하 및 독소잔류 등의 건강에 대한 안전성 문제가 제기되고 있다. 따라서 황색포도상구균과 같은 유해세균에 대한 새로운 항균물질의 개발이 시급히 요구되고 있으며, 전통적으로 감염질환의 치료에 사용되어 온 약용식물을 바탕으로 알칼로이드(alkaloid), 플라보노이드(flavonoid), 테르페노이드(terpenoid), 페놀성 화합물(phenolic compound), 퀴논(quinone), 휘발유(volatile oil) 등의 2차 대사산물 또는 그 유도체들이 후보물질로 활발히 진행되고 있다 (Kim NY et al., Journal of Life Science, 20:589, 2010).
한편, 하수오(Polygonum multiflorum)는 한국 각지의 산야에 야생하므로 전국 어디서나 재배할 수 있으며, 하수오 뿌리는 안트라퀴논(anthraquinone)류를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 하수오 뿌리 유래의 레인을 통해 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 가지고, 기존 항생제의 부작용을 최소화한 항균 조성물을 제공하기 위하여, 레인이 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 레인에 의한 항균활성은 황색포도상구균의 막 침투성 및 황색포도상구균 유래의 펩티도글리칸과의 결합에 의한 효과와 밀접한 관계가 있음을 확인하였다.
대한민국등록특허 제10-1392808호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 항균 상승 효과를 갖는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 항균효과가 매우 우수한 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 의약품, 화장품, 건강기능성 식품 및 동물 사료를 제공하는데 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 레인(rhein)과 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), Triton X-100(TX), 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD) 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레인은 하수오(Pleuropterus multiflorus TURCZ.)의 뿌리 유래일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 에틸렌다이아민테트라아세트산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 에틸렌다이아민테트라아세트산을 포함하고, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함되고, 상기 에틸렌다이아민테트라아세트산은 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40mM으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 Triton X-100을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 Triton X-100을 포함하고, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함되고, 상기 Triton-X 100는 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40부피%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 NaN3를 포함하고, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함되고, 상기 NaN3는 상기 항균 조성물 내 0.0009 내지 0.007부피%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효성분은 레인과 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 포함하고, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함되고,상기 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드는 상기 항균 조성물 내 20 내지 105μM로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 β-락탐항생제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 β-락탐항생제는 암피실린 또는 옥사실린일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 동물 사료를 제공한다.
본 발명에 따르면 항균 상승 효과를 가지면서, 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 항균효과가 우수하고, 인체 부작용이 적은 항균 조성물을 제공할 수 있으며, 의약제품, 의약품, 화장품, 식품 및 동물성 사료에 적용하여 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 레인과 EDTA를 혼합 사용하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 레인과 EDTA를 혼합 사용하였을 때, EDTA의 농도에 따른 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 레인과 Triton X-100을 혼합 사용하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 레인과 Triton X-100을 혼합 사용하였을 때, Triton X-100의 농도에 따른 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 레인과 NaN3을 혼합 사용하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 레인과 NaN3을 혼합 사용하였을 때, NaN3의 농도에 따른 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 레인과 DCCD를 혼합 사용하였을 때, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 레인과 DCCD를 혼합 사용하였을 때, DCCD의 농도에 따른 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
상술한 바와 같이, 현재 사용되고 있는 항생제는 대부분의 균들이 내성을 지니고 있기 때문에 의약품, 식품뿐만 아니라, 축산분야에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.
본 발명은 레인을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 인체 부작용이 적고 항균효과가 우수한 항균 조성물을 제공할 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 레인(rhein)과 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), Triton X-100(TX), 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD) 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명은 레인과 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), Triton X-100(TX), 아지드 나트륨(sodium azide; NA) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide; DCCD) 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함함으로써, 레인 단독 사용시의 황색포도상구균을 억제하는 최소 억제농도 보다 현저히 적은 양의 레인으로도 항균 효과가 우수한 항균 조성물을 제공할 수 있는 이점이 있다.
먼저, 상기 유효성분 중 레인에 대하여 설명하도록 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레인은 하수오(Pleuropterus multiflorus TURCZ.)의 뿌리 유래일 수 있다.
또한, 상기 레인은 하수오로부터 추출할 수 있는 공지된 방법을 사용하여 추출될 수 있으며, 일예로 메탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 물 중에서 어느 하나의 용매로 추출될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레인은 10 내지 20 ㎍/mL의 농도로 포함될 수 있다.
