KR101982899B1

KR101982899B1 - ＴＬ1ａ에 대한 항체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101982899B1
Application number: KR1020147011661A
Authority: KR
Inventors: 린 도로티 폴톤; 아담 클라케; 앤드류 제임스 포우; 데브라 탐바키스; 조지 콥시다스; 안토니 제라드 도일; 필립 안토니 젠닝스; 매튜 폴라드
Original assignee: 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2019-05-27
Also published as: CA2850549A1; AU2012315474B2; EA201400390A1; EA035018B1; EP2760889A1; EP2760889A4; IL231777A0; ZA201401843B; US10822422B2; AU2012315474A1; CA2850549C; US20160333104A1; KR20140101727A; EP3495389A1; MX2014003689A; BR122020013379B1; BR112014007426B1; CN104114577A; US20210347904A1; BR112014007426A2

Abstract

본 개시내용은 TNF 유사 리간드 1a(TL1a)에 특이적으로 결합하고, TL1a와 사멸 수용체 3(DR3)의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 데코이 수용체 3(DcR3)의 상호작용은 억제시키지 않는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 TL1a 결합 단백질을 제공한다. 본 개시내용은 또한 TL1a 결합 단백질의 용도를 제공한다.

Description

ＴＬ1ａ에 대한 항체 및 그의 용도{ANTIBODIES AGAINST TL1A AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 데이터

본 출원은 2011년 9월 30일 출원된 호주 특허 출원 번호 제2011904042호(발명의 명칭: "Antibodies against TL1a and uses thereof"), 및 2011년 9월 30일 출원된 미국 특허 출원 번호 제61/541,590호(발명의 명칭: "Antibodies against TL1a and uses thereof")로부터의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 전자 양식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록의 전문이 본원에서 참고로 포함된다.

기술 분야

본 개시내용은 TL1a에 결합하는 단백질, 및 예컨대, 요법, 예방, 진단 또는 예후에서의 그의 용도에 관한 것이다.

TNF 유사 리간드 1a(TL1a: TNF-like ligand 1a, 동의어: TNF 슈퍼패밀리 구성원 15(TNFSF15: TNF superfamily member 15); TL1 및 VEGI)는 종양 괴사 인자 슈퍼패밀리의 구성원으로서, 이는 항원 제시 세포(수지상 세포, B 세포 및 대식세포 포함), CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포, 및 내피 세포에 의해 발현되고, 세포 표면 상에서 발현될 수 있거나, 가용성 시토카인으로서 분비될 수 있다. TL1a에 대한 수용체인 사멸 수용체 3(DR3: Death Receptor 3)은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 FOXP3⁺ 조절 T(Treg) 세포를 비롯한 다양한 세포에 의해 발현된다.

TL1a는 또한 DR3의 경쟁적 억제제인 데코이 수용체(DcR3: decoy receptor)에 결합할 수 있다. DcR3은 또한 Fas-리간드(Fas-L), 및 T 세포 상의 헤르페스바이러스 유입 매개 인자에의 결합에 대하여 당단백질 D와 경쟁하는 림포톡신 유사 유도성 단백질(LIGHT: lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for binding herpesvirus entry mediator on T-cells)에 대한 데코이 수용체로서의 역할을 한다. 따라서, DcR3은 수개의 신호 전달 경로의 중요한 조절 인자이다.

TL1a/DR3 신호전달 경로는 인간 질환과 관련된, 수개의 생물학적 시스템에 연루되어 있다. 예를 들어, TL1a는 면역 및 혈관형성에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

연구자들은 또한 TL1a 및/또는 DR3이 결핍된 마우스를 사용하여 상기 경로를 억제시키는 것이 수개의 면역 매개 병태, 예컨대, 실험상 자가면역 뇌척수염(EAE: experimental autoimmune encephalomyelitis; 다발성 경화증의 모델), 결장염, 염증성 장 질환, 천식 및 관절염에서 예방학적 또는 치료적 이점을 제공할 수 있다고 밝혔다. TL1a는 또한 포말 세포 및 죽상경화성 플라크의 형성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다.

당업자에게 TL1a는 수개의 중요한 인간 질환에 관여하는 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다는 것은 상기 내용으로부터 자명해질 것이다. 따라서, TL1a 활성을 억제시키는 화합물이 예컨대, 그의 치료학적, 예방학적, 진단학적 및 예후적 용도로 바람직할 수 있다.

요약

본 발명자들은 TL1a에 특이적으로 결합할 수 있고, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않으면서, TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시킬 수 있는 (이로써, TL1a 활성(들)을 중화시킬 수 있는), 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 TL1a 결합 단백질을 제조하였다. 어느 이론 또는 작용 모드에 의해 제한하고자 하지 않으면서, 본 발명자들은 상기 TL1a 결합 단백질이 TL1a와 DcR3의 항상성 상호작용은 유의적으로 방해하지 않으면서, DR3을 통한 TL1a의 신호전달을 감소 또는 방해할 수 있다고 추론하였다. 이는 DcR3이 TL1a-DR3 상호작용에 미치는 천연 길항 효과는 보존하며, 이는 DcR3 또한 유리 Fas-L 및 LIGHT의 수용체(각각 Fas 및 Fas)에의 결합에 이용가능한 유리 Fas-L 및 LIGHT의 양을 조절하기 때문에 유익할 수 있다. Fas 매개 사멸은 암 감시에서 중요한 역할을 하는 바, Fas-L에 결합하는 DcR3의 양을 증가시킴으로써 발생되는 잠재적인 하류의 결과로는 암에 대한 감수성 증가를 포함할 수 있다. 또한, 어느 이론 또는 작용 모드에 의해 제한하고자 하지 않으면서, DcR3이 아닌 DR3과의 TL1a의 상호작용을 특이적으로 억제시키는 단백질은 안전성을 손상시키지 않으면서, 질환을 치료하는 데 유익할 수 있다.

본 발명자에 의해 확인된 TL1a 결합 단백질의 서브부류 또한 저농도에서 인간 TL1a에 의해 유도된 TF-1 세포의 아폽토시스(아포프토시스)를 억제시키고 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 즉, 항체는 낮은 유효 농도 또는 EC₅₀을 가졌다. TL1a 활성(예컨대, TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스)를 억제시키거나 방해할 수 있는 TL1a 결합 단백질은 때때로 본원에서 고도로 강력한 TL1a 결합 단백질로 지칭된다.

본 발명자들은 또한 TL1a에 특이적으로 결합하고, DcR3과 상호작용할 수 있는 TL1a의 능력은 억제시키지 않으면서, TL1a와 DR3과의 상호작용을 억제시키는 고도로 강력한 TL1a 결합 단백질이 결합하는 TL1a의 영역을 확인하게 되었다.

본 발명에 의해 확인된 TL1a 결합 단백질은 다양한 치료학적/예방학적/진단학적/예후적 용도에 대한 기반을 형성한다. 결장염 병태에 대한 현 표준 치료와 적어도 동일한 효능을 보이는, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 용인된 결장염 모델을 치료하는 본 발명자들의 용도에 의해 입증된다.

따라서, 본 개시내용은 항원 결합 도메인이 TL1a에 특이적으로 결합하고, 여기서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DcR3의 상호작용을 검출가능할 정도로 감소시키지 않는다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질이 TL1a와 DcR3의 상호작용에 미치는 효과는 경쟁 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay)을 사용하여 평가된다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질을 TL1a(예컨대, 인간 TL1a)와 함께 인큐베이션시킨 후, 항체의 Fc 영역에 융합된 DcR3(예컨대, 인간 DcR3(hDcR3: human DcR3))을 포함하는 폴리펩티드("DcR3/Fc")와 접촉시키고, 결합된 TL1a의 수준을 검출한다. 일례에서, 상기 단백질의 존재 또는 부재하에서 결합된 TL1a의 수준은 EC₅₀을 계산할 수 있도록 허용하는 데 유의적으로 상이하지 않고/거나, 불충분하게 상이하다.

일례에서, TL1a 결합 단백질의 부재하의 결합 수준에 대한 백분율(%)로서 표시된, 상기 단백질의 존재하에서 TL1a와 DcR3(또는 DcR3/Fc)의 상호작용 억제 수준은 25% 이하, 또는 22% 이하, 또는 20% 이하, 또는 18% 이하, 또는 15% 이하, 또는 12% 이하, 또는 10% 이하, 또는 7% 이하, 또는 5% 이하이다.

일례에서, TL1a와 DR3 또는 DcR3의 상호작용을 억제시킬 수 있는 TL1a 결합 단백질의 능력은 DcR3/Fc, 또는 항체의 Fc 영역에 융합된 DR3(예컨대, 인간 DR3(hDR3))을 포함하는 폴리펩티드(DR3/Fc)를 약 2 ㎍/ml의 농도로 고체 또는 반고체 표면(예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화시킴으로써 평가된다. 이어서, TL1a 결합 단백질을 약 30분 동안 (약 1 ㎍/ml 농도의) 비오티닐화된 인간 TL1a와 접촉시킨 후, 고정화된 DcR3/Fc 또는 DR3/Fc에 첨가한다. 세척 후, 결합된 TL1a를 검출한다. 결합률(%) 또는 억제율(%)을 측정하기 위해, TL1a 결합 단백질의 부재하에서의 TL1a의 고정화된 DcR3/Fc 또는 DR3/Fc에의 최대 결합치에 대한 백분율(%)로서 표시함으로써 데이터를 정규화한다. 다중 농도의 TL1a 결합 단백질에서의 억제 수준을 계산함으로써, EC₅₀을 측정할 수 있다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DcR3(또는 DcR3/Fc)이 아닌, TL1a와 DR3(또는 DR3/Fc)의 상호작용을 억제시킨다.

예를 들어, TL1a 결합 단백질은 약 20 nM 내지 약 10 fM의 EC₅₀으로, 또는 20 nM 이하, 예컨대, 15 nM 이하, 예를 들어, 11 nM 이하, 예를 들어, 5 nM 이하의 EC₅₀으로 DR3/Fc와 TL1a의 상호작용을 억제시킨다. 일례에서, EC₅₀은 5 nM 이하이다. 예를 들어, EC₅₀은 3 nM 이하이다. 예를 들어, EC₅₀은 2.5 nM 이하이다. 예를 들어, EC₅₀은 1 nM 이하이다. 예를 들어, EC₅₀은 0.5 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 경쟁 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA)을 사용하여 평가된다. 예를 들어, 다양한 농도의 TL1a 결합 단백질을 TL1a(예컨대, 인간 TL1a)(예컨대, 약 1 ㎍/ml의 TL1a)와 인큐베이션시킨 후, DR3/Fc(예컨대, 약 2 ㎍/ml의 DR3/Fc)와 접촉시키고, 결합된 TL1a의 수준을 검출한다. TL1a에의 결합의 최대 억제의 ½이 검출되는 단백질의 농도를 EC₅₀으로 간주한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DR3의 상호작용을 방해함으로써 세포에서 또는 세포 상에서 TL1a 활성을 중화시킨다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 TL1a의 세포외 도메인, 예컨대, 인간 TL1a의 세포외 도메인에 결합한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 포유동물 세포, 예컨대, 인간 세포에 의해 생산된 인간 TL1a에 결합한다.

본 개시내용의 예시적인 TL1a 결합 단백질은 인간 TL1a, 예컨대, 포유동물 세포(예컨대, 인간 세포)에 의해 생산된 인간 TL1a(예컨대, 배양물 1 mL당 약 100 ng의 인간 TL1a) 및 사이클로헥시미드의 존재하에서 배양된 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 감소시킨다. 예를 들어, 약 7x10⁴ 내지 8x10⁴개의 TF-1 세포(예컨대, 7.5x10⁴개의 세포)를 배양물 1 mL당 약 1 ㎍의 인간 TL1a 및 사이클로헥시미드와 접촉시킨다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 25 nM 이하의 EC₅₀(즉, TL1a 결합 단백질에 의해 달성되는 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스의 최대 억제의 50%를 달성하는 TL1a 결합 단백질의 농도)으로 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 감소시킨다. 일례에서, EC₅₀은 5 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 2 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 1.5 nM 이하 또는 1.2 nM 이하 또는 1.1 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 1 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.75 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.3 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.1 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 약 1.5 nM 내지 약 10 fM, 예컨대, 약 1 nM 내지 약 50 fM, 예를 들어, 약 1 nM 내지 약 100 fM이다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 예컨대, 유세포 측정법(flow cytometry)을 사용하여 측정되는 바, 약 10 nM 이하의 EC₅₀(즉, TL1a 결합 단백질에 의해 달성되는 세포에의 최대 결합의 50%를 달성하는 TL1a 결합 단백질의 농도)으로 세포 표면 상의 TL1a에 결합한다. 일례에서, 유세포 측정법은 약 2x10⁵ 내지 3x10⁵개의 세포(예컨대, 2.5x10⁵개의 세포)를 이용하여 수행된다. 일례에서, EC₅₀은 5 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 2 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 약 10.0 nM 또는 5.0 nM 또는 1.0 nM 또는 0.5 nM 또는 0.1 nM 내지 약 10 fM이다.

본 개시내용은 또한 항원 결합 도메인이 TL1a에 특이적으로 결합하고, 경쟁 ELISA에서 약 2.5 nM 이하, 예컨대, 1 nM 이하 또는 약 2.5 nM, 또는 약 1.0 nM, 또는 약 0.5 nM, 또는 약 0.1 nM 내지 약 10 fM의 EC₅₀으로 비오티닐화된 TL1a와 DR3/Fc의 상호작용을 억제시키고,

여기서, DR3/Fc는 약 2 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재(substrate)(예컨대, 고체 기재, 예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화되고, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 10 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL 농도 범위의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DR3/Fc에 접촉하게 되고,

여기서, TL1a 결합 단백질은 경쟁 ELISA에서 비오티닐화된 TL1a와, DcR3/Fc의 상호작용을 TL1a 결합 단백질 부재하의 비오티닐화된 TL1a의 DcR3/Fc에의 결합 수준과 비교하여 검출가능할 정도로 감소시키지 않으며, 여기서, DcR3/Fc는 약 2 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재(예컨대, 고체 기재, 예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화되고, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 10 ㎍/mL 내지 0.1 ㎍/mL 농도의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DcR3/Fc에 접촉하게 되는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다.

여기서, DR3/Fc는 약 2 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재(예컨대, 고체 기재, 예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화되고, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 10 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL 농도 범위의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DR3/Fc에 접촉하게 되고,

여기서, TL1a 결합 단백질은 경쟁 ELISA에서 비오티닐화된 TL1a와 DcR3/Fc의 상호작용을 TL1a 결합 단백질 부재하의 비오티닐화된 TL1a의 DcR3/Fc에의 결합 수준과 비교하여 검출가능할 정도로 감소시키지 않으며, 여기서, DcR3/Fc는 약 2 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재(예컨대, 고체 기재, 예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화되고, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 10 ㎍/mL 내지 0.1 ㎍/mL 농도의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DcR3/Fc에 접촉하게 되고,

여기서, TL1a 결합 단백질은 인간 세포에 의해 생산된 인간 TL1a 및 사이클로헥시미드의 존재하에서 배양된 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 25 nM 이하, 또는 약 1.5 nM 또는 1.0 nM 또는 0.5 nM 또는 0.1 nM 또는 0.05 nM 내지 약 10 fM의 EC₅₀(즉, TL1a 결합 단백질에 의해 달성되는 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스의 최대 억제의 50%를 달성하는 TL1a 결합 단백질의 농도)으로 감소시키고,

여기서, 약 7.5x10⁴개의 TF-1 세포가 약 5 ㎍/mL 이하인 농도의 TL1a 결합 단백질과 함께 약 4 내지 5시간 동안 배양물 1 mL당 약 100 ng의 인간 TL1a 및 약 10 ㎍/mL의 사이클로헥시미드와 접촉하게 되는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다.

일례에서, TL1a는 한쪽 부위에서 비오티닐화되고, 즉, 비오틴은 TL1a 중 단 하나의 아미노산에 연결된다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 경쟁 ELISA에서 비오티닐화된 TL1a와 DcR3/Fc의 상호작용을 TL1a 결합 단백질 부재하의 비오티닐화된 TL1a의 DcR3/Fc에의 결합 수준과 비교하여 검출가능할 정도로 감소시키지 않으며, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 100 ㎍/mL 농도의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DcR3/Fc에 접촉하게 된다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 경쟁 ELISA에서 비오티닐화된 TL1a와 DcR3/Fc의 상호작용을 TL1a 결합 단백질 부재하의 비오티닐화된 TL1a의 DcR3/Fc에의 결합 수준과 비교하여 검출가능할 정도로 감소시키지 않으며, 여기서, 약 1 ㎍/mL 농도의 비오티닐화된 TL1a는 약 30분 동안 약 10 ㎍/mL 농도의 TL1a 결합 단백질과 접촉된 후, 고정화된 DcR3/Fc에 접촉하게 된다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 22 nM 이하의 EC₅₀으로 감소시킨다. 일례에서, EC₅₀은 10 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 5 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 2 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 1.5 nM 이하 또는 1.2 nM 이하 또는 1.1 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 1 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.75 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.3 nM 이하이다. 일례에서, EC₅₀은 0.1 nM 이하이다.

본 개시내용은 추가로, 또는 별법으로 항원 결합 도메인이 TL1a에 특이적으로 결합하고, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고 TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않으며, TL1a 결합 단백질은, TL1a 결합 단백질이 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준보다 75% 이상 더 낮은 수준으로, 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나, 85번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에 결합하는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다.

일례에서, 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형은 약 1 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재(예컨대, 고체 기재, 예컨대, ELISA 플레이트) 상에 고정화되고, 여기서, 이어서, 약 10 ㎍/mL 내지 약 0.01 ㎍/mL 농도 범위의 TL1a 결합 단백질은 고정화된 돌연변이체 TL1a에 접촉하게 된다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 상기 단백질이 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준의 25% 이하인 수준으로 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나, 85번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에 결합한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질이 10 ㎍/mL의 농도로 테스트되었을 때, TL1a 결합 단백질의 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에의 결합 수준은 상기 단백질이 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준의 25% 이하이다.

본 개시내용은 추가로, 또는 별법으로 항원 결합 도메인이 TL1a에 특이적으로 결합하고, 여기서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않으며, 여기서, TL1a 결합 단백질은, 상기 단백질이 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준보다 75% 이상 더 낮은 수준으로, 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나, 85번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에 결합하고,

여기서, TL1a의 돌연변이형은 약 1 ㎍/mL의 농도로 고체 또는 반고체 기재 상에 고정화되고, 여기서, 이어서, 10 ㎍/mL 농도의 TL1a 결합 단백질은 고정화된 돌연변이체 TL1a에 접촉하게 되는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다.

일례에서, 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형은 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환된, 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함한다.

일례에서, 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형은 85번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환된, 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함한다.

일례에서, 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형은 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고, 85번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는, 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질의 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에의 결합 수준은 상기 단백질이 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준보다 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 이상 더 낮다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 가용성 인간 TL1a의 돌연변이형에 검출가능할 정도로 결합하지 않는다.

일례에서, TL1a 결합 단백질의 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형에 결합은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 평가된다. 예를 들어, 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형은 (예컨대, 약 1 ㎍/mL의 농도로) 고정화되고, TL1a 결합 단백질(예컨대, 약 500 ng/mL의 농도)은 고정화된 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형에 접촉하게 되고, 결합은 표면 플라즈몬 공명에 의해 검출된다. 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형에의 결합 수준을 비교함으로써 TL1a 결합 단백질은 상기 단백질이 가용성 인간 TL1a에 결합하는 수준보다 75% 이상 더 낮은 수준으로 결합하는 것을 측정할 수 있다.

일례에서, TL1a 결합 단백질의 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형에 결합은 ELISA를 사용하여 평가된다. 예를 들어, 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형은 (예컨대, 약 1 ㎍/mL의 농도로) 고정화되고, TL1a 결합 단백질(예컨대, 약 10 ㎍/mL)은 고정화된 가용성 인간 TL1a 또는 그의 돌연변이형에 접촉하게 되고, 결합은 (예컨대, 당업계의 표준 방법을 사용하여) ELISA에 의해 검출된다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 202의 32번 위치의 아르기닌 및 서열 번호 202의 85번 위치의 아르기닌에 상응하는 잔기를 포함하는 TL1a 내의 에피토프에 결합한다. 일례에서, 에피토프는 입체형태적 에피토프이다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 202에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 TL1a의 적어도 32번 위치의 아르기닌 및 85번 위치의 아르기닌인 아미노산 잔기에 결합한다.

상기 문단에 기재된 결합 특징을 가지는 예시적인 TL1a 결합 단백질은 본원 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이며, 하기 V_H 및 V_L 쌍을 포함하는 것을 포함한다:

(i) 서열 번호 94에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열 번호 137에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 138에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열 번호 162에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 172에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 또는

(iv) 서열 번호 173에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 174에 기재된 서열을 포함하는 V_L.

상기 서열에 포함되는 V_H 및 V_L은 본원 설명으로부터 당업자에게 자명해질 것이며, 본 개시내용의 본 실시예를 준용한다는 것을 이해하여야 한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 레수스 원숭이로부터의 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시킨다. 상기 TL1a 결합 단백질은 인간 질환의 동물 모델을 특징 규명하는 데 유용하다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 마우스, 돼지, 토끼 또는 기니아 피그로부터의 TL1a와 DR3의 상호작용을 검출가능할 정도로 억제시키지 않으며, 예컨대, TL1a 결합 단백질은 예컨대, 본원에 기술된 검정법을 사용하여 측정되는 바, 관련 TL1a의 존재하에서 배양된 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 검출가능할 정도로 억제시키지 않는다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 래트로부터의 TL1a와 DR3의 상호작용을 검출가능할 정도로 억제시킨다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 예컨대, 본원에 기술된 검정법을 사용하여 측정되는 바, 관련 TL1a의 존재하에서 배양된 TF-1 세포의 아폽토시스 수준을 검출가능할 정도로 억제시킨다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 123의 아미노산 72-251로 구성된 TL1a의 이소폼, 및/또는 서열 번호 123의 아미노산 84-251로 구성된 TL1a의 이소폼에 검출가능할 정도로 결합한다.

예를 들어, 결합은, TL1a의 이소폼을 1 ㎍/ml의 농도로 고정화시키고, TL1a 결합 단백질을 이소폼에 접촉시키고, 결합 수준을 평가하는 ELISA에 의해 평가된다.

본 개시내용은 추가로 또는 별법으로 하기 중 임의의 하나 이상의 것을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다:

(i) 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 6에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열 번호 10에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 14에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열 번호 18에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 22에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열 번호 26에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 30에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(v) 서열 번호 34에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 38에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vii) 서열 번호 50에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 54에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열 번호 66에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xi) 서열 번호 70에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xii) 서열 번호 74에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xiii) 서열 번호 78에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xiv) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 82에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xv) 서열 번호 86에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xvi) 서열 번호 90에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xvii) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xviii) 서열 번호 154에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 164에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xix) 서열 번호 155에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 163에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xx) 서열 번호 156에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 165에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxi) 서열 번호 157에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 166에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxii) 서열 번호 158에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 167에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxiii) 서열 번호 159에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 168에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxiv) 서열 번호 160에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 169에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxv) 서열 번호 161에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 170에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxvi) 서열 번호 234에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 169에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxvii) 서열 번호 154에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxviii) 서열 번호 155에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxix) 서열 번호 156에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxx) 서열 번호 157에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxi) 서열 번호 158에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxii) 서열 번호 159에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxiii) 서열 번호 160에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxiv) 서열 번호 161에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxv) 서열 번호 234에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxvi) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 164에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxvii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 165에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxviii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 166에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxxix) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 167에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xl) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 168에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xli) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 169에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 170에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xliii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 171에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xliv) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 172에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlv) 서열 번호 175에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 188에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlvi) 서열 번호 176에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 189에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlvii) 서열 번호 177에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 190에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlviii) 서열 번호 178에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 191에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xlix) 서열 번호 179에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 192에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(l) 서열 번호 180에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 193에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(li) 서열 번호 181에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 194에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(lii) 서열 번호 182에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 195에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(liii) 서열 번호 183에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 196에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(liv) 서열 번호 184에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 197에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(lv) 서열 번호 185에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 198에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(lvi) 서열 번호 186에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 199에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 또는

(lvii) 서열 번호 187에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 200에 기재된 서열을 포함하는 V_L.

특정 일례에서, V_H 및 V_L이 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 V_H 및 V_L을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다:

(i) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열 번호 106에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 107에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(iii) 서열 번호 175에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 188에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열 번호 222에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(v) 서열 번호 176에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 189에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열 번호 223에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(vii) 서열 번호 177에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 190에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 229에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(ix) 서열 번호 178에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 191에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xi) 서열 번호 179에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 192에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xii) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 231 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xiii) 서열 번호 180에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 193에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xiv) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xv) 서열 번호 181에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 194에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xvi) 서열 번호 225에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xvii) 서열 번호 183에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 196에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xviii) 서열 번호 226에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xix) 서열 번호 185에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 198에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xx) 서열 번호 226에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 232에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xxi) 서열 번호 186에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 199에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xxii) 서열 번호 227에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 232에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L;

(xxiii) 서열 번호 187에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 200에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 및

(xxiv) 서열 번호 227에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H 및 서열 번호 233에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L.

본 개시내용은 추가로 또는 별법으로 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하며, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 것인, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다:

(i) V_H는 서열 번호 42의 16번 위치에 세린을 포함하고;

(ii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(iii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(iv) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(v) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(vi) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(vii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(viii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(ix) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(x) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xi) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xiii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xiv) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xv) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xvi) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xvii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xviii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xix) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xx) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxi) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxiii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxiv) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxv) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxvi) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxvii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxviii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxix) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxx) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxi) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxiii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxiv) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxv) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxvi) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxvii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxviii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xxxix) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xl) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xli) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xliii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xliv) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlv) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlvi) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlvii) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlviii) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(xlix) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(l) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(li) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(liii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(liv) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lv) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lvi) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lvii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lviii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lix) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lx) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxi) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 23번 위치에 알라닌을 포함하고;

(lxii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 28번 위치에 아스파르트산을 포함하고;

(lxiii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 33번 위치에 티로신을 포함하고;

(lxiv) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 34번 위치에 아스파르트산을 포함하고;

(lxv) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 53번 위치에 아스파라긴을 포함하고;

(lxvi) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 54번 위치에 세린을 포함하고;

(lxvii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 82번 위치에 알라닌을 포함하고;

(lxviii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 95번 위치에 세린을 포함하고;

(lxix) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 96번 위치에 세린을 포함하고;

(lxx) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxi) V_H는 서열 번호 42의 47번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 23번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxiii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxiv) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxv) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxvi) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxvii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxviii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxix) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고;

(lxxx) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하고;

(lxxxi) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하고;

(lxxxii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글리신을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기 중 임의의 하나 이상의 것을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다:

(i) 서열 번호 26에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 30에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열 번호 34에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 38에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 및

(iii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L.

한 특정 일례에서, V_H 및 V_L이 각각 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 V_H 및 V_L을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 또는 재조합 TL1a 결합 단백질을 제공한다:

(ii) 서열 번호 175에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 188에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열 번호 176에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 189에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열 번호 177에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 190에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(v) 서열 번호 178에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 191에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열 번호 179에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 192에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vii) 서열 번호 180에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 193에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열 번호 181에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 194에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열 번호 183에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 196에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열 번호 185에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 198에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xi) 서열 번호 186에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 199에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 및

(xii) 서열 번호 187에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 200에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 상기 언급된 항체의 가변 영역의 CDR3을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, CDR3은 카바트(Kabat) 번호매김 체계에 따라 정의되고, 서열 번호 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93 중 어느 하나에 기재된 서열, 또는 도 1A 내지 1H 또는 도 9B 또는 9C에 "CDR3"으로 표시되고, 굵은체로 제시된 서열, 또는 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108, 또는 서열 번호 188 내지 200 또는 234 중 어느 하나의 아미노산 91 내지 100을 포함하는 서열을 포함한다.

예를 들어, CDR3은 카바트 번호매김 체계에 따라 정의되고, 서열 번호 45 또는 49에 기재된 서열, 또는 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108 또는 서열 번호 188 내지 194, 196 또는 198 내지 200 중 어느 하나의 아미노산 아미노산 91 내지 100을 포함하는 서열을 포함한다.

또 다른 일례에서, CDR3(예컨대, HCDR3)은 강화된 코티아(Chothia) 번호매김 체계에 따라 정의되고, 도 1A, 1C, 1D 또는 1E 또는 9B 중 어느 하나에서 "CDR3"으로 표시되고, 밑줄체로 제시된 서열을 포함한다.

일례에서, CDR3은 서열 EVPX₁TAX₂FEY(서열 번호 143)(여기서, X₁은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, X₂는 세린 또는 알라닌이다)를 포함한다.

일례에서, CDR3은 서열 EX₁PX₂X₃AX₄FX₅Y(서열 번호 235)(여기서, X₁은 발린, 알라닌, 세린, 히스티딘, 아스파르트산, 류신, 티로신, 프롤린, 글루타민 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;

X₂는 알라닌, 세린, 히스티딘, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;

X₃은 알라닌, 세린, 아스파르트산, 티로신 또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;

X₄는 세린, 알라닌, 히스티딘, 류신, 아스파르트산 또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅는 알라닌, 세린, 히스티딘, 류신, 아스파르트산, 프롤린, 글루타민, 글루탐산 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다)를 포함한다.

일례에서, CDR3(예컨대, LCDR3)은 서열 번호 141에 기재된 서열(또는 도 1F 또는 9C에서 "컨센서스"로 표지된 굵은체의 CDR3으로 표지된 서열)을 포함한다.

예를 들어, 항원 결합 도메인은 항체의 가변 영역의 3개의 CDR을 포함한다.

일부 예에서 of 본 개시내용은, 항원 결합 도메인은 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 95, 137, 138, 152 내지 200 또는 234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 항체 가변 영역이다.

일부 예에서, 항원 결합 도메인은 하기 V_H 또는 V_L을 포함하는 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 항체 가변 영역이다:

(a) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하고, 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 것인 V_H:

(i) 서열 번호 42의 16번 위치에 알라닌;

(ii) 서열 번호 42의 100번 위치에 알라닌;

(iii) 서열 번호 42의 100번 위치에 세린;

(iv) 서열 번호 42의 100번 위치에 히스티딘;

(v) 서열 번호 42의 100번 위치에 류신;

(vi) 서열 번호 42의 100번 위치에 아스파르트산;

(vii) 서열 번호 42의 100번 위치에 티로신;

(viii) 서열 번호 42의 100번 위치에 프롤린;

(ix) 서열 번호 42의 100번 위치에 글루타민;

(x) 서열 번호 42의 100번 위치에 리신;

(xi) 서열 번호 42의 101번 위치에 알라닌;

(xii) 서열 번호 42의 101번 위치에 세린;

(xiii) 서열 번호 42의 101번 위치에 히스티딘;

(xiv) 서열 번호 42의 101번 위치에 류신;

(xv) 서열 번호 42의 101번 위치에 아스파르트산;

(xvi) 서열 번호 42의 101번 위치에 티로신;

(xvii) 서열 번호 42의 101번 위치에 글루타민;

(xviii) 서열 번호 42의 101번 위치에 리신;

(xix) 서열 번호 42의 102번 위치에 알라닌;

(xx) 서열 번호 42의 102번 위치에 세린;

(xxi) 서열 번호 42의 102번 위치에 히스티딘;

(xxii) 서열 번호 42의 102번 위치에 류신;

(xxiii) 서열 번호 42의 102번 위치에 티로신;

(xxiv) 서열 번호 42의 102번 위치에 프롤린;

(xxv) 서열 번호 42의 102번 위치에 글루타민;

(xxvi) 서열 번호 42의 102번 위치에 리신;

(xxvii) 서열 번호 42의 103번 위치에 알라닌;

(xxviii) 서열 번호 42의 103번 위치에 세린;

(xxix) 서열 번호 42의 103번 위치에 히스티딘;

(xxx) 서열 번호 42의 103번 위치에 류신;

(xxxi) 서열 번호 42의 103번 위치에 아스파르트산;

(xxxii) 서열 번호 42의 103번 위치에 티로신;

(xxxiii) 서열 번호 42의 103번 위치에 프롤린;

(xxxiv) 서열 번호 42의 103번 위치에 글루타민;

(xxxv) 서열 번호 42의 103번 위치에 리신;

(xxxvi) 서열 번호 42의 104번 위치에 세린;

(xxxvii) 서열 번호 42의 104번 위치에 히스티딘;

(xxxviii) 서열 번호 42의 104번 위치에 류신;

(xxxix) 서열 번호 42의 104번 위치에 아스파르트산;

(xl) 서열 번호 42의 104번 위치에 티로신;

(xli) 서열 번호 42의 104번 위치에 프롤린;

(xlii) 서열 번호 42의 104번 위치에 글루타민;

(xliii) 서열 번호 42의 104번 위치에 리신;

(xliv) 서열 번호 42의 105번 위치에 알라닌;

(xlv) 서열 번호 42의 105번 위치에 히스티딘;

(xlvi) 서열 번호 42의 105번 위치에 류신;

(xlvii) 서열 번호 42의 105번 위치에 아스파르트산;

(xlviii) 서열 번호 42의 105번 위치에 티로신;

(xlix) 서열 번호 42의 105번 위치에 프롤린;

(l) 서열 번호 42의 105번 위치에 글루타민;

(li) 서열 번호 42의 105번 위치에 리신;

(lii) 서열 번호 42의 107번 위치에 알라닌;

(liii) 서열 번호 42의 107번 위치에 세린;

(liv) 서열 번호 42의 107번 위치에 히스티딘;

(lv) 서열 번호 42의 107번 위치에 류신;

(lvi) 서열 번호 42의 107번 위치에 아스파르트산;

(lvii) 서열 번호 42의 107번 위치에 티로신;

(lviii) 서열 번호 42의 107번 위치에 프롤린;

(lix) 서열 번호 42의 107번 위치에 글루타민;

(lx) 서열 번호 42의 107번 위치에 리신;

(lxi) 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌;

(lxii) 서열 번호 42의 47번 위치에 세린;

(lxiii) 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산 및 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌;

(lxiv) 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산;

(lxv) 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌;

(lxvi) 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌; 또는

(b) 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하고, 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 것인 V_L:

(i) 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌;

(ii) 서열 번호 46의 23번 위치에 트레오닌;

(iii) 서열 번호 46의 28번 위치에 아스파라긴;

(iv) 서열 번호 46의 33번 위치에 티로신;

(v) 서열 번호 46의 34번 위치에 아스파르트산;

(vi) 서열 번호 46의 53번 위치에 아스파라긴;

(vii) 서열 번호 46의 54번 위치에 세린;

(viii) 서열 번호 46의 82번 위치에 알라닌;

(ix) 서열 번호 46의 95번 위치에 세린;

(x) 서열 번호 46의 96번 위치에 세린;

(xi) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌;

(xii) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 76번 위치에 트레오닌;

(xiii) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산; 또는

(xiv) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글리신.

예를 들어, 항원 결합 도메인은 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 86, 90, 94, 137, 152, 154 내지 162, 173, 175 내지 187 또는 234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함하는 V_H이다.

일례에서, CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라 정의된다.

예를 들어, TL1a 결합 단백질은 하기와 같은 CDR을 포함하는 V_H를 포함한다:

(i) 서열 번호 3에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 4에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다), 및 서열 번호 5에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C336 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(ii) 서열 번호 11에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 12에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 13에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C334 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(iii) 서열 번호 19에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 20에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 21에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C333 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(iv) 서열 번호 27에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 28에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 29에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C323 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(v) 서열 번호 35에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 36에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 37에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C321 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(vi) 서열 번호 43에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 44에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 45에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C320 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(vii) 서열 번호 51에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 52에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 53에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C319 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(viii) 서열 번호 67에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 68에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 69에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-90 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(ix) 서열 번호 71에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 72에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 73에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-103 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(x) 서열 번호 75에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 76에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 77에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-114 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(xi) 서열 번호 79에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 80에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 81에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-115 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(xii) 서열 번호 87에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 88에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 89에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-129 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(xiii) 서열 번호 91에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 92에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 93에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1C의 항체 C320-130 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(xiv) 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 31 내지 35에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 50 내지 66을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108; 및

(xv) 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 26 내지 35에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 50 내지 66을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 175 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108.

(i) 서열 번호 43에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 44에 기재된 서열을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 45에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1A의 항체 C320 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(ii) 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 31 내지 35에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 50 내지 66을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108; 또는

(iii) 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 26 내지 35에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 50 내지 66을 포함하는 CDR2(여기서, CDR2 아미노산 서열의 5개의 C 말단 아미노산 중 임의의 하나 이상의 것은 임의의 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다) 및 서열 번호 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나의 아미노산 99 내지 108.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기와 같은 CDR을 포함하는 V_H를 포함한다:

(i) 서열 번호 43에 기재된 서열을 포함하는 CDR1(또는 도 1E에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR1로 표지된 서열);

(ii) 서열 WX₁NPNSGNTGYAQKFQG(서열 번호 142)(여기서, X₁은 메티오닌 또는 류신이다)를 포함하는 CDR2(또는 도 1E 또는 도 9B에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR2로 표지된 서열); 및

(iii) 서열 EVPX₁TAX₂FEY(서열 번호 143)(여기서, X₁은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, X₂는 세린 또는 알라닌이다)를 포함하는 CDR3(또는 도 1E 또는 도 9B에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR3으로 표지된 서열), 또는 서열 EX₁PX₂X₃AX₄FX₅Y(서열 번호 235)(여기서,

X₁은 발린, 알라닌, 세린, 히스티딘, 아스파르트산, 류신, 티로신, 프롤린, 글루타민 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;

X₅는 알라닌, 세린, 히스티딘, 류신, 아스파르트산, 프롤린, 글루타민, 글루탐산 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다)를 포함하는 CDR3.

CDR3에 포함되는 데 적합한 추가의 잔기는 본원에 기술되어 있고, 본 개시내용의 본 실시예를 준용한다는 것을 이해하여야 한다.

일례에서, CDR은 강화된 코티아 번호매김 체계에 따라 정의된다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 도 1A에서 항체 336, 334, 333, 323, 321, 320 또는 319, 또는 도 1C에서 항체 C320-90, C320-103, C320-114, C320-115, C320-129 또는 C320-130, 또는 도 1C 또는 도 1E 또는 도 9B에서 "컨센서스"로 표지된 서열의 밑줄체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 CDR을 포함하는 V_H를 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기를 추가로 포함한다:

(i) 서열 번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR1;

(ii) 서열 번호 145에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR2;

(iii) 서열 번호 146에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR3; 및

(iv) 서열 번호 147에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR4.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기를 포함한다:

(ii) 서열 번호 43에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

(iii) 서열 번호 145에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR2;

(iv) 서열 번호 142에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;

(v) 서열 번호 146에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR3;

(vi) 서열 번호 143 또는 235에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및

(vii) 서열 번호 147에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR4.

예를 들어, 항원 결합 도메인은 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 82, 95, 153, 163 내지 172, 174, 또는 188 내지 200 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열의 3개의 CDR을 포함하는 V_L이다. 일례에서, CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라 정의된다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 하기와 같은 CDR을 포함하는 V_L을 포함한다:

(i) 서열 번호 7에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 8에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 9에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C336 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(ii) 서열 번호 15에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 16에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 17에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C334 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(iii) 서열 번호 23에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 24에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 25에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C333 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(iv) 서열 번호 31에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 32에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 33에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C323 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(v) 서열 번호 39에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 40에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 41에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C321 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(vi) 서열 번호 47에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 48에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 49에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C320 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(vii) 서열 번호 55에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 56에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 57에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1B의 항체 C319 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열);

(viii) 서열 번호 83에 기재된 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호 84에 기재된 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 85에 기재된 서열을 포함하는 CDR3(또는 도 1F의 항체 C320-120 중 굵은체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 서열); 또는

(ix) 서열 번호 188 내지 200 중 어느 하나의 아미노산 23 내지 36을 포함하는 CDR1, 서열 번호 188 내지 200 중 어느 하나의 아미노산 52 내지 58을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호 188 내지 200 중 어느 하나의 아미노산 91 내지 100을 포함하는 CDR3.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기와 같은 CDR을 포함하는 V_L을 포함한다:

(i) 서열 X₁X₂SSSDIGAGLGVH(서열 번호 139)(여기서, X₁은 알라닌 또는 트레오닌이고, X₂는 글리신 또는 세린이다)를 포함하는 CDR1(또는 도 9C에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR1로 표지된 서열); 및

(ii) 서열 번호 140에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및

(iii) 서열 번호 141에 기재된 서열을 포함하는 CDR3.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기를 추가로 포함한다:

(i) 서열 번호 148에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR1;

(ii) 서열 번호 149에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR2;

(iii) 서열 번호 150에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR3; 및

(iv) 서열 번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR4.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기를 포함한다:

(ii) 서열 번호 139에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

(iii) 서열 번호 149에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR2;

(iv) 서열 번호 140에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

(v) 서열 번호 150에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR3;

(vi) 서열 번호 141에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 및

(vii) 서열 번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR4.

일례에서, CDR은 강화된 코티아 번호매김 체계에 따라 정의된다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 도 1B에서 항체 336, 334, 333, 323, 321, 320 또는 319, 또는 도 1F에서 항체 C320-120, 또는 도 1H 및 도 9에서 "컨센서스"로 표지된 서열의 밑줄체의 CDR 1, 2 및 3으로 표지된 CDR을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, 항원 결합 도메인은 하기 가변 영역 쌍 중 하나의 6개의 CDR을 포함한다:

일례에서, 항원 결합 도메인은 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하는 항체의 6개의 CDR을 포함하며, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함한다:

(i) V_H는 서열 번호 42의 16번 위치에 알라닌을 포함하거나;

(ii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(iii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(iv) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(v) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(vi) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(vii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(viii) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(ix) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(x) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xi) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xiii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xiv) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xv) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xvi) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xvii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xviii) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xix) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xx) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxi) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxiii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxiv) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxv) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxvi) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxvii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxviii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxix) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxx) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxi) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxiii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxiv) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxv) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxvi) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxvii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxviii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxxix) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xl) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xli) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xliii) V_H는 서열 번호 42의 104번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xliv) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlv) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlvi) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlvii) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlviii) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xlix) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(l) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(li) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(liii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(liv) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 히스티딘을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lv) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 류신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lvi) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 아스파르트산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lvii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 티로신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lviii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 프롤린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lix) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 글루타민을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lx) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 리신을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxi) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 23번 위치에 알라닌을 포함하거나;

(lxii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 28번 위치에 아스파르트산을 포함하거나;

(lxiii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 33번 위치에 티로신을 포함하거나;

(lxiv) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 34번 위치에 아스파르트산을 포함하거나;

(lxv) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 53번 위치에 아스파라긴을 포함하거나;

(lxvi) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 54번 위치에 세린을 포함하거나;

(lxvii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 82번 위치에 알라닌을 포함하거나;

(lxviii) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 95번 위치에 세린을 포함하거나;

(lxix) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 96번 위치에 세린을 포함하거나;

(lxx) V_H는 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxi) V_H는 서열 번호 42의 47번 위치에 세린을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 23번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산 및 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxiii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxiv) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxv) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxvi) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxvii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxviii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxix) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxx) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하거나;

(lxxxi) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하거나; 또는

(xxiii) 서열 번호 187에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 200에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 또는

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기 6개의 CDR을 포함한다:

(ii) 서열 WX₁NPNSGNTGYAQKFQG(서열 번호 142)(여기서, X₁은 메티오닌 또는 류신이다)를 포함하는 CDR2(또는 도 1E에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR2로 표지된 서열); 및

(iii) 서열 EVPX₁TAX₂FEY(서열 번호 143)(여기서, X₁은 아스파르트산 또는 글루탐산이고, X₂는 세린 또는 알라닌이다)를 포함하는 CDR3(또는 도 9B에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR3으로 표지된 서열), 또는 서열 EX₁PX₂X₃AX₄FX₅Y(서열 번호 235)(여기서,

X₅는 알라닌, 세린, 히스티딘, 류신, 아스파르트산, 프롤린, 글루타민, 글루탐산 또는 리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다);

(iv) 서열 X₁X₂SSSDIGAGLGVH(서열 번호 139)(여기서, X₁은 알라닌 또는 트레오닌이고, X₂는 글리신 또는 세린이다)를 포함하는 CDR1(또는 도 9C에서 "컨센서스"로 표지된 서열 중 굵은체의 CDR1로 표지된 서열);

(v) 서열 번호 48에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및

(vi) 서열 번호 49에 기재된 서열을 포함하는 CDR3.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기 V_H 또는 V_L을 포함한다:

(a) (i) 서열 번호 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR1;

(ii) 서열 번호 43에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

(iv) 서열 번호 142에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;

(vii) 서열 번호 147에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 FR4를 포함하는 V_H; 및

(b) (i) 서열 번호 148에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR1;

(ii) 서열 번호 139에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

(iv) 서열 번호 48에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

(vi) 서열 번호 49에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 CDR3; 및

(vii) 서열 번호 151에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 FR4를 포함하는 V_L.

일례에서, CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라 정의된다. 카바트 번호매김 체계에 따라 정의된 예시적인 CDR은 상기 기술되어 있고/거나, 도 1A 내지 1H, 9B 또는 9C에 굵은체의 CDR1 내지 3으로 표지되어 있고, 본 개시내용의 본 실시예를 준용한다는 것을 이해하여야 한다.

일례에서, CDR은 강화된 코티아 번호매김 체계에 따라 정의된다. 강화된 코티아 번호매김 체계에 따라 정의된 예시적인 CDR은 상기 기술되어 있고/거나, 도 1A 내지 1H에 굵은체의 CDR1 내지 3으로 표지되어 있고, 본 개시내용의 본 실시예를 준용한다는 것을 이해하여야 한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 항체의 가변 영역을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 86, 90, 94, 137, 152, 154 내지 162, 173, 175 내지 187 또는 234 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 또는 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일례에서, V_H는 서열 번호 26, 34, 42 또는 94 중 어느 하나에 기재된 서열, 또는 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일례에서, V_H는 서열 번호 42, 175 내지 181, 183 또는 185 내지 187 중 어느 하나에 기재된 서열, 또는 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 94, 137, 152, 162 또는 173에 기재된 서열을 포함하는 V_H를 포함한다. 일례에서, V_H는 서열 번호 42, 58, 66, 70, 74, 78, 86 또는 90 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 일례에서, V_H는 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하고, 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 V_H를 포함한다:

(i) 서열 번호 42의 16번 위치에 알라닌;

(ii) 서열 번호 42의 100번 위치에 알라닌;

(iii) 서열 번호 42의 100번 위치에 세린;

(iv) 서열 번호 42의 100번 위치에 히스티딘;

(v) 서열 번호 42의 100번 위치에 류신;

(vi) 서열 번호 42의 100번 위치에 아스파르트산;

(vii) 서열 번호 42의 100번 위치에 티로신;

(viii) 서열 번호 42의 100번 위치에 프롤린;

(ix) 서열 번호 42의 100번 위치에 글루타민;

(x) 서열 번호 42의 100번 위치에 리신;

(xi) 서열 번호 42의 101번 위치에 알라닌;

(xii) 서열 번호 42의 101번 위치에 세린;

(xiii) 서열 번호 42의 101번 위치에 히스티딘;

(xiv) 서열 번호 42의 101번 위치에 류신;

(xv) 서열 번호 42의 101번 위치에 아스파르트산;

(xvi) 서열 번호 42의 101번 위치에 티로신;

(xvii) 서열 번호 42의 101번 위치에 글루타민;

(xviii) 서열 번호 42의 101번 위치에 리신;

(xix) 서열 번호 42의 102번 위치에 알라닌;

(xx) 서열 번호 42의 102번 위치에 세린;

(xxi) 서열 번호 42의 102번 위치에 히스티딘;

(xxii) 서열 번호 42의 102번 위치에 류신;

(xxiii) 서열 번호 42의 102번 위치에 티로신;

(xxiv) 서열 번호 42의 102번 위치에 프롤린;

(xxv) 서열 번호 42의 102번 위치에 글루타민;

(xxvi) 서열 번호 42의 102번 위치에 리신;

(xxvii) 서열 번호 42의 103번 위치에 알라닌;

(xxviii) 서열 번호 42의 103번 위치에 세린;

(xxix) 서열 번호 42의 103번 위치에 히스티딘;

(xxx) 서열 번호 42의 103번 위치에 류신;

(xxxi) 서열 번호 42의 103번 위치에 아스파르트산;

(xxxii) 서열 번호 42의 103번 위치에 티로신;

(xxxiii) 서열 번호 42의 103번 위치에 프롤린;

(xxxiv) 서열 번호 42의 103번 위치에 글루타민;

(xxxv) 서열 번호 42의 103번 위치에 리신;

(xxxvi) 서열 번호 42의 104번 위치에 세린;

(xxxvii) 서열 번호 42의 104번 위치에 히스티딘;

(xxxviii) 서열 번호 42의 104번 위치에 류신;

(xxxix) 서열 번호 42의 104번 위치에 아스파르트산;

(xl) 서열 번호 42의 104번 위치에 티로신;

(xli) 서열 번호 42의 104번 위치에 프롤린;

(xlii) 서열 번호 42의 104번 위치에 글루타민;

(xliii) 서열 번호 42의 104번 위치에 리신;

(xliv) 서열 번호 42의 105번 위치에 알라닌;

(xlv) 서열 번호 42의 105번 위치에 히스티딘;

(xlvi) 서열 번호 42의 105번 위치에 류신;

(xlvii) 서열 번호 42의 105번 위치에 아스파르트산;

(xlviii) 서열 번호 42의 105번 위치에 티로신;

(xlix) 서열 번호 42의 105번 위치에 프롤린;

(l) 서열 번호 42의 105번 위치에 글루타민;

(li) 서열 번호 42의 105번 위치에 리신;

(lii) 서열 번호 42의 107번 위치에 알라닌;

(liii) 서열 번호 42의 107번 위치에 세린;

(liv) 서열 번호 42의 107번 위치에 히스티딘;

(lv) 서열 번호 42의 107번 위치에 류신;

(lvi) 서열 번호 42의 107번 위치에 아스파르트산;

(lvii) 서열 번호 42의 107번 위치에 티로신;

(lviii) 서열 번호 42의 107번 위치에 프롤린;

(lix) 서열 번호 42의 107번 위치에 글루타민;

(lx) 서열 번호 42의 107번 위치에 리신;

(lxi) 서열 번호 42의 41번 위치에 트레오닌;

(lxii) 서열 번호 42의 47번 위치에 세린;

(lxiii) 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌;

(lxvi) 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌; 또는

(lxvii) 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 113, 114, 115, 117, 118 또는 222 내지 227 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그와 약 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H를 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 106 또는 222 또는 227에 기재된 서열 또는 그와 약 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_H를 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 82, 95, 138, 153, 163 또는 174 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 V_L, 또는 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 일례에서, V_L은 서열 번호 30, 38, 46, 188 내지 194, 196 또는 198 내지 200 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 95, 138, 153, 163 또는 174에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46, 62 또는 82 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하고, 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 V_L을 포함한다:

(i) 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌;

(ii) 서열 번호 46의 23번 위치에 트레오닌;

(iii) 서열 번호 46의 28번 위치에 아스파라긴;

(iv) 서열 번호 46의 33번 위치에 티로신;

(v) 서열 번호 46의 34번 위치에 아스파르트산;

(vi) 서열 번호 46의 53번 위치에 아스파라긴;

(vii) 서열 번호 46의 54번 위치에 세린;

(viii) 서열 번호 46의 82번 위치에 알라닌;

(ix) 서열 번호 46의 95번 위치에 세린;

(x) 서열 번호 46의 96번 위치에 세린;

(xiii) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산;

(xiv) 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글리신; 또는

(xv) 상기 중 어느 하나와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 116 또는 228 내지 233 중 어느 하나에 기재된 서열 또는 그와 약 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 107 또는 228 내지 233에 기재된 서열 또는 그와 약 80% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산에 의해 코딩된 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 임의적으로 중쇄 불변 영역 또는 Fc 또는 중쇄 불변 도메인 (C_H)2 및/또는 C_H3, 또는 면역 효과기 세포에 결합하는 단백질에 연결된 도메인 항체이다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 적어도 V_H 및 V_L을 포함하며, 여기서, V_H 및 V_L은 결합하여 항원 결합 도메인을 포함하는 Fv를 형성한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 하기 V_H 및 V_L 쌍 중 어느 하나를 포함한다:

일례에서, TL1a 결합 단백질은 하기 V_H 및 V_L 쌍 중 어느 하나를 포함한다:

(ii) 서열 번호 34에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 38에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열 번호 175에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 188에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열 번호 177에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 190에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vii) 서열 번호 178에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 191에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열 번호 179에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 192에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열 번호 180에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 193에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(x) 서열 번호 181에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 194에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xi) 서열 번호 183에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 196에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xii) 서열 번호 185에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 198에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(xiii) 서열 번호 186에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 199에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 또는

(xiv) 서열 번호 187에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 200에 기재된 서열을 포함하는 V_L.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 94에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 137에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 138에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 152에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 153에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 173에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 174에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

(i) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ii) 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iii) 서열 번호 66에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(iv) 서열 번호 70에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(v) 서열 번호 74에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vi) 서열 번호 78에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(vii) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 82에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(viii) 서열 번호 86에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(ix) 서열 번호 90에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L; 또는

(x) 서열 번호 58에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 62에 기재된 서열을 포함하는 V_L.

예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하고, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함한다:

(i) V_H는 서열 번호 42의 16번 위치에 알라닌을 포함하거나;

(iv) V_H는 서열 번호 42의 100번 위치에 히스티딘을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xv) V_H는 서열 번호 42의 101번 위치에 아스파르트산을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 류신을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxiii) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 티로신을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxvi) V_H는 서열 번호 42의 102번 위치에 리신을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(xxvii) V_H는 서열 번호 42의 103번 위치에 알라닌을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하고, V_L은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

일례에서, V_H 및 V_L은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 존재한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은:

(i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv: single chain Fv fragment);

(ii) 이량체(dimeric) scFv(디scFv);

(iii) 중쇄 불변 영역 또는 Fc 또는 중쇄 불변 도메인 (C_H)2 및/또는 C_H3에 연결된 (i) 또는 (ii) 중 하나; 또는

(iv) 면역 효과기 세포에 결합하는 단백질에 연결된 (i) 또는 (ii) 중 하나이다.

또 다른 일례에서, V_H 및 V_L은 별개의 폴리펩티드 쇄 중에 존재한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은

(i) 디아바디;

(ii) 트리아바디;

(iii) 테트라바디;

(iv) Fab;

(v) F(ab')₂;

(vi) Fv;

(vii) 중쇄 불변 영역 또는 Fc 또는 중쇄 불변 도메인 (C_H)2 및/또는 C_H3에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나; 또는

(viii) 면역 효과기 세포에 결합하는 단백질에 연결된 (i) 내지 (vi) 중 하나이다.

본 개시내용의 예시적인 형태에서, TL1a 결합 단백질은 항체이다.

예시적인 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 키메라인, 탈면역화된, 인간화된, 인간의, 합성 인간화된(synhumanized) 또는 영장류화된 것이다.

일례에서, 본 개시내용은 항원 결합 도메인이 TL1a에 특이적으로 결합하고, 여기서, 항체는 TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않고, 항원 결합 도메인은 하기 중 어느 하나를 포함하는 것인, 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 제공한다:

일례에서, 항체는 하기 V_H 및 V_L 쌍 중 어느 하나를 포함한다:

일례에서, 항체는 서열 번호 94에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 95에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 42의 V_H 및 서열 번호 46의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 175의 V_H 및 서열 번호 188의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 176의 V_H 및 서열 번호 189의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 177의 V_H 및 서열 번호 190의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 178의 V_H 및 서열 번호 191의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 179의 V_H 및 서열 번호 192의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 180의 V_H 및 서열 번호 193의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 181의 V_H 및 서열 번호 194의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 183의 V_H 및 서열 번호 196의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 185의 V_H 및 서열 번호 198의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 186의 V_H 및 서열 번호 199의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 187의 V_H 및 서열 번호 200의 V_L을 포함하는 TL1a 결합 항체를 제공한다.

상기 목록에 기재된 항체는 하기 이점들 중 하나 이상의 이점을 제공한다:

(i) 본원에 기술된 방법에 의해 측정된 바, TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않거나;

(ii) TL1a 결합 단백질 부재하에서의 아폽토시스 수준과 비교하여, 약 2 nM 미만(예컨대, 약 1.5 nM 또는 1.2 nM 또는 1.1 nM 미만; 또는 1 nM 이하)의 EC₅₀으로 TF-1 세포의 아폽토시스 수준(예컨대, 약 7x10⁴개의 세포-8x10⁴개의 세포(예컨대, 7.5x10⁴개의 세포))을 감소시키거나;

(iii) 약 2x10⁵ 내지 3x10⁵개의 세포(예컨대, 2.5x10⁵개의 세포)를 이용하여 수행되는 유세포 측정법을 사용함으로써 평가된 바, 약 10 nM 미만, 예컨대, 약 5 nM 또는 3nM 또는 2nM 미만의 EC₅₀으로 세포 표면 상의 TL1a에 결합한다.

일례에서, 항체는 서열 번호 137에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 138에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 152에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 153에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 162에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 172에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 163에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 174에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

예를 들어, 항체는 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H, 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하고, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함한다:

(i) V_H는 서열 번호 42의 16번 위치에 알라닌을 포함하거나;

(li) V_H는 서열 번호 42의 105번 위치에 리신을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 알라닌을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lv) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 류신을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lviii) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 프롤린을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lix) V_H는 서열 번호 42의 107번 위치에 글루타민을 포함하고, VL은 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxvii) VH는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(lxxxii) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, 각각 서열 번호 42와 비교하여 V_L은 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글리신을 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgM, IgE 및 IgA로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 비인간 영장류 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 예시적인 중쇄 면역글로불린 불변 영역은 IgG 불변 영역, 예컨대, IgG1 불변 영역, 예컨대, 인간 IgG1 불변 영역이다. 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역은 서열 번호 134에 기재된 서열을 포함하는 FC 영역을 포함한다. 일례에서, 인간 또는 비인간 영장류 중쇄 면역글로불린 불변 영역은 C 말단 리신 잔기를 포함하지 않는다.

또 다른 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 카파 또는 람다로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 또는 비인간 영장류 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 135(카파) 또는 서열 번호 136(람다)에 기재된 서열을 포함하는 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 코딩하는 단리된 또는 재조합 핵산, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 제공한다. 이와 관련하여, 본 개시내용은 본원에 기술된 특정의 예시된 핵산으로 제한되는 것은 아니며, 또한 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 코딩하는 임의의 핵산도 포함한다. 예를 들어, 핵산은 특정 세포 유형에서 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 96 내지 118 중 어느 하나에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 102에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 103에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 102에 기재된 서열, 및 서열 번호 103에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 104에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 105에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 104에 기재된 서열, 및 서열 번호 105에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 106에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 107에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 106에 기재된 서열, 및 서열 번호 107에 기재된 서열, 또는 그와 약 80% 이상의 동일성을 가지는 서열, 또는 중간 정도 또는 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 서열을 포함한다.

일례에서, 핵산은 서열 번호 106, 107 또는 222 내지 233 중 어느 하나에 기재된 서열과 95% 이상 동일한 서열, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산을 포함한다.

일례에서, 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 서열 번호 106에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 107에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(ii) 서열 번호 222에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(iii) 서열 번호 223에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(iv) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 229에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(v) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(vi) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 231에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(vii) 서열 번호 224에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 228에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(viii) 서열 번호 225에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(ix) 서열 번호 226에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 230에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(x) 서열 번호 226에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 232에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산;

(xi) 서열 번호 227에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 232에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산; 또는

(xii) 서열 번호 227에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산 및 서열 번호 233에 기재된 서열과 약 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 핵산, 또는 중간 정도 내지 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화하는 핵산.

예시적인 핵산의 서열 및 그의 조합은 하기 표 1에 기재되어 있고, 이는 각각의 개별 서열 및 그의 조합을 문자 표현 방식으로 지원하는 것임을 이해하여야 한다.

일례에서, 상기 핵산은 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 발현 구성물(construct)에 포함되어 있다. 상기 발현 구성물은 벡터, 예컨대, 플라스미드 중에 있을 수 있다.

단일 폴리펩티드 TL1a 결합 단백질에 대한 본 개시내용의 일례에서, 발현 구성물은 상기 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산에 연결된 프로모터를 포함할 수 있다.

TL1a 결합 단백질을 형성하는 다중의 폴리펩티드에 대한 예에서, 본 개시내용의 발현 구성물은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드(예컨대, V_H를 포함하는 것) 중 하나를 코딩하는 핵산, 및 프로모터에 작동가능하게 연결된, 폴리펩티드(예컨대, V_L을 포함하는 것) 중 하나를 코딩하는 핵산을 포함한다.

또 다른 일례에서, 발현 구성물은 이시스트론성 발현 구성물, 예컨대, 5'→3' 순서로 작동가능하게 연결된 하기의 성분을 포함하는 것이다:

(i) 프로모터

(ii) 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

(iii) 내부 리보좀 진입 부위; 및

(iv) 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.

예를 들어, 제1 폴리펩티드는 V_H를 포함하고, 제2 폴리펩티드는 V_L을 포함하거나, 또는 제1 폴리펩티드는 V_L을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 V_H를 포함한다.

본 개시내용은 또한 제1 폴리펩티드(예컨대, V_H를 포함하는 것)를 코딩하는 것 하나와, 제2 폴리펩티드(예컨대, V_L을 포함하는 것)를 코딩하는 또 다른 하나인 것인, 별개의 발현 구성물을 고려한다. 예를 들어, 본 개시내용은 또한

(i) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, 프로모터에 작동가능하게 연결된, V_H를 포함하는 것을 코딩하는 핵산)을 포함하는 제1 발현 구성물; 및

(ii) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, 프로모터에 작동가능하게 연결된, V_L을 포함하는 것을 코딩하는 핵산)을 포함하는 제2 발현 구성물을 포함하는 조성물로서, 여기서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 회합되어 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 형성하는 것인 조성물을 제공한다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 발현하는 단리된 세포, 또는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 발현하도록 유전자 변형된 재조합 세포를 제공한다.

일례에서, 세포는 본 개시내용의 발현 구성물, 또는

(ii) 폴리펩티드를 코딩하는 핵산(예컨대, 프로모터에 작동가능하게 연결된, V_L을 포함하는 것을 코딩하는 핵산)을 포함하는 제2 발현 구성물을 포함하며, 여기서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 회합되어 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 형성한다.

본 개시내용의 세포의 예는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 포유동물 세포이다.

본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 방법은 TL1a 결합 단백질이 제조될 수 있는 충분한 조건하에 본 개시내용의 발현 구성물(들)을 유지시키는 것을 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 제조하는 방법은 단백질이 제조되고, 임의적으로는 분비될 수 있는 충분한 조건하에서 본 개시내용의 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 제조하는 방법은 추가로 단백질을 단리시키는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 또는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물 또는 세포, 및 적합한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일례에서, 조성물은 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질 및 적합한 담체를 포함한다. 일례에서, 담체는 제약상 허용되는 것이고, 예컨대, 조성물은 제약 조성물이다.

본 개시내용은 또한 세포, 조직, 장기 또는 피험체에게 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 장기 또는 피험체에서 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일례에서, 본 개시내용은 피험체에게 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이와 관련하여, 병태를 예방하는 방법은 재발 완화성 형태를 가지는 병태, 예컨대, 다발성 경화증의 재발을 예방할 수 있고, 예컨대, 단백질은 완화 동안 투여됨으로써 재발을 예방할 수 있다.

본 개시내용은 또한 피험체에게 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 혈관형성을 유도 또는 증진시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 의약으로서의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 또한 피험체에서 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)의 증상을 치료 또는 예방하기 위한, 또는 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)를 치료 또는 예방하기 위한 또는 혈관형성을 유도 또는 증진시키기 위한 약제의 제조에서 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 또는 세포의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 또한 피험체에서 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)의 증상을 치료 또는 예방하는 데, 또는 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)를 치료 또는 예방하는 데 또는 혈관형성을 유도 또는 증진시키는 데 사용하기 위한 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 또는 세포를 제공한다.

일례에서, 본 개시내용의 치료 또는 예방 방법은 추가로 예컨대, 본원에 기술된 방법을 수행함으로써 병태를 진단하는 단계를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 치료 또는 예방 방법은 추가로 피험체에서 TL1a의 수준을 검출하는 단계, 및 TL1a의 수준이 유의적으로 감소되지 않았거나, 병태와 관련되지 않은 수준으로까지 감소되지 않았다면, 추가 용량의, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 또한 세포, 조직, 장기 또는 피험체에게 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 핵산, 발현 구성물, 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 세포, 조직, 장기 또는 피험체에서 세포, 조직, 장기 또는 피험체에서 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키는 (및 일례에서, TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는) 방법을 제공한다. 일례에서, 피험체는 병태(예컨대, TL1a 매개 병태)를 앓는 피험체이다.

본 개시내용은 또한 항원-단백질 복합체가 형성되도록 시료를 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질과 접촉시키는 단계 및 복합체를 검출하는 단계를 포함하고, 복합체의 검출이 시료 중 TL1a를 나타내는 것인, 시료 중 TL1a를 검출하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 피험체에서 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 검출하는 단계를 포함하고, 단백질은 검출가능한 표지에 컨쥬게이트되어 있는 것인, 피험체에서 TL1a를 검출하는 방법을 제공한다. 일례에서, 본 방법은 단백질을 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 또한 피험체로부터의 시료 중 TL1a를 검출하는 본 개시내용의 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 시료 중 TL1a의 검출이 TL1a 매개 병태를 나타내는 것인, 피험체에서 TL1a 매개 병태를 진단하는 방법을 제공한다.

일례에서, 본 방법은 시료 중 TL1a의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 대조군 시료와 비교하여 시료 중 TL1a의 수준의 증가 또는 감소가 TL1a 매개 병태를 나타내는 것인 단계를 포함한다.

일례에서, TL1a를 검출하거나, 병태를 진단/예후하는 방법의 결과를 예컨대, 지면 또는 기계 판독가능한 형태로 제공된다.

본 개시내용은 또한 TL1a를 검출하거나, 병태를 진단/예후하는, 본 개시내용의 방법의 결과를 수득하는 단계, 치료학적 또는 예방학적 조성물을 투여하는 단계, 또는 상기 투여를 권고하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일례에서, 조성물은 본 개시내용의 조성물이다.

치료, 예방, 진단 또는 예후하고자 하는 예시적인 병태는 T_H17 매개 병태, 염증성 병태, 자가면역 병태 또는 불충분한 혈관형성과 관련이 있거나, 그에 의해 유발되는 병태이다. 적합한 병태는 본원에 기술되어 있다.

일례에서, 치료, 예방, 진단 또는 예후하고자 하는 병태는 자가면역 질환이다. 예를 들어, 병태는 포도막염, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병, 과민성 장 증후군, 류마티스 관절염, 다발성 관절염, 다발성 경화증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이다.

일례에서, 병태는 염증성 장 병태, 예컨대, 대장염, 예컨대, 궤양성 대장염 또는 크론병이다.

본 개시내용은 또한 서열 번호 202의 32번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나 85번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 TL1a 뮤테인에 TL1a 결합 단백질의 결합을 허용하기에 충분한 조건하에서 복수의 TL1a 결합 단백질을 뮤테인에 접촉시켜 TL1a 결합 단백질-TL1a 뮤테인 복합체 및 TL1a 뮤테인에 결합하지 않는 고갈된 복수의 TL1a 결합 단백질을 형성하는 단계, 및

고갈된 복수의 TL1a 결합 단백질로부터 TL1a 뮤테인에 결합하지 않는 TL1a 결합 단백질을 수집하는 단계로서, 수집된 TL1a 결합 단백질이 TL1a에 특이적으로 결합하고 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키며 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는 것인 단계

를 포함하는, TL1a에 특이적으로 결합하고 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키고 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는 TL1a 결합 단백질을 복수의 TL1a 결합 단백질로부터 선별하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 또한 복수의 TL1a 결합 단백질로부터 서열 번호 202의 32번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나 85번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 TL1a 뮤테인에 결합하지 않는 하나 이상의 TL1a 결합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, TL1a에 특이적으로 결합하고 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키고 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는 TL1a 결합 단백질을 복수의 TL1a 결합 단백질로부터 단리하는 방법을 제공한다.

복수의 TL1a 결합 단백질은 항체 또는 항원 결합 도메인의 라이브러리, 예컨대, 파지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 또는 효모 디스플레이 라이브러리에 존재할 수 있다. 복수의 TL1a 결합 단백질은 항혈청에 존재할 수 있다. 복수의 TL1a 결합 단백질은 하이브리도마 배양물 상청액에 존재할 수 있다.