상기 레인은 단독사용시 황색포도상구균을 억제하는 최소억제농도가 존재하며, 본 발명은 상기 레인과 다른 이외의 유효성분을 함께 사용함에 따라서 상기 레인을 단독사용시 최소억제농도보다 현저히 적은 양으로 사용하여도 매우 우수한 항균효과를 발현할 수 있다.
만일, 상기 레인이 10 ㎍/mL 미만의 농도로 포함될 경우, 항균 활성이 낮아서 EDTA나 Triton X-100 등의 유효성분을 더 포함하는 경우에도 항생제 내성 황색포도상구균의 억제가 안될 수 있는 등 본 발명의 목적을 달성하기에 어려울 수 있고, 20 ㎍/mL을 초과하여 포함될 경우, 추출 공정 비용이 증가할 수 있는 등의 문제점이 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 유효 성분으로 레인과 EDTA를 포함할 경우, 상기 EDTA는 항생제 내성 황색포도상구균의 막 투과성을 증가시키는 역할을 하며, 이에 따라 레인의 항균 활성이 향상될 수 있다. 도 1를 참조하여 설명하면, 레인 또는 EDTA 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않았으나, EDTA와 레인을 혼합 사용한 경우, 레인 또는 EDTA 단독 사용시보다 MRSA균주에 대한 항균활성이 더욱 향상된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 EDTA는 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40mM으로 포함될 수 있다. 만일 상기 EDTA가 0.08mM 미만으로 포함될 경우, 레인과의 혼합 사용에 따른 항균 상승 효과가 발현되지 않을 수 있고, 0.40 mM을 초과하여 포함될 경우, EDTA의 농도 증가에 따른 항균 상승 효과가 크게 증가하지 않는 등 EDTA가 불필요하게 과다 사용될 우려가 있다.
도 2를 참조하여 설명하면, EDTA의 농도가 0.04mM일 때는 레인의 단독사용과 거의 동일한 수준으로 항균 활성이 나타나고 있으나, EDTA의 농도가 0.09mM일 때, 항균활성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 유효 성분은 레인과 Triton X-100(TX)을 포함할 수 있다.
상기 Triton X-100은 항생제 내성 황색포도상구균의 막 투과성을 증가시키는 역할을 하며, 이에 따라 레인의 항균 활성이 향상될 수 있다. 도 3를 참조하여 설명하면, 레인 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않았고, Triton X-100 단독 사용시에는 항균활성이 거의 없었으나, TX와 레인을 혼합 사용한 경우, 레인 또는 Triton X-100 단독 사용시보다 MRSA균주에 대한 항균활성이 더욱 향상된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 Triton X-100은 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40부피%로 포함될 수 있다.
만일 상기 Triton X-100가 0.08부피% 미만으로 포함될 경우, 레인과의 혼합사용에 따른 항균 상승 효과가 발현되지 않을 수 있고, 0.40 부피%를 초과하여 포함될 경우, Triton X-100의 농도 증가에 따른 항균 상승 효과가 크게 증가하지 않는 등 Triton X-100가 불필요하게 과다사용될 우려가 있다.
도 4를 참조하여 설명하면, Triton X-100의 농도가 0.04부피%일 때는 레인의 단독사용과 거의 동일한 수준으로 항균 활성이 나타나고 있으나, Triton X-100의 농도가 0.09부피%일 때, 항균활성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효 성분은 레인과 NaN3(NA)를 포함할 수 있다.
상기 NaN3는 항생제 내성 황색포도상구균의 ATPase 기능을 억제하는 역할을 하며, 이에 따라 레인의 항균 활성이 향상될 수 있다. 도 5를 참조하여 설명하면, 레인 또는 NaN3 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않았으나, NaN3와 레인을 혼합 사용한 경우, 레인 또는 NaN3 단독 사용시보다 MRSA균주에 대한 항균활성이 향상된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 NaN3는 상기 항균 조성물 내 0.0009 내지 0.007부피%로 포함될 수 있다.
만일 상기 NaN3가 0.0009부피% 미만으로 포함될 경우, 레인과의 혼합 사용에 따른 항균 상승 효과가 발현되지 않을 수 있고, 0.007 부피%를 초과하여 포함될 경우, NaN3의 농도 증가에 따른 항균 상승 효과가 크게 증가하지 않는 등 NaN3가 불필요하게 과다 사용될 우려가 있다.
도 6를 참조하여 설명하면, NaN3의 농도가 0.00075부피%일 때는 레인의 단독사용과 거의 동일한 수준으로 항균 활성이 나타나고 있으나, NaN3의 농도가 0.001부피%일 때, 항균활성이 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유효 성분은 레인과 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드는(DCCD)를 포함할 수 있다.