본 개시내용은 또한 32번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있고/거나, 85번 아미노산 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 서열 번호 202에 기재된 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

도 1A 내지 1H는 항체의 가변 영역 서열을 보여주는 다이어그램 대표도이다. 도 1D 내지 1H에 제시된 정렬에서, 임의의 동일한 아미노산은 마침표 , 즉 "."로 표시되어 있다. 도 1A는 인간 항TL1a 항체의 V_H 영역의 서열을 나타낸다. 도 1B는 인간 항TL1a 항체의 V_L 영역의 서열을 나타낸다. 도 1C는 항TL1a 항체 C320 및 그의 일부 유도체의 V_H 영역의 서열을 나타낸다. 도 1D는 C320의 V_H CDR 1, 2, 및 3이 이식되어 있는, 선택된 인간 항체의 V_H 영역의 정렬을 나타낸다. 도 1E는 C320의 유도체의 V_H 영역의 컨센서스 서열을 나타낸다. 도 1F는 항TL1a 항체 C320 및 그의 유도체의 V_L 영역의 서열을 나타낸다. 도 1G는 C320의 V_L CDR 1, 2, 및 3이 이식되어 있는, 항체의 인간 V_L 서열의 정렬을 나타낸다. 도 1H는 C320의 유도체의 V_L 영역의 컨센서스 서열을 나타낸다. 박스로 표시된 영역은 카바트 번호매김 체계 및 강화된 코티아 번호매김 체계에 의해 정의된 바와 같은 (표시된 바와 같은) CDR을 포함한다. 카바트 번호매김 체계에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 굵은체로 표시되어 있다. 강화된 코티아 번호매김 체계에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 밑줄체로 표시되어 있다.
도 2는 일정 범위의 항TL1a 항체의 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스를 억제시킬 수 있는 능력을 입증하는 효능 검정법의 결과를 보여주는 그래프 대표도이다. TF-1 세포 중에서 TL1a 유도성 아폽토시스를 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 5 ㎍/ml의 항TL1a 항체를 스크리닝하였다.
도 3은 고도로 강력한 항TL1a 항체를 확인하는 검정법의 결과를 나타낸 그래프 대표도이다. 도시된 결과는 다양한 농도의 테스트 항체(테스트된 최대 농도 5 ㎍/mL)에서 달성된 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스의 억제 수준을 보여주는 것이다. 상기 수준을 통해 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스의 억제를 위한 항TL1a 항체의 EC₅₀을 측정할 수 있으며, 이로써 상대 효능에 기초하여 기능을 비교할 수 있다.
도 4A는 다양한 농도의 테스트 항체(테스트된 최대 농도 25 ㎍/mL)에서 달성된 TL1a와 DR3의 상호작용 억제 수준을 보여주는 그래프 대표도이다. 항체 C320, C321 및 C323은 다수의 농도에서 TL1a와 DR3 사이의 상호작용을 억제시켰다.
도 4B는 다양한 농도의 테스트 항체(테스트된 최대 농도 25 ㎍/mL)에서 달성된 TL1a와 DcR3의 상호작용 억제 수준을 보여주는 그래프 대표도이다. 항체 C320, C321 및 C323은 10 ㎍/mL 이하의 항체 농도에서는 TL1a와 DcR3 사이의 상호작용을 검출가능할 정도로 억제시키지는 못했다.
도 4C는 다양한 농도의 테스트 항체(테스트된 최대 농도 10 ㎍/mL)에서 달성된 TL1a와 DR3의 상호작용 억제 수준을 보여주는 그래프 대표도이다. 항체 C320-0, C320-168 및 C320-179는 다수의 농도에서 TL1a와 DR3 사이의 상호작용을 억제시켰다. 항체 1B4 및 C300-25는 비교 목적으로 포함시켰다.
도 4D는 다양한 농도의 테스트 항체(테스트된 최대 농도 100 ㎍/mL)에서 달성된 TL1a와 DcR3의 상호작용 억제 수준을 보여주는 그래프 대표도이다. 항체 C320-0, C320-168 및 C320-179는 TL1a와 DcR3 사이의 상호작용을 검출가능할 정도로 억제시키지는 못했다. 항체 1B4 및 C300-25는 다양한 농도에서 TL1a와 DcR3 사이의 상호작용을 억제시켰고, 이는 비교 목적으로 포함시켰다.
도 5A는 다양한 농도의 테스트 항체의 가용성 인간 TL1a(서열 번호 202; 상단 패널) 및 32번 아르기닌 잔기가 알라닌을 치환된 가용성 인간 TL1a(R32A 뮤테인, 하단 패널)에의 결합을 보여주는 2개의 그래프 대표도를 포함한다. 항체 C320-0, C320-168 및 C320-179는 모두 다양한 농도에서 TL1a에 결합하였지만, R32A 뮤테인 TL1a에는 결합하지 않았다. (US20090280116에 기술되어 있는) 항TL1a 항체 1B4 및 16H2는 다양한 농도에서 TL1a 및 R32A 뮤테인 TL1a, 둘 모두에 결합하였다. 이소타입 대조군 항체는 어느 형태의 TL1a에도 결합하지 않았다.
도 5B는 다양한 농도의 테스트 항체의, 85번 아르기닌 잔기가 알라닌을 치환된 가용성 인간 TL1a(R85A 뮤테인, 상단 패널), 및 32번 및 85번 아르기닌 잔기가 알라닌을 치환된 가용성 인간 TL1a(R32A+R85A 뮤테인, 하단 패널)에의 결합을 보여주는 그래프 대표도를 포함한다. 항체 C320-0, C320-168 및 C320-179는 R85A 또는 R32A+R85A 뮤테인 TL1a, 어느 것에도 결합하지 않았다. (US20090280116에 기술되어 있는) 항TL1a 항체 1B4 및 16H2는 다양한 농도에서 R85A 또는 R32A+R85A 뮤테인 TL1a, 둘 모두에 결합하였다. 이소타입 대조군 항체는 어느 형태의 TL1a에도 결합하지 않았다.
도 5C는 1 ㎍/ml 농도의 가용성 인간 TL1a, R32A 뮤테인 TL1a 및 R85A 뮤테인 TL1a의, 8R32A 뮤테인 TL1a 및 R85A 뮤테인 TL1a에의 결합을 보여주는 그래프 대표도를 포함한다. TL1a는 두 수용체 모두에 동일하게 잘 결합하였다. R32A 및 R85A 뮤테인 TL1a는 TL1a와 유사한 정도로 DcR3에 결합하였지만, TL1a의 DcR3에의 결합보다 대략 50% 이상 낮은 수준으로 DR3에 결합하였다.
도 5D는 각 단량체 상의 잔기 R32 및 R85가 검은색으로 강조 표시되어 있는, 삼량체인간 TL1a(PDB: 3K51)(회색)의 X선 결정 구조를 도시한 다이어그램 대표도이다.
도 6은 항체 C320, C321, C323 및 1B4이 세포 표면 TL1a에 결합할 수 있는 능력을 보여주는 그래프 대표도이다. 유세포 측정법을 이용하여 결합을 평가하였으며, 결과는 평균 형광 강도(MFI: mean fluorescence intensity)로 제시되어 있다. 이소타입 대조군을 제외한 모든 항체는 TL1a에 결합하였다.
도 7A는 미토겐(콘카나발린 A) 자극성 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)에 의한 세포 표면 TL1a의 생산을 보여주는 그래프 대표도이다. 음영 그래프는 이소타입 대조군 항체를 나타내고, 선 그래프는 키메라 래트/인간 항인간 TL1a에 의해 검출되는 바, 세포 표면 TL1a를 나타낸다.
도 7B는 미토겐(콘카나발린 A) 자극이 증가함에 따른, PBMC에서 분비되는 TL1a 생산 증가를 보여주는 그래프 대표도이다.
도 8A는 내인성 인간 TL1a에 의해 유도되는 인터페론 γ(IFN-γ) 생산을 억제시킬 수 있는 항TL1a 항체(테스트된 최대 농도 50 ㎍/mL)의 능력을 보여주는 그래프 대표도이다. 내인성 TL1a는 자극받은 PBMC에 의한 시토카인 생산을 증진시켰다. 항체 C320 및 C323은 IFN-γ 생산을 억제시켰다. 항체 1B4는 비교 목적으로 포함시켰다.
도 8B는 내인성 인간 TL1a에 의해 유도되는 IL-13 생산을 억제시킬 수 있는 항TL1a 항체(테스트된 최대 농도 50 ㎍/mL)의 능력을 보여주는 그래프 대표도이다. 내인성 TL1a는 자극받은 PBMC에 의한 시토카인 생산을 증진시켰다. 항체 C320 및 C323은 IL-13 생산을 억제시켰다. 항체 1B4는 비교 목적으로 포함시켰다.
도 9A는 상동성이 가장 높은 배선 서열, IGLV1-40*01에 대한 C320의 경쇄 서열의 정렬을 보여주는 다이어그램 대표도이다. 임의의 동일한 아미노산은 마침표, 즉, "."로 표시되어 있다. CDR 영역 중 아미노산 서열의 차이는 동일하다.
도 9B는 본원에서 확인된 항체의 V_H 영역의 정렬을 보여주는 다이어그램 대표도이다.
도 9C는 본원에서 확인된 항체의 V_L 영역의 정렬을 보여주는 다이어그램 대표도이다.
도 9D는 C320-168, C320-163 및 C320-170을 비교하는 등전 포커싱 겔의 결과를 보여주는 사진 대표도 사본이다. C320-168은 C320-163 및 C320-170에 대해 시각화되는 1-2개의 이소폼과 비교하여 5-6개의 상이한 하전된 이소폼을 가진다.
도 9E는 다양한 농도(테스트된 최대 농도 10 ㎍/mL)에서 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스를 중화시킬 수 있는 항체 C320-168, C320-179 및 C320-183의 능력을 보여주는 그래프 대표도이다. 항체 C320-0 및 1B4는 비교용으로 포함시켰다. 모든 항체는 다중 농도에서 TF-1 세포의 TL1a 유도성 아폽토시스를 억제시킨다.
도 10A는 DNBS 유도성 결장염 이후의 경과일수에 따른, 래트에서의 궤양화된 결장의 총 면적(㎠)을 보여주는 그래프 대표도이다. 래트를 항체 C320-168(10 mg/kg), 비히클(음성 대조군)(이는 0 및 4일째), 또는 술파살라진(표준 치료 화합물)으로 0일째로부터의 매일 처리하였다(각 처리군에 대한 결과는 표시된 바와 같다). C320-168은 비히클로 처리된 동물과 비교하여 평균 궤양 면적을 술파살라진과 유사한 정도로까지 감소시켰다.
도 10B는 옥사졸론 유도성 결장염 이후의 경과일수에 따른, 래트에서의 체중 변화(g)를 보여주는 그래프 대표도이다. 래트를 항체 C320-168(10 mg/kg), 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)(이는 0 및 4일째), 또는 술파살라진(SoC(5-ASA); 표준 치료 화합물)(표준 치료 화합물)으로 0일째로부터의 매일 처리하였다(각 처리군에 대한 결과는 표시된 바와 같다). C320-168은 이소타입 대조군 항체와 비교하여 체중 감소를 술파살라진과 유사한 정도로까지 호전시켰다.
도 10C는 옥사졸론 유도성 결장염 이후의 경과일수에 따른, 래트에서의 대변 굳기(DAI - 질환 활성 지수(disease activity index))를 보여주는 그래프 대표도이다. 래트를 항체 C320-168(10 mg/kg), 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)(이는 0 및 4일째), 또는 술파살라진(SoC(5-ASA); 표준 치료 화합물)(표준 치료 화합물)으로 0일째로부터의 매일 처리하였다(각 처리군에 대한 결과는 표시된 바와 같다). C320-168은 이소타입 대조군 항체에 비하여 질환의 임상 징후(대변 굳기)를 개선시켰다.
도 11A는 덱스트란 황산나트륨(DSS: dextran sodium sulphate) 유도성 결장염 이후의 경과일수에 따른, 래트에서의 대변 굳기(DAI - 질환 활성 지수)를 보여주는 그래프 대표도이다. 래트를 질환 유도 후 4일째부터 매주 2회씩 항체 C320-168(10 mg/kg), 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)으로, 또는 질환 유도 후 4일째부터 매일 술파살라진(SoC(5-ASA); 표준 치료 화합물)(표준 치료 화합물)으로 처리하였다(각 처리군에 대한 결과는 표시된 바와 같다). C320-168은 이소타입 대조군 항체와 비교하여 질환의 임상 징후(대변 굳기)를 술파살라진과 유사한 정도로까지 개선시켰다.
도 11B는 DSS 유도성 결장염 이후의 경과일수에 따른, 체중 변화(%)를 보여주는 그래프 대표도이다. 래트를 질환 유도 후 4일째부터 매주 2회씩 항체 C320-168(10 mg/kg), 또는 이소타입 대조군(10 mg/kg)으로, 또는 질환 유도 후 4일째부터 매일 술파살라진(SoC(5-ASA); 표준 치료 화합물)(표준 치료 화합물)으로 처리하였다(각 처리군에 대한 결과는 표시된 바와 같다). C320-168은 이소타입 대조군 항체와 비교하여 체중 감소를 술파살라진과 유사한 정도로까지 개선시켰다.
도 12는 상이한 TL1a 이소폼에의 항체 결합을 확인하는 ELISA 검정법의 결과를 보여주는 그래프 대표도이다. C320-168 및 C320-179, 둘 모두 가용성 절단된 TL1a의 보다 장쇄인 (72-251) 및 보다 단쇄인 (84-251) 이소폼에 결합하였다.

상세한 설명

일반

본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 또는 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계들로 이루어진 군, 또는 물질의 조성물들로 이루어진 군에 대한 언급은 상기 단계들, 물질의 조성물들, 단계들로 이루어진 군들, 또는 물질의 조성물들로 이루어진 군들 하나 및 복수 개(즉, 하나 이상)을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 단수 형태인 "하나"("a", "an") 및 "그"라는 것은 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수의 측면을 포함한다. 예를 들어, "하나("a")"라고 언급하는 것은 단일의 것 뿐만 아니라, 2개 이상의 것을 포함하고; "하나("an")"라고 언급하는 것은 단일의 것 뿐만 아니라, 2개 이상의 것을 포함하고; "그"라고 언급하는 것은 단일의 것 뿐만 아니라, 2개 이상의 것 등을 포함한다.

본원에 기술된 본 개시내용의 각각의 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 각각의 다른 모든 예들을 준용하는 것으로 한다.

당업자는 본원의 개시내용이 구체적으로 기술된 것 이외의 것으로 쉽게 변형 및 수정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 개시내용은 상기와 같은 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 개시내용은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 종합적으로 언급되거나, 또는 지시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물들 모두, 및 상기 단계 또는 특징의 임의의 및 모든 조합 또는 상기 단계 또는 특징 중 임의의 2가지 이상을 포함한다.

본 개시내용은 본원에 기술된 특정 일례로 범주를 제한하고자 하는 것은 아니며, 그러한 일례는 단지 예시를 목적으로 하는 것이다. 기능상 등가인 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 범주 내에 명백하게 포함된다.

본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 과도한 실험 없이, 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 중 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성, 및 면역학에서의 종래 기법을 사용함으로써 수행된다. 그러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III]; [Benny K.C.Lo, Antibody Engineering: Methods and Protocols, (2004) Humana Press, Vol. 248]; [DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford(텍스트 전문)]; [Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford(텍스트 전문), 및 특히, 본 문헌내 (Gait)의 논문 ppl-22]; [Atkinson et al., pp35-81]; [Sproat et al., pp 83-115]; 및 [Wu et al., pp 135-151]; [4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford(텍스트 전문)]; [Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford(텍스트 전문)]; [Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; [Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)(시리즈 전체)]; [J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)]; [Sakakibara Biochem. Biophys. Res. Commun. 73: 336-342, 1976]; [Merrifield J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963]; [Barany and Merrifield (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wiinsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Mueler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart]; [Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg]; [Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg]; [Bodanszky Int. J. Peptide Protein Res. 25: 449-474, 1985]; [Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)]; 및 [Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970(텍스트 전문)]에 기술되어 있다.

"및/또는"이라는 용어, 예컨대, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, 상기 2가지 의미 모두, 또는 그 중 하나의 의미를 명확하게 지원하는 것으로 이해되어야 된다.

본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다"("comprise")라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다"("comprises") 또는 "포함하는"이라는 파생어는 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들로 이루어진 군을 배제시키는 것이 아니라, 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계들로 이루어진 군을 포함한다는 암시하는 것으로 이해될 것이다.

서열 목록에 관한 풀이

서열 번호 1: N 말단 HIS 및 FLAG 태그를 포함하는 인간 TL1a의 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 2: C336 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 3: C336 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 4: C336 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 5: C336 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 6: C336 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 7: C336 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 8: C336 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 9: C336 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 10: C334 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 11: C334 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 12: C334 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 13: C334 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 14: C334 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 15: C334 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 16: C334 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 17: C334 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 18: C333 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 19: C333 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 20: C333 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 21: C333 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 22: C333 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 23: C333 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 24: C333 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 25: C333 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 26: C323 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 27: C323 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 28: C323 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 29: C323 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 30: C323 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 31: C323 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 32: C323 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 33: C323 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 34: C321 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 35: C321 HCDR1의 아미노산 서열

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서열 번호 37: C321 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 38: C321 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 39: C321 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 40: C321 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 41: C321 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 42: C320 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 43: C320 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 44: C320 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 45: C320 HCDR3의 아미노산 서열

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서열 번호 49: C320 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 50:: C319 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 51:: C319 HCDR1의 아미노산 서열

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서열 번호 54: C319 VL의 아미노산 서열

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서열 번호 58: C320-3 V_H의 아미노산 서열

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서열 번호 60: C320-3 HCDR2의 아미노산 서열

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서열 번호 66: C320-90 V_H의 아미노산 서열

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서열 번호 69: C320-90 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 70: C320-103 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 71: C320-103 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 72: C320-103 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 73: C320-103 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 74: C320-114 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 75: C320-114 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 76: C320-114 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 77: C320-114 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 78: C320-115 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 79: C320-115 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 80: C320-115 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 81: C320-115 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 82: C320-120 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 83: C320-120 LCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 84: C320-120 LCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 85: C320-120 LCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 86: C320-129 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 87: C320-129 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 88: C320-129 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 89: C320-129 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 90: C320-130 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 91: C320-130 HCDR1의 아미노산 서열

서열 번호 92: C320-130 HCDR2의 아미노산 서열

서열 번호 93: C320-130 HCDR3의 아미노산 서열

서열 번호 94: C320의 V_H 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 95: C320의 V_L 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 96: C336의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 97: C336의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 98: C334의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 99: C334의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 100: C333의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 101: C333의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 102: C323의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 103: C323의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 104: C321의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 105: C321의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 106: C320의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 107: C320의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 108: C319의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 109: C319의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 110: C320-3의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 111: C320-5의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 112: C320-90의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 113: C320-103의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 114: C320-114의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 115: C320-115의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 116: C320-120의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 117: C320-129의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 118: C320-130의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 119: 인간화된 항체 1B4의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 120: 인간화된 항체 1B4의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 121: 인간화된 항체 1B4의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 122: 인간화된 항체 1B4의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 123: (2011년 5월 8일 현재, 진뱅크 진(GenBank Gene) 수탁 번호 9966으로부터 유도된) 인간 TL1a의 아미노산 서열

서열 번호 124: 마우스 TL1a 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 125: 시노몰구스/레수스 TL1a 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 126: 래트 TL1a 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 127: 토끼 TL1a 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 128: 기니아 피그 TL1a 세포외 도메인의 아미노산 서열

서열 번호 129: (2011년 5월 8일 현재, 진뱅크 진 수탁 번호 진뱅크 진 수탁 번호 8718로부터 유도된) 인간 사멸 수용체 3의 아미노산 서열

서열 번호 130: (2011년 5월 8일 현재, 진뱅크 진 수탁 번호 8771로부터 유도된) 인간 데코이 수용체 3의 아미노산 서열

서열 번호 131: TL1a의 영역의 서열

서열 번호 132: TL1a의 영역의 서열

서열 번호 133: TL1a의 영역의 서열

서열 번호 134: 인간 IgG1 Fc 영역의 아미노산 서열

서열 번호 135: 인간 카파 불변 영역의 아미노산 서열

서열 번호 136: 인간 람다 불변 영역의 아미노산 서열

서열 번호 137: C320의 V_H 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 138: C320의 V_L 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 139: C320의 LCDR1 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 140: C320의 LCDR2 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 141: C320의 LCDR3 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 142: C320의 HCDR2 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 143: C320의 HCDR3 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 144: C320의 HFR1 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 145: C320의 HFR2 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 146: C320의 HFR3 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 147: C320의 HFR4 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 148: C320의 LFR1 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 149: C320의 LFR2 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 150: C320의 LFR3 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 151: C320의 LFR4 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 152: C320의 V_H 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 153: C320의 V_L 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 154: 항체 1TZG의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 155: 항체 1RHH의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 156: 항체 2DD8의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 157: 항체 2JB5의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 158: 항체 3FKU의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 159: 항체 3GBM의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 160: 항체 3LMJ의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 161: 항체 3P30의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 162: C320의 V_H 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 163: 항체 1RHH의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 164: 항체 1TZGL의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 165: 항체 2DD8의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 166: 항체 2JB5의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 167: 항체 3FKU의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 168: 항체 3GBM의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 169: 항체 3LMJ의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 170: 항체 3P30의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 171: 항체 3IYW의 FR 상에 이식된 C320으로부터의 CDR을 포함하는 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 172: C320의 V_L 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 173: C320의 V_H 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 174: C320의 V_L 컨센서스 서열의 아미노산 서열 및 유도체

서열 번호 175: 항체 C320-162의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 176: 항체 C320-163의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 177: 항체 C320-164의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 178: 항체 C320-165의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 179: 항체 C320-166의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 180: 항체 C320-167의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 181: 항체 C320-168의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 182: 항체 C320-169의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 183: 항체 C320-170의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 184: 항체 C320-171의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 185: 항체 C320-172의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 186: 항체 C320-179의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 187: 항체 C320-183의 V_H의 아미노산 서열

서열 번호 188: 항체 C320-162의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 189: 항체 C320-163의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 190: 항체 C320-164의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 191: 항체 C320-165의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 192: 항체 C320-166의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 193: 항체 C320-167의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 194: 항체 C320-168의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 195: 항체 C320-169의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 196: 항체 C320-170의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 197: 항체 C320-171의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 198: 항체 C320-172의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 199: 항체 C320-179의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 200: 항체 C320-183의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 201: 배선 서열 IGLV1-40*1의 V_L의 아미노산 서열

서열 번호 202: 가용성 인간 TL1a의 아미노산 서열

서열 번호 203: C320의 V_H 중 N 연결된 당화 부위의 아미노산 서열

서열 번호 204: C320의 V_H 중 N 연결된 당화 부위에 상응하는 ITZG의 V_H로부터의 아미노산 서열

서열 번호 205: C320-168의 V_H로부터의 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 206: C320-168의 V_L로부터의 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 207: 인플루엔자 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 208: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 209: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 210: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 211: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 212: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 213: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 214: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 215: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 216: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 217: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 218: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 219: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 220: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 221: C320-168의 V_L로부터의 돌연변이체 펩티드의 아미노산 서열

서열 번호 222: 항체 C320-162의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 223: 항체 C320-163의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 224: 항체 C320-164, C320-165, C320-166 및 C320-167의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 225: 항체 C320-168 및 C320-169의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 226: 항체 C320-170 및 C320-172의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 227: 항체 C320-179 및 C320-183의 V_H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 228: 항체 C320-162, C320-163, C320-167 및 C320-169의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 229: 항체 C320-164의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 230: 항체 C320-165, C320-168 및 C320-170의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 231: 항체 C320-166의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 232: 항체 C320-172 및 C320-179의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 233: 항체 C320-183의 V_L을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열 번호 234: C320-13 및 C320-22의 아미노산 서열

서열 번호 235: C320의 HCDR3의 컨센서스의 아미노산 서열 및 유도체

선택된 정의

제한없이, 명명하기 위한 목적으로 인간 TL1a의 아미노산 서열은 서열 번호 123에 기재되어 있다. 인간 TL1a의 추가의 서열은 진뱅크 진 수탁 번호 9966에 기재되어 있다. 따라서, 일례에서, 인간 TL1a의 아미노산 서열은 서열 번호 123에 기재된 서열을 포함한다. TL1a의 다른 이소폼도 기술되었다: 72-251(서열 번호 123의 72번 내지 251 위치), 84-251(서열 번호 123의 84번 내지 251 위치); 101-251 또는 VEGI-174(서열 번호 123의 101번 내지 251 위치) 및 86-251 또는 VEGI-192(서열 번호 123의 86번 내지 251 위치). 다양한 종으로부터의 TL1a의 세포외 도메인의 서열은 서열 번호 1(아미노산 16 내지 184; 인간), 서열 번호 124(마우스), 서열 번호 125(시노몰구스/레수스 원숭이), 서열 번호 126(래트), 서열 번호 127(토끼) 및 서열 번호 128(기니아 피그)에 기재되어 있다. TL1a는 일반적으로 대상체에서 동종삼량체를 형성하고, DR3을 통해 신호를 전달한다. 예시적인 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 인간 TL1a와, 그의 재조합 형태(본원에서 인간 TL1a로 약칭된다)에 결합 또는 그에 특이적으로 결합한다.

제한없이, 명명하기 위한 목적으로 인간 DR3의 서열은 서열 번호 129에 기재되어 있다. 인간 DR3의 추가의 서열은 진뱅크 진 수탁 번호 8718에 기재되어 있다. 일례에서, 본 개시내용에 포함되는 DR3은 서열 번호 129에 기재된 서열을 포함하는 인간 DR3이다.

제한없이, 명명하기 위한 목적으로 인간 DcR3의 서열은 서열 번호 130에 기재되어 있다. 인간 DcR3의 추가의 서열은 진뱅크 진 수탁 번호 8771에 기재되어 있다. 일례에서, 본 개시내용에 포함되는 DcR3은 서열 번호 130에 기재된 서열을 포함하는 인간 DcR3이다.

"단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"라는 용어는 그의 기원 또는 유래의 공급원에 의해서 그의 천연 상태에서는 그를 동반하는 천연적으로 회합된 성분과 회합되어 있지 않은 상태의, 같은 공급원으로부터의 다른 단백질은 실질적으로 함유하지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 한다. 단백질은 천연적으로 회합된 성분을 실질적으로 함유하지 않는 상태가 될 수 있거나, 당업계에 공지된 단백질 정제 기법을 사용함으로써 단리에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. "실질적으로 정제된"이라는 것을 단백질이 오염 물질을 실질적으로 함유하지 않는다는 것, 예컨대, 약 70% 이상 또는 75% 이상 또는 80% 이상 또는 85% 이상 또는 90% 이상 또는 95% 이상 또는 96% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상으로 오염 물질을 함유하지 않는다는 것을 의미한다.

"재조합"이라는 용어는 인공 유전자 재조합의 생성물을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질과 관련하여, 상기 용어는 B 세포 성숙화 동안 발생되는 천연 재조합의 생성물인, 피험체의 체내에서 천연적으로 발생된 항체는 포함하지 않는다. 그러나, 상기 항체가 단리된 것이라면, 이는 항원 결합 도메인을 포함하는 단리된 단백질인 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 단백질을 코딩하는 핵산이 단리된 것이고, 재조합 수단에 의해 발현된다면, 생성된 단백질은 항체 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 또한 그가 세포, 조직 또는 피험체 내에 있을 때, 예컨대, 그가 발현된 곳에 위치할 때에 인공 재조합 수단에 의해 발현된 단백질을 포함한다.

"TL1a 결합 단백질"이라는 용어는 본원에 기술되고/거나, 본원에서 주장하는 방식으로 TL1a에 결합할 수 있는 단일 폴리펩티드 쇄(즉, 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산), 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 일련의 폴리펩티드 쇄(즉, 폴리펩티드 복합체)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 일련의 폴리펩티드 쇄는 적합한 화학 물질 또는 이황화 결합을 사용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비공유 결합의 예로는 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 및 소수성 상호작용을 포함한다.

"폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 쇄"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접한 아미노산을 의미한다는 것을 상기 문단으로부터 이해하게 될 것이다.

본원에서 사용되는 바, "항원 결합 도메인"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 영역, 즉, V_H 또는 V_L, 또는 V_H 및 V_L, 둘 모두를 포함하는 Fv를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 항원 결합 도메인은 전체 항체 형태일 필요는 없으며, 예컨대, 이는 단리된 형태(예컨대, 도메인 항체) 또는 또 다른 형태, 예컨대, 본원에 기술된 것, 예컨대, scFv일 수 있다.

본 개시내용의 목적을 위해, "항체"라는 용어는 Fv 내에 포함되어 있는 항원 결합 도메인에 의해 하나 또는 수개의 밀접한 관계가 있는 항원(예컨대, TL1a)에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 상기 용어는 4개의 쇄로 된 항체(예컨대, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄), 재조합 또는 변형된 항체(예컨대, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, CDR 이식된 항체, 영장류화된 항체, 탈면역화된 항체, 합성 인간화된 항체, 절반 항체, 이중 특이성 항체)를 포함한다. 항체는 일반적으로 불변 도메인을 포함하는데, 이는 불변 영역 또는 불변 단편 또는 결정성 단편(Fc)으로 배열될 수 있다. 항체의 예시적인 형태는 그의 기본 단위로서 4쇄 구조를 포함한다. 전장의 항체는 공유적으로 연결된 2개의 중쇄(~50 내지 70 kD) 및 2개의 경쇄(각각 ~23 kDa)를 포함한다. 경쇄는 일반적으로 가변 영역(존재할 경우) 및 불변 도메인을 포함하고, 포유동물에서는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이다. 중쇄는 일반적으로 가변 영역 및 힌지 영역에 의해 추가의 불변 도메인(들)에 연결된 1 또는 2개의 불변 도메인(들)을 포함한다. 포유동물의 중쇄는 하기 유형 α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 하나의 것이다. 각각의 경쇄 또한 중쇄 중 하나에 공유적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 2개의 중쇄, 및 중쇄 및 경쇄는 쇄간 이황화 결합 및 비공유 상호작용에 의해 결합된다. 쇄간 이황화 결합의 개수는 상이한 유형의 항체 사이에서 달라질 수 있다. 각 쇄는 N 말단 가변 영역(각각의 길이가 ~110개의 아미노산 길이인 것인 V_H 또는 V_L) 및 C 말단에 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 경쇄의 불변 도메인(길이가 ~110개의 아미노산 길이인 것인 C_L)은 중쇄의 제1 불변 도메인(길이가 330 내지 440개의 아미노산 길이인 것인 C_H1)과 정렬되어 있고, 그에 이황화 결합되어 있다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬되어 있다. 항체 중쇄는 2개 이상의 추가의 C_H 도메인(예컨대, C_H2, C_H3 등)을 포함할 수 있고, C_H1과 C_H2 불변 도메인 사이에 힌지 영역을 포함할 수 있다. 항체는 임의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예컨대, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 서브부류의 것일 수 있다. 일례에서, 항체는 뮤린(마우스 또는 래트) 항체 또는 영장류(예컨대, 인간) 항체이다. 일례에서 항체 중쇄는 C 말단 리신 잔기가 손실되어 있는 것이다. 일례에서, 항체는 인간화된, 합성 인간화된, 키메라, CDR 이식된 또는 탈면역화된 항체이다.

본원에서 사용되는 바, "가변 영역"은 본원에서 정의되는 바, 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region); 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 골격 영역(FR: framework region)을 포함하는, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 의미한다. 예를 들어, 가변 영역은 3개의 CDR과 함께 3 또는 4개의 FR(예컨대, FR1, FR2, FR3 및 임의적으로 FR4)을 포함한다. V_H는 중쇄의 가변 영역을 의미한다. V_L은 경쇄의 가변 영역을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "상보성 결정 영역"(동의어: CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)이라는 용어는, 그의 존재가 특이적인 항원 결합에의 주된 공헌자인 것인, 항체 가변 영역의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 영역 도메인(V_H 또는 V_L)은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 가진다. 일례에서, CDR 및 FR로 지정된 아미노산 위치는 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991](이는 또한 본원에서 "카바트 번호매김 체계"로 지칭된다)에 따라 정의된다. 또 다른 일례에서, CDR 및 FR로 지정된 아미노산 위치는 강화된 코티아 번호매김 체계(http://www.bioinfo.org.uk/mdex.html)에 따라 정의된다. 카바트의 번호매김 체계에 따라, V_H FR 및 CDR은 하기와 같이 위치한다: 잔기 1 내지 30(FR1), 31 내지 35(CDR1), 36 내지 49(FR2), 50 내지 65(CDR2), 66 내지 94(FR3), 95 내지 102(CDR3) 및 103 내지 113(FR4). 카바트의 번호매김 체계에 따라, V_L FR 및 CDR은 하기와 같이 위치한다: 잔기 1 내지 23(FR1), 24 내지 34(CDR1), 35 내지 49(FR2), 50 내지 56(CDR2), 57 내지 88(FR3), 89 내지 97(CDR3) 및 98 내지 107(FR4). 본 개시내용은 카바트 번호매김 체계에 의해 정의된 바와 같은 FR 및 CDR로 제한되지 않고, 정규 번호매김 체계, 또는 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196: 901-917, 1987]; [Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989]; 및/또는 [Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol . 273: 927-948, 1997]; 문헌 [Honnegher and Plukthun J. Mol . Biol . 309: 657-670, 2001]의 번호매김 체계; 또는 문헌 [Giudicelli et al., Nucleic Acids Res . 25: 206-2111997]에서 논의된 IMGT 체계의 것을 비롯한, 모든 번호매김 체계를 포함한다. 일례에서, CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라 정의된다. 임의적으로, 카바트 번호매김 체계에 따른 중쇄 CDR2는 본원에 열거된 5개의 C 말단 아미노산을 포함하지 않거나, 상기 아미노산 중 임의의 하나 이상이 또 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다. 추가의 또는 대체 옵션으로, 경쇄 CDR1은 본원에 열거된 4개의 N 말단 아미노산을 포함하지 않거나, 상기 아미노산 중 임의의 하나 이상이 또 다른 천연적으로 발생된 아미노산으로 치환된다. 이와 관련하여, 문헌 [Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995]에서는 중쇄 CDR2의 5개의 C 말단 아미노산 및/또는 경쇄 CDR1의 4개의 N 말단 아미노산이 일반적으로는 항원 결합에 관여하지 않는다는 것이 확립되어 있다.

"골격 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 영역 잔기의 것이다.

본원에서 사용되는 바, "Fv"라는 용어는 다중 폴리펩티드 또는 단일 폴리펩티드로 구성되든지 간에, V_L 및 V_H가 회합되어, 항원 결합 도메인을 가지는, 즉, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 항원 결합 도메인을 형성하는 V_H 및 V_L은 단일 폴리펩티드 쇄 중에 존재할 수 있거나, 또는 상이한 폴리펩티드 쇄 중에 존재할 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 Fv(뿐만 아니라, 본 개시내용의 임의의 단백질)는 같은 항원에 결합하거나, 또는 결합하지 않을 수도 있는 다중 항원 결합 도메인을 가질 수 있다. 상기 용어는 항체로부터 직접적으로 유도된 단편 뿐만 아니라, 재조합 수단에 의해 제조된, 상기 단편에 상응하는 단백질도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, V_H는 중쇄 불변 도메인(C_H: heavy chain constant domain) 1에 연결되어 있지 않고/거나, V_L은 경쇄 불변 도메인(C_L: light chain constant domain)에 연결되어 있지 않다. 예시적인 Fv 포함 폴리펩티드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 고차 복합체, 또는 불변 영역 또는 그의 도메인, 예컨대, C_H2 또는 C_H3 도메인에 연결된 상기의 것 중 임의의 것, 예컨대, 미니바디를 포함한다. "Fab 단편"은 항체의 1가 항원 결합 단편으로 구성되고, 이는 효소 파파인으로 전체 항체를 분해함으로써 무손상 경쇄 및 경쇄의 일부로 구성된 단편을 수득함으로써 제조될 수 있거나, 재조합 수단을 사용하여 제조될 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전체 항체를 펩신으로 처리한 후, 환원시켜 무손상 경쇄, 및 V_H 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부로 구성된 분자를 수득함으로써 수득될 수 있다. 상기 방식으로 처리된 항체 1개당 2개의 Fab' 단편이 수득된다. Fab' 단편 또한 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 두 이황화 결합에 의해 결합된 두 Fab' 단편으로 이루어진 이량체로 구성되며, 후속되는 환원 단계 없이, 전체 항체를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득된다. "Fab₂" 단편은 예를 들어, 류신 지퍼 또는 C_H3 도메인을 사용하여 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv(단일 chain Fv)"는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이 적합한 가용성 폴리펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된, 항체의가변 영역 단편(Fv)을 포함하는 재조합 분자이다.

본원에서 사용되는 바, 항원과, TL1a 결합 단백질 또는 그의 항원 결합 도메인의 상호작용과 관련하여 "결합하다"라는 용어는 상호작용이 항원 상의 특정 구조(예컨대, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 따라 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질이 아닌 특이 단백질 구조를 인식하고, 그에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합한다면, 표지화된 "A" 및 항체의 반응에서 에피토프 "A"(또는 유리, 비표지화된 "A")를 포함하는 분자의 존재로 항체에 결합된 표지화된 "A"의 양은 감소하게 될 것이다.

본원에서 사용되는 바, "특이적으로 결합한다"("specifically binds" 또는 "binds specifically")는 것은 본 개시내용의 단백질이 특정의 항원, 또는 그를 발현하는 세포와 대체 또는 세포보다 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 오랜 지속 기간 동안 및/또는 더 큰 친화도로 반응하거나, 회합한다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 단백질은 그가 다른 항원에 결합할 때보다 더 큰 친화도로, 더 큰 결합도로, 더 빠르게, 및/또는 더 오랜 지속 기간 동안 항원과 결합한다. 예를 들어, 단백질은 상기 단백질이 다른 TNF 슈퍼패밀리 리간드에, 또는 보통은 다중반응성 천연 항체에 의해(즉, 천연적으로 인간에서 발견되는 다양한 항원에 결합하는 것으로 알려진 천연적으로 발생된 항체에 의해) 인식되는 항원에 결합할 때보다 실질적으로 더 큰 친화도로 TL1a(예컨대, 인간 TL1a)에 결합한다. 또한, 예를 들어, 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 결합하지 않을 수 있다는 것을 상기 정의를 판독함으로써 이해할 수 있다. 따라서, "특이 결합"은 반드시 배타적 결합 또는 또 다른 항원의 비검출가능한 결합일 필요는 없으며, 즉, 이는 "선택적 결합"이라는 용어를 의미한다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 항원에의 "특이 결합"은 단백질이 항원에 100 nM 이하, 예컨대, 50 nM 이하, 예를 들어 20 nM 이하, 예컨대, 15 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 5 nM 이하의 평형 상수(K_D)로 결합한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "검출가능하게 결합하지 못한다"라는 용어는 TL1a 결합 단백질, 예컨대, 항체가 배경보다 20%, 또는 10% 또는 6% 또는 5% 미만의 높은 수준으로 후보 항원에 결합한다는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 배경은 TL1a 결합 단백질의 부재하에서, 및/또는 음성 대조군 단백질(예컨대, 이소타입 대조군 항체)의 존재하에서 검출되는 결합 신호의 수준, 및/또는 음성 대조군 항원의 존재하에서 검출되는 결합 수준일 수 있다. 결합 수준은 예를 들어, ELISA를 사용하여 항원이 고정화되고, TL1a 결합 단백질과 접촉한 것으로 검출된다.

본원에서 사용되는 바, "에피토프"(동의어: "항원 결정기")라는 용어는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 결합하는 TL1a의 영역을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 상기 용어는 단백질이 접촉하게 되는 특이 잔기 또는 구조로 반드시 제한되지는 않는다. 예를 들어, 상기 용어는 단백질이 접촉하게 되는 아미노산에 걸쳐 있는 영역 및/또는 상기 영역 바깥쪽 적어도 5 내지 10개, 또는 2 내지 5개 또는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 에피토프는 선형의 일련의 아미노산이다. 에피토프는 또한 TL1a가 폴딩되었을 때, 서로 인접하게 위치하는 일련의 불연속 아미노산, 즉, "입체형태적 에피토프"도 포함할 수 있다. 당업자는 또한 "에피토프"라는 용어가 펩티드 또는 폴리펩티드로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, "에피토프"라는 용어는 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹핑, 예컨대, 당 측쇄, 포스포릴 측쇄, 또는 술포닐 측쇄를 포함하고, 특정 예에서는 특이적인 3차 구조적 특징, 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프, 또는 그를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 동물에게 투여하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시킨다"라는 용어는, TL1a와 DR3의 결합을 측정하는 검정법에서, 단백질이 약 13 nM 미만, 예를 들어, 약 10 nM 미만, 예컨대, 약 7 nM 미만, 예컨대, 약 5 nM 미만, 예를 들어, 약 3 nM 미만으로 결합의 50%를 억제시킬 수 있다는 것(즉, 그러한 값의 EC₅₀을 가진다는 것)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바, "TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는다"라는 용어는, 본원에 기술된 TL1a 결합 단백질이 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는다는 것(즉, 이로써, 상호작용은 예컨대, 본원에 기술된 ELISA 검정법 사용으로 더 이상 검출되지 않는다는 것)을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 100 ㎍/ml 농도에서, 단백질은 TL1a와 DcR3의 상호작용을 완전하게 억제시키지 않는다. 일부 예에서, 단백질은 예컨대, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml 농도에서 테스트되었을 때, TL1a와 DcR3의 상호작용을 약 20% 또는 15% 또는 10% 미만만큼 감소시킨다.

본원에서 사용되는 바, "검출가능하게 감소시키지 못한다"라는 용어는 본원에 기술된 단백질이 예컨대, 10 ㎍/ml 또는 100 ㎍/ml 농도에서 테스트되었을 때, TL1a(또는 그의 비오티닐화된 형태)의 DcR3에의 결합을, 단백질 부재하에서의 상호작용 수준보다 또는 배경 상호작용의 수준보다 20% 또는 8% 또는 6% 또는 5% 또는 4% 또는 3% 또는 2% 이하만큼 큰 정도로 감소시킨다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 배경은 단백질의 부재하에서 및/또는 음성 대조군 단백질(예컨대, 이소타입 대조군 항체)의 존재하에서 검출되는 결합 신호의 수준일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "중화시키는"이라는 용어는 TL1a 결합 단백질이 세포에서 TL1a 매개 활성을 감소 또는 방해할 수 있다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 중화를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/거나, 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질의 존재 또는 부재하에서 TF-1 세포를 TL1a, 예컨대, 인간 TL1a(예컨대, 포유동물 세포에 의해 발현된 것) 및 사이클로헥시미드와 접촉시킨다. 단백질 부재하의 수준과 비교하여 세포의 아폽토시스 수준을 감소시키는 TL1a 결합 단백질을 TL1a 활성을 "중화시키는" 것으로 간주한다.

본원에서 사용되는 바, "병태"라는 용어는 정상적인 기능의 파괴, 또는 그를 방해하는 것을 의미하고, 임의의 특정 병태로 제한되지 않으며, 질환 또는 장애를 포함할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "TL1a와 관련된 병태"란 TL1a, 또는 TL1a를 발현하는 세포에 의해 유발되거나, 그와 관련된, 임의의 병태를 의미한다. 당업자는 본원의 개시내용에 기초하여 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 TL1a와 관련된 병태를 진단하는 검정법을 수행함으로써 상기 병태를 쉽게 측정할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 일부 예에서, 병태는 염증성 병태, 자가면역 병태 및 혈관형성 증진에 의해 치료될 수 있는 병태이다. 예시적인 병태에 관한 설명은 본원에 포함되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "예방하는," "예방하다" 또는 "예방"이라는 용어는 본 개시내용의 단백질을 투여함으로써 병태의 1 이상의 증상이 발생되지 못하도록 중단시키거나, 막는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 재발을 예방하거나, 막기 위해 관해 상태의 피험체를 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 재발 완화성 다발성 경화증을 앓는 피험체를 관해 상태에 있는 동안 치료함으로써 재발을 예방할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "치료하는," "치료하다," 또는 "치료"라는 용어는 본 개시내용의 단백질을 투여함으로써 언급된 질환 또는 병태의 1 이상의 증상을 감소시키거나, 제거하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "피험체"라는 용어는 임의의 동물, 예컨대, 포유동물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 일례에서, 포유동물은 인간 또는 비인간 영장류이다. 일례에서, 포유동물은 인간이다.

본원에서 "시료"라고 언급되는 것은 피험체로부터 유래된 임의의 시료, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 체액(예컨대, 혈액 또는 혈액 분획, 예컨대, 혈청 또는 혈장, 눈물, 소변, 윤활액, 또는 뇌척수액), 세포 물질(예컨대, 조직 흡인물), 조직 생검 표본 또는 수술 적출물이라고 언급되는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, "시료"는 혈청, 혈장, PBMC, 또는 연막 분획 중 임의의 하나 이상의 것이다.

본원에서 사용되는 바, "진단"이라는 용어, 및 그의 파생어, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, "진단하다," "진단된," 또는 "진단하는"이라는 용어는 임상 상태의 임의의 1차 진단 또는 재발성 질환의 진단을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "예후," "예후하는," 및 그의 파생어는 회복 또는 재발 또는 치료 결과의 기회를 비롯한, 질환의 가능한 결과 또는 진행 과정을 의미한다.

"발현 구성물"이라는 용어는 그의 가장 광범위한 의미로 이해되어야 하며, 이는 본원에 기술된 하나 이상의 핵산과 작동가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.

"발현 벡터"라는 용어는 추가로 핵산을 발현가능한 포맷으로 유지시키고/거나, 복제시킬 수 있는 발현 구성물을 포함하는 핵산을 의미한다. 예를 들어, 발현 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 서브게놈 또는 게놈 단편을 포함할 수 있다. 적절한 벡터를 선택하는 것은 당업자의 지식 범위 내에 포함되어 있다.

본원에서 사용되는 바, "프로모터"라는 용어는 그의 가장 광범위한 의미로 이해되어야 하며, 예컨대, 발생적 및/또는 외부 자극에 대한 반응으로, 또는 조직 특이 방식으로 핵산의 발현을 변경시키는 추가의 조절 요소(예컨대, 상류 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일렌서)와 함께, 또는 그의 부재하에서 정확한 전사 개시에 요구되는, 게놈 유전자의 전사 조절 서열, 예컨대, TATA 박스 또는 개시제 요소를 포함한다. 본 맥락에서, "프로모터"라는 용어는 또한 상기 프로모터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화시키거나, 증진시키는 재조합, 합성, 또는 융합 핵산 또는 유도체를 기술하는 데에도 사용된다. 예시적인 프로모터는 상기 핵산의 발현을 추가로 증진시키고/거나, 그 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키는 하나 이상의 특이 조절 요소의 추가의 카피를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "~에 작동가능하게 연결된"이라는 용어는 프로모터가 핵산의 발현이 프로모터에 의해 제어될 수 있도록 하는 방식으로 핵산에 대해 상대적으로 배치되어 있는 것을 의미한다. 프로모터는 예컨대, 내부 리보좀 진입 부위를 통해 다수의 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다.

항체 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질

항체

면역화 기반 방법

항체를 생성하기 위해, 임의적으로 임의의 적합한 또는 원하는 애주번트 및/또는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, TL1a 또는 에피토프를 보유하는 단편 또는 그의 일부 또는 그의 변형된 형태(예컨대, 마우스 TL1a 단백질내 인간 에피토프를 포함하는 융합 단백질) 또는 상기를 코딩하는 핵산을 주사용 조성물 형태로 피험체(예를 들어, 비인간 동물 피험체, 예컨대, 마우스, 래트, 닭 등)에게 투여한다. 예시적인 비인간 동물은 포유동물, 예컨대, 뮤린 동물(예컨대, 래트 또는 마우스)이다. 주사는 비내, 근육내, 피하, 정맥내, 진피내, 복강내, 또는 공지된 다른 경로에 의한 주사일 수 있다. 임의적으로, TL1a 또는 에피토프를 보유하는 단편 또는 그의 일부 또는 상기를 코딩하는 핵산은 수회에 걸쳐 투여된다. 항체를 제조하고, 그의 특징을 규명하는 수단은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조).

면역화 이후 다양한 시점에 면역화된 동물의 혈액을 샘플링함으로써 다중클론 항체 제조를 모니터링할 수 있다. 원하는 항체 역가를 달성하는 것이 요구될 경우, 2차 추가 주사를 접종할 수 있다. 추가 접종 및 적정 공정은 적합한 역가를 달성할 때까지 반복된다. 원하는 수준의 면역원성을 달성하였을 때, 면역화된 동물을 출혈시키고, 혈청을 단리시키고, 보관하고/거나, 동물을 사용하여 단일클론 항체(mAb: monoclonal antibody)를 생성한다.

단일클론 항체는 본 개시내용에 의해 고려되는 예시적인 항체이다. 일반적으로, 단일클론 항체를 제조하는 것은 항체 생산 세포를 자극시키는 데 충분하는 조건하에서 피험체(예컨대, 설치류, 예컨대, 마우스 또는 래트)를 TL1a 또는 에피토프를 보유하는 단편 또는 그의 일부 또는 상기를 코딩하는 핵산으로 면역화시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, (예컨대, PCT/US2007/008231 및/또는 문헌 [Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994]에 기술되어 있는 바와 같이) 인간 면역글로불린 단백질을 발현하도록 및 뮤린 면역글로불린 단백질을 발현하지 못하도록 유전적으로 조작된 마우스를 면역화시키 항체를 제조한다. 면역화시킨 후, 항체 생산 체세포(예컨대, B 림프구)를 무한증식 세포, 예컨대, 무한증식 골수종 세포와 융합시킨다. 상기 융합된 세포(하이브리도마)를 제조하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497, 1975]에 기술되어 있다. 이어서, 항체를 생산하는 데 충분한 조건하에서 하이브리도마 세포를 배양할 수 있다.

본 개시내용은 항체를 제조하는 다른 방법, 예컨대, (예를 들어, 문헌 [Largaespada et al., Curr . Top . Microbiol . Immunol , 166: 91-96, 1990]에 기술되어 있는 것과 같은) ABL-MYC 기술을 고려한다.

이어서, 본원에 기술된 방법에 기초하여 적합한 항체를 선별한다.

라이브러리 기반 방법

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 확인하기 위해 항체 또는 그의 항원 결합 도메인을 포함하는(예컨대, 그의 가변 영역을 포함하는) 단백질로 이루어진 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 개시내용에 의해 고려되는 라이브러리의 예로는 (시험감염되지 않은 피험체로부터의) 나이브 라이브러리, (항원으로 면역화된 피험체로부터의) 면역화된 라이브러리 또는 합성 라이브러리를 포함한다. 항체를 코딩하는 핵산 또는 그의 영역(예컨대, 가변 영역)을 (예컨대, 문헌 [Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 개시된 바와 같이) 종래 기법에 의해 클로닝하고, 이를 사용하여 당업계에 공지된 방법을 이용함으로써 단백질을 코딩하는 디스플레이한다. 단백질의 라이브러리를 제조하는 다른 기법은 예를 들어, US6300064(예컨대, 모르포시스 아게(Morphosys AG)의 HuCAL 라이브러리; US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 기술되어 있다.

본 개시내용에 따른 TL1a 결합 단백질은 가용성 분비 단백질일 수 있거나, 세포, 또는 입자(예컨대, 파지 또는 다른 바이러스, 리보좀 또는 포자) 표면 상의 융합 단백질로서 제시될 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 시험관내 디스플레이 라이브러리(예컨대, 리보좀 디스플레이 라이브러리, 공유 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리, 예컨대, US7270969에 기술되어 있는 것)이다. 추가의 또 다른 예에서, 디스플레이 라이브러리는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 파지 상에서 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리, 예컨대, US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; 또는 US6248516에 기술되어 있는 것과 같은 것이다. 다른 파지 디스플레이 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 개시내용에 의해 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법, 예컨대, 박테리아 디스플레이 라이브러리, 예컨대, US5516637에 기술되어 있는 것; 효모 디스플레이 라이브러리, 예컨대, US6423538에 기술되어 있는 것, 또는 포유동물 디스플레이 라이브러리가 본 개시내용에 의해 고려된다.

디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일례에서, 본 개시내용의 디스플레이 라이브러리를 예컨대, 문헌 [Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)]에 기술되어 있는 바와 같이, 친화도 정제를 사용하여 스크리닝한다. 친화도 정제 방법은 전형적으로 라이브러리에 의해 디스플레이되는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 표적 항원(예컨대, TL1a)과 접촉시킨 후, 세척한 후, 상기 항원에 결합된 상태 그대로 남아있는 도메인을 용리시키는 단계를 포함한다.

원하는 경우, 스크리닝에 의해 확인된 scFv 중 임의의 가변 영역을 완전한 항체로 쉽게 변형시킬 수 있다. 가변 영역 또는 scFv를 완전한 항체로 변형시키거나, 또는 재포맷팅시키는 방법의 예는 예를 들어, 문헌 [Jones et al., J. Immunol . Methods 354: 85-90, 2010]; 또는 [Jostock et al., J. Immunol . Methods , 289: 65-80, 2004]에 기술되어 있다. 별법으로 또는 추가로, 표준 클로닝 방법, 예컨대, 문헌 [Ausubel et al., (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)], 및/또는 [(Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)]에 기술된 것이 사용된다.

탈면역화된, 키메라, CDR 이식된, 인간화된, 합성 인간화된, 영장류화된, 인간 및 복합 TL1a-결합 단백질

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 인간 항체로부터의 FR 상에 이식되거나, 또는 그 내부로 삽입된, 비인간 종(예컨대, 마우스 또는 래트 또는 비인간 영장류)으로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는 CDR 이식된 단백질, 또는 또 다른 유형의 항체(예컨대, 또 다른 유형의 인간 항체)로부터의 FR 상에 이식되거나, 또는 그 내부로 삽입된, 한 유형의 항체(예컨대, 한 유형의 인간 항체)로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는 CDR 이식된 단백질일 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 하나 이상의 CDR 이식된 가변 영역 및 예컨대, 인간 가변 영역, 키메라 가변 영역, 합성 인간화된 가변 영역 또는 영장류화된 가변 영역 중 하나 이상의 것을 포함하는 복합 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 본원에서 C320-16 내지 C320-33으로 지정된 항체로 예시된다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 인간화된 단백질일 수 있다.

"인간화된 단백질"이라는 용어는 인간 항체로부터의 FR 상에 이식되거나, 또는 그 내부로 삽입된, 비인간 종(예컨대, 마우스 또는 래트 또는 비인간 영장류)으로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는, 인간 유사 가변 영역을 포함하는 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다(이러한 유형의 항체는 또한 "CDR 이식된 항체"로도 지칭된다). 인간화된 단백질은 또한 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/거나, 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된 것인 단백질을 포함한다. 인간화된 단백질은 또한 인간 항체에서도, 또는 비인간 항체에서도 발현되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가 영역(예컨대, Fc 영역)은 일반적으로 인간의 것이다. 인간화는 예컨대, US5225539, US6054297, US7566771 또는 US5585089에서와 같이, 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. "인간화된 단백질"이라는 용어는 또한 예컨대, US7732578에 기술되어 있는 바와 같이, 초인간화된 단백질도 포함한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 하나 이상의 인간화된 가변 영역, 및 예컨대, 인간 가변 영역, 키메라 가변 영역, 합성 인간화된 가변 영역 또는 영장류화된 가변 영역 중 하나 이상의 것을 포함하는 복합 단백질을 포함한다.

일례에서, 인간화된 TL1a 결합 단백질은 본원에 개시된 경쇄 서열 중 27d 내지 34, 50 내지 55, 내지 89 내지 96 사이의 영역; 및 본원에 개시된 중쇄 서열 중 31 내지 35b, 50 내지 58, 내지 95 내지 101 사이의 영역(카바트 번호매김 체계에 따른 번호매김)을 포함한다. 이와 관련하여, 문헌 [Padlan et al., FASEB J., 9: 133-139, 1995]에는 상기 영역이 항원에 결합하거나, 접촉할 가능성이 가장 높은 영역이라는 증거가 제시되어 있다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "인간 단백질"이라는 용어는 인간에서, 예컨대, 인간 배선 또는 체세포에서 발견되는, 또는 본 영역을 사용하여 제조되는 라이브러리로부터의 가변 및, 임의적으로, 불변 항체 영역을 가지는 단백질을 의미한다. "인간" 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기, 예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위 지정 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이(특히, 보존적 치환을 포함하는 돌연변이, 또는 단백질의 소수의 잔기, 예컨대, 단백질의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기에서의 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이러한 "인간 항체"는 반드시 인간의 면역 반응의 결과로서 생성되어야 할 필요는 없으며, 오히려 상기 항체는 재조합 수단(예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝)에 의해, 및/또는 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 동물(예컨대, 마우스)에 의해, 및/또는 (예컨대, US5565332에 기술된 바와 같은) 유도된 선택을 사용하여 생성될 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 항체의 친화도 성숙된 형태를 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 인간 단백질은 또한 예컨대, US6300064 및/또는 US6248516에 기술된 바와 같이, 인간 항체로부터의 FR, 또는 인간 FR의 컨센서스 서열로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 CDR은 무작위 또는 반무작위인 것인 단백질을 포함하는 것으로 간주될 수 있다.

예시적인 인간 TL1a 결합 단백질은 하기의 가변 영역 쌍을 포함하는 항체이다:

(xxv) 서열 번호 160에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 171에 기재된 서열을 포함하는 V_L;

(lvi) 서열 번호 186에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 199에 기재된 서열을 포함하는 V_L; ; 또는

추가의 예시적인 인간 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하는 항체로서, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함하는 것인 항체이다:

(i) V_H는 서열 번호 42의 16번 위치에 세린을 포함하거나;

(lxxxi) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하거나;

(i) V_H는 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린, 51번 위치에 류신, 72번 위치에 알라닌, 73번 위치에 아스파르트산, 74번 위치에 아르기닌, 76번 위치에 트레오닌, 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌, 24번 위치에 세린, 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글리신을 포함한다.

임의적으로, V_H는 중쇄 불변 영역, 예컨대, IgG1 중쇄 불변 영역에 연결되어 있다. 일례에서, 중쇄 불변 영역은 c 말단 리신 잔기를 포함하지 않는다.

임의적으로, V_L은 경쇄 불변 영역에 연결되어 있다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 합성 인간화된 단백질일 수 있다. "합성 인간화된 단백질"이라는 용어는 WO2007/019620에 기술된 방법에 의해 제조된 단백질을 의미한다. 합성 인간화된 TL1a 결합 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하고, 여기서, 가변 영역은 신세계(New World) 영장류의 항체 가변 영역으로부터의 FR, 및 비신세계(non-New World) 영장류 항체 가변 영역으로부터의 CDR을 포함한다. 예를 들어, 합성 인간화된 TL1a 결합 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하고, 여기서, 가변 영역은 신세계 영장류의 항체 가변 영역으로부터의 FR, 및 마우스 또는 래트 항체로부터의 CDR을 포함한다. 일례에서, 합성 인간화된 TL1a 결합 단백질은 가변 영역 중 하나 또는 둘 모두가 합성 인간화된 것인 TL1a 결합 항체이다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 하나 이상의 합성 인간화된 가변 영역, 및 하나 이상의, 예컨대, 인간 가변 영역 또는 인간화된 가변 영역 또는 키메라 가변 영역을 포함하는 복합 단백질을 포함한다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 영장류화된 단백질일 수 있다. "영장류화된 단백질"은 비인간 영장류(예컨대, 시노몰구스 원숭이)의 면역화 이후에 생성되는 항체로부터의 가변 영역(들)을 포함한다. 임의적으로, 비인간 영장류 항체의 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킴으로써 영장류화된 항체를 제조할 수 있다. 영장류화된 항체를 제조하는 방법의 예는 US6113898에 기술되어 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 하나 이상의 영장류화된 가변 영역 및 예컨대, 인간 가변 영역 또는 인간화된 가변 영역 또는 키메라 가변 영역 중 하나 이상의 것을 포함하는 복합 단백질을 포함한다.

일례에서 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 키메라 단백질이다. "키메라 단백질"이라는 용어는 항원 결합 도메인은 특정 종(예컨대, 뮤린, 예컨대, 마우스 또는 래트)으로부터의 것이거나, 또는 특정 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 것이고, 단백질의 나머지 부분은 또 다른 종(예컨대, 예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류)으로부터 유래된 단백질로부터의 것이거나, 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 것인 단백질을 의미한다. 일례에서, 키메라 단백질은 비인간 항체(예컨대, 뮤린 항체)로부터의 V_H 및/또는 V_L, 및 인간 항체로부터의 것인, 항체의 나머지 영역을 포함하는 키메라 항체이다. 상기 키메라 단백질의 제조는 당업계에 공지되어 있고, (예컨대, US6331415; LIS5807715; US4816567 및 US4816397에 기술되어 있는 바와 같이) 표준 수단에 의해 달성될 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 하나 이상의 키메라 가변 영역 및 예컨대, 인간 가변 영역 또는 인간화된 가변 영역 또는 키메라 가변 영역 중 하나 이상의 것을 포함하는 복합 단백질을 포함한다.

본 개시내용은 또한 예컨대, WO2000/34317 및 WO2004/108158에 기술되어 있는 바와 같이, 탈면역화된 TL1a 결합 단백질을 고려한다. 탈면역화된 항체 및 단백질에서 하나 이상의 에피토프, 예컨대, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 제거(즉, 돌연변이화)되어 있으며, 이로써, 피험체가 항체 또는 단백질에 대해 면역 반응을 일으킬 가능성은 감소되어 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 분석함으로써 하나 이상의 B 또는 T 세포 에피토프 및 에피토프 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 돌연변이됨에 따라 TL1a 결합 단백질의 면역원성이 감소되어 있다는 것을 확인할 수 있다. 본 발명자들은 MHC 클래스 II 분자에 결합할 것으로 예측되는 에피토프를 확인하는 데, 및 피험체에서 면역 반응을 유도할 가능성이 감소되어 있는 TL1a 결합 단백질을 확인하는 데 상기 기법을 사용하였다.

당업자에게 "복합" 단백질이 한 형태의 V_H(예컨대, 인간의 것) 및 또 다른 형태의 V_L(예컨대, 인간화된 것)을 포함한다는 것은 상기 개시내용으로부터 자명해질 것이다. 본 개시내용은 명백하게 V_H 및 V_L 형태의 모든 조합을 포함한다.

항원 결합 도메인을 포함하는 다른 TL1a 결합 단백질

본 개시내용은 항체의 가변 영역 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 TL1a 결합 단백질, 예컨대:

(i) 항체의 V_H 또는 V_L 모두 또는 그의 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄인 것인 단일 도메인 항체(예컨대, US6248516 참조);

(ii) 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 예컨대, US5844094 및/또는 US2008152586에 기술되어 있는 것;

(iii) scFv, 예컨대, US5260203에 기술되어 있는 것;

(iv) 미니바디, 예컨대, US5837821에 기술되어 있는 것;

(v) US5731168에 기술되어 있는 것과 같은, "열쇠와 구멍(key and hole)" 이중특이성 단백질;

(vi) 헤테로컨쥬게이트 단백질, 예컨대, US4676980에 기술되어 있는 것;

(vii) 화학적 가교제를 사용하여 제조된 헤테로컨쥬게이트 단백질, 예컨대, US4676980에 기술되어 있는 것;

(viii) Fab'-SH 단편, 예컨대, 문헌 [Shalaby et al., J. Exp . Med ., 175: 217- 225, 1992]에 기술되어 있는 것; 또는

(ix) Fab₃(예컨대, EP19930302894에 기술되어 있는 것) 또한 고려한다

불변 도메인 융합

본 개시내용은 항체의 항원 결합 도메인, 및 불변 영역 또는 Fc 또는 그의 도메인, 예컨대, C_H2 및/또는 C_H3 도메인을 포함하는 TL1a 결합 단백질을 포함한다. 적합한 불변 영역 및/또는 도메인은 당업자에게 자명할 것이고/거나, 상기 폴리펩티드의 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베스트로부터 쉽게 이용될 수 있다. 카바트 등은 또한 일부 적합한 불변 영역/도메인에 대한 설명을 제공하였다.

불변 영역 및/또는 그의 도메인은 생물학적 활성, 예컨대, 이량체화, (예컨대, FcRn에의 결합에 의한) 혈청 반감기 연장, 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell cytotoxicity), 보체 의존적 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 항체 의존적 세포 식세포 작용(ADCP: antibody-dependent cell phagocytosis)을 제공하는 데 유용하다.

본 개시내용은 또한 예컨대, US7217797; US7217798; 또는 US20090041770(반감기가 연장된 것) 또는 US2005037000(ADCC가 증가된 것)에 기술되어 있는 것과 같이, 돌연변이체 불변 영역 또는 도메인을 포함하는 TL1a 결합 단백질을 고려한다.

불변 영역 또는 Fc를 포함하는, 본 개시내용의 항체, 또는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 중쇄 불변 영역의 C 말단 리신은 예를 들어, 항체의 제조 또는 정제 동안, 또는 항체 또는 단백질의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 전체 항체 또는 단백질은 모든 C 말단 리신 잔기가 제거된 항체 또는 단백질 집단, C 말단 리신 잔기가 제거되지 않은 항체 또는 단백질 집단, 또는 C 말단 리신 잔기를 포함하는 항체 및 그를 포함하지 않는 항체의 혼합물을 가지는 항체 또는 단백질 집단을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항체 또는 단백질 집단은 중쇄 불변 영역 중 C 말단 리신 잔기가 하나에서 제거되어 있는 것인 항체 또는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 항체 또는 단백질 조성물은 C 말단 리신 잔기를 포함하거나, 포함하지 않는 항체 또는 단백질 집단의 동일한 또는 유사한 믹스를 포함할 수 있다.

효과기 기능 증진

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 효과기 기능 또는 효과기 기능 증진을 유도할 수 있다.

본 개시내용과 관련하여, "효과기 기능"이란, 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 결합하는 세포 또는 단백질에 의해 매개되며, 세포 사멸을 일으키는 생물학적 활성을 의미한다. 항체에 의해 유도되는 효과기 기능의 예로는 보체 의존적 세포독성; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 항체 의존적 세포 식세포 작용(ADCP); 및 B 세포 활성화를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 효과기 기능, 예컨대, ADCC 또는 CDC를 유도할 수 있는 방식으로 세포의 표면 상의 TL1a에 결합한다.

예를 들어, TL1a 결합 단백질은 효과기 기능, 예컨대, ADCC 및/또는 CDC를 유도하는 데 충분한 시간 동안 세포의 표면 상의 TL1a에 결합된 상태 그대로 유지된다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 예컨대, 변형된 Fc 영역에 의해, 또는 면역 효과기 세포에 결합할 수 있는 영역을 포함함으로써 효과기 기능 증진을 유도할 수 있다. 예를 들어, 효과기 기능의 수준은 인간 IgG1 또는 IgG3 Fc 영역에 의해 유도된 수준과 비교하여 증가된다. 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질에 의해 유도된 효과기 기능 증진은 예컨대, TL1a의 작용을 차단시킴으로써 그리고 병태를 유발하는 세포를 사멸시키거나, 또는 고갈시킴으로써, 예컨대, 자가반응성 T 세포를 사멸시킴으로써 치료학적 또는 예방학적 효과를 증진시킬 수 있다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 Fc 영역은 변형되지 않은 Fc 영역과 비교하였을 때, 상기 단백질이 유도할 수 있는 효과기 기능의 수준을 증가시킬 수 있도록 변형된다. 상기 변형은 아미노산 수준 및/또는 2차 구조 수준 및/또는 3차 구조 수준에서 이루어질 수 있고/거나, Fc 영역의 당화에의 변형일 수 있다.

숙련된 수신자는 더욱 큰 효과기 기능은 다수의 방식 중 임의의 방식으로 예를 들어, 더욱 큰 효과 수준, 보다 지속적인 효과, 또는 더욱 빠른 효과로 나타날 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일례에서, Fc 영역은 효과기 기능 증진을 유도할 수 있는 그의 능력을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일례에서, Fc 영역은 하나 이상의 FcγR, 예컨대, FcγRIII에 대하여 더 큰 친화도로 결합한다. 일례에서, Fc 영역은 카바트의 EU 인덱스에 따라 번호매김된, 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332, 및 335로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 1 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일례에서, Fc 영역은 카바트의 EU 인덱스에 따라 번호매김된 하기 아미노산 치환 S239D/I332E을 포함한다. 상기 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIIa에 대하여 약 14배 증가된 친화도를 가지고, 야생형 Fc 영역과 비교하여 ADCC를 유도할 수 있는 능력이 약 3.3 증가된 능력을 가진다. 일례에서, Fc 영역은 카바트의 EU 인덱스에 따라 번호매김된, 하기 아미노산 치환 S239D/A330L/I332E을 포함한다. 상기 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 FcγRIIIa에 대하여 약 138배 증가된 친화도를 가지고, 야생형 Fc 영역과 비교하여 ADCC를 유도할 수 있는 능력이 약 323 증가된 능력을 가진다.

효과기 기능을 유도할 수 있는 Fc 영역의 능력을 증가시키는 추가의 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있고/거나, 예를 들어, US6737056 또는 US7317091에 기술되어 있다.

일례에서, Fc 영역의 당화는 효과기 기능 증진을 유도할 수 있는 그의 능력을 증가시키도록 변경된다. 이와 관련하여, 포유동물 세포에 의해 제조된 천연 항체는 전형적으로는 일반적으로 N 연결부에 의해 Fc 영역의 C_H2 도메인의 Asn297에 부착된 분지형, 2 안테나형 올리고당을 포함한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산 뿐만 아니라, 2 안테나형 올리고당 구조의 "줄기" 내 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 개시내용에 따른 Fc 영역은 Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는, 즉, Fc 영역이 "비푸코실화되어 있는," 탄수화물 구조를 포함한다. 상기 변이체는 ADCC를 유도하는 개선된 능력을 가질 수 있다. 비푸코실화된 항체의 제조 방법은 (예컨대, 문헌 [Yumane-Ohnuki et al., Biotechnol . Bioengineer. 87: 614-622, 2004]에 기술된 바와 같이) α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8)를 발현할 수 없는 세포주 내에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계, (예컨대, 문헌 [Mori et al., Biotechnol . Bioengineer ., 88: 901-908, 2004]에 기술된 바와 같이) FUT8에 대해 소형 간섭 RNA를 발현시키는 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계, (예컨대, 문헌 [Kanda et al., J. Biotechnol , 130: 300-310, 2007]에 기술된 바와 같이) 구아노신 디포스페이트(GDP)-만노스 4,6-데하이드라타제(GMD)를 발현시킬 수 없는 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 (예컨대, 문헌 [Umana et al., Nat . Biotechnol . 17: 176-180, 1999]에 기술된 바와 같이) 예컨대, β-(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnT-III)을 발현하도록 변형된 세포주를 사용하여 제조된, 푸코실화 수준이 감소된 단백질을 사용하는 것을 고려한다.

다른 방법으로는 Fc 매개 효과기 기능 증진을 유도할 수 있는 항체를 선천적으로 생산하는 세포주(예컨대, 바이러스 백신 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포( WO2008/129058); 조류 EBX® 세포에서 재조합 단백질 제조(WO 2008/142124))를 사용하는 것을 포함한다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 또한 예컨대, Fc 영역에 부착된 2 안테나형 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 올리고당이 양분되어 있는 것을 포함한다. 상기 단백질은 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기 단백질의 예는 예컨대, US6602684 및 US20050123546에 기술되어 있다.

Fc 영역에 부착된 올리고당내 1 이상의 갈락토스 잔기를 가지는 TL1a 결합 단백질 또한 고려된다. 상기 단백질은 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기 단백질은 예컨대, WO 1997/30087 및 W01999/22764에 기술되어 있다.

TL1a 결합 단백질은 또한 CDC 수준 증진을 유도할 수 있는 Fc 영역을포함할 수 있다. 예를 들어, IgG1 및 IgG3의 하이브리드는 CDC 활성이 증진된 항체를 생산한다(문헌 [Natsume et al., Cancer Res . 68: 3863-3872, 2008]).

TL1a 결합 단백질은 또한 또는 별법으로 면역 효과기 세포에 결합하는 단백질(예컨대, 항체 가변 영역)에 예컨대, CD3 또는 CD16에의 결합에 의해 융합되거나, 컨쥬게이트될 수 있다.

효과기 기능을 측정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 일례에서, ADCC 활성 수준은 ⁵¹ 방출 검정법, ³⁵유로퓸 방출 검정법 또는 ³⁵S 방출 검정법을 사용하여 평가된다. 각각의 상기 검정법에서는 TL1a를 발현시키는 세포를, 세포가 화합물을 흡수하는 데 충분한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 언급된 화합물들 중 하나와 함께 배양한다. ³⁵S 방출 검정법의 경우, 표지화된 아미노산이 새로 합성된 단백질에 혼입되도록 하는 데 충분한 시간 동안 ³⁵S 표지화된 메티오닌 및/또는 시스테인과 함께 상기 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 세포를 면역 효과기 세포, 예컨대, PBMC 및/또는 NK 세포의 존재하에 및 단백질의 존재 또는 부재하에서 배양한다. 이어서, 세포 배양 배지 중 ⁵¹Cr, 유로퓸 및/또는 ³⁵S의 양을 검출하고, 단백질 부재하의 양과 비교하여 단백질 존재하에서 양이 증가하였다면, 이는 결합 분자/작용제가 효과기 기능을 가진다는 것을 나타내는 것이다. 단백질에 의해 유도된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 검정법을 개시한 공개 문헌의 예로는 문헌 [Hellstrom et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA 83: 7059-7063, 1986] 및 [Bruggemann et al., J. Exp . Med . 166: 1351-1361, 1987]을 포함한다.