상기 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드는 항생제 내성 황색포도상구균의 ATPase 기능을 억제하는 역할을 하며, 이에 따라 레인의 항균 활성이 향상될 수 있다. 도 7를 참조하여 설명하면, 레인 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않았으나, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드와 레인을 혼합 사용한 경우, 레인 또는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 단독 사용시보다 MRSA균주에 대한 항균활성이 향상된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드는 상기 항균 조성물 내 20 내지 105μM로 포함될 수 있다.
만일 상기 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드가 20 μM미만으로 포함될 경우, 레인과 병용처리에 따른 항균 상승 효과가 발현되지 않을 수 있고, 105 μM를 초과하여 포함될 경우, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드의 농도 증가에 따른 항균 상승 효과가 크게 증가하지 않는 등 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드가 불필요하게 과다사용될 우려가 있다.
도 8를 참조하여 설명하면, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드의 농도가 12.5μM일 때는 레인의 단독사용과 거의 동일한 수준으로 항균 활성이 나타나고 있으나, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드의 농도가 25 μM일 때, 항균활성이 증가한 것을 확인할 수 있다.
상술한 바와 같이 유효 성분으로써 레인과 함께 EDTA, Triton X-100, NaN3 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 중 어느 하나를 혼합하여 사용할 경우, 항생제 내성 황색포도상구균에 대하여 항균 상승 효과를 가질 수 있으며, 이에 따라 최소억제농도보다 상대적으로 낮은 농도의 레인으로 최소억제농도에서 발현되는 항균 효과와 동일하거나 더욱 향상될 수 있다. 특히, 유효 성분으로써 레인과 함께 EDTA 및/또는 Triton X-100을 혼합하여 사용할 경우, 상기 항균 상승 효과가 더욱 상승될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 β-락탐항생제를 더 포함할 수 있다.
상기 β-락탐항생제는 암피실린 또는 옥사실린일 수 있으며, 상기 암피실린 및 옥사실린은 펩티도글리칸 합성을 억제하여 세포벽을 표적화하고 박테리아를 억제하는 역할을 한다. 본 발명에 따른 항균 조성물은 항생제 내성 황색포도상구균의 ATPase 기능을 억제하거나 막 투과성을 증가시킬 수 있기 때문에 상기 β-락탐항생제를 더 포함 시킬 경우, 항균 활성을 더욱 상승시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 식품, 화장품, 의약품에 항생제 내성 황색포도상구균에 대한 보존제로 사용될 수 있고, 동물 사료에 기존 항생제 대신 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 시코닌을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 ㎎/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 시코닌의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또 는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 화장료 조성물에 활용될 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 건강기능식품에 활용될 수 있으며, 상기 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물은 동물사료에 활용될 수 있으며, 상기 동물사료는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.
( 실시예1 ) 하수오 추출물의 제조 및 화합물 분리
본 발명에서 사용한 하수오 뿌리는 국립원예특작과학원으로부터 제공받았다.
하수오 추출물은 공지된 논문(S. Yao et al., J. Chromatogr. A 1115 (2006) 64-71)을 참조하여 제조하였다.
(실시예2) 메티실린 내성 황색포도상구균 선별 및 특성 확인
2-1: 메티실린 내성 황색포도상구균 선별 및 배양 조건
실시예 1에서 분리한 하수오 뿌리 유래 레인의 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant staphylococcus aureus; MRSA, 이하 'MRSA'로 표기함)에 대한 항균활성 여부를 확인하기 위해, 16개의 MRSA 및 1개의 메티실린 민감성 황색포도상구균(methicillin-susceptible staphylococcus aureus; MSSA, 이하'MSSA'로 표기함)을 준비하였다.
ATCC 33591(MRSA 표준균주) 및 ATCC 25923(MSSA 표준균주)은 각각 MRSA 및 MSSA로 두 균주 모두 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)으로부터 구입하였으며, 임상적 메티실린 내성 황색포도상구균은 원광대학교 의과대학병원의 15명의 환자로부터 분리하여 사용하였다(DPS strains).