단백질에 의해 유도된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 다른 검정법으로는 유세포 측정을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정법(셀테크놀로지, 인코퍼레이티드(CellTechnology, Inc.: 미국 캘리포니아주)) 또는 사이토톡스 96(CytoTox 96)® 비방사성 세포독성 검정법(프로메가(Promega: 미국 위스콘신주))을 포함한다.

별법으로 또는 추가로, TL1a 결합 단백질의 효과기 기능은 예컨대, US7317091에 기술되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 FcγR에 대한 그의 친화도를 측정함으로써 평가된다.

C1q 결합 검정법은 또한 TL1a 결합 단백질이 C1q와 결합할 수 있고, CDC를 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 검정법을 수행할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163, 1996] 참조).

또 다른 일례에서, TL1a 결합 단백질은 단백질의 반김기를 연장시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 신생아 Fc 영역(FcRn)에 대한 불변 영역의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 불변 영역은 더 낮은 pH, 예컨대, 약 pH 6.0에서 FcRn에 대하여 증가된 친화도를 가지며, 이로써 엔도좀에서의 Fc/FcRn 결합은 쉽게 이루어진다. 일례에서, 불변 영역은 약 pH 7.4에서의 그의 친화도와 비교하였을 때, 약 pH 6에서 FcRn에 대해 증가된 친화도를 가지며, 이로써, 세포 재순환 이후, Fc의 혈액 내로의 재방출은 용이하게 이루어진다. 상기 아미노산 치환은 혈액으로부터의 제거를 감소시킴으로써 TL1a 결합 단백질의 반감기를 연장시키는 데 유용하다.

예시적인 아미노산 치환으로는 EU 번호매김 체계에 따라, T250Q 및/또는 M428L 또는 T252A, T254S 및 T266F 또는 M252Y, S254T 및 T256E 또는 H433K 및 N434F를 포함한다. 추가의 또는 대안적 아미노산 치환은 예를 들어, US20070135620 또는 US7083784에 기술되어 있다.

안정화된 TL1a 결합 단백질

본 개시내용의 중화 TL1a 결합 단백질은 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. "안정화된 IgG4 불변 영역"라는 용어는 Fab 아암 교환, 또는 Fab 아암 교환 수행 성향, 또는 항체 절반부 형성 또는 항체 절반부를 형성하는 성향을 감소시키기 위해 변형된 IgG4 불변 영역을 의미한다는 것을 이해할 것이다. "Fab 아암 교환"이란, IgG4 중쇄 및 부착된 경쇄(분자의 절반부)가 또 다른 IgG4 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍과 교환된, 인간 IgG4에 대한 단백질 변형의 한 유형을 의미한다. 따라서, IgG4 분자는 상이한 두 항원을 인식하는 상이한 두 Fab 아암을 획득할 수 있다(이로써 이중특이성 분자가 형성된다). Fab 아암 교환은 천연적으로 생체내에서 일어나며, 이는 정제된 혈액 세포 또는 환원제, 예컨대, 환원된 글루타티온에 의해 시험관내에서 유도될 수 있다. "항체 절반부"는 IgG4 항체가 해리되어, 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 포함하는 2개의 분자를 형성할 때 형성된다.

일례에서, 안정화된 IgG4 불변 영역은 카바트의 체계에 따라 힌지 영역의 241번 위치에 프롤린을 포함한다(문헌 [Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991]). 상기 위치는 EU 번호매김 체계에 따라 힌지 영역의 228번 위치에 상응한다(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001] 및 [Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63: 78-85, 1969]). 인간 IgG4에서, 상기 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린 대신 세린으로 치환된 후, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 당업자는 "힌지 영역"이 항체의 두 Fab 아암에 가동성을 부여하며, Fc 및 Fab 영역을 연결하는, 항체 중쇄 불변 영역 중 프롤린이 풍부한 부위라는 것을 이해할 것이다. 힌지 영역은 중쇄간 이황화 결합에 관여하는 시스테인 잔기를 포함한다. 이는 일반적으로는 카바트의 번호매김 체계에 따라 인간 IgG1의 Glu226부터 Pro243까지에 이어져 있는 것으로 정의된다. 다른 IgG 이소타입의 힌지 영역은 중쇄간 이황화(S-S)를 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 같은 위치에 배치함으로써 IgG1 서열과 함께 정렬될 수 있다(예를 들어, WO2010/080538 참조).

돌연변이체 TL1a 결합 단백질

본 개시내용은 또한 본원에 개시된 서열과 80% 이상의 동일성을 가지는 TL1 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질 또는 핵산은 본원에 개시된 서열과 약 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 동일한 서열로서, 여기서, 단백질은 TL1a에 특이적으로 결합하고, TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않는 것을 포함한다.

별법으로 또는 추가로, TL1a 결합 단백질은 임의의 일례에 따라 본원에 기술된 바와 같은 V_H 또는 V_L의 CDR(들)과 약 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 동일한 CDR(예컨대, 3개의 CDR)을 포함하며, 여기서, 단백질은 TL1a에 특이적으로 결합할 수 있고, TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시킬 수 있고, 여기서, 단백질은 TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않는다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 그의 CDR 내에 다양한 서열을 가지는 다수의 항체를 제조하였다. 단백질 TL1a의 결합을 측정하고, TL1a와 DR3의 상호작용 또는 TL1a와 DcR3의 상호작용을 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다.

예를 들어, 본 발명자들은 카바트 번호매김 체계에 따라 TL1a 결합 단백질의 HCDR1에서 60%의 동일성을 공유하는 TL1a 결합 단백질 군, 및 카바트 번호매김 체계에 따라 그의 HCDR1에서 80%의 동일성을 공유하는 단백질의 또 다른 서브군을 확인하였다.

본 발명자들은 또한 카바트 번호매김 체계에 따라 TL1a 결합 단백질의 HCDR2에서 40%의 동일성 또는 47%의 동일성을 공유하는 TL1a 결합 단백질의 서브부류를 확인하였다.

본원에서 논의되는 바와 같이, 중쇄 CDR2의 5개의 C 말단 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환으로 돌연변이될 수 있다는 것 또한 알려져 있다(잔기 중 31%)(문헌 [Padlan et al., FASEB J. 9: 133-139, 1995]). 따라서, 단백질은 본원에 개시된 중쇄 CDR2 서열과 약 69% 이상의 동일성을 가지는 CDR2를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 본원에 기술된 항체 C320의 가변 영역의 변이체를 포함하는 단백질 부류를 확인하였다. 이러한 변이체를 통해 기능 손실 없이 치환될 수 있는, 가변 영역 내의 부위를 확인할 수 있다.

예를 들어, 본 발명자들은 기능 손실 없이 치환될 수 있는, 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 중의 수개의 잔기를 확인하였다. 따라서, 본 개시내용은 서열 번호 42에 기재된 서열과 약 86% 이상의 동일성을 가지는 V_H를 포함하는 단백질을 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 본원에서 언급된 기능은 보유하면서, 약 17개의 아미노산 치환을 가지는(즉, 서열 번호 42에 대한 동일성 약 86%), 서열 번호 42의 변형된 형태를 제조하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 본원에서 언급된 기능은 보유하면서, 서열 번호 42에 대하여 약 90 또는 94%의 동일성을 가지는 서열 번호 42의 변형된 형태를 제조하였다. 일례에서, 서열은 서열 번호 42에 기재된 서열과 약 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 이상의 동일성을 가진다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 서열 번호 42에 기재된 서열과 약 97% 또는 98% 또는 99%의 동일성을 가지는 단백질을 제조하였다. 일례에서, 서열은 서열 번호 42에 기재된 서열과 약 99% 이상의 동일성을 가진다. 일례에서, 서열은 서열 번호 42에 기재된 서열과 약 99.2% 이상의 동일성을 가진다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 1 내지 17개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17개의 아미노산 치환을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 FR 중 1 내지 17개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 FR 중 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17개의 아미노산 치환을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 CDR3 중 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 CDR3 중 1 또는 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일례에서, 치환은 서열 번호 42의 99 또는 101 또는 104 또는 108번 위치 중 하나 이상의 위치에 존재하지 않는다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 단백질의 당화를 방해하거나 감소시키기 위한 하나 이상의 치환을 포함하며, 여기서, 치환(들)은 서열 번호 42의 아미노산 72 내지 76 사이에 위치한다. 예를 들어, 단백질은 서열 번호 42의 71번 위치에 아르기닌 대신 알라닌을, 및/또는 72번 위치에 아스파라긴 대신 아스파르트산을, 및/또는 73번 위치에 트레오닌 대신 아르기닌을, 및/또는 75번 위치에 이소류신 대신 트레오닌을 포함한다.

일례에서, 단백질의 V_H는 당화되지 않은 것이고/거나, N 연결된 당화를 위한 컨센서스 부위를 포함하지 않는다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 서열 번호 42의 16번 위치에 세린을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 41번 위치에 프롤린을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 74번 위치에 아르기닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 서열 번호 42의 49번 위치에 글루탐산 또는 글리신을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린 및 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린 및 51번 위치에 류신 및 72번 위치에 알라닌 및 73번 위치에 아스파르트산 및 74번 위치에 아르기닌 및 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린 및 51번 위치에 류신 및 72번 위치에 알라닌 및 73번 위치에 아스파르트산 및 74번 위치에 아르기닌 및 76번 위치에 트레오닌 및 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

본 발명자들은 치환될 수 있는 HCDR2 내의 부위를 확인하였다. 문헌 [Padlan et al., 상기 문헌 동일]의 관찰 결과와 결부시켜 볼 때, 따라서, 본 개시내용은 서열 번호 44에 기재된 서열과 약 65% 이상 동일한 서열을 가지는 CDR2를 포함하는 V_H를 포함하는 단백질을 제공한다. 일례에서, 동일성(%)은 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 90% 이상이다. 일례에서, 동일성(%)은 약 94%이상이다.

본 발명자들은 치환될 수 있는 HCDR3 내의 많은 부위를 확인하였다. 따라서, 본 개시내용은 서열 번호 45에 기재된 서열과 약 60% 이상 동일한 서열을 가지는 CDR3을 포함하는 V_H를 포함하는 단백질을 제공한다. 일례에서, 동일성(%)은 예컨대, 본원에 예시된 바와 같이, 서열 번호 45에 기재된 서열과 약 70% 이상 동일하다. 일례에서, 동일성(%)은 약 75% 또는 80% 또는 90% 이상이다. 일례에서, 동일성(%)은 약 90% 이상이다.

일례에서, 서열 번호 45의 돌연변이형은 서열 번호 45의 1번 위치에 글루탐산 및/또는 서열 번호 45의 3번 위치에 프롤린 및/또는 서열 번호 45의 6번 위치에 알라닌을 포함한다. 임의적으로, 돌연변이형은 추가로 서열 번호 45의 8번 위치에 페닐알라닌 및/또는 서열 번호 45의 10번 위치에 티로신을 포함한다.

돌연변이될 수 있는 추가의 잔기는 도 1C-1E, 및 서열 번호 94, 137, 152, 162 및 173에 기재되어 있다.

일례에서, 본 발명자들은 기능 손실 없이 치환될 수 있는, 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L 중의 수개의 잔기를 확인하였다. 따라서, 본 개시내용은 서열 번호 46에 기재된 서열과 약 95% 이상의 동일성을 가지는 V_L을 포함하는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명자들은 기능 손실 없이 V_L 중 32개의 잔기를 돌연변이시켰으며, 이는 본 개시내용이 서열 번호 46에 기재된 서열과 약 71% 이상의 동일성을 가지는 단백질을 제공한다는 것을 의미한다. 일례에서, 동일성(%)은 약 75% 또는 80% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 이상이다. 일례에서, 동일성(%)은 약 98% 이상이다. 일례에서, 동일성(%)은 약 99% 이상이다. 일례에서, 동일성(%)은 약 99.1% 이상이다.

TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42와 비교하여 1 내지 17개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46과 비교하여 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17 또는 18 또는 19 또는 20 또는 21 또는 22 또는 23 또는 24 또는 25 또는 26 또는 27 또는 28 또는 29 또는 30 또는 31 또는 32개의 아미노산 치환을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46과 비교하여 FR 중 1 내지 32개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46과 비교하여 FR 중 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9 또는 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17 또는 18 또는 19 또는 20 또는 21 또는 22 또는 23 또는 24 또는 25 또는 26 또는 27 또는 28 또는 29 또는 30 또는 31 또는 32개의 아미노산 치환을 포함한다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46과 비교하여 CDR 중 1 내지 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46과 비교하여 CDR 중 1 또는 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 일례에서, 치환은 서열 번호 46의 34, 54, 94번 위치 중 하나 이상의 위치에 존재하지 않는다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 서열 번호 46의 24번 위치에 세린을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 서열 번호 46의 81번 위치에 글루타민을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 46에 기재된 서열의 돌연변이체로서, 여기서, 돌연변이체 서열은 적어도 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함하는 것인 돌연변이체를 포함한다.

본 발명자들은 치환될 수 있는 LCDR1 내의 복수의 부위를 확인하였다. 따라서, 본 개시내용은 서열 번호 47에 기재된 서열과 약 60% 이상 동일한 서열을 가지는 CDR1을 포함하는 V_L을 포함하는 단백질을 제공한다. 일례에서, 동일성(%)은 약 70% 또는 75% 또는 80% 또는 90% 이상이다. 예를 들어, 본 발명자들은 서열 번호 47에 기재된 서열을 포함하는 LCDR1 내 두 부위를 돌연변이시켜 언급된 서열과 약 86% 이상의 동일성을 가지는 단백질을 제조하였다. 일례에서, 동일성(%)은 약 90% 이상이다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 서열 번호 42에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 46에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하며, 여기서, V_H 및/또는 V_L은 하기 치환, 또는 치환 군 중 하나 이상을 포함한다:

(i) V_H는 적어도 서열 번호 42의 16번 위치에 세린을 포함하거나;

(ii) V_L은 적어도 서열 번호 46의 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(iii) V_L은 적어도 서열 번호 42의 81번 위치에 글루타민을 포함하거나;

(iv) V_H는 적어도 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린 및 51번 위치에 류신 및 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 적어도 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌을 포함하거나;

(v) V_H는 적어도 각각 서열 번호 42와 비교하여 41번 위치에 프롤린 및 51번 위치에 류신 및 72번 위치에 알라닌 및 73번 위치에 아스파르트산 및 74번 위치에 아르기닌 및 102번 위치에 글루탐산 및 105번 위치에 알라닌을 포함하고, V_L은 적어도 각각 서열 번호 46과 비교하여 23번 위치에 트레오닌 및 24번 위치에 세린 및 76번 위치에 트레오닌 및 51번 위치에 글루탐산을 포함한다.

또 다른 일례에서, 본 개시내용의 핵산은 본원에 기재된 서열과 약 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 이상 동일하고, TL1a에 특이적으로 결합할 수 있고, TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시킬 수 있는 TL1a 결합 단백질을 코딩하는 서열로서, 여기서, 단백질은 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는 것인 서열을 포함한다. 본 개시내용은 또한 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 본원에 예시된 서열과는 상이한, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.

핵산 또는 폴리펩티드의 동일성(%)은 갭 형성 패널티=5, 미 갭 연장 패널티=0.3을 이용하여 GAP(문헌 [Needleman and Wunsch. Mol . Biol . 48, 443-453, 1970]) 분석(GCG 프로그램)에 의해 측정한다. 질의 서열의 길이는 50개 이상의 잔기 길이이고, GAP 분석은 50개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 예를 들어, 질의 서열의 길이는 100개 이상의 잔기 길이이고, GAP 분석은 100개 이상의 잔기로 이루어진 영역에 걸쳐 두 서열을 정렬한다. 예를 들어, 두 서열은 그의 전장에 걸쳐 정렬된다.

상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용은 또한 엄격한 혼성화 조건하에서 본원에 기술된 TL1a 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 예컨대, 항체 C319, C320, C321, C323, C333, C334, C336, C320-3, C320-5, C320-90, C320-103, C320-114, C320-115, C320-120, C320-129, C320-130, C320-135, C320-162, C320-163, C320-164, C320-165, C320-166, C320-167, C320-168, C320-169, C320-170, C320-171, C320-172, C320-179 또는 C320-183의 V_H 또는 V_L을 코딩하는 핵산에 혼성화하는 핵산을 고려한다. 본원에서 "중간 정도의 엄격도"란 혼성화 및/또는 세척을 2 x SSC 완충제, 0.1% (w/v) SDS 중 45℃ 내지 65℃ 범위의 온도에서, 또는 등가의 조건하에서 수행하는 것으로 정의된다. "고도의 엄격도"란 혼성화 및/또는 세척을 0.1 x SSC 완충제, 0.1% (w/v) SDS, 또는 더 낮은 염 농도, 및 65℃ 이상의 온도에서, 또는 등가의 조건하에서 수행하는 것으로 정의된다. 본원에서 특정의 엄격도 수준으로 언급되는 것은 당업자에게 공지된 SSC 이외의 세척/혼성화 용액을 사용하는 등가의 조건을 포함한다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산의 가닥들이 해리되는 온도를 계산하는 방법(이는 용융 온도, 또는 Tm으로도 알려져 있다)은 당업계에 공지되어 있다. 핵산의 Tm과 유사하거나(예컨대, 5℃ 이내, 또는 10℃ 이내), 그와 동일한 온도를 고도의 엄격도인 것으로 간주한다. 중간 정도의 엄격도는 핵산의 계산된 Tm의 10℃ 내지 20℃, 또는 10℃ 내지 15℃ 이내에 있는 것으로 간주된다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 서열과 비교하여 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질이 돌연변이형을 고려한다. 일부 예에서, TL1a 결합 단백질은 10개 이하, 예컨대, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄 및/또는 수치(hydropathicity) 및/또는 친수성을 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β 분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 수치 지수는 예를 들어, 문헌 [Kyte and Doolittle J. Mol. Biol, 157: 105-132, 1982]에 기술되어 있고, 친수성 지수는 예컨대, US4554101에 기술되어 있다.

본 개시내용은 또한 비보존적 아미노산 변이를 고려한다. 예를 들어, 하전된 아미노산이 또 다른 하전된 아미노산으로, 및 중성 또는 양으로 하전된 아미노산으로 치환된 것이 특히 관심의 대상이 된다. 일부 예에서, TL1a 결합 단백질은 10개 이하, 예컨대, 9 또는 8 또는 7 또는 6 또는 5 또는 4 또는 3 또는 2 또는 1개의 비보존적 아미노산 치환을 포함한다.

일례에서, 돌연변이(들)는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 항원 결합 도메인의 FR 내에서 이루어진다. 또 다른 일례에서, 돌연변이(들)는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 CDR 내에서 이루어진다.

TL1a 결합 단백질의 돌연변이형을 제조하는 방법의 예로는 하기를 포함한다:

· DNA(문헌 [Thie et al., Methods Mol . Biol . 525: 309-322, 2009]) 또는 RNA(문헌 [Kopsidas et al., Immunol . Lett . 707: 163-168, 2006]; [Kopsidas et al., BMC Biotechnology , 7: 18, 2007]; 및 WO1999/058661)의 돌연변이 유발법;

· 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 돌연변이 유발 인자 세포, 예컨대, XL-1Red, XL-mutS 및 XL-mutS-Kanr 박테리아 세포(스트라진(Stratagene)) 내로 도입하는 방법;

· 예컨대, 문헌 [Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994]에 개시되어 있는 것과 같은, DNA 셔플링; 및

· 예컨대, 문헌 [Dieffenbach (ed) and Dveksler (ed) (In: PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1995)]에 기술되어 있는 것과 같은, 부위 지정 돌연변이 유발법.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 돌연변이체의 생물학적 활성을 측정하는 예시적인 방법은 당업자에게 자명할 것이고/거나, 예컨대, 항원 결합과 같이, 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 항원 결합, 결합의 경쟁적 억제, 친화도, 회합, 해리 및 치료학적 효능을 측정하는 방법은 본원에 기술되어 있다.

예시적인 TL1a -결합 단백질

본 발명자들에 의해 제조된, 예시적인 가변 영역 포함 TL1a 결합 단백질, 및 그의 코딩 핵산은 하기 표 1 및 2에 기술되어 있다.

[표 1]

[표 2]

단백질 제조 방법

재조합 발현

본원에서 논의되는 바와 같이, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질(및/또는 상기 TL1a 결합 단백질에 포함된 폴리펩티드)을 코딩하는 핵산을, 상기 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결시켜 그의 발현이 용이하게 이루어질 수 있도록 발현 구성물에 도입시킨다. 발현 구성물을 제조하는 방법, 예컨대, 발현 구성물/벡터로 클로닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/거나, 문헌 [Ausubel et al., (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987)], 및 [(Sambrook et al., (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)] 및 US7270969에 기술되어 있다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 박테리아 세포에서 발현된다. 박테리아 세포, 예컨대, E. 콜라이(E. coli), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp .), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp .), 살모넬라 속(Salmonella sp .), 바실러스 속(Bacillus sp .), 및 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .)으로부터 선택되는 박테리아 세포에서의 발현을 위해 적합한 전형적인 프로모터로는 프로모터, 예컨대, lacz , Ipp, 온도 감응성(_L 또는 (_R 프로모터, T7, T3, SP6 또는 반인공 프로모터, 예컨대, IPTG 유도성 tac 프로모터 또는 lacUV5 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 일례에서, TL1a 결합 단백질은 효소 세포에서 발현된다. 효모 세포, 예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 S. 폼베(S. pombe)에서의 발현을 위해 적합한 전형적인 프로모터로는 하기 유전자 ADH1 , GAL1 , GAL4 , CUP1 , PH05 , nmt , RPR1 , 또는 TEF1 로부터 선택되는 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

추가의 일례에서, TL1a 결합 단백질은 곤충 세포에서 발현된다. 곤충 세포에서, 또는 곤충에서의 발현을 위해 적합한 전형적인 프로모터로는 OPEI2 프로모터, 봄빅스 모리(Bombyx mori)로부터 단리된 곤충 액틴 프로모터, 드로소필라 속(Drosophila sp .) dsh 프로모터(문헌 [Marsh et al., Hum . Mol . Genet . 9: 13-25, 2000])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 또한 식물 세포에서 발현될 수 있다. 식물 세포에서의 펩티드 발현을 위한 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) 아밀라제 유전자 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 노팔린 신타제(NOS: nopaline synthase) 유전자 프로모터, 옥신 유도성 식물 프로모터 P1 및 P2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 포유동물 세포에서, 또는 포유동물에서 발현된다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 적합한 전형적인 프로모터로는 예를 들어, 레트로바이러스 LTR 요소, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, CMV IE(사이토메갈로바이러스 즉시 초기(cytomegalovirus immediate early)) 프로모터, EF₁ 프로모터(인간 신장 인장 1elongation factor 1)로부터의 것), EM7 프로모터, UbC 프로모터(인간 유비퀴틴 C로부터의 것)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7); 인간 배아 신장 세포주(human embryonic kidney line)(HEK293 세포); 새기 햄스터 신장 세포(BHK: baby hamster kidney); 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO: Chinese hamster ovary); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 또는 골수종 세포(예컨대, NS/0 세포)를 포함한다.

다른 발현 구성물/벡터 요소가 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 인핸서, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 서열, 선별가능한 또는 검출가능한 마커를 코딩하는 핵산, 및 복제 기점을 포함한다.

일례에서, 발현 구성물은 이시스트론성 발현 구성물이다.

"이시스트론성"이란 단일 핵산 분자가 핵산의 다른 영역으로 2개의 상이한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것, 예를 들어, 단일 핵산이 상이한 폴리펩티드로서 V_H 포함 폴리펩티드 및 V_L 포함 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 일반적으로, 각 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 영역은 내부 리보좀 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)에 의해 이격되어 있고, IRES의 영역 5'는 전사 종결 서열을 포함하지 않는다. 예시적인 IRES는 예를 들어, US20090247455에 기술되어 있다.

적합한 발현 구성물을 제조한 후, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 적합한 세포 내로 도입한다. 예시적인 방법으로는 특히 미세주입법, DEAE-덱스트란에 의해 매개된 형질감염, 예컨대, 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하는 리포좀에 의해 매개된 형질감염, PEG 매개 DNA 흡수, 전기천공법 및 예컨대, DNA 코팅된 텅스텐 또는 금 입자(아그라시터스 인크.(Agracetus Inc.: 미국 위스콘신주)를 사용함으로써 이루어지는 마이크로입자 충격을 포함한다.

이어서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 제조하는 데 사용되는 세포를 당업계에 공지된, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 제조하기 위한 조건하에서 배양한다.

무세포 발현 시스템, 예컨대, TNT T7 및 TNT T3 시스템(프로메가), pEXP1-DEST 및 pEXP2-DEST 벡터(인비트로겐(Invitrogen)) 또한 본 개시내용에 의해 고려된다.

단백질 정제

제조/발현 후, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정제한다. 상기 정제를 통해 비특이 단백질, 산, 지질, 탄수화물 등을 실질적으로 함유하지 않는 본 개시내용의 단백질을 제공한다. 일례에서, 단백질은 제제 중 90% 초과(예컨대, 95%, 98% 또는 99%)의 단백질이 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질인 것인 것으로 제제 중에 존재하게 될 것이다.

각종 고압(고성능) 액체 크로마토그래피(HPLC: high-pressure (or performance) liquid chromatography) 및 비HPLC 폴리펩티드 단리 프로토콜, 예컨대, 크기 배제, 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합형 모드 크로마토그래피, 상 분리 방법, 전기영동 분리, 침전 방법, 염해/염석 방법, 면역크로마토그래피, 및/또는 다른 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표준 펩티드 정제 방법을 사용하여 본 개시내용의 단리된 TL1a 결합 단백질을 수득한다.

일례에서, 친화도 정제는 표지를 포함하는 융합 단백질을 단리시키는 데 유용하다. 친화도 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 표지(폴리히스티딘 태그인 경우, 예를 들어, 니켈-NTA)에 결합하는 항체 또는 화합물을 고체 지지체 상에 고정화시킨다. 이어서, 단백질을 포함하는 시료를 결합이 이루어질 수 있는 충분한 시간 동안 및 그러한 조건하에서 고정화된 항체 또는 화합물에 접촉시킨다. 세척하여 임의의 비결합 또는 비특이 결합 단백질을 제거한 후, 단백질을 용리시킨다.

항체의 Fc 영역을 포함하는 TL1a 결합 단백질인 경우, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 그의 변형된 형태가 친화도 정제에 사용될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄 Fc 영역을 포함하는 정제된 단백질을 단리시키는 데 유용하다. 단백질 G는 모든 마우스 Fc 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권고된다.

컨쥬게이트

일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 화합물에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위 원소, 검출가능한 표지, 치료학적 화합물, 콜로이드, 독소, 핵산, 펩티드, 단백질, 피험체에서 TL1a 결합 단백질의 반감기를 연장시키는 화합물 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 화합물은 TL1a 결합 단백질에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다(예컨대, 간접 결합인 경우, 링커를 포함할 수 있다. 화합물의 예로는 방사성 동위 원소(예컨대, 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-III), 검출가능한 표지(예컨대, 형광단 또는 형광성 나노결정 또는 양자점), 치료학적 화합물(예컨대, 화학요법제 또는 항염증제), 콜로이드(예컨대, 금), 독소(예컨대, 리신 또는 파상풍 톡소이드), 핵산, 펩티드(예컨대, 혈청 알부민 결합 펩티드), 단백질(예컨대, 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 또는 혈청 알부민), 피험체에서 TL1a 결합 단백질의 반감기를 연장시키는 화합물(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 또는 상기 활성을 가지는 다른 수용성 중합체) 및 그의 혼합물을 포함한다. 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질에 컨쥬게이트될 수 있는 예시적인 화합물 및 상기 컨쥬게이션 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, WO2010/059821에 기술되어 있다.

TL1a 결합 단백질은 (예를 들어, 문헌 [Kogan et al., Nanomedicine ( Lond ). 2: 287-306, 2007]에 리뷰되어 있는 바와 같이) 나노입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 나노입자는 금속성 나노입자일 수 있다.

TL1a 결합 단백질은 (예를 들어, PCT/IB2005/000204에 기술되어 있는 바와 같이) 항체 표적화된 박테리아 미니세포에 포함되어 있을 수 있다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질에 컨쥬게이트될 수 있는 일부 예시적인 화합물은 하기 표 3에 열거되어 있다.

[표 3]

스크리닝 검정법

본 개시내용의 항체 결합 도메인을 포함하는 TL1a 결합 단백질은 예컨대, 하기 기술되는 바와 같이, 생물학적 활성에 대해 쉽게 스크리닝된다.

결합 검정법

검정법 중 한 형태는 예컨대, 문헌 [Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)]에 기술되어 있는 바와 같은, 항원 결합 검정법이다. 상기 방법은 일반적으로 TL1a 결합 단백질을 표지화하고, 이를 고정화된 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다. 세척하여 비특이 결합 단백질을 제거한 후, 표지의 양, 및 그 결과로서 결합된 단백질의 양을 검출한다. 물론, TL1a 결합 단백질을 고정화시키고, 항원을 표지화시킬 수도 있다. 패닝 유형의 검정법, 예컨대, 본원에 기술되어 있거나, 예시화되어 있는 것 또한 사용될 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 표면 플라즈몬 공명 검정법이 사용될 수 있다.

일례에서, TL1a의 에피토프를 포함하는 펩티드를 이용하여 결합 검정법을 수행한다. 이러한 방식으로, TL1a의 특이 영역에 결합하는 TL1a 결합 단백질을 선별한다.

TL1a 와 DR3 의 상호작용 억제

TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키는 TL1a 결합 단백질을 확인하는 방법은 본원의 설명에 기초하여 자명해질 것이다.

예를 들어, DR3(예컨대, 2 ㎍/ml의 DR3)을 표면 상에 고정화시키고, TL1a(예컨대, 1 ㎍/ml TL1a)와, 그리고, 테스트하고자 하는 TL1a 결합 단백질과 접촉시킨다(대조군의 경우, 이소타입이 매칭되는 대조군 항체를 첨가한다). TL1a 결합 단백질 부재하에서의 수준과 비교하였을 때, TL1a 결합 단백질의 존재하에서 DR3에 결합한 TL1a의 수준이 감소하였다면, 이는 TL1a 결합 단백질이 TL1a의 DR3에의 결합을 억제시킨다는 것을 나타내는 것이다. 본 검정법은 또한 DR3이 접촉하게 되는 고정화된 TL1a를 사용함으로써 수행될 수 있다. 본 검정법은 또한 검출을 지원하기 위해 표지화된 TL1a 및/또는 DR3을 사용함으로써 수행될 수 있다.

일부 예에서, 다양한 농도의 TL1a 결합 단백질을 테스트하여, TL1a 결합 단백질에 의해, TL1a의 DR3에의 결합에 대한 최대 억제의 50%를 달성하게 되는 농도(상기 농도는 EC₅₀으로 알려져 있다)를 측정한다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 EC₅₀은 약 5 nM 또는 4 nM 또는 3.5 nM 또는 3 nM 또는 2.5 nM 또는 2.3nM 또는 1 nM 또는 0.5 nM 미만이다. 일례에서, EC₅₀은 3 nM 미만이다. 일례에서, EC₅₀은 2.5 nM 미만이다. 일례에서, EC₅₀은 1 nM 미만이다. 일례에서, EC₅₀은 0.5 nM 미만이다.

일부 예에서, TL1a와 DR3의 상호작용에 대한 최대 억제는 TL1a 결합 단백질의 존재 및 부재하에서 TL1a와 DR3의 상호작용 수준을 측정함으로써 평가된다. 이어서, 상기 단백질의 존재하에서의 TL1a와 DR3의 상호작용 억제 수준을 상기 단백질의 부재하에서의 상호작용 수준에 대한 백분율(%)로서 표시한다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DR3 사이의 상호작용을 약 80% 이상 억제시킨다. 예를 들어, 억제율(%)은 약 84% 또는 85% 또는 90% 또는 93% 또는 94% 또는 95% 이상이다. 일례에서, 억제율(%)은 약 93% 이상이다. 일례에서, 억제율(%)은 약 94% 이상이다. 일례에서, 억제율(%)은 항체 Fc 영역에 융합된 DR3을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 평가된다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 약 10 ㎍/ml 농도로 사용된다.

TL1a 와 DR3 의 상호작용에 대한 선택적 억제

TL1a와 DcR3이 아닌, TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키는 TL1a 결합 단백질을 확인하는 방법은 당업자에게 자명하고/거나, 본원에 기술될 것이다.

예를 들어, DcR3(예컨대, 2 ㎍/mL DcR3)을 표면 상에 고정화시키고, TL1a(예컨대, 1 ㎍/ml TL1a)와, 그리고, 테스트하고자 하는 TL1a 결합 단백질과 접촉시킨다(음성 대조군의 경우, 이소타입이 매칭되는 대조군 항체를 사용한다). 이어서, DcR3에 결합된 TL1a의 수준을 측정하였다. TL1a 결합 단백질 부재하에서의 수준과 비교하였을 때, TL1a 결합 단백질의 존재하에서 DcR3에 결합한 TL1a의 수준이 감소하였다면, 이는 TL1a 결합 단백질이 TL1a의 DcR3에의 결합을 억제시킨다는 것을 나타내는 것이다. TL1a 결합 단백질의 존재 또는 부재하에서의 결합된 TL1a의 수준이 유사하였다면, 이는 TL1a 결합 단백질이 TL1a와 DcR3의 상호작용을 억제시키지 않는다는 것을 나타내는 것이다. 본 검정법은 또한 DcR3이 접촉하게 되는 고정화된 TL1a를 사용함으로써 수행될 수 있다.

일부 예에서, 다양한 농도의 TL1a 결합 단백질을 테스트하여 상이한 농도에서의 DcR3과의 TL1a 상호작용 억제 수준을 측정한다.

일부 예에서, TL1a와 DcR3의 상호작용에 대한 최대 억제는 TL1a 결합 단백질의 존재 및 부재하에서 TL1a와 DcR3의 상호작용 수준을 측정함으로써 평가된다. 이어서, 상기 단백질의 존재하에서의 TL1a와 DcR3의 상호작용 억제 수준을 상기 단백질의 부재하에서의 상호작용 수준에 대한 백분율(%)로서 표시한다. 일례에서, 10 ㎍/ml 농도의 TL1a 결합 단백질은 TL1a와 DcR3 사이의 상호작용을 25% 이하로 억제시킨다. 예를 들어, 억제율(%)은 20% 이하 또는 18% 이하 또는 15% 이하 또는 12% 이하 또는 10% 이하 또는 8% 이하 또는 5% 이하이다. 일례에서, 억제율(%)은 약 18% 이하이다. 일례에서, 억제율(%)은 약 7% 이하이다. 일례에서, 억제율(%)은 약 5% 이하이다. 일례에서, 억제율(%)은 항체 Fc 영역에 융합된 DcR3을 포함하는 폴리펩티드를 사용하여 평가된다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 약 10 ㎍/ml 농도로 사용된다.

중화 검정법

DR3을 통해 TL1a 활성을 중화시키는 TL1a 결합 단백질을 확인하는 방법은 또한 예컨대, 본원의 설명에 기초하여 자명해질 것이다.

예를 들어, DR3 발현 세포(예컨대, TF-1 세포)(예컨대, 약 7x10⁴개의 세포 내지 8x10⁴개의 세포(예컨대, 7.5x10⁴개의 세포)를 테스트하고자 하는 TL1a 결합 단백질의 존재 또는 부재하에서 TL1a 및 단백질 합성 억제제(예컨대, 사이클로헥시미드)와 접촉시킨다. 이어서, 세포의 아폽토시스 수준을 예컨대, 카스파제 활성화 또는 프로피디움 요오다이드 흡수를 검출함으로써, 또는 다른 공지 검정법에 의해 평가한다. TL1a 결합 단백질의 부재하의 아폽토시스 수준과 비교하여 아폽토시스 수준을 감소시킨 TL1a 결합 단백질은 DR3을 통해 TL1a 활성을 억제시키거나, TL1a 활성을 중화시키는 것으로 간주된다.

일부 예에서, 다양한 농도의 TL1a 결합 단백질을 테스트하여 상이한 농도에서의 중화 수준을 측정한다. 일부 예에서, TL1a 결합 단백질에 의한, 아폽토시스의 최대 억제의 50%를 달성하는 농도(상기 농도는 EC₅₀으로 알려져 있다)를 측정한다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 EC₅₀은 3 nM 이하, 예를 들어, 약 2.5 nM 이하, 예컨대, 약 2.4 nM 이하, 예를 들어, 약 2 nM 이하, 예컨대, 약 1.5 nM 이하, 예컨대, 약 1 nM 이하이다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 EC₅₀은 약 0.99 nM 이하이다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 EC₅₀은 약 0.6 nM 이하이다. 일례에서, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 EC₅₀은 약 0.4 nM 이하이다.

TL1a 활성을 중화시킬 수 있는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 능력은 또한 면역 세포에 의한 시토카인 분비를 감소시킬 수 있는 그의 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, PBMC를 TL1a 결합 단백질의 존재 또는 부재하에서 콘카나발린 A와 접촉시킨다. 이어서, 예컨대, ELSIA를 이용하여 TL1a 유도성 시토카인(예컨대, 인터페론 γ 또는 IL-13)의 분비 수준을 평가한다. TL1a 결합 단백질의 부재하에서의 것과 비교하여 상기 단백질 존재하에서 시토카인의 분비가 감소하였다면, 이는 TL1a 결합 단백질이 TL1a 활성을 중화시킨다는 것을 나타내는 것이다.

일부 예에서, 다양한 농도의 TL1a 결합 단백질을 테스트하여 상이한 농도에서의 시토카인 분비 감소 수준을 측정한다. 일부 예에서, TL1a 결합 단백질에 의한, 시토카인 분비의 최대 억제의 50%를 달성하는 농도(상기 농도는 EC₅₀으로 알려져 있다)를 측정한다. 예를 들어, 인터페론-γ 분비를 억제시키기 위한 EC₅₀은 4 nM 이하, 예컨대, 3 nM 이하 또는 2.5 nM 이하 또는 2 nM 이하이다. 또 다른 일례에서, IL-13 분비를 억제시키기 위한 EC₅₀은 15 nM 이하, 예컨대, 10 nM 이하, 예를 들어, 5 nM 이하, 예컨대, 1 nM 이하이다. 예를 들어, IL-13 분비를 억제시키기 위한 EC₅₀은 0.5 nM 이하이다.

TL1a 활성의 중화를 측정하는 다른 검정법으로는 TL1a 결합 단백질의 존재 및 부재하에서의 내피 세포의 증식, 이동 및 관 형성 수준을 측정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 내피 세포를 세포외 매트릭스, 예컨대, 마트리겔(Matrigel)™ 중에서 배양하고, 예컨대, 현미경법을 사용하여 이동 및 관 형성 수준을 측정한다. TL1a 결합 단백질 부재하에서의 것과 비교하여 TL1a 결합 단백질 존재하에서 이동 및 관 형성이 증가하였다면, 이는 TL1a 결합 단백질이 DR3을 통한 TL1a 활성을 중화시킨다는 것을 나타내는 것이다.

예컨대, 본질적으로 문헌 [Bagley et al., Cancer Res 63: 5866, 2003]에 기술되어 있는 바와 같이, 생체내 마트리겔™ 플러그 검정법 또한 수행될 수 있다.

추가의 검정법으로는 IL-12 및/또는 IL-18로 자극받은 말초 혈액 T 세포 및/또는 NK 세포로부터의, 또는 FcγR 활성화된 단핵구에서의 인터페론 γ 분비를 감소 또는 방해하는 TL1a 결합 단백질의 능력을 평가하는 것을 포함한다.

생체내 검정법

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 또한 병태, 예컨대, TL1a 매개 병태를 앓는 동물 모델에서의 치료학적 효능에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질을 염증성 장 질환 또는 결장염을 앓는 모델(예컨대, 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도성 결장염 또는 CD45Rb 입양 전달인 결장염 모델(예컨대, 문헌 [Kanai et al., Inflamm . Bowel Dis . 12: 89-99, 2006])에 투여한다. 또 다른 일례에서, TL1a 결합 단백질을 다발성 경화증을 앓는 모델, 예컨대, 마우스 또는 래트를 미엘린초 단백질 또는 그로부터 유래된 펩티드(예컨대, MOG, MBP 또는 PLP)로 면역화시키고, 상기 단백질에 대한 면역 반응을 일으켜 다발성 경화증을 앓는 모델을 유도한 EAE 모델에 투여한다. 예시적인 EAE 모델은 예를 들어, 문헌 [Tsunoda and Fujinami, J. Neuropathol . Exp . Neurol . 55: 673-686, 1996]에 리뷰되어 있다. TL1a 결합 단백질은 또한 또는 별법으로 관절염을 앓는 모델, 예컨대, SKG 마우스 계통(문헌 [Sakaguchi et al., Nature 426: 454-460, 1995]), 래트 II형 콜라겐 관절염 모델, 마우스 II형 콜라겐 관절염 모델 또는 항원 유도성 관절염 모델(문헌 [Bendele J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 377-385, 2001]) 및/또는 염증성 기도 질환을 앓는 모델(예를 들어, OVA 시험감염 또는 바퀴벌레 항원 시험감염)에서, 또는 염증성 포도막염을 앓는 모델, 예를 들어, 광수용체간 레티노이드 결합 단백질 면역화 유도성 포도막 망막염을 앓는 모델(문헌 [Caspi, Curr Protoc Immunol Chapter 15: unit 15.6, 2003])에서 테스트될 수 있다.

TL1a 활성을 중화시킬 수 있는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 능력은 또한 또는 별법으로 이식편 대 숙주 반응 모델, 예컨대, 한 동물로부터의 비장 세포를 동종 동물(예컨대, MHC 또는 HLA가 매칭되지 않는 동물) 내로 주사한 것인 모델에서 평가될 수 있다.

에피토프 지도화 검정법

또 다른 일례에서, 본원에 기술된 단백질이 결합하는 에피토프를 지도화한다. 에피토프 지도화 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, TL1a 서열 또는 관심 에피토프를 포함하는 그의 영역에 걸쳐 있는 일련의 중복 펩티드, 예컨대, 10 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 제조한다. 이어서, TL1a 결합 단백질을 각 펩티드 또는 그의 조합과 접촉시키고, 상기 단백질이 결합한 펩티드(들)를 측정하였다. 이를 통해 TL1a 결합 단백질이 결합하는 에피토프를 포함하는 펩티드(들)를 측정할 수 있다. 상기 단백질이 다중의 비인접한 펩티드에 결합한다면, 단백질은 입체형태적 에피토프에 결합하는 것일 수 있다.

별법으로, 또는 추가로, 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해 TL1a 내의 아미노산 잔기를 돌연변이화시키고, 단백질 결합을 감소 또는 방해하는 돌연변이를 측정한다. TL1a 결합 단백질의 결합을 감소 또는 방해하는 임의의 돌연변이는 단백질이 결합하는 에피토프 내에 위치할 가능성이 있다. 이러한 형태의 방법은 본원에 예시되어 있다.

추가 방법으로는 TL1a 또는 그의 영역을 고정화된 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질에 결합시키고, 생성된 복합체를 프로테아제로 분해하는 것을 포함한다. 이어서, 고정화된 단백질에 결합된 상태 그대로 남아있는 펩티드를 단리시키고, 예컨대, 질량 분석법을 사용하여 분석함으로써 그의 서열을 측정한다.

친화도 검정법

임의적으로, TL1a, 또는 그의 에피토프를 포함하는 펩티드에 대한 TL1a 결합 단백질의 해리 상수(Kd) 또는 회합 상수(Ka) 또는 평형 상수(KD)를 측정한다. 일례에서, TL1a 결합 단백질의 상기와 같은 상수는 방사성 표지화된 또는 형광 표지화된 TL1a 결합 검정법에 의해 측정된다. 상기 검정법에서는 일련으로 적정된 비표지화된 TL1a의 존재하에서 최소 농도의 표지화된 TL1a로 상기 단백질을 평형화시킨다. 세척하여 비결합 TL1a를 제거한 후, 표지의 양을 측정한다.

친화도 측정은 하체 반응에 대한 표준 방법, 예를 들어, 면역검정법, 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)(문헌 [Rich and Myszka Curr . Opin . Biotechnol 11::54, 2000]; [Englebienne Analyst . 123: 1599, 1998]), 등온 적정 열량 측정(ITC: isothermal titration calorimetry) 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 동력학적 상호작용 검정법에 의해 측정될 수 있다.

일례에서, 상수는 고정화된 TL1a 또는 그의 영역을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 검정법, 예컨대, 비아코어(BIAcore) 표면 플라즈몬 공명(비아코어, 인코퍼레이티드(BIAcore, Inc.: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)을 사용함으로써 측정된다. 예시적인 SPR 방법은 US7229619에 기술되어 있다.

일례에서, 임의의 일례에 따른 본원에 기술된 TL1a 결합 단백질의 TL1a에 대한 K_D는 100 nM 이하, 예컨대, 50 nM 이하, 예를 들어, 20 nM 이하, 예를 들어, 10 nM 이하 또는 6 nM 이하이다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질의 K_D는 5.5 nM 이하이다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질의 K_D는 5 nM 이하이다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질의 K_D는 4 nM 이하이다.

반감기 검정법

본 개시내용에 포함되는 일부 TL1a 결합 단백질은 개선된 반감기를 가지며, 예컨대, 변형되지 않은 TL1a 결합 단백질과 비교하여 그의 반감기가 연장되도록 변형되어 있다. 반감기가 개선된 TL1a 결합 단백질을 측정하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들어, 신생아 Fc 영역(FcRn)에 결합할 수 있는 TL1a 결합 단백질의 능력을 평가한다. 이와 관련하여, FcRn에 대한 결합 친화도 증가는 TL1a 결합 단백질의 혈청 반감기를 연장시켰다(예를 들어, 문헌 [Kim et al., Eur . J. Immunol . 24: 2429, 1994] 참조).

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 반감기는 또한 예컨대, 문헌 [Kim et al ., Eur. J. of Immunol . 24: 542, 1994]에 기술된 방법에 따라 약동학적 연구에 의해 측정될 수 있다. 상기 방법에 따라, 방사성 표지화된 TL1a 결합 단백질을 마우스에 정맥 주사하고, 그의 혈장 농도를 주기적으로 시간에 대한 함수로서, 예를 들어, 주사 후 3분 내지 72시간 동안 측정하였다. 그렇게 수득된 제거 곡선은 이상, 즉, 알파 상 및 베타 상을 가져야 한다. TL1a 결합 단백질의 생체내 반감기 측정을 위해, 베타상의 제거 속도를 계산하고, 야생형 또는 변형되지 않은 TL1a 결합 단백질의 것과 비교한다.

안정성 검정법

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 안정성은 다양한 검정법 중 임의의 것에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, TL1a 결합 단백질을 예컨대, 열 또는 산성과 같은 조건에 노출시키거나, 실온에서 일정 기간 동안(예컨대, 1개월 동안) 보관한다. 이어서, 혼탁도(조건에 노출된 후, 혼탁도가 증가하였다면, 이는 불안정하다는 것을 나타내는 것이다)를 측정함으로써, 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 비환원성 겔 전기영동에 의해, 또는 본원에 기술된 결합 또는 중화 연구에 의해 TL1a 결합 단백질의 응집을 평가할 수 있다.

제약 조성물 및 치료 방법

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 핵산 또는 상기를 발현하는 세포(동의어: 활성 성분)는 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 비경구적, 국소, 경구, 또는 국부 투여, 에어로졸 투여, 또는 경피 투여에 유용하다.

투여하고자 하는 TL1a 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 핵산 또는 상기를 발현하는 세포를 제제화하는 것은 선택된 투여 경로 및 제제(예컨대, 액제, 에멀젼, 캡슐제)에 따라 달라질 것이다. 투여하고자 하는 TL1a 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 핵산 또는 상기를 발현하는 세포를 포함하는 적절한 제약 조성물은 생리학상 허용되는 담체 중에서 제조될 수 있다. TL1a 결합 단백질 혼합물 또한 사용될 수 있다. 액체 또는 에멀젼인 경우, 적합한 담체로는 예를 들어, 수성 또는 알콜성/수성 액제, 에멀젼, 또는 현탁제(염수 및 완충처리된 매질 포함)를 포함한다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함할 수 있다. 물, 완충처리된 염수, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로스 용액 및 글리신을 비롯한, 각종의 적절한 수성 담체가 당업자에게 공지되어 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980] 참조). 조성물은 임의적으로 생리학적 조건에 가까워지도록 만드는 데 필요한, 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대, pH 조정제, 및 완충화제, 및 등장성 조절제, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 나트륨 락테이트를 함유할 수 있다. 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기법에 따라, 사용 이전에 보관을 위해 동결건조되고, 적합한 담체 중에서 재구성될 수 있다.

선택된 매질 중의 활성 성분(들)의 최적의 농도는 당업자에게 주지된 방법에 따라 실험적으로 결정될 수 있고, 이는 원하는 최종의 제약 제제에 따라 달라질 것이다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 투여를 위한 투여량 범위는 원하는 효과를 발휘하기에 충분할 정도로 큰 범위이다. 예를 들어, 조성물은 치료학상 또는 예방학상 유효량의 TL1a 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 핵산 또는 상기를 발현하는 세포를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 피험체에서 TL1a의 신호전달을 유도/증가시키거나, 또는 억제/감소/방해하는 데 충분한 TL1a 결합 단백질, 핵산 또는 세포의 양을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 상기 양은 예를 들어, TL1a 결합 단백질, 핵산 또는 세포 및/또는 특정 피험체 및/또는 치료되는 병태의 유형 또는 중증도에 따라 달라질 것이라는 것을 이해할 것이다. 따라서, 상기 용어는 본 개시내용을 특정 양으로, 예컨대, TL1a 결합 단백질, 핵산 또는 세포의 중량 또는 개수로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량"이라는 용어는 병태의 하나 이상의 증상을 감소 또는 억제시키는 데 충분한 TL1a 결합 단백질, 핵산 또는 세포의 양을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 사용되는 바, "예방학상 유효량"이라는 용어는 병태의 하나 이상의 검출가능한 증상의 발병을 방해 또는 억제 또는 지연시키는 데 충분한 TL1a 결합 단백질, 핵산 또는 세포의 양을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

투여량은 유해한 부작용, 예컨대, 과점성 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전 등을 유발할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환의 정도에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 합병증이 있는 경우, 투여량은 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 1일 또는 수일 동안 1일 1회 시앙의 용량 투여로 약 0.1 mg/kg 내지 약 300 mg/kg, 예컨대, 약 0.2 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 예컨대, 약 0.5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg으로 달라질 것이다.

일례에서, TL1a 결합 단백질은 약 1 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 일례에서, TL1a 결합 단백질은 피하로 또는 정맥내로 투여된다.

일부 예에서, TL1a 결합 단백질 또는 다른 활성 성분은 초기 용량(또는 로딩 용량)으로 투여되는데, 이 용량은 후속 용량(유지 용량)보다 더 높다. 예를 들어, 결합 분자는 약 1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 이어서, 결합 분자는 약 0.0001 mg/kg 내지 약 1 mg/kg의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 매 7 내지 35일마다, 예컨대, 매 14 또는 21 또는 28일마다 투여될 수 있다.

일부 예에서, TL1a 결합 단백질 또는 다른 활성 성분을 초기에는 후속 투여에 사용되는 용량보다 더 낮은 용량으로 투여하는 용량 단계적 확대 방식이 사용된다. 이러한 투여량 요법은 초기에 유해 사례를 겪게 되는 피험체의 경우에 유용하다.

치료에 대하여 적절하게 반응하지 못하는 피험체인 경우, 1주일에 다중 용량을 투여할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 용량을 증가시켜가면서 투여할 수 있다.

본 개시내용의 하나 이상의 TL1a 결합 단백질은 적절한 경로에 의해서 개체에게 단독으로, 또는 또 다른 약물 또는 작용제와 함께 조합하여 (그 이전에, 그와 동시에 또는 그 이후에) 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 또한 단백질, 예컨대, TNF 길항제, 항IL-12/23 항체, 항염증제, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트 또는 진통제와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은 항생제 및/또는 항미생물제와 함께 제공되는, 별개로 투여되는 조성물로서 사용될 수 있다.

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질은, 본 개시내용의 발현 구성물, 또는 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 발현하는 세포를 투여함으로써 피험체 내로 도입될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 항체를 코딩하는 핵산을 생체내에서 표적 세포 내로 도입시키는 데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 네이키드 핵산을 표적 부위에 주사할 수 있거나, 리포좀 내로 캡슐화시킬 수 있거나, 또는 바이러스 벡터에 의해 도입시킬 수 있다.

TL1a 검출 검정법

본 개시내용의 TL1a 결합 단백질, 예컨대, 본원에 논의된 바와 같이, 검출가능한 표지에 컨쥬게이트된 TL1a 결합 단백질을 이용하여 하기 검정법을 수행할 수 있다. 본원에 기술된 검정법을 이용하여 TL1a를 검출하는 것은 병태를 진단 또는 예후하는 데 유용하다.

면역검정법은 피험체에서 병태를 진단하기 위한, 또는 시료 중 TL1a를 검출하기 위한 예시적인 검정 포맷이다. 본 개시내용은 웨스턴 블롯팅, 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent), 형광 결합 면역흡착 검정법(FLISA: fluorescence linked immunosorbent), 경쟁 검정법, 방사성 면역검정법, 측방 유동 면역검정법, 유동식 면역검정법, 전기화학발광성 검정법, 비탁 기반 검정법, 혼탁도 측정 기반 검정법, 및 형광 활성화된 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting) 기반 검정법을 비롯한, 임의 형태의 면역검정법을 고려한다.

적합한 면역검정법의 한 형태는 예를 들어, ELISA 또는 FLISA이다.

한 형태에서, 상기 검정법은 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질을 고체 매트릭스, 예컨대, 폴리스티렌 또는 폴리카보네이트 마이크로웰 또는 딥스틱, 막, 또는 유리 지지체(예컨대, 유리 슬라이드) 상에 고정화시키는 단계를 포함한다. 이어서, 테스트 시료를 TL1a 결합 단백질과 직접 접촉시키면, 시료 중 TL1a는 결합되거나, 포획된다. 세척하여 시료 중의 임의의 비결합 단백질을 제거한 후, 별개의 에피토프에서 TL1a에 결합하는 단백질을 포획된 TL1a와 직접 접촉시킨다. 상기 검출기 단백질은 일반적으로 검출가능한 리포터 분자, 예컨대, ELISA인 경우에는 효소(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제(AP: alkaline phosphatase) 또는 β 갈락토시다제)로, 또는 FLISA인 경우에는 형광단으로 표지화된다. 별법으로, 검출기 단백질에 결합하는 제2 표지화된 단백질이 사용될 수 있다. 세척하여 임의의 비결합 단백질을 제거한 후, ELISA인 경우, 기질, 예컨대, 과산화수소, TMB, 또는 톨루이딘, 또는 5-브로모-4-클로로-3-인돌-베타-D-갈락토피라노시드(x-gal)를 첨가함으로써 검출가능한 리포터 분자를 검출한다. 물론, 고정화된 (포획) 단백질 및 검출기 단백질이 반대 방식으로 사용될 수 있다.

이어서, 공지된 정량의 마커를 이용하여 작성된 표준 곡선을 사용함으로써, 또는 대조군 시료와의 비교에 의해 시료 중 항원의 수준을 측정한다.

검출을 위한 기초로서 화학발광법 또는 전기화학발광법을 사용할 수 있도록 상기 기술된 검정법은 쉽게 변형될 수 있다.

당업자에게 자명한 바와 같이, 면역흡착 검정법에 기반한 다른 검출 방법은 본 개시내용을 수행하는 데 유용하다. 예를 들어, 상기 설명에 기반한 면역흡착 방법은 검출용 방사성 표지, 또는 검출용 금 표지(예컨대, 콜로이드 금), 또는 리포좀, 예를 들어, 검출용 캡슐화 NAD+ 또는 아크리디늄 결합 면역흡착 검정법을 사용한다.

본 개시내용의 일부 예에서, TL1a 수준은 표면 플라즈몬 공명 검출기(예컨대, 비아코어™, GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)), 유동식 장치, 예를 들어, US7205159에 기술되어 있는 것; 마이크로- 또는 나노-면역검정법 장치(예컨대, US20030124619에 기술되어 있는 것); 측방 유동 장치(예컨대, US20040228761 또는 US20040265926에 기술되어 있는 것); 형광 편광 면역검정법(FPIA: fluorescence polarization immunoassay, 예컨대, US4593089 또는 US4751190에 기술되어 있는 것); 또는 면역혼탁도 측정 검정법(예컨대, US5571728 또는 US6248597에 기술되어 있는 것)을 사용하여 측정된다.

시료 및 대조군 시료

당업자에게 자명한 바와 같이, 본원에 기술된 실시예 중 일부는 TL1a 측정을 위해 어느 정도의 정량화를 필요로 한다. 상기 정량화는 본 개시내용의 검정법에서 적합한 대조군 시료를 포함함으로써 측정될 수 있다.

일례에서, 적합한 대조군 시료는 건강한 피험체 또는 정상적인 피험체로부터 유래된 시료이다.

본 맥락에서, "건강한 피험체"라는 용어는 TL1a와 관련된 병태, 예컨대, 염증성 병태를 앓지 않는 것으로 알려진 개체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

"정상적인 피험체"라는 용어는 개체 집단과 비교하여 정상 수준의 TL1a를 가지는 개체를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 개시내용은 또한 대조군 시료를 정상적인 및/또는 건강한 피험체, 또는 정상적인 및/또는 건강한 피험체의 집단으로부터 수득된 데이터 세트인 것으로 간주한다.

일례에서, 본 개시내용의 방법은 예컨대, 본원에 기술된 방법을 사용하여 대조군 시료 중의 TL1a의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

일례에서, 피험체로부터의 시료 및 대조군 시료를 대략적으로 또는 실질적으로 동시에 검정한다.

일례에서, 결과를 비교할 수 있도록 하기 위해 피험체로부터의 시료 및 대조군 시료를 임의의 하나 이상의 실시예에서 본원에 기술된 바와 같이 본 개시내용의 동일한 방법을 사용하여 검정한다.

병태

본 개시내용의 방법을 수행함으로써 치료/예방/진단/예후될 수 있는 병태의 일례로는 자가면역 질환, 염증성 병태, 및 혈관형성 부족을 특징으로 하는 병태를 포함한다.

일례에서, 병태는 자가면역 질환이다.

병태의 일례로 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease), 과민성 장 증후군(IBS: irritable bowel syndrome), 크론병, 궤양성 대장염, 게실병, 전신성 홍반성 루프스, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (공피증), 특발성 염증성 근육병증(피부근육염, 다발근육염), 쇼그렌 증후군, 전신성 혈관염, 사코이드증, 중추 및 말초 신경계의 탈수초 질환, 예컨대, 다발성 경화증, 특발성 다발신경병증, 자가면역 또는 면역 매개 눈 질환, 예컨대, 자가면역 포도막염 및 각종 혈관염과 관련된 포도막염, 자가면역 또는 면역 매개 피부 질환, 예컨대, 수포성 피부 질환, 다형 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 폐의 알레르기성 질환, 예컨대, 천식, 기도 과민증, 호산구 폐렴, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐렴, 죽상동맥경화증 또는 이식편대숙주병을 포함한다.

일례에서, 병태는 관절염, 예컨대, 류마티스 관절염, 다발성 관절염, 골관절염 또는 척추관절병증이다. 이와 관련하여, 문헌 [Bull et al., J. Exp . Med . 205: 2457, 2008]에는 TL1a를 길항시키는 항체가 류마티스 관절염 치료에 유용한 것으로 제시되어 있다. 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질의 선택성 성질에 기인하여 상기 단백질은 류마티스 관절염 치료에 있어 유용하다.

일례에서, 병태는 다발성 경화증이다. 이와 관련하여, US20090317388에는 TL1a 결핍 마우스에서는 다발성 경화증의 용인된 모델인 실험상 자가면역 뇌척수염(EAE)이 발생하지 않은 것으로 제시되어 있다.

일례에서, 염증성 병태는 염증성 점막 병태, 예컨대, 장의 염증성 질환(예컨대, 염증성 장 질환, 크론병 또는 궤양성 대장염), 또는 폐의 염증성 질환(예컨대, 기도 과민증 또는 천식)이다.

일례에서, 병태는 염증성 장 질환 및/또는 결장염이다. 이와 관련하여, 문헌 [Takedatsu et al., Gastroenterology 135: 552, 2008]에는 TL1a를 길항시키는 항체가 결장염 치료에 유용한 것으로 제시되어 있다.

일례에서, 병태는 천식 또는 기도 과민증 또는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)이다.

또 다른 일례에서, 병태는 염증성 피부 질환(예컨대, 자가면역 또는 면역 매개 피부 질환), 예컨대, 수포성 피부 질환, 다형 홍반, 접촉성 피부염이다. 별법으로, 피부 질환은 건선이다.

혈관형성 부족을 특징으로 하는 병태의 예로는 심혈관 질환, 자가면역 병태(예컨대, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 전신성 홍반성 루프스(SLE: systemic lupus erythematosus) 및 전신 경화증), 항중성구 세포질 항체(ANCA: antineutrophil cytoplasmic antibodies) 관련 혈관염, 허혈(이식으로부터 유발된 허혈) 또는 괴사를 포함한다.

키트

본 개시내용은 추가로 하기 중 하나 이상을 포함하는 키트를 포함한다:

(i) 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질 또는 상기를 코딩하는 발현 구성물(들);

(ii) 본 개시내용의 세포; 또는

(iii) 본 개시내용의 제약 조성물.

TL1a 검출용 키트인 경우, 키트는 예컨대, 본 개시내용의 TL1a 결합 단백질과 연관된 검출 수단을 추가로 포함할 수 있다.

치료학적/예방학적 용도의 키트인 경우, 키트는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

임의적으로, 본 개시내용의 키트는 임의의 일례에 따라 본원에 기술된 방법에서 사용하기 위한 사용 설명서와 함께 패킹된다.

본 개시내용은 하기의 비제한적인 실시예를 포함한다.

실시예 1: 물질 및 방법

하기 실시예에서, 잔기 위치에 대한 언급은 달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 관련 서열에서의 위치에 대한 언급이다.

1.1 HEK293/ pTT5 발현 시스템

HEK293E/pTT5 발현 시스템을 포함하는 모든 형질감염을 위해(문헌 [Durocher et al., Nucl. Acids Res., 30: E9, 2002]), HEK293E 세포를 완전 세포 성장 배지(1 ℓ의 F17 배지(인비트로겐), 9 ml의 플루로닉(Pluronic) F68(인비트로겐), 50 ㎕/100 ml 배양물로 제네티신(Geneticin)™ (50 mg/ml, 인비트로겐)과 함께 2 mM 글루타민을 함유하는 20% (w/v) 트립톤 NI(오가노테크니에(Organotechnie))) 중에서 배양하였다. 형질감염을 수행하기 전 그 당일 날, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 제네티신™을 함유하지 않는 새 배지 중에 재현탁시켰다. 다음날, DNA를 시판용 형질감염 시약과 혼합하고, DNA 형질감염 믹스를 배양물에 적가하였다. 배양물을 제네티신™ 부재하에 37℃, 5% CO₂에서 및 120 rpm으로 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 배양물 500 ml당 12.5 ml의 트립톤 및 250 ㎕의 제네티신™을 첨가하였다. 배양물을 37℃, 5% CO₂에서 및 120 rpm으로 7일 동안 인큐베이션시킨 후, 상청액을 수거하고 정제하였다.

1.2 TL1a 단백질

인간 TL1a를 구입하거나(펩프로테크(Peprotech) 및 진스크립트(Genscript): 2가지 모두 E. 콜라이 발현), 또는 N 말단에 위치하는 HIS 및 FLAG 태그를 포함하는 인간 TL1a의 세포외 도메인(ECD: extracellular domain)을 코딩하는 DNA 발현 구성물(서열 번호 1)을 사용하여 포유동물 HEK293E/pTT5 발현 시스템에서 제조하였다. 2,000 g로 10 min 동안 원심분리하여 분비된 TL1a 단백질을 함유하는 배양물 상청액을 수거함으로써 세포를 제거하였다. 히스트랩(HisTrap)™ HP 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 상청액으로부터 TL1a 단백질을 정제하였다. 하이로드 16/60 슈퍼덱스 200 프렙(HiLoad 16/60 Superdex 200 prep) 등급 칼럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 용리된 단백질에 대해 PBS로 완충제 교환을 수행하고, 하이로드 26/60 슈퍼덱스 200 프렙 등급 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에서 겔 여과에 의해 ~70 kDa 분획을 분리하였다.

파지 디스플레이 실험을 위해, EZ 연결 술포-NHS-LC-비오틴(EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotin) 키트(피어스(Pierce))를 사용하여 비오틴:TL1a=3:1인 비로 재조합 인간 TL1a(펩프로테크, 진스크립트 HEK293E 유래)를 비오티닐화시켰다. 3.5 kDa 분자량의 컷 오프와 함께 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트를 이용하여 PBS에 대해 투석시킴으로써 유리 비오틴을 단백질 표본으로부터 제거하였다.

또한, 단일 부위를 비오티닐화시키는 태그를 이용하여 TL1a를 제조하였다. 상기 TL1a 단백질을 HEK293 세포에서 발현시키고, 앞서 기술된 바와 같이 정제하였다. 이어서, TL1a 단백질 상에 비오틴을 선택적으로 혼입시키는 효소를 사용하여 비오티닐화시켰다.

1.3 파지 디스플레이

TL1a에 특이적으로 결합하는 항체를, 10x10¹⁰개 초과의 개별 인간 FAb 단편을 포함하는 나이브 파지미드 라이브러리로부터 단리시켰다.

수회의 패닝 '캠페인'(즉, 상이한 시약 또는 패닝 조건을 이용한 개별 파지 디스플레이 실험) 동안 파지 디스플레이 라이브러리로부터 항TL1a 항체를 단리시켰다. 일반 프로토콜은 문헌 [Marks and Bradbury (Methods Mol . Biol . 248: 161-176, 2004)]에 개략적으로 설명되어 있는 방법을 따라 이루어졌다.

각 파지 디스플레이 캠페인은 3 라운드의 패닝을 포함하였다. 각 라운드당 ~1x10¹³개의 파지 입자를, 차단 완충제(포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)(pH 7.4) 중 5% 탈지유)와 1:1로 혼합하고, 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션시킴으로써 차단시켰다. 이어서, 상기 라이브러리에 대해 기술된 바와 같이 차단된 100 ℓ의 스트렙트아비딘 커플링된 다이나비즈(Dynabeads)(인비트로겐)와 함께 45 min 동안 인큐베이션시킴으로써 차단된 파지 라이브러리를 스트렙트아비딘 결합제에 대해 사전 고갈시켰다. 인큐베이션 단계 후 비드(및 그에 부착된 스트렙트아비딘 결합제)를 폐기하였다.

패닝을 위해서 스트렙트아비딘 커플링된 다이나비즈(인비트로겐)의 표면 상에 포획시킴으로써 재조합 인간 TL1a 항원을 제조하였다. 이를 달성하기 위해, 10 내지 100 pmol의 비오티닐화된 TL1a를 100 ㎕의 비드와 함께 실온에서 45 min 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 TL1a-비드 복합체를 PBS로 세척하여 유리 TL1a를 제거한 후, 후속 패닐 반응에 사용하였다.

차단되고, 사전 고갈된 라이브러리를 1.5 mL 미량 원심분리관 중에서 TL1a-비드 복합체와 혼합시키고, 실온에서 2 hrs 동안 회전시킴으로써 라이브러리 패닝을 수행하였다. 비특이 결합 파지는 연속 세척을 사용하여 제거하였다. 각 세척은, 자성 랙을 사용하여 비드 복합체를 상기 용액으로부터 관의 벽 상으로 견인하고, 상청액을 흡인시킨 후, 상기 비드를 새 세척 완충제 중에 재현탁시키는 단계를 포함하였다. 상기 세척을 PBS 세척 완충제(0.5% 탈지유를 포함하는 PBS) 또는 PBS-T 세척 완충제(0.05% 트윈-20(TWEEN-20)(시그마(Sigma)) 및 0.5% 탈지유를 포함하는 PBS)를 이용하여 수회에 걸쳐 반복하였다. 0.5 mL의 100 mM 트리에닐아민(TEA)(머크(Merck))과 함께 실온에서 20 min 동안 인큐베이션시킴으로써 세척 공정 후 결합된 상태 그대로 남아있는 파지를 TL1a-비드 복합체로부터 용리시켰다. 0.25 mL의 1 M 트리스-HCl(pH 7.4)(시그마)을 첨가함으로써 용리된 생성물파지를 중화시켰다.

1회차 및 2회차 라운드의 패닝 종료시, 10 mL의 지수적으로 성장하는 TGI E. 콜라이의 배양물(효모-트립톤(YT: yeast-tryptone) 성장 배지)에 생성된 파지를 첨가하고, 진탕시키지 않고 37℃에서 30 min 동안, 이어서, 250 rpm으로 30 min 동안 진탕시키면서 인큐베이션시킴으로써 세포가 감염되도록 하였다. 이어서, 표준 프로토콜(문헌 [Marks and Bradbury, 상기 문헌 동일])에 따라 파지 디스플레이 생성물을 코딩하는 파지미드를 파지 입자로서 구제하였다.

3회차 라운드의 패닝 종료시, TGI 세포를 생성물 파지로 감염시키되, 단, 충분한 희석률로 (2% 글루코스 및 100 ㎍/mL 카베니실린으로 보충된) 고체 YT 성장 배지 상에 세포를 플레이팅하여 개별 E. 콜라이를 수득하였다. 이들 콜로니를 사용하여 1 mL 액체 배양물에 접종함으로써 스크리닝 실험에서 사용하기 위한 FAb 단편을 발현시켰다.

1.4 TL1a 결합을 위한 FAb 의 SPR 기반 스크리닝

각각의 개별 E. 콜라이 콜로니를 사용함으로써 TL1a 결합 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 FAb를 발현시켰다. 콜로니를 96 웰 딥웰 플레이트(코스타(Costar)) 중 (100 ㎍/mL 카베니실린 및 2% 글루코스로 보충된) 1 mL YT 종균 배양물 내로 접종하고, 650 rpm으로 진탕시키면서, 30℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 상기 종균 배양물을 (오직 100 ㎍/mL 카베니실린으로만 보충된 YT) 1 mL 발현 배양물에 1:50으로 희석시키고, 600 nm에서의 광학 밀도가 0.8 내지 1.0이 될 때까지 성장시켰다. 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드를 최종 농도 1 mM으로 첨가함으로써 FAb 발현을 유도하였다. 배양물을 20℃에서 16 hrs 동안 인큐베이션시켰다.

원심분리 (2,500 g, 10 mins)에 의해 세포를 수거하고, 주변세포질 추출을 수행함으로써 FAb 시료를 제조하였다. 세포 펠릿을 75 ㎕의 추출 완충제(30 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 20% 수크로스) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 10 min 동안 1,000 rpm으로 진탕시켰다. 225 ㎕의 H₂O을 첨가하고, 1 hr 동안 1,000 rpm으로 진탕시키고, 10 min 동안 2,500 g으로 원심분리함으로써 추출물을 세정하여 추출물 제조를 완료하였다. 상청액을 회수하고, 아크로프렙(Acroprep) 100 kDa 분자량 컷오프 플레이트(팔 코포레이션(Pall Corporation))를 통해 여과시키고, 추가 실험을 위해 요구될 때까지 4℃에서 보관하였다.