모든 균주는 10% DMSO(dimethyl sulfoxide)에서 -80℃에 보관하였으며, 실험에 사용하기 위해 뮬러-힌트 배지(Mueller-Hinton broth; MH broth)에 현탁시킨 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 뮬러-힌트 아가(MH agar) 및 뮬러-힌트 배지(MH broth)는 미국의 디프코사(Difco Laboratories)에서 구입하여 사용하였다. 모든 균주는 MH agar에서 유지시켰으며, 항균활성 측정(antibacterial assays)은 MH broth에서 수행하였다. 균주의 성장은 600nm에서 OD(optical density)값으로 혼탁도(turbidity)를 측정하였다.
2-2: 메티실린 내성 유전자 확인
MRSA의 메티실린에 대한 내성은 유전체 중 mecA(Mobile genetic element A)라 불리는 내성유전자를 획득함으로써 나타난다. 또한, 메티실린의 내성을 증가시키는 보조 유전자인 femA(factor essential for methicillin resistance A)은 mecA와 협조하여 β-락탐계 항균제에 대한 내성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 실시예 2-1의 황색포도상구균에 대해 항생제 내성 여부를 확인하기 위하여 MecA 및 femA(β-lactamase)의 포함여부를 확인하였다.
MecA 및 femA 유전자 검출을 위해서 MH agar에서 배양하고 증식한 한개의 집락을 취하여, 300 ㎕의 세포용해버퍼(cell lysis buffer)에 혼합하였으며, 20분간 100℃로 가열한 다음, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 수득하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA 2 ㎕를 MRSA Primer Mix Kit (Genotek Co., 한국)를 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR 수행을 위한 프라이머는 하기 표 1과 같으며, PCR 반응조건은 94℃에서 60초, 55℃에서 60초, 72℃에서 60초로 하여 30사이클(cycle)을 수행하였다. 증폭산물을 2% 아가로오스 겔(agarose gel)에 넣고, 0.5% Tris-borate buffer에서 25분간 전기영동하여 판독하였다.
Gene Primer Sequence(5'-3') 서열번호
mecA Forward primer ATGAGATTAGGCATCGTTTC 서열번호 1
Reverse primer TGGATGACAGTACCTGAGCC 서열번호 2
femA Forward primer CATGATGGCGAGATTACAGG 서열번호 3
Reverse primer CGCTAAAGGTACTAACACACGG 서열번호 4
황색포도상구균의 항생제 내성 여부는 하기 표 2에 나타내었다.
S. aureus strain Class mecA
gene		 β-lactamase
activity		 Antibiotic resistance
ATCC 33591 MRSA + + AM, OX
ATCC 25923 MSSA - - -
DPS 1 MRSA + + AM, OX
DPS 2 MRSA + - AM, OX
DPS 3 MRSA + + AM, OX
DPS 4 MRSA + - AM, OX
DPS 5 MRSA + - AM, OX
DPS 6 MRSA + - AM, OX
DPS 7 MRSA + - AM, OX
DPS 8 MRSA + + AM, OX
DPS 9 MRSA + + AM, OX
DPS 10 MRSA + + AM, OX
DPS 11 MRSA + + AM, OX
DPS 12 MRSA + - AM, OX
DPS 13 MRSA + + AM, OX
DPS 14 MRSA + - AM, OX
DPS 15 MRSA + - AM, OX
상기 표 2에서 확인한 바와 같이, 총 17개의 황색포도상구균에 대한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용하여 항생제 내성 여부를 확인한 결과, 1개(ATCC 25923) 이외의 균주에서는 모두 메티실린 내성이 있는 황색포도상구균임을 확인할 수 있었다.
(실시예3) 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 최소억제 농도 측정
실시예1에서 분리한 하수오 뿌리 유래 레인의 황색포도상구균에 대한 항균효과를 알아보기 위해 균주를 억제하는 최소 억제 농도(Minimum inhibitory concentration; MIC)를 측정하였다.
MIC의 측정은 CLSI 가이드 라인(Clinical and Laboratory Standards Institute guidelines, 2006)에 기술된 액체배지미량희석법(Broth microdilution method)에 따라 수행되었으며, 황색포도상구균에 대한 레인의 최소억제농도 값은 마이크로플레이트(microplate) 및 마이크로튜브(micro tube)를 이용하여 측정하였다.
실험을 수행하기 앞서서, 레인은 DMSO(diluted using MH broth; v/v)를 이용하여 희석하였고 연속 2배 희석으로 96-웰 플레이트(96 well plates)와 마이크로튜브에 준비하였다. 황색포도상구균 접종물들은 0.5 McFarland standard(약 108 colony-forming units(CFU)/mL)로 조정하였다. 최소억제농도 값은 37℃에서 24시간 동안 배양하여 황색포도상구균의 성장이 억제되는 가장 낮은 농도로 정의하였다.