표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정법을 사용하여 FAb 시료를 TL1a 결합 활성에 대해 스크리닝하였다. 비아코어 4000 바이오센서(GE 헬쓰케어)를 사용하여 단일 농도 피분석물 통과 검정법으로 고효율 SPR 스크리닝을 수행하였다. 스폿 3은 변형시키지 않고 그대로 남겨둔 채, pH 5.5에서 표준 아민 커플링 화학법을 사용하여 대략 10,000 RU의 항V5 항체(인비트로겐 카탈로그 번호 R960CUS)를 CM5 시리즈 S 센서 칩 상의 4개의 유동 셀 각각의 스폿 1, 2, 4 & 5 상에 고정화시켰다. 사용된 러닝 버퍼는 HBS-EP+(GE 헬쓰케어)였고, 모든 상호작용을 25℃에서 측정하고, 데이터 수집 속도를 10 Hz로 설정하였다. V5로 태깅된 FAb의 조 주변세포질 표본을 러닝 버퍼 중에 2배로 희석시킨 후, 100 sec 동안 10 ul/min의 유속으로 각 유동 셀의 스폿 1 또는 5 상에 포획시켰다(전형적으로 약 200 RU의 FAb가 포획되었다). 짧은 안정화 기간 후, 인간 TL1a 삼량체를 100 sec 동안 30 ㎕/min의 유속으로 동시에 4개의 유동 셀 모두의 모든 스폿을 통과시켰다. 상호작용의 해리를 100 sec 동안 측정한 후, 30 sec 펄스의 100 mM 인산을 사용하여 항V5 항체로 재생시켰다. 작성된 센서그램은 각 유동 셀의 인접한 항V5 항체 스폿을 참조로 하였으며, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 방정식을 사용하여 피팅함으로써 k_a, k_d 및 K_D를 측정하였다.

SPR 스크리닝 공정으로부터 얻은 데이터를 사용하여 잠재적인 TL1a 결합제를 선별하였다. FAb k_d 값을 순위화하고, DNA 서열 분석을 위해 가장 강력한 결합제를 최대 200개까지 제출하였다. 전장의 인간 IgG₁ 항체로 전환시키기 위해 독특한 서열을 가지는 FAb를 선택하였다.

1.5 가변 영역 서열 분석

DNA 서열 분석은 멜버른 대학 병리과(Melbourne University Department of Pathology)(호주 멜버른)의 어플라이드 제네틱 다이아그노스틱스 그룹(Applied Genetic Diagnostics group)에 의해 수행되었다. 5 pmol의, Fab V_H 또는 V_L 쇄 서열 분석에 적합한 프라이머와 파지미드 DNA(~500 ng)를 혼합하였다. 서열 분석 반응은 제소사의 설명서에 따라 빅다이® 터미네이터 v3.1 사이클 시퀀싱 키트(BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 수행하였다. 3130x1 제네틱 애널라이저즈(3130x1 Genetic Analyzers)(어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 모세관 분리에 의해 시료를 분석하였다. 크로마스 라이트(Chromas Lite) 소프트웨어 패키지(테크넬리시움(Technelysium: 호주 QLD 브리즈번))를 사용하여 서열 크로마토그램 데이터를 분석하였다. Seq에이전트(SeqAgent) 소프트웨어 패키지(조마(Xoma: 미국 캘리포니아주 버클리))를 사용하여 서열 텍스트 파일을 아미노산 서열로 번역하고, 분석하였다.

1.6 항체를 발현하는 벡터 구성

인간 불변 영역(인간 IgG1 중쇄 C_H1, 힌지, C_H2 및 C_H3 도메인(예컨대, 스위스프로트 번호(SwissProt No.) P01857))과 함께 V_H 아미노산 쇄를 발현시켰다. 이는 합성 올리고뉴클레오티드의 조립에 의해 새롭게 합성시킨 DNA 서열로 아미노산 서열을 역 번역시킴으로써 달성되었다. 유전자 합성 후, 전체 서열을 pTT5 중쇄 벡터의 다중 클로닝 부위로 서브클로닝하였다(문헌 [Durocher et al., Nucl . Acids Res . 30: E9, 2002]). 상기 서열을 pTT5 경쇄 벡터의 다중 클로닝 부위로 서브클로닝함으로써 인간 카파 경쇄 불변 영역(스위스프로트 번호 P01834.1) 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역(스위스프로트 번호 P0CG05.1)과 함께 V_L 아미노산 쇄를 발현시켰다.

별법으로, FAb V_H 및 V_L 서열을 PCR에 의해 파지미드 DNA로부터 직접적으로 증폭시키고, IgG 발현 벡터로 서브클로닝하였다. PCR 반응은 제조사의 지침에 따라 플래티넘 PCR 슈퍼믹스(Platinum PCR Supermix) 키트(인비트로겐)를 사용함으로써 수행하였다. FAb를 코딩하는 대략 50 ng의 주형 파지미드 DNA를 10 pmol의 적절한 전방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 PCR 슈퍼믹스 시약과 함께 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 혼합하였다. 각 반응에서는 일반 V_H 또는 V_L 특이 역방향 프라이머와 함께 조합된 서열 특이 전방향 프라이머를 사용하였다. IgG 발현 벡터로의 클로닝을 촉진시키기 위해, 5' BsiWI 및 3' NheI 제한 효소 부위를 부가하기 위한 V_H 증폭용 프라이머, 5' BssHII 및 3' BsiWI 부위를 부가하기 위한 V_L 카파 증폭용 프라이머, 및 5' BssHII 및 3' AvrII 부위를 부가하기 위한 V_L 람다 증폭용 프라이머를 디자인하였다.

박판(thin-walled) PCR(96 웰 진앰프(GeneAmp)® PCR 시스템 9700(어플라이드 바이오시스템즈: 호주 빅토리아주 스콜스비))에서 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 처음 5분 동안 94℃에서의 변성 단계, 이어서, 30회의 증폭 사이클(94℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링, 이어서, 68℃에서 30 내지 90초 동안 연장), 및 68℃에서 7분 동안 최종 연장을 포함하였다. 증폭된 V_H 유전자를 미네루트(Minelute) PCR 정제용 키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 정제하고, BsiWI 및 NheI 효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 이용하여 분해시키고, 미네루트 리액션 클린업(Minelute Reaction Clean-up) 키트(퀴아젠)를 이용하여 다시 정제하였다. 증폭된 V_L 카파 유전자도 유사하게 제조하였는데, 단, 분해는 BssHII 및 BsiWI를 사용하여 수행하였다. 증폭된 V_L 람다 유전자 또한 같은 방식으로 제조하였는데, 단, BssHII 및 AvrII로 분해시켰다. 상기 기술된 바와 같이, 생성된 V_H 및 V_L 유전자 단편을 적절한 pTT5 중쇄 또는 경쇄 벡터(카파 또는 람다 경쇄)의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였다.

1.7 항체의 발현 및 정제

중쇄 및 경쇄 DNA를 HEK293/pTT5 발현 시스템에 공동 형질감염시키고, 7일 동안 배양하였다. 상기 형질감염으로부터 유도된 상청액의 pH를 pH 7.4로 조정한 후, 하이트랩(HiTrap) 단백질 A 칼럼(5 ml, GE 헬쓰케어) 상에 로딩하였다. 칼럼을 50 ml의 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M 시트르산(pH 2.5)을 사용하여 용리를 수행하였다. 용리된 항체를 제바 디솔팅(Zeba Desalting) 칼럼(피어스)을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염시켰다. SDS-PAGE를 사용하여 항체를 분석하였다. BCA 검정용 키트(피어스)를 사용하여 항체 농도를 측정하였다. ㎍/ml와 몰 농도 사이의 항체 농도 전환을 위해, 모든 항체에 대하여 사용되는 그의 분자량은 150 kDa인 것으로 가정하였다.

1.8 TF -1 세포주 효능 검정

어떤 항TL1a 항체가 TL1a의 생물학적 활성을 기능적으로 중화시키는지 측정하기 위해, TF-1 세포주에서 TL1a 유도성 아폽토시스를 중화시킬 수 있는 능력에 대하여 항체를 테스트하였다. TF-1 인간 적백혈병 세포주(ATCC: CRL-2003)를 표준 조건하에 배양물 중에서 유지시켰다. TF-1 세포(7.5x10⁴/웰)를 측면이 검은색인 96 웰 플레이트(가르니에(Greiner)) 중에서 재조합 인간 TL1a 100 ng/ml 및 사이클로헥시미드 10 ㎍/ml와 함께 인큐베이션시켜 아폽토시스를 유도하였다. 테스트 항체를 10 ㎍/mL(66.7 nM) 이하인 농도로 플레이트에 첨가하고, 4 내지 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 제조사의 지침에 따라 호모지니어스 카스파제즈 키트(Homogeneous Caspases Kit)(로슈(Roche))를 사용하여 아폽토시스 유도를 평가하였다. 시노몰구스 및 레수스 원숭이, 마우스, 래트, 기니아 피그, 돼지 또는 토끼로부터의 TL1a의 기능을 중화시킬 수 있는 항체의 능력을 테스트하는 실험에서는 상기 프로토콜에서 인간 TL1a를 대신하여 적절한 종의 TL1a를 사용하였다.

아폽토시스 최대치(항TL1a 항체 부재하에 재조합 인간 TL1a + 사이클로헥시미드에 의해서 달성된 아폽토시스 수준)에 대한 백분율(%)로서 표시함으로써 데이터를 정규화시켰다.

1.9 리드 항체의 수용체 선택성

TL1a는 그의 동족 신호전달 수용체인 DR3, 및 데코이 수용체인 DcR3에 결합하는데, 상기 DcR3은 또한 TNF 패밀리 구성원 Fas-L 및 LIGHT에 대한 데코이 수용체로서의 역할도 한다.

항체를 경쟁 ELISA에서 TL1a의 그의 수용체에의 결합을 억제시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. DR3/Fc 키메라(R&D 시스템즈(R&D Systems)) 또는 DcR3/Fc 키메라(R&D 시스템즈)를 2 ㎍/ml 농도로 96 웰 플레이트(맥시소르프(Maxisorp), 눈크(Nunc)) 상에 코팅하였다. 일련으로 희석된 테스트 항체를 1 ㎍/ml의 단일 부위 비오티닐화된 재조합 인간 TL1a와 함께 30분 동안 사전 인큐베이션시킨 후, DR3/Fc 또는 DcR3/Fc로 코팅된 웰에 첨가하였다. 스트렙트아비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제 1:2,000(BD 파미노겐(BD Pharmingen))을 사용하여 결합된 TL1a를 검출하였다. 항TL1a 항체 부재하에서의 TL1a의 수용체에의 최대 결합치에 대한 백분율(%)로서 표시함으로써 데이터를 정규화시켰다.

비교를 위해 본 검정에 TL1a 활성을 억제시키는 것으로 기술된 항체(1B4; 이는 서열 번호 119에 기재된 서열을 포함하는 V_H 및 서열 번호 120에 기재된 서열을 포함하는 V_L을 포함하며, WO 2009/064854 및 미국 특허 출원 공개 US 200900280116에 기술되어 있다)를 포함시켰다.

1.10 에피토프 지도화

알라닌 스캐닝 실험을 사용하여 에피토프 지도화를 수행하였다. TL1a 상의 노출 개연성을 가진 잔기를 측정하기 위해 모델링 분석을 수행하였다. 이어서, TL1a 구성물을 디자인하여 그의 이론상의 노출된 각 잔기들을 알라닌으로 치환하였다. 이어서, 상기 구성물을 발현시키고, 발현 배양물로부터의 상청액을 SPR을 이용하여 단백질 발현 및 항TL1a 항체 C320에의 결합에 대해 테스트하였다. Ni-NTA 센서 칩(비아코어)을 사용하여, HIS 태깅된 TL1a 뮤테인을 형질감염된 HEK293E 세포의 상청액으로부터 포획시켰다. 뮤테인은 유동 셀 2(또는 4) 상에 포획되었고, 이어서, C320은 유동 셀 1+2(또는 3+4) 상을 통과하였다. 뮤테인 주사 종결시 RLI의 변화로서 뮤테인 발현(RU)을 측정하였다. C320 주사 종결시 RLI의 변화로서 C320 결합(RU)을 측정하였다.

발현되었지만, C320에의 결합은 명백하게 손실된 TL1a 구성물을 다시 형질감염시키고, ELISA에 의해 테스트하기 위해 정제하였다. ELISA 플레이트를 다중클론 토끼 항인간 TL1a(펩프로테크)(1 ㎍/ml), DR3/Fc 키메라(R&D 시스템즈)(1 ㎍/ml) 또는 DcR3/Fc 키메라(R&D 시스템즈)(1 ㎍/ml)로 코팅하였다. TL1a 뮤테인 또는 비치환된 TL1a를 1 ㎍/ml 농도로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 비오티닐화된 다중클론 토끼 항인간 TL1a(펩프로테크)(250 ng/ml) 및 스트렙트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(BD 파미노겐) 1:2,000을 이용하여 결합된 TL1a를 검출하였다. 다중클론 항TL1a에 의해 검출될 수 있는 구성물은 적절하게 발현되고 폴딩된 것으로 간주하였다. 수용체 중 하나에 또는 그 중 어느 것에도 결합하지 못한, 적절하게 발현되고 폴딩된 구성물은 TL1a의 그 수용체에의 결합에 중요한 것으로 간주하였다. 테스트 항체의 TL1a 뮤테인에의 결합은 직접 ELISA에 의해 테스트하였다. ELISA 플레이트를 상이한 TL1a 뮤테인(1 ㎍/ml)으로 코팅하였다. 이어서, 일련으로 희석된 테스트 항체를 첨가하고, 결합된 항체를 항인간 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(인비트로겐) 1:2,000으로 검출하였다. 테스트 항체의 다른 TL1a 이소폼에의 결합을 같은 방법을 사용하여 검출하였다.

1.11. 막 결합 TL1a ( mbTL1a : Membrane Bound TL1a ) 발현 세포주 생성

전장의 TL1a를 코딩하는 서열(서열 번호 123)을 포함하는 벡터를 이용하여 HEK293 세포를 전기천공시키고, 선별 배지(블라스트사이딘 6 ㎍/ml가 보충된 배지) 중에서 유지시켰다. 다회에 걸쳐 계대접종한 후, 유세포 측정법에 의해 세포를 세포 표면 발현에 대하여 테스트하였다. 웰당 2.5x10⁵개의 세포를 96 웰 둥근 바닥 플레이트(코닝(Corning))에 플레이팅하고, 얼음 상에서 30분 동안 비오티닐화된 다중클론 토끼 항인간 TL1a(펩프로테크)와 함께 인큐베이션시켰다. 시료를 세척한 후, 얼음 상에서 추가로 30분 동안 스트렙트아비딘-FITC와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 시료를 세척하고, 재현탁시키고, 유세포 측정기에서 데이터를 획득하였다.

1.12 유세포 측정법 검출

(실시예 1.10에 기술된 바와 같이) TL1a의 안정한 세포 표면 발현을 확인한 후, 10 ㎍/ml로부터 출발하여 농도를 감소시켜 가면서 항체 C320, C321 및 C323을 형질감염된 세포 및 비형질감염된 세포(96 웰 둥근 바닥 플레이트(코닝) 중 웰당 2.5x10⁵개의 세포), 둘 모두를 사용하여 스크리닝하였다. 1:200으로 희석된 다중클론 염소 항 인간 IgG-FITC(시그마)를 검출용 항체로서 사용하였다. 비교를 위해 항TL1a 항체 1B4를 포함시켰다.

1.13. 시토카인 생산 억제

본원에 기술된 항체의 특징을 추가로 규명하기 위해, 1차 인간 세포에 대한 그의 기능을 테스트하였다. 내인성 TL1a 생산을 확인하기 위해, 림포프렙(lymphoprep)(니코메드(Nycomed)) 구배에 걸쳐 PBMC를 연막으로부터 단리시키고, 2 ㎍/ml로부터 출발하여 농도를 감소시켜 가면서, 콘카나발린 A를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트(코닝) 중에서 배양하였다. 플레이트를 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 상청액을 수거하고, 인간 TL1a ELISA 키트(펩프로테크)를 사용하여 TL1a에 대해 검정하였다.

추가로, 부착성 세포를 수거하고, 비오티닐화된 항인간 TL1a(펩프로테크) 1:100 및 스트렙트아비딘-FITC(지메드(Zymed)) 1:200을 사용하여 유세포 측정법에 의해 TL1a 발현에 대해 검정하였다.

1.14. 등전 포커싱 겔 실험

1.15 단백질 A HPLC

일과적으로 항체를 발현하도록 형질감염된 HEK293E 세포로부터의 상청액을 애질런트(Agilent) 1100 크로마토그래피 시스템에 연결된 포로스(POROS) A/20 2.1x30 mm Id 칼럼(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 단백질 A HPLC에 의해 분석하였다. 칼럼을 포스페이트 완충처리된 염수(PBS)(pH 7.4)로 평형화시키고, 상기 단백질을 함유하는 0.2 ml의 HEK 293E 상청액을 로딩하고, 단백질을 pH 2.2로 조정된 PBS를 이용하여 용리시켰다. 제조사의 소프트웨어를 사용하여 215 nm 또는 280 nm 파장에서의 크로마토그램 적분을 수행하고, 곡선하 면적(AUC: area under the curve)을 기록하였다.

1.16 SPR 에 의해 측정된 항체 발현 및 항원 결합

CM5 센서 칩(비아코어)을 사용하여 단백질 A를 아민 커플링을 이용함으로써 칩 표면에 커플링시켰다. 단백질 A를 비아코어 3000을 사용하여 유동 셀 1 및 2(또는 별법으로, 3 및 4)에 커플링시켰다. 항체를 포함하는 HEK293 세포에 대한 세포 상청액은 유동 셀 2의 표면 상에 통과시킨 반면, 완충제(HBS-EP)는 유동 셀 1 상에 통과시켰다. 상청액 주사 종료시, 반응 단위의 변화를 측정하였다. 상기 값을 단백질 포획량(SPR)로 기록하였다. 발현율(%)은 같은 실험에서 C320의 단백질 포획량(SPR)에 대한 백분율(%)로서 표시된 시험된 항체의 단백질 포획량(SPR)이다. 항체가 TL1a에 결합하는지 여부를 측정하기 위하여, TL1a를 이어서 유동 셀 1 및 2 상에 통과시켰다. 센서그램을 이중 참조하였다(유동 셀 1 및 완충제 블랭크에서 유동 셀 2를 감산하였다).

실시예 2: 파지 디스플레이 결과

재조합 인간 TL1a에 대해 파지 디스플레이 캠페인을 수행하였다. 재조합 박테리아 발현 재조합 TL1a를 사용하여 6개의 개별 캠페인을 수행하였다. TL1a에 결합한 소수의 FAb가 단리되었고, 어떤 중화 항체도 단리되지 않았다.

포유동물 발현 TL1a를 사용하여 후속 캠페인을 수행하였다. TL1a에 결합한 FAb의 단리된 FAb의 백분율(%)은 박테리아 유래 TL1a보다 포유동물 유래 TL1a를 사용하였을 때에 실질적으로 더 높았다. 전체 파지 디스플레이 캠페인에 걸쳐 TL1a 결합에 대해 양성인 것으로 나타난 FAb의 개수는 200개를 초과하였다. 이로부터 독특한 서열을 가지는 55개의 FAb를 확인하였고, 그 중 29개를 전장의 IgG₁ 항체로 전환시키기 위해 선택하였다.

실시예 3: TL1a 활성 중화

TL1a 유도성 아폽토시스를 억제시키거나, 감소시킬 수 있는, 파지 디스플레이를 사용하여 단리된 FAb를 포함하는 전장의 IgG1 항체의 능력을 상기 기술된 바와 같이(실시예 1.8) 평가하였다. 이러한 조건하에서, 테스트된 항체 29개 중 15개는 TL1a 유도성 아폽토시스 억제가 50%보다 우수한 것으로 나타났다(도 2). 이러한 항체로는 C319, C320, C321, C323, C333, C334, C335, C336을 포함한다.

상기 데이터를 통해 TL1a에 결합한 항체는 단리될 수 있지만, 오직 이들 항체의 제한된 서브세트만이 TL1a 활성을 기능적으로 억제시키는 데 필요한 특이성을 가진다는 것이 입증되었다.

재조합 인간 TL1a의 억제를 입증한 항체 군들 중에서 EC₅₀ 값을 이용하여 각 항체의 상대적인 억제 프로파일을 평가하였다(표 4 및 도 3). 오직 항체 C320, C321 및 C323만이 1 nM 이하의 억제성 EC₅₀ 값을 가졌다.

실시예 4: 수용체 선택성

항체 C320, C321 및 C323은 TL1a와 DR3의 상호작용은 억제시키고(도 4A), TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않는다(도 4B). 같은 검정법을 사용하였을 때, 항체 C319, C333, C334 및 C336은 같은 선택적 중화를 입증한 것으로 나타났다.

유사 검정법을 사용하였을 때, 하기 기술되는 항체 C320 및 그의 유도체, 특히 C320-168 및 C320-179의 결합은 EC₅₀ 1 nM 이하로 TL1a와 DR3의 상호작용을 억제시키는 것으로 나타났다(도 4C). 상기 항체는 또한 0.1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL 범위의 농도로 테스트되었을 때, TL1a와 DcR3의 상호작용은 억제시키지 않았다. 이러한 결과는 항체 C300-25 및 1B4의 것과 대조를 이룬다. 이와 관련하여, 항체 C300-25는 본 발명자에 의해 제조된 래트 단일클론 항체이다.

DR3 및 DcR3은 TL1a에의 결합에 대하여 경쟁하는 것으로 나타났다. 그러므로, 항체는 DcR3이 아닌, DR3에 대해 중화성인 TL1a 상의 에피토프를 표적화하면서, 특이적으로 단리되었다는 것을 예상하지 못했다. 이러한 결과는 본원에 기술된 항체가 DcR3의 천연 길항성 기능 또는 DcR3 결합의 항상성 균형을 파괴시키지 않으면서, 어느 이론 또는 작용 모드에 의해 제한하고자 하지 않으면서, DcR3은 동족 신호전달 수용체(각각 Fas 및 H-VEM)에의 결합에 대하여 이용가능한 각 유리 Fas-L 및 LIGHT의 양을 조절하기 때문에, 상기 선택성 억제는 생물학적으로 관련이 있을 수 있다. 결과적으로, TL1a와 DcR3 사이의 상호작용을 억제시키면, DcR3이 결합하는 Fas-L 및 LIGHT의 양은 증가하게 되고, 이로써, 그의 동족 수용체를 통해 신호전달에 이용가능한 양은 감소하게 된다. Fas 매개 사멸은 암 감시에서 중요한 역할을 하는 바, Fas-L에 결합하는 DcR3의 양을 증가시켰을 때 하류에서 일어나는 잠재적인 결과로는 암에 대한 감수성 증가를 포함할 수 있다. 어느 이론 또는 작용 모드에 의해 제한하고자 하지 않으면서, DcR3이 아닌, TL1a와 DR3의 상호작용을 특이적으로 억제하는 항체를 단리시키는 것이 안전성을 손상시키지 않으면서, 질환을 치료하는 데 있어서 유익할 수 있다.

실시예 5: 에피토프 지도화

아미노산 치환을 가용성 TL1a의 서열(서열 번호 202)에 도입하여 일련의 TL1a 뮤테인을 생성하였다.

실시예 1.10에 기술된 SPR 기반 뮤테인 분석 검정볍을 사용하여, 형질감염된 HEK293E 세포로부터의 상청액 중 TL1a 뮤테인을 발현 수준 및 C320에의 결합에 대하여 테스트하였다. 결과는 하기 표 6에 제시되어 있다.

[표 6]

발현은 잘 되지만(2,000 RU 초과의 뮤테인 발현) 항체 C320에는 결합하지 못하는(17 RU 미만의 TL1a 결합) 뮤테인을 추가 분석을 위해 선택하였다.

아미노산 G53 및 A55가 치환된 뮤테인은 발현을 잘하지 못하고, 다중클론 항TL1a에의 결합은 감소되었는데, 이는 상기 아미노산이 TL1a의 구조적 완전성에 중요한 잔기라는 것을 제안한다. 다른 뮤테인들은 모두 적절하게 발현되었고, 다중클론 항TL1a에 결합하였으며, 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE 겔 상에서 야생형 TL1a와 등가로 전개되었다. 이러한 특징들은 모두 뮤테인이 적절하게 발현되었고, TL1a 단백질로 폴딩되었다는 것을 제안한다.

뮤테인은 본원에 기술된 상이한 단일클론 항TL1a 항체에 대하여 차별적인 결합 패턴을 보였다. 항체 C320, C320-168 및 C320-179는 R32A 및 R85A 뮤테인에, 또는 상기 두 치환 모두를 포함하는 뮤테인에 검출가능하게 결합하지는 못했다(도 5A 및 B). C320은 또한 P35A, T168A 및 E170A 뮤테인에 대해 무시해도 될 정도의 결합을 보인 반면, C320-168 및 C320-179는 C320과 같은 정도는 아니지만, 상기 뮤테인에 대하여 감소된 결합을 나타내었다. 대조적으로, TL1a 결합 항체 1B4 및 16H2는 야생형 TL1a의 50% 초과로 뮤테인 R32A, R85A, P35A, T168A에 결합하는 것으로 나타났는데, 이는 상기 위치의 아미노산은 1B4 및 16H2의 TL1a에의 결합에 대해서는 중요하지 않다는 것을 시사한다.

항체 C320, C320-168 및 C320-179는 DcR3이 아닌 DR3에의 TL1a의 결합을 억제시킨다는 것을 고려하면, 항체는 DR3의 TL1a에의 결합에 관여하는 아미노산에 결합할 가능성이 있으며, 상기 상호작용을 파괴시킬 가능성이 있다. DcR3이 아닌 DR3의 R32A 및 R85A 뮤테인에의 결합은 유의적으로 감소하였는데, 이는 상기 장기가 TL1a 결합에의 TL1a 결합에 관여한다는 것을 제안한다(도 5C).

TL1a 상의 항체 C320, C320-168 및 C320-179의 결합 부위는 도 5D에 되시되어 있다. 상기 다이어그램으로부터 알 수 있는 바와 같이, 잔기 R32 및 R85는 1차 아미노산 서열에서는 원거리에 있지만, 단백질의 3차 구조에서는 서로 인접하게 위치해 있다. 그러므로, 이는 항체 C320, C320-168 및 C320-179가 결합하는 TL1a 상의 에피토프 내에서 중요한 잔기인 것으로 간주될 수 있다.

실시예 6 - 세포 표면 TL1a 에 결합하는 항체의 특징 규명

대부분의 TNF-리간드 슈퍼패밀리 구성원과 같이 TL1a는 절단되어 가용성 TL1a를 생성하는 세포 표면 형태로 존재하며, 다른 구성원의 경우에는, 막 형태의 TL1(mbTL1a)은 생물학적 기능을 가지는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, TL1a의 활성을 중화시키기 위해서는 막 및 가용성 TL1a, 둘 모두에 강력하게 결합하는 항체를 가지는 것이 유익할 것이다. TL1a를 기능적으로 억제시키는 것으로 나타난 항체를 (실시예 1.11에 기술된 바와 같이 제조된) 막 고정 TL1a로 안정하게 형질감염된 인간 세포주에서 유세포 측정법에 의해 스크리닝하였다.

항체 C320, C321, C323 및 1B4는 모두 0.5 내지 2 nM의 EC_50S로 TL1a 형질감염된 세포주(도 6)에 결합하였지만, 비형질감염된 정상 세포에는 결합하지 못했다.

본원에 기술된 항체의 특징을 추가로 규명하기 위해, 1차 인간 세포에서의 그의 기능을 테스트하였다. 실시예 1.12에 기술되어 있는 바와 같이 PBMC를 단리시켰다. 실시예 1.13에 기술된 검정 조건을 사용한 결과, 상기 세포는 mbTL1a(도 7A) 및 가용성 TL1a(도 7B), 둘 모두에 결합하는 것으로 나타났다.

PBMC를 실시예 1.13에 기술되어 있는 바와 같이 자극시키고, 항TL1a 항체의 존재하에서 시토카인 생산에 대해 검정하였다. 세포 배양물에 어떤 외인성 TL1a도 첨가하지 않았기 때문에, 항TL1a 항체의 효과는 내인성 TL1a의 중화에 기인하는 것이었다. 항체 C320 및 C323은 PBMC에 의한 내인성 TL1a 유도성 시토카인 생산을 잘 억제시키는 것으로 나타났다(도 8). 이러한 억제는 전형적으로 Th1 세포(IFN-γ; 도 8A) 및 Th2 세포(IL-13; 도 8B)에 의해 생산되는 시토카인에 대해 뚜렷이 나타났다. 상기 데이터는 이들 항체가 1차 인간 세포로부터 제조된 TL1a를 억제시킬 가능성이고 있고, 이들 항체가 세포 상의, 또는 혈청 중의 TL1a를 검출하기 위한 진단학적 시약으로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

실시예 7: C320 의 개선된 변이체 생성

C320의 효능에는 최소의 영향을 미치면서, 항체의 생물물리학적 특성에는 미치는 긍정적인 효과를 낼 수 있게 하려는 목적으로 C320 항체를 항체의 서열을 변경시킴으로써 추가로 최적화시켰다.

예를 들어, 항체의 발현 수준을 증진시키면서, 부수적으로 생산 수준도 증가시키는 변경이 바람직할 수 있다. 아미노산 치환을 통해 V_H 중의 N 연결된 당화 부위를 제거하여 생성물의 이종성을 감소시키면, C320은 추가로 증진될 수 있다. 정제 또는 보관하는 동안 산화 또는 이성질화를 통해 항체의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 잠재능을 가진 아미노산 잔기를 상기와 같은 이행을 겪지 않는 아미노산으로 치환시키면 C320은 추가로 개선될 수 있다. 잠재적으로 면역원성에 기여할 수 있는 희귀 또는 비배선 C320 서열을 면역원성이 더 낮은 것으로 예측되는 서열로 치환시키면 C320은 추가로 개선될 수 있다. 상기와 같은 변이는 하기에 더욱 상세하게 기술된다.

C320 의 발현 증진

C320 V_H 및 V_L 아미노산 서열을 사용하여 베이직 로컬 얼라이먼트 서치 툴 검색(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool: 문헌 [Altschul et al., J Mol Biol 215: 403-410, 1990])에 의해 인간 항체 배선 아미노산 서열에 대한 데이터베이스 정보를 얻었다. 이를 통해서 각각 C320 V_H 및 C320 V_L과의 상동성이 가장 큰 인간 항체 배선 서열 20개를 확인하였다. 인간 배선 서열을 C320의 것과 정렬함으로써 대다수의 배선에는 보편적이지 않지만, C320에는 존재하는 잔기를 확인할 수 있었다. 배선 서열로부터의 가장 보편적인 아미노산을 C320 아미노산 서열로 치환하였다. 하기 표 7에는 아미노산 치환, 및 HEK293E 세포에서의 일과성 형질감염으로부터 각 항체의 발현 수준에 대해 상기 치환이 미치는 영향이 열거되어 있다.

C320-3 및 C320-5 중에 존재하는 두 치환은, TF-1 효능 검정법에서 항체의 효능에는 최소로 영향을 미치면서, 항체의 발현 수준을 2배 초과로 상승시켰다. 상기 두 치환 모두를 혼입하는 추가의 항체인 C320-135는 대체로 등가인 효능을 가졌고, 개선된 발현 수준을 유지하였다.

C320-4은, 발현 개선을 목적으로 함과 동시에, N 연결된 당화 모티프를 제거하려는 시도로 N73D(카바트 번호매김 체계에 따르면 N72D) 치환을 포함하였다. 그러나, N73D 치환은 항체 발현을 폐기시켰으며, 이는 N73이 항체의 발현에 바람직하다는 것을 제안한다.

C320 발현을 추가로 개선시키기 위해, C320의 CDR을 결정 구조가 공지되어 있는 항체의 다른 골격 상에 이식시켰다. 결정 구조가 공지되어 있는 항체는 보통 매칭되는 V_H:V_L 쌍을 가지고 있기 때문에, 상기와 같은 독특한 접근법을 취하였다. 적합한 V_H 및 V_L 골격을 가진 항체를 선별하기 위해, 골격 구조 데이터베이스에 대한 BLAST 검색을 수행하여 C320과 유사한 아미노산 서열을 가진 항체를 확인하였다. C320 V_H를 사용하여 BLAST 검색을 이용함으로써 공지된 결정 구조와 가장 상동성이 큰 항체 서열 100개를 확인하였다. 유사하게, 공지된 결정 구조와 가장 상동성이 큰 C320 V_L에 대한 항체 서열 100개를 확인하였다. 중쇄 및 경쇄 목록, 둘 모두에 나타난 결정 구조는 CDR 이식에 적합한 수용체 골격인 것으로 간주하였다. 이는 1TZG, 1RHH, 2DD8, 2JB5, 3FKU, 3GBM, 3IYW, 3LMJ, 및 3P30이었다. 이어서, C320의 CDR을 사용하여 상기 각 항체 서열에 존재하는 CDR 서열을 치환하였다. C320 CDR 영역을 포함하는 각 서열에 대한 정렬은 도 1D(중쇄) 및 도 1G(경쇄)에 제시되어 있다. 이어서, 항체 중쇄 및 경쇄를 하기와 같이 쌍으로 만들고, 단백질 발현 및 TL1a 결합에 대해 평가하고, 그 결과를 하기 표 8에 열거하였다.

C320의 CDR을 상이한 항체 골격 상에 이식시켰을 때, 다수의 생성된 항체는 C320 항체의 수준보다 높은 수준을 발현되었다. 중쇄 C320 CDR이 항체 1TZG 골격 상에 이식되고, C320 경쇄와 쌍을 형성하고 있는 항체 C320-16은 C320보다 3배 더 우수하게 발현되었다. 본 실험에서는 또한, 그 내부로 C320 경쇄 CDR이 이식되는 경쇄 항체 골격 중 일부는 C320에 존재하는 람다 이소타입이 아닌 카파 이소타입이기 때문에, 상기 접근법을 이용함으로써 항체의 이소타입은 변화시킬 수 있고, 단백질 발현 및 TL1a에의 결합을 유지시킬 수 있다는 것이 입증되었다.

항체의 발현을 추가로 개선시키기 위해, 아미노산 치환을 C320의 가변 중쇄의 CDR3 영역 내로 도입하고, 항체로 HEK293E 세포를 형질감염시키고, 단백질 A HPLC를 사용하여 발현 수준에 대하여, 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 단백질 A 포획에 대해 스크리닝하였다. 그 결과는 하기 표 9에 기술되어 있다.

[표 9]

단백질 A 표면 상에의 포획에 의해 측정된 바, C320 수준보다 유의적으로 더 큰 발현 수준을 보이는 수개의 항체를 생성하였다. 발현 수준이 높은 항체 중 수개의 항체를 다시 형질감염시키고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하고, TF-1 검정법으로 그의 효능을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 10에 열거되어 있다.

생성된 항체의 효능은 예컨대, C320-119와 같이, C320과 비교하였을 때 감소된 것에서부터, C320과 등가인 수준까지의 범위였다.