24시간 동안 배양한 후, 20㎕(1㎎/㎖)의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 육안으로 최소억제농도를 관찰하였다.
기존 항생제와의 비교를 위하여 음성대조군으로 암피실린(Ampicillin) 및 옥사실린(oxacillin)을 사용하였으며, 황색포도상구균에 대한 최소억제농도는 상기와 같은 방법으로 수행하였다. 하기 표 3에 최소억제농도 값 측정 결과를 나타내었다.
S. aureus strain Minimum inhibitory concentrations (㎍/mL)
Rhein Ampicillin Oxacillin
ATCC 33591 62.5 62.5 1000
ATCC 25923 62.5 0.97 1.95
DPS 1 250 31.25 500
DPS 2 125 31.25 1000
DPS 3 125 31.25 1000
DPS 4 250 31.25 1000
DPS 5 125 31.25 1000
DPS 6 250 31.25 500
DPS 7 250 62.5 500
DPS 8 250 125 500
DPS 9 250 125 500
DPS 10 125 62.5 500
DPS 11 125 125 500
DPS 12 62.5 125 500
DPS 13 250 125 500
DPS 14 250 62.5 1000
DPS 15 250 125 500
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예1에서 수득한 레인의 최소억제농도는 62.5 내지 250 ㎍/mL으로 확인되었다. 음성대조군으로 사용한 암피실린 및 옥사실린은 메티실린 감수성 황색포도상구균에 대해서는 최소억제농도가 각각 0.97 ㎍/mL 및 1.95 ㎍/mL 로 매우 높은 항균활성을 보인 반면, 16종의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해서 암피실린의 최소억제농도는 31.25 내지 125 ㎍/mL으로 항균활성이 감소되었으며, 옥사실린의 최소억제농도는 500 내지 1000 ㎍/mL으로 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성이 거의 없는 것을 확인하였다.
( 실시예4 ) 레인과 에틸렌다이아민테트라아세트산 ( ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA )의 혼합에 따른 상승효과 측정
레인의 항균활성과 막 투과성의 관련성을 확인하기 위해, EDTA(Sigma-Aldrich, 미국)를 병용 처리하여 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 측정하였다. 실험균주는 메티실린 내성 황색포도 상구균인 MRSA(ATCC 33591)을 사용하였다. 또한, 상기 EDTA는 황색포도상구균에 대해 어떠한 저해효과도 보이지 않는 0.02 내지 0.39 mM의 농도로 사용하였다. 레인의 농도는 최소억제농도인 62.5 ㎍/mL를 기준으로 4배(15.6 ㎍/mL) 희석하여 사용하였다. 상기 레인과 EDTA를 혼합하여 MRSA(ATCC 33591) 균주에 첨가하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 결과를 도 1 내지 도 2에 나타내었다. 도 1를 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL) 및 EDTA(0.09mM) 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않게 나타났다. 도 2를 참조하면, 레인과 EDTA를 혼합 사용할 경우, EDTA가 0.09 mM 이상의 농도로 포함될 때 항균활성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
(실시예5) 레인과 Triton X-100(TX)의 혼합에 따른 상승효과 측정
레인의 항균활성과 막 투과성의 관련성을 확인하기 위해, Triton X-100(Fluka, 스위스)를 병용 처리하여 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 측정하였다. 실험균주는 메티실린 내성 황색포도 상구균인 MRSA(ATCC 33591)을 사용하였다. 또한, 상기 TX는 황색포도상구균에 대해 어떠한 저해효과도 보이지 않는 0.02 내지 0.39 부피%의 농도로 사용하였다. 레인의 농도는 최소억제농도인 62.5 ㎍/mL를 기준으로 4배(15.6 ㎍/mL) 희석하여 사용하였으며, 상기 레인과 TX를 혼합하여 MRSA(ATCC 33591) 균주에 첨가하였다. 배양 및 흡광도 측정 방법은 실시예4와 동일하다. 흡광도 측정 결과를 도 3 내지 도 4에 나타내었다. 도 3을 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL) 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않게 나타났으며, TX 단독 사용시에는 항균활성이 거의 나타나지 않았다. 도 4를 참조하면, 레인과 TX를 혼합 사용할 경우, TX가 0.09부피% 이상의 농도로 포함될 때 레인의 항균활성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
(실시예6) 레인과 아지드 나트륨(sodium azide; NA)의 혼합에 따른 상승효과 측정
레인의 항균활성과 ATPase 저해의 관련성을 확인하기 위해, NA(Sigma-Aldrich, 미국)를 병용 처리하여 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 측정하였다. 실험균주는 메티실린 내성 황색포도 상구균인 MRSA(ATCC 33591)을 사용하였다. 또한, 상기 NaN3는 황색포도상구균에 대해 어떠한 저해효과도 보이지 않는 0.0003 내지 0.006 부피%의 농도로 사용하였다. 레인의 농도는 최소억제농도인 62.5 ㎍/mL를 기준으로 4배(15.6 ㎍/mL) 희석하여 사용하였으며, 상기 레인과 NaN3를 혼합하여 MRSA 균주에 첨가하였다. 배양 및 흡광도 측정 방법은 실시예4와 동일하다. 흡광도 측정 결과를 도 5 내지 도 6에 나타내었다. 도 5를 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL) 및 NaN3(0.001부피%) 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않게 나타났다. 도 6을 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL)과 함께 NaN3가 0.001부피% 이상의 농도로 포함될 경우 레인의 항균활성이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있다.