C320의 경쇄 서열을 상동성이 가장 높은 배선 서열인 IGLV1-40*01에 대하여 정렬하였다. 도 9A에 제시된 바와 같은, CDR 영역 중의 아미노산 서열 차이를 확인하였다. 서열이 상이한 위치에서 배선 서열로부터 C320으로의 아미노산 역 치환을 수행하였다. 항체를 HEK293 세포에서 발현시키고, 정제하고, C320에 대해 상대적인 단백질 수율을 측정하였다. TF-1 세포를 사용하여 효능 검정을 이용함으로써 항체의 억제 프로파일의 특징을 규명하였다. 그 결과는 하기 표 11에 제시하였다.

항체 C320-120은 발현 수준이 우수하고, 본 실험에서 테스트된 모든 항체 중 효능이 가장 높은 것으로 입증되었다. 치환 중 일부, 예컨대, C320-123 및 C320-125에서의 치환을 통해 항체는 발현되었지만, 그 항체는 TF-1 세포 상에서의 TL1a 유도성 아폽토시스를 더 이상 억제시키지 않거나, 또는 약하게 억제시켰다. 이는 가변 경쇄의 G34(카바트 번호매김 체계에 따라 G32) 위치 및 Y54(카바트 번호매김 체계에 따라 Y52) 위치의 아미노산은 항체가 TL1a의 활성을 억제시킬 수 있도록 하는 데 있어 중요할 수 있다는 것을 제안하였다.

C320 으로부터의 산화 또는 이성질화 추정 부위 제거

가변 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산을 분석함으로써 산화 또는 이성질화를 겪을 수 있는 수개의 아미노산을 확인하였다. 항체의 CDR 중에 존재하는 아미노산에 특히 많은 가치를 두었다. 이들 아미노산에 대한 변이는 시간이 경과함에 따라 항체의 결합 프로파일을 변경시킬 수 있다. 가변 중쇄에서, 잠재적 아스파테이트 이성질화 부위인 D102(카바트의 번호매김 체계에 따라 D98)와 함께, M51(카바트의 번호매김 체계에 따라 M51)은 잠재적 산화 부위로서 확인되었다. 경쇄에서, D94(카바트의 번호매김 체계에 따라 D92)는 잠재적 이성질화 부위로서 확인되었다. 이와 같이 예측되는 문제의 잠재적 영향을 감소시키기 위하여, 상기 위치에 보존적 또는 반보존적 아미노산 치환을 포함하는 C320의 변이체를 제조하였다. 이들 치환 및 이들 치환이 생성된 C320 변이체의 효능에 미치는 효과가 하기 표 12에 열거되어 있다.

중쇄에 존재하는 잠재적 산화 및 이성질화 부위를 보존적 아미노산으로 성공적으로 치환시킴으로써 발현은 개선시키고, 효능을 유지시켰다. 경쇄 CDR 영역 중의 D94E를 치환시킴으로써 발현 수준은 C320과 유사하지만, 효능은 유의적으로 감소된 항체를 수득하였으며, 이는 경쇄의 D94가 C320의 기능적 활성을 매개하는 데 있어 중요할 수 있다는 것을 시사한다.

C320 중쇄로부터의 N 당화 부위 제거

DTS로의 치환(N73D; 카바트의 번호매김 체계에 따라 N72D)에 의해 V_H 당화 부위 NTS를 제거하고자 한 이전 시도가 성공을 거두지 못했기 때문에, 더욱 포괄적 범위의 치환을 사용함으로써 N 연결된 당화 모티프, NX(S/T)(여기서, X≠P)를 파괴시키기 위해 추가로 시도하였다. 첫번째로, 73번 위치의 아스파라긴 대신, 추가의 잔기를 테스트하였다. 두번째로, 치환 T74P(카바트 번호매김 체계에 따라 T73P)를 테스트하였는데, 그 이유는 상기 위치의 프롤린이 N 연결된 당화를 방해하는 것으로 알려져 있기 때문이다. S75(카바트 번호매김 체계에 따라 T74) 대시 다양한 아미노산 또한 테스트하였다. 상기 당화 부위를 제거하기 위한 시도로 테스트된 구성물, 및 그가 항체 발현 수준에 미치는 효과는 하기 표 13에 열거되어 있다.

테스트된 C320 변이체 대부분은 C320과 비교하여 더 낮은 발현 수준을 보였는데, 이는 C320 중의 NTS 모티프에 존재하는 개별 아미노산을 치환시키는 것이 항체의 발현을 감소시켰다는 것을 제안한다.

C320 CDR을 상이한 항체 골격에 이식시킴으로써 C320의 발현을 증진시키고자 한 이전 시도의 결과는, 1TZG의 골격을 이용한, C320-16으로 지정된 항체였다. 상기 항체는 잘 발현되었고, TL1a에 결합하였다(표 7). C320 V_H 서열의 서열 번호 42의 72번부터 76번까지 위치(카바트의 번호매김 체계에 따라 71번부터 75번까지 위치)의 RNTSI(서열 번호 203)가 1TZG의 상응하는 V_H 서열 중 ADRST(서열 번호 204)로 치환되었기 때문에, 1TZG 및 C320-16의 골격에는 N 연결된 당화 서열 모티프가 없었다.

발현 증진 치환 V_H T41P 및 V_L A73T를 포함하는 변이체 C320-135를 추가로 중쇄를 공학처리하였다. 71번부터 75번까지 위치의 C320 V_H 서열 RNTSI(서열 번호 203)를 1TZG의 상응하는 V_H 서열로부터의 ADRST(서열 번호 204)로 치환시켜 항체 C320-163을 수득하였다. 현재 N 연결된 당화 부위가 없는 상기 항체는 HEK293E 세포를 형질감염시켰을 때, 발현되었고, 정제시켰을 때에는 TF-1 세포의 TL1a 매개 아폽토시스를 기능적으로 억제시킬 수 있었다(표 14).

개선된 C320 변이체

이어서, 이전 실험에서 C320에 대해 유익한 특성을 부여하는 것으로 확인된 아미노산 치환을 조합하고, 생성된 항체를 발현시키고, 정제시키고, 효능에 대해 검정하였다. 이들 서열은 도 9B(가변 중쇄) 및 도 9C(가변 경쇄)에 열거되어 있다. 각 항체의 비교 효능 및 발현 데이터는 하기 표 14에 열거되어 있다.

등전 포커싱(IEF: isoelectric focusing) 겔 상에서 (N 연결된 글리칸 모티프를 포함하는) 항체 C320-168을 (N 연결된 글리칸 모티프가 없는) C320-163 및 C320-170과 비교한 결과, N 연결된 당화 부위 제거시, 항체 프로파일로부터 전하 이질성이 제거된다는 것이 입증되었다(도 9D). C320-168은 C320-163 및 C320-170에 대해 시각화되는 1-2개의 이소폼과 비교하여 5 내지 6개의 상이한 하전된 이소폼을 가진다. 이러한 전하 이질성 감소는 대규모 제조 공정에서 배치와 배치 사이의 일관성 개선을 제공하는 유익한 특성이 된다(문헌 [Wang et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 96:1-26, 2006]).

테스트된 항체들 중, 두 항체, C320-168 및 C320-179는 모체 C320 항체보다 더강력한 효력을 가졌다(도 9E). 상기 두 C320 변이체는 모두 앞서 기술된 다른 유익한 아미노산 치환과 함께 조합하여, TF-1 검정법에서 효능을 개선시키는 것으로 밝혀진 경쇄 가변 영역 치환 G24S(카바트의 번호매김 체계에 따라 G25S)를 포함하였다.

항체로부터의 예측 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 제거

소프트웨어 패키지 에피베이스(Epibase)™(론자(LONZA))를 사용하여 C320-168 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열에 대한 인 실리코 분석을 수행하였다. 상기 소프트웨어를 통해 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합하는, C320-168에 존재한 펩티드의 서열의 성향을 예측하였다. 펩티드의 MHC 클래스 II 대립유전자에의 상기와 같은 결합은 투여된 항체에 대한 숙주 면역 반응에서 중요한 단계이다.

C320-168의 중쇄 중의 펩티드 서열, GLEWMGWLNPNSGNT(서열 번호 205)는 DRB1*0401에 강하게 결합하는 것으로 예측되었다. C320-168의 경쇄 중의 펩티드 서열, LLIYGYYNRPSGVPD(서열 번호 206)는 DRB1*1101, DRB1*1104 및 DRB1*1501에 강하게 결합하는 것으로 예측되었다.

상기 열거된 펩티드 서열, 및 이들 펩티드 서열의 변형된 버전을 합성하고, 상응하는 MHC 클래스 II 단백질과 인큐베이션시키고, ELISA를 수행하여 펩티드가 MHC 클래스 II 단백질과 복합체를 형성하는지 여부를 측정하였다. 인플루엔자 펩티드, PKYVKQNTLKLAT(서열 번호 207)를 본 검정법에서 양성 대조군으로서 사용함으로써 펩티드:MHC 클래스 II 복합체 형성을 나타내었다. 각 펩티드의 MHC 클래스 II 대립유전자에의 결합은 하기 표 15에 열거되어 있다.

면역학상 유의적이거나, 또는 추가 조사를 통해 우수한 결합제인 것으로 보증되는 펩티드는 점수가 양성 대조군의 ≥ 15% 펩티드인 것으로 간주된다. 그러므로, 펩티드 GLEWMGWLNPNSGNT(서열 번호 205)는 면역원성일 가능성은 낮으며, C320 관련 항체 중 상기 모티프를 변형시키는 시도는 하지 않았다.

펩티드 LLIYGYYNRPSGVPD(서열 번호 206)는 MHC 클래스 II 단백질 DRB1*1501과는 복합체를 형성하였지만(123% 결합), DRB1*1101 또는 DRB1*1104와는 형성하지 않은 것으로 나타났다. (C320-168 가변 경쇄 서열에서 51번 위치(카바트의 번호매김 체계에 따라 49번 위치)에 상응하는) 펩티드의 4번째 위치의 티로신 잔기를 글루탐산, 글리신, 프롤린, 또는 리신 중 하나로 변형시킴으로써 펩티드:MHC 클래스 II 복합체 형성을 감소시키고자 하는 시도를 수행하였다. 상기 위치에 글루탐산 또는 글리신 잔기를 도입한 결과, 복합체 형성은 50% 초과만큼 감소하였다(표 14). 상기 위치에 글루탐산 또는 프롤린을 도입한 결과, 복합체 형성은 저지되었다. 항체 C320-172 및 C320-179는 그의 V_L 영역에 치환 Y51E(카바트의 번호매김 체계에 따라 Y49E)를 도입한 반면, C320-183은 V_L 영역에 변이 Y51G(카바트의 번호매김 체계에 따라 Y49G)를 도입하였다. 표 13에 제시되어 있는 바와 같이, 3가지 항체 모두 발현되었고, TL1a를 기능적으로 억제시켰다. 치환 Y51E(카바트의 번호매김 체계에 따라 Y49E)를 도입한 항체 C320-171의 발현은 검출되었지만, 상기 항체는 TL1a를 기능적으로 억제시키지는 않았으며, 이는 모든 아미노산이 경쇄 49번 위치에서 허용되는 것은 아니라는 것을 시사한다(표 13).

실시예 8 - 고효능의 DR3 선택성 항체의 생성

TL1a 상의 C320 항체 에피토프에 초점을 맞춤으로써 고효능으로 TL1a 활성을 중화시킬 수 있고, TL1a-DR3 매개 활성을 선택적으로 억제시킬 수 있는 신규한 항체를 생성하였다. 예를 들어, 발현 및/또는 TL1a 중화(예컨대, 실시예 7에 기술된 것)가 개선된 돌연변이체 가변 영역 및/또는 개별 치환을 조합하고, 다시 테스트하여 상기 개선이 부가적인지 여부를 측정하였다.

다른 접근법에서, C320에 결합하는 에피토프에 결합하는 항체를 다양한 기법 중 임의 기법에 의해 선별하였다.

8.1 C320 항체를 사용한 항체 라이브러리로부터의 선별

약 100 pmol의 항원 밀도(즉, 비오티닐화된 TL1a) 및 앞서 기술된 TEA 기반 용리 단계를 이용하여 1회차 패닝 라운드를 수행하는 파지 디스플레이 프로토콜을 사용하였다. 2회차 및 3회차 라운드에서는 감소된 항원 밀도(예컨대, 약 50 pmol)를 사용하였다. 10배 몰 과량으로 C320 IgG를 첨가하고, 반응물을 실온에서 2, 5, 10 또는 20 min 동안 인큐베이션시킴으로써 파지를 용리시켰다. IgG는 C320 에피토프에 결합하는 FAb를 발현하는 파지를 특이적으로 이동시키고 용리시키는 것으로 예상되었다. TL1a 표면 상의 다른 영역에 결합하는 비특이 결합제 및 파지는 상기 조건하에서 용리될 가능성이 더 적은 것으로 나타났다.

세척 방식은 1회차 및 2회차 라운드의 경우에는 M-PBS로 6회에 걸쳐 세척하는 것을 포함하였다. 3회차 라운드의 경우, PBST로 3회에 걸쳐 세척한 후, 이어서, PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다.

다른 파지 디스플레이 실험에 대하여 기술된 바와 같이, 파지미드 구제를 위해, 또는 스크리닝을 위한 콜로니 생성을 위해 TG1 E. 콜라이를 감염시키는 데 용리된 파지를 사용하였다.

8.2 돌연변이체 TL1a를 사용하여 항체 선별/제조

파지 디스플레이를 위한 패닝 시약으로서 TL1a의 돌연변이화된 버전을 사용함으로써 C320의 것과 유사한 에피토프를 인식하는 항체를 수득하였다. 파지 디스플레이 라이브러리에는 R32A 및/또는 R85A의 아미노산 치환을 가지는 TL1a를 인식하는 항체는 고갈되어 있을 수 있었다. 이어서, 라이브러리를 TL1a에 대해 패닝할 수 있었다. 생성된 단리된 항체는 잔기 R32 및/또는 R85에 결합할 가능성이 있었다.

실시예 9: C320 의 친화도 성숙

항체 C320은 이미 TL1a 활성의 강력한 억제제이다. 그러나, 친화도 성숙 접근법을 사용함으로써 효능을 증진시킬 수 있었다. 증진된 효능은 빈번하게는 투약 및 효능에 있어 장점을 부여한다.

항체의 친화도 성숙에 관한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들 다수는 돌연변이 유발에 의해 변이체 단백질로 이루어진 패널 또는 라이브러리를 생성한 후, 친화성 개선에 대하여 선별 및/또는 스크리닝하는 일반 전략법에 기초한다. 돌연변이 유발은 대개 예를 들어, 오류 유발형 PCR(문헌 [Thie et al., Methods Mol . Biol. 525: 309-322, xv, 2009])에 의해, 유전자 셔플링에 의해(문헌 [Kolkman and Stemmer, Nat . Biotechnol . 19: 423-428, 2001]), 돌연변이 유발성 화학 물질 또는 방사선 사용에 의해, 오류 유발형 복제 기구를 가진 '돌연변이 유발 인자' 균주 사용에 의해(문헌 [Greener et al., In Vitro Mutagenesis Protocols. (Humana press, NJ ), 1996]), 또는 천연 친화도 성숙화 기구를 이용하는 체세포 과다돌연변이화 접근법(문헌 [Peled et al., Annu . Rev . Immunol . 26: 481-511, 2008])에 의해 DNA 수준에서 수행된다. 돌연변이 유발은 또한 예를 들어, Qβ 레플리카제 사용에 의해 RNA 수준에서 수행된다(문헌 [Kopsidas et al., Immunol . Lett . 107: 163-168, 2006]). 개선된 변이체 단백질에 대한 스크리닝을 허용하는 라이브러리 기반 방법은 예컨대, 파지, 효모, 리보좀, 박테리아 또는 포유동물 세포와 같은 다양한 디스플레이 기술에 기초하며, 이는 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Benhar, Expert Opin . Biol . Ther . 7: 763-779, 2007]). 친화도 성숙은 또한 예를 들어, 3D 단백질 모델링을 통한 발견 결과에 의해 유도되는 부위 지정 돌연변이 유발 또는 유전자 합성에 의해 규제력/예측력이 더 큰 방법에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, US6,180,370 또는 US5,225,539 참조).

리보좀 디스플레이를 사용한 친화도 성숙(문헌 [Kopsidas et al., BMC Biotechnol. 7: 18, 2007])은 scFv 포맷의 C320 관련 항체의 V_L 및 V_H 도메인을 코딩하는 RNA를 이용함으로써 수행된다. Qβ 레플리카제를 사용하여(전형적으로는 분자 1개당 1 내지 3개의 변이) 상기 RNA의 변이체의 라이브러리를 생성하고, 상기 라이브러리를 디스플레이하고, TL1a에의 결합에 대하여 리보좀 상에서 선별한다. 사용된 RNA 구성물은 기능성 scFv 단백질을 번역하는 리보좀에 부착된 상태로 남아있기 때문에, 표현형과 유전자형 사이의 연관 관계가 달성된다. C320 관련 scFv-RNA-리보좀 복합체를 TL1a에 대해 패닝하고, 단리시켰다. RNA를 DNA로 전환시키고, 박테리아 발현 시스템으로 혼입시켰다. 이어서, 단일 scFv를 코딩하는 개별 박테리아를 단리시키고, scFv를 발현하도록 유도하였다. 경쟁 ELISA를 사용하여, TL1a에 대한 친화도가 C320 관련 scFv보다 더 높은 scFv를 확인하였다. 상기 scFv를 전장의 항체로 전환시키고, 실시예 1.8에 기술된 바와 같이 TF-1 아폽토시스 검정법으로 스크리닝함으로써 TL1a의 생물학적 활성 억제에 있어서 C320에 비하여 개선이 이루어졌는지 측정하였다.

실시예 11: 결장염을 앓는 동물 모델에서의 항 TL1a 항체의 효능

(문헌 [Wirtz et al., Nat . Protoc . 2: 541-546, 2007]에 기술되어 있는 바와 같이) 디- 또는 트리-니트로벤젠술폰산(D/TNBS) 또는 옥사졸론의 직장내 투여에 의해 유도된 급성 결장염, 및 식수 중의 DSS의 투여에 의해 유도된 만성 결장염을 앓는 설치류 모델에서 본원에 기술된 설치류 교차 반응성 항TL1a 항체를 테스트하였다. DNBS 및 옥사졸론은 국소 궤양 및 염증을 유도한다. DSS 투여는 부식성 병변 및 염증성 침윤을 특징으로 하는 강력한 전신성 장관 염증을 유도한다. 상기 모델 모두의 증상으로는 보통 설사, 잠혈, 체중 감소 및 간혹 직장탈출증을 포함한다.

예방학적 모델에서, 결장염 유도 화합물 투여 출발시 항체 치료를 개시하였다. 치료학적 모델에서는, 유도 개시 후 수일이 경과한 후에 항체 치료를 개시하였다. 치료가 체중, 대변 굳기 및 잠혈에 미치는 효과 뿐만 아니라, 상피 보전에 미치는 미시적 효과 및 염증성 침윤 정도를 측정하였다. 대변 굳기 및 잠혈 존재에 기초하여 매일의 임상 점수 평가를 수행함으로써 질병 활성도 지표(DAI) 점수 매김을 하였다.

항체 C320-168은 DNBS- 또는 옥사졸론 유도성 결장염에서 예방학적으로 투여되었을 때(도 10A-10C), 및 DSS 유도성 결장염에서 치료학적으로 투여되었을 때(도 11A 및 11B), 표준 치료 화합물과 유사한 효능을 보였다

실시예 12: 질환을 앓는 동물 모델에서의 항 TL1a 항체의 효능

다발성 경화증을 앓는 설치류 모델에서 항체를 추가로 테스트하였다(문헌 [Racke, Curr . Protoc . Neurosci . Chapter 9, Unit 9 7, 2001]). 상기 모델에서, 애주번트 중의 척수 균질액 또는 정제된 미엘린 펩티드 투여에 의해 급성 또는 만성 중추 신경계 탈수초화를 유도하였다. 상기 투여로 척수 뉴런 주변의 미엘린초는 자가면역적으로 파괴되었고, 이로써 하지는 쇠약해졌고, 이는 마비로 발전할 수 있었으며, 척수로의 유의적인 염증성 침윤을 특징으로 하였다. 급성 형태는 단상이고, 동물은 자발적으로 회복되었다. 만성 형태는 재발 완화성 다발성 경화증과 유사하였고, 이는 뒷다리 쇠약/마비로 이루어진 2가지 이상의 에피소드로 구성되었다.

예컨대, 근육 쇠약의 역전 또는 감소와 같은 증상의 호전, 및 척수 수초화 정도 및 염증성 침윤 정도를 평가함으로써 미시적 수준, 이 둘 모두에서 항체 효과를 측정하였다.

항체를 예컨대, 급성 및 만성 형태의 질환에서 치료학적 적용에 대해, 및 예컨대, 만성 형태의 질환의 관해 동안의 투여에 의해 예방학적 적용에 대해 테스트하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Cephalon Australia Pty Ltd Poulton, Lynn Clarke, Adam Tamvakis, Debra Kopsidas, George Doyle, Anthony Jennings, Philip Pollard, Matthew <120> Antibodies against TL1a and uses thereof <130> 512500 <150> 61/541590 <151> 2011-09-30 <150> 2011904042 <151> 2011-09-30 <160> 235 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser His His His His His His His His Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Ser Leu Lys Gly Gln Glu 20 25 30 Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly 35 40 45 Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln 50 55 60 His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly 65 70 75 80 Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu 85 90 95 Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg 100 105 110 Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn 115 120 125 Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val 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tatgataatc tcccgatcac cttcggccag 300 gggacacgac tggagattaa acgt 324 <210> 98 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C334 <400> 98 caaatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaaccac 180 gcacagagct tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attattgttc aaccaactcg 300 tatagcagca gctggtatga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C334 <400> 99 gatgttgtga tgacacagtc tccagctttc ctctctgtgt ctcctgggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattagc aacaacttag cctggtatca gcaaatgcct 120 ggccaggctc ccaggctcct tctttatgat gcatccacca gggccactga tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagag ttcactctca ccatcagcgg cctgcagtct 240 gcagattttg cagtttatta ctgtcaacaa tacaataact ggcctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagc tggagatcaa acgt 324 <210> 100 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C333 <400> 100 caggtccagc ttgtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccatat attactgttc aaccaactcc 300 tatagcagca gctggtatga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 101 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C333 <400> 101 gaaattgtgt tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctcctgggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtattacc aacaacttag cctggtatca acaactgcct 120 ggccaggctc ccaggctcct tatttacgat gcatccacca gggccactga tatcccagcc 180 aggttcagtg gcactgggtc tgggtcagag ttcactctca ccatcagcgg cctgcagtct 240 gcggattttg cagtttatta ctgtcaacaa tacaataact ggcctctcac tttcggcgga 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324 <210> 102 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C323 <400> 102 caaatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180 gcacagaggt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccatat attactgttc aaccaactcc 300 tatagcagca gctggtatga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 103 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C323 <400> 103 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gcgcaagtca gggcattggc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggtacagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcgg cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttagttatt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagc tggagatcaa acgt 324 <210> 104 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C321 <400> 104 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagactcc 300 catatttacg atattttgac tggttatgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 105 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C321 <400> 105 gatgttgtga tgacacagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgcc actctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcagcaga ggcccggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagatac acaatttcct 300 cagacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgt 339 <210> 106 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320 <400> 106 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgatacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 107 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C320 <400> 107 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcgctg ggagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 108 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C319 <400> 108 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc agtagaaact ggtggagttg ggtccgccag 120 tccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatc acagtgatat aaccaactat 180 aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccatt tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gaaggacggg 300 gaggcgggcg ggacctacat tgatgctttt gatgtctggg gccaagggac aatggtcacc 360 gtctcttca 369 <210> 109 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C319 <400> 109 cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt atttataact atgtctcctg gtaccaacaa 120 cacccaggca aagcccccaa actcataatt tatgatgtca gtgagcggcc ctcaggggtc 180 cctgatcgct tctctggctc caagtctgac aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc tactcatatg caggcaccta cacttcctta 300 ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta ggt 333 <210> 110 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-3 <400> 110 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgatacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 111 <211> 333 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C320-5 <400> 111 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcgctg ggagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 112 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-90 <400> 112 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 accggccagg gcctggaatg gatgggctgg atgaacccca acagcggcaa caccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccggaaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggtg 300 cccgacgacg ccagcttcga gtattggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 113 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-103 <400> 113 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 accggccagg gcctggaatg gatgggctgg atgaacccca acagcggcaa caccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccggaaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggtg 300 cccgacaccg ccgccttcga gtattggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 114 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-114 <400> 114 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 accggccagg gcctggaatg gatgggctgg atgaacccca acagcggcaa caccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccggaaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggtg 300 cccgacaccg ccagcttcct gtattggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 115 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-115 <400> 115 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacgaca tcaactgggt ccgacaggcc 120 accggccagg gcctggaatg gatgggctgg atgaacccca acagcggcaa caccggctac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccggaaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaggtg 300 cccgacaccg ccagcttcga ctattggggc cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 116 <211> 333 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of C320-120 <400> 116 cagagcgtgc tgacacagcc ccctagcgtg tcaggcgccc ctggccagag agtgaccatc 60 tcttgcaccg gcagcagcag cgacatcgga gctggactgg gcgtgcactg gtatcagcag 120 ctgcctggca ccgcccccaa gctgctgatc tacggctact acaaccggcc cagcggcgtg 180 cccgacagat tcagcggcag caagagcggc accagcgcca gcctggccat cactggactg 240 ctgcccgagg acgagggcga ctactactgc cagagctacg acggcaccct gagcgccctg 300 tttggcggag gcaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 117 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-129 <400> 117 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgagacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 118 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of C320-130 <400> 118 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgatacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 119 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of VH of humanized antibody 1B4 <400> 119 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Asn Met Gly Val Val Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Leu Trp Asp Asp Arg Glu Tyr Ser Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Met Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 120 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of VL of humanized antibody 1B4 <400> 120 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr 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antibody 1B4 <400> 122 gacatccagc tgacccagag ccccagcttc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgta gcgccagcag cagcgtgaac tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 aaggccccca agctgctgat ctacagcacc agcaacctgg ccagcggcgt gcccagcaga 180 ttttctggca gcggcagcgg caccgagttc accctgacca tcagcagcct gcagcccgag 240 gacttcgcca cctactactg ccaccagtgg aacaactacg gcaccttcgg ccagggcacc 300 aaggtggaaa tcaagcgt 318 <210> 123 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu 1 5 10 15 Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala 35 40 45 Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu 50 55 60 Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser 65 70 75 80 His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg 85 90 95 Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn 100 105 110 Gln Phe Pro Ala Leu His Trp 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= Y or E or G <400> 149 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Xaa 1 5 10 15 <210> 150 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR3 consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> X=A or T <400> 150 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Leu Xaa Ile Thr Gly Leu Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR4 consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X=Q or K <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> X=L or T <400> 151 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 1 5 10 <210> 152 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> X <222> (41)..(41) <223> X=T or P <220> <221> X <222> (51)..(51) <223> X=M or L <220> <221> X <222> (102)..(102) <223> X=E or D <220> <221> X <222> (103)..(103) <223> X=T or D <220> <221> X <222> (105)..(105) <223> X=S or A <220> <221> X <222> (107)..(107) <223> X=L or D or E <400> 152 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Xaa Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Xaa Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Xaa Xaa Ala Xaa Phe Xaa Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 153 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vl consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> X=A or T <220> <221> X <222> (76)..(76) <223> X=A or T <400> 153 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Xaa Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 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VH consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> X=Q or E <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> X=L or V <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> X=V or L or Q <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> X=L or absent <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> X=Q or E <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> X=K or R <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> X=K or R or A <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> X=A or S <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> X=K or T or Q or R <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> X=K or T <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> X=A or S or V <220> <221> X <222> (42)..(42) <223> X=T or P <220> <221> X <222> (44)..(44) <223> X=Q or R or H or K <220> <221> X <222> (46)..(46) <223> X=L or P <220> <221> X <222> (47)..(47) <223> X=E or Q <220> <221> X <222> (49)..(49) <223> X=M or L <220> <221> X <222> (69)..(69) <223> X=V or I or L <220> <221> X <222> (70)..(70) <223> X=T or S <220> <221> X <222> (71)..(71) <223> X=M or I or F <220> <221> X <222> (73)..(73) <223> X=R or A or T or E <220> <221> X <222> (74)..(74) <223> X=N or D <220> <221> X <222> (75)..(75) <223> X=T or R or Q or E or D <220> <221> X <222> (76)..(76) <223> X=S or A or F <220> <221> X <222> (77)..(77) <223> X=I or T or A <220> <221> X <222> (78)..(78) <223> X=S or R or G or N <220> <221> X <222> (80)..(80) <223> X=A or V <220> <221> X <222> (82)..(82) <223> X=M or L <220> <221> X <222> (83)..(83) <223> X=E or D <220> <221> X <222> (85)..(85) <223> X=S or N or T or R <220> <221> X <222> (86)..(86) <223> X=S or N <220> <221> X <222> (89)..(89) <223> X=S or P or Y <220> <221> X <222> (90)..(90) <223> X=E or D <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> X=V or M <220> <221> X <222> (98)..(98) <223> X=A or T <220> <221> X <222> (99)..(99) <223> X=R or K or T <220> <221> X <222> (112)..(112) <223> X=Q or K <220> <221> X <222> (115)..(115) <223> X=L or T <400> 162 Xaa Val Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Ala Glu Val Xaa Xaa Pro Gly 1 5 10 15 Xaa Ser Val Xaa Val Ser Cys Xaa Xaa Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 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172 Xaa Xaa Xaa Leu Thr Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala 20 25 30 Gly Leu Gly Val His Trp Xaa Gln Gln Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Pro Xaa 35 40 45 Leu Xaa Xaa Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Xaa Xaa Pro Asp Arg 50 55 60 Phe Xaa Gly Xaa Lys Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ala Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly 85 90 95 Thr Leu Ser Ala Leu Phe Xaa Gly Gly Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 100 105 110 <210> 173 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> X= T or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X= M or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> X= R or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73) <223> X= N or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> X= T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> X= S or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> X=I or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> X= D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> X= S or A <400> 173 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Xaa Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Xaa Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Xaa Thr Ala Xaa Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 174 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL consensus sequence of C320 and derivatives <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> X = A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X = G or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) 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Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VH of antibody C320-164 <400> 177 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Glu Thr Ala Ser Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 178 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VH of antibody C320-165 <400> 178 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Leu Asn 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Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 189 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-163 <400> 189 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 190 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-164 <400> 190 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 191 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-165 <400> 191 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 192 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-166 <400> 192 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 193 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-167 <400> 193 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ala Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 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Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 199 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-179 <400> 199 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 200 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of antibody C320-183 <400> 200 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Leu Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Gly Thr 85 90 95 Leu Ser Ala Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 201 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of VL of germline sequence IGLV1-40*1 <220> <221> misc_feature <222> (100)..(111) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 201 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 <210> 202 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of soluble hTL1a <400> 202 Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser His Gln Gln Val Tyr Ala Pro 1 5 10 15 Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg Ala His Leu Thr Val Val Arg 20 25 30 Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp 35 40 45 Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr 50 55 60 Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln 85 90 95 Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr Lys 100 105 110 Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys 115 120 125 Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly 130 135 140 Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn Val Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly 165 170 175 Ala Phe Leu Leu 180 <210> 203 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of N-linked glycosylation site in VH of C320 <400> 203 Arg Asn Thr Ser Ile 1 5 <210> 204 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence from VH of 1TZG corresponding to N-linked glycosylation site in VH of C320 <400> 204 Ala Asp Arg Ser Thr 1 5 <210> 205 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of peptide from VH of C320-168 <400> 205 Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Leu Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr 1 5 10 15 <210> 206 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of peptide from VL of C320-168 <400> 206 Leu Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 207 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of influenza peptide <400> 207 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 1 5 10 <210> 208 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 208 Leu Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 209 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 209 Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 210 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 210 Leu Leu Ile Pro Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 211 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 211 Leu Leu Ile Lys Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 212 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 212 Leu Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 213 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 213 Leu Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 214 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 214 Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 215 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 215 Leu Leu Ile Pro Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 216 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 216 Leu Leu Ile Lys Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 217 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 217 Leu Leu Ile Tyr Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 218 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 218 Leu Leu Ile Glu Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 219 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 219 Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 220 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 220 Leu Leu Ile Pro Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 221 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutant peptide from VL of C320-168 <400> 221 Leu Leu Ile Lys Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 1 5 10 15 <210> 222 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibody C320-162 <400> 222 caggtgcagc tggtgcagtc tggggccgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca ccgccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgagacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtgacagt gtcctca 357 <210> 223 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibody C320-163 <400> 223 caggtgcagc tggtgcagtc tggggcggag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgcagatc gttccaccag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgatacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 224 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibodies C320-164, C320-165, C320-166 and C320-167 <400> 224 caggtgcagc tggtgcagtc tggggccgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgagacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtgacagt gtcctca 357 <210> 225 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibodies C320-168 and C320-169 <400> 225 caggtgcagc tggtgcagtc tggggccgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgagacgg ccgcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtgacagt gtcctca 357 <210> 226 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibodies C320-170 and C320-172 <400> 226 caggtgcagc tggtgcagtc tggggcggag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgcagatc gttccaccag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgatacgg cctcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 227 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VH of antibodies C320-179 and C320-183 <400> 227 caggtgcagc tggtgcagtc tggggcggag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 cccggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctgaacccta acagtggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accgcagatc gttccaccag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagtg 300 cctgagacgg ccgcctttga gtactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 228 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibodies C320-162, C320-163, C320-167 and C320-169 <400> 228 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcgctg ggagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 229 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibody C320-164 <400> 229 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcgcta gcagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 230 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibodies C320-165, C320-168 and C320-170 <400> 230 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcacta gcagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 231 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibody C320-166 <400> 231 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 232 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibodies C320-172 and C320-179 <400> 232 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcacta gcagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc gaaggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 233 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding VL of antibody C320-183 <400> 233 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcacta gcagtagttc cgacatcggg gcaggtcttg gcgtgcactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc ggaggttact acaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctgaccat cactgggctc 240 ctgcctgagg atgagggtga ttattactgc cagtcctatg acggcactct gagtgcccta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggt 333 <210> 234 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> amino acid sequence of VH of antibody C320-12 and C320-22 <400> 234 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Thr Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Pro Asp Thr Ala Ser Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 235 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus of HCDR3 of C320 and derivatives <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = V or A or S or H or D or L or Y or P or Q or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X = A or S or H or K or E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = A or S or D or Y or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = A or S or H or L or D or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X = A or S or H or L or D or P or Q or E or K <400> 235 Glu Xaa Pro Xaa Xaa Ala Xaa Phe Xaa Tyr 1 5 10

Claims

TNF 유사 리간드 1a(TL1a: TNF-like ligand 1a)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 도메인으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 서열 번호 186의 중쇄 가변 영역(V_H) 및 서열 번호 199의 경쇄 가변 영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은, 32번 위치의 아르기닌이 알라닌으로 치환되어 있는 서열 번호 202에, 상기 항체가 서열 번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 인간 TL1a에 결합하는 수준보다 75% 이상 더 낮은 수준으로 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 마우스 TL1a, 인간 TL1a, 시노몰구스 원숭이 TL1a, 래트 TL1a 및 기니아 피그 TL1a에 결합하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 IgG1 중쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 도메인은 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 도메인 및 적합한 담체를 포함하는, 자가면역질환 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역질환 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 천식의 치료에 사용하기 위한 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 궤양성 대장염, 크론병, 과민성 장 증후군, 류마티스 관절염, 다발성 관절염, 다발성 경화증, 포도막염, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환의 치료에 사용하기 위한 것인 항체 또는 이의 항원 결합 도메인.
제8항에 있어서, 자가면역질환이 천식인 약학 조성물.
제8항에 있어서, 자가면역질환이 궤양성 대장염, 크론병, 과민성 장 증후군, 류마티스 관절염, 다발성 관절염, 다발성 경화증, 포도막염, 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인 약학 조성물.
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