( 실시예7 ) 레인과 N,N '- 디시클로헥실카르보디이미드 ( N,N '- dicyclohexylcarbodiimide ; DCCD )의 혼합에 따른 상승효과 측정
레인의 항균활성과 ATPase 저해의 관련성을 확인하기 위해, DCCD(Sigma-Aldrich, 미국)를 병용 처리하여 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균활성을 측정하였다. 실험균주는 메티실린 내성 황색포도 상구균인 MRSA(ATCC 33591)을 사용하였다. 또한, 상기 DCCD는 황색포도상구균에 대해 어떠한 저해효과도 보이지 않는 6.2 내지 100 μM의 농도로 사용하였다. 레인의 농도는 최소억제농도인 62.5 ㎍/mL를 기준으로 4배(15.6 ㎍/mL) 희석하여 사용하였으며, 상기 레인과 DCCD를 혼합하여 MRSA 균주에 첨가하였다. 배양 및 흡광도 측정 방법은 실시예4와 동일하다. 흡광도 측정 결과를 도 7 내지 도 8에 나타내었다. 도 7을 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL) 및 DCCD(25 μM) 단독 사용시에는 MRSA 균주에 대한 항균활성이 다소 높지 않게 나타났다. 도 8을 참조하면, 레인(15.6 ㎍/mL)과 함께 DCCD가 25 μM 이상의 농도로 포함될 경우 레인의 항균활성이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 농도가 증가할수록 항균활성이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 건강기능식품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
< 제조예 1>
항균 조성물 200 ㎎
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B 1 0.13 ㎎
비타민 B 2 0.15 ㎎
비타민 B 6 0.5㎎
비타민 B 12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 화장료 조성물의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
< 제조예 2>
에틸 알코올 4.00 중량%
메틸 파라벤 0.10 중량%
향 0.10 중량%
수소처리된 캐스터 오일 0.60 중량%
DL-a-토코페릴 아세테이트 0.02 중량%
글리세린 5.00 중량%
1,3-부틸렌 글리콜 3.00 중량%
하이드록시 에틸 셀룰로오스 0.20 중량%
잔탄검 0.40 중량%
E.D.T.A-2Na 0.02 중량%
피쉬-콜라겐 4.00 중량%
항균 조성물 0.5~2.0 중량%
증류수 잔량
이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 주사제의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제조예 3>
항균 조성물 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
이하, 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 동물 사료의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제조예 4>
항균 조성물 40g
부형제(말분) 760g
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (15)

10 내지 20μg/mL의 레인(rhein) 및 하기 1) 내지 4) 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물:
1) 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40mM으로 포함되는 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)
2) 상기 항균 조성물 내 0.08 내지 0.40부피%로 포함되는 Triton X(TX)
3) 상기 항균 조성물 내 0.0009 내지 0.007부피%로 포함되는 아지드 나트륨(sodium azide; NA)
4) 상기 항균 조성물 내 20 내지 105μM로 포함되는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(N,N'-dicyclohexylacrbodiimide; DCCD).
제1항에 있어서,
상기 레인은 하수오(Pleuropterus multiflorus TURCZ.)의 뿌리 유래인 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
β-락탐항생제를 더 포함하는 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
제10항에 있어서,
상기 β-락탐항생제는 암피실린 또는 옥사실린인 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 의약품.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 화장품.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 항생제 내성 황색포도상구균 억제용 항균 조성물을 포함하는 건강기능식품.
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