KR101980554B1 - 암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 CAPRIN-1을 표적으로 한 종래의 항체보다 항종양 활성이 우수한 항체를 작출하여 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 암 세포의 표면에 특이적으로 발현하는 암 항원 단백질을 동정하여 그것을 표적으로 한 항체의 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도, 구체적으로는 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

암의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물{CANCER TREATMENT AND/OR PREVENTION DRUG COMPOSITION}
본 발명은 CAPRIN-1에 대한 항체 또는 그 프래그먼트의 암의 치료 및/또는 예방제 등으로서의 신규인 의약용도에 관한 것이다.
암은 전체 사망 원인의 제 1 위를 차지하는 질환이며, 현재 행해지고 있는 치료는 수술 요법을 주체로 방사선 요법과 화학 요법을 조합한 것이다. 최근의 새로운 수술법의 개발이나 새로운 항암제의 발견에도 불구하고, 일부의 암을 제외하고 암의 치료 성적은 그다지 향상되어 있지 않은 것이 현상황이다. 최근, 분자 생물학이나 암 면역학의 진보에 따라 암에 특이적으로 반응하는 항체류, 세포 장해성 T세포에 의해 인식되는 암 항원류, 암 항원을 코딩하는 유전자류 등이 동정되어 있어 암 항원류를 타겟으로 한 특이적 암 치료법으로의 기대가 높아지고 있다(비특허문헌 1).
암 치료법에 있어서는 부작용을 경감하기 위해서 그 항원으로서 인식되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 정상 세포에는 거의 존재하지 않고, 암세포에 특이적으로 존재하고 있는 것이 바람직하다. 1991년, 벨기에 Ludwig 연구소의 Boon들은 자기 암세포주와 암반응성 T세포를 사용한 cDNA 발현 클로닝법에 의해 CD8 양성 T세포가 인식하는 인간 흑색종 항원 MAGE1을 단리했다(비특허문헌 2). 그 후, 암환자의 생체 내에서 자기의 암에 반응해서 산생되는 항체가 인식하는 종양 항원을 유전자의 발현 클로닝의 방법을 받아들여서 동정하는 SEREX(serological identification of antigens by recombinant expression cloning)법이 보고되며(비특허문헌 3 및 특허문헌 1), 이 방법에 의해 정상 세포에는 거의 발현이 없고, 암에 특이적으로 발현하는 몇개의 암 항원이 단리되어 있다(비특허문헌 4~9). 또한, 그 일부를 타겟으로 해서 암 항원에 특이적으로 반응하는 면역 세포를 사용한 세포 요법이나, 암 항원을 포함하는 백신 등의 암 특이적 면역 요법의 임상 시험이 실시되고 있다.
한편, 최근 암세포 상의 항원 단백질을 표적으로 한 암을 치료하기 위한 각종 항체 의약이 세상에 대두되어 왔다. 암 특이적 치료약으로서 일정의 약효가 얻어져 주목받고 있지만, 표적이 되는 항원 단백질의 대부분은 정상 세포에도 발현되는 것이며, 항체 투여의 결과 암세포뿐만 아니라 항원이 발현하는 정상 세포도 장해되어버리고, 그 결과 발생하는 부작용이 문제가 되고 있다. 따라서, 암세포 표면에 특이적으로 발현하는 암 항원을 동정하고, 그것을 표적으로 한 항체를 의약품으로서 사용할 수 있으면 보다 부작용이 적은 항체 의약에 의한 치료가 가능해지는 것으로 기대된다.
Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1(CAPRIN-1)은 휴지기의 정상 세포가 활성화나 세포 분열을 일으킬 때에 발현되고, 또한 세포 내에서 RNA와 세포 내 스트레스 과립을 형성해서 mRNA의 수송, 번역의 제어에 관여하는 세포 내 단백질로서 알려져 있었지만, 암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 것이 발견되어 암 치료를 위한 항체 의약 타겟으로서 연구가 진척되고 있다(특허문헌 2).
미국 특허 제 5698396 호 WO 2010/016526
아키요시 쯔요시, 「암과 화학 요법」, 1997년, 제 24 권, p551-519(암과 화학 요법사, 일본) Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995) Int. J. Cancer, 72:965-971(1997) Cancer Res., 58:1034-1041(1998) Int. J. Cancer, 29:652-658(1998) Int. J. Oncol., 14:703-708(1999) Cancer Res., 56:4766-4772(1996) Hum. Mol. Genet, 6:33-39:1997
본 발명의 목적은 암세포의 표면에 특이적으로 발현하는 CAPRIN-1을 표적으로 한 종래의 항체보다 항종양 활성이 우수한 항체를 작출하여 암의 치료 및/또는 예방제로서의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 이하의 특징을 갖는다.
본 발명에서는 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 제공한다.
다른 실시형태에 있어서 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이 항체이다.
본 발명에서는 상기 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다.
그 실시형태에 있어서, 상기 암은 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종이다.
본 명세서는 본원의 우선권 주장의 기초가 되는 일본국 특허 출원 2011-171379호의 개시 내용을 포함한다.
(발명의 효과)
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체는 암세포를 장해한다. 따라서, CAPRIN-1에 대한 항체는 암의 치료나 예방에 유용하다.
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1의 폴리펩티드에 대한 항체의 항종양 활성은 후술하는 바와 같이 생체 내에서 담암 동물에 대한 종양 증식의 억제를 조사함으로써 또는 생체 외에서 상기 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포에 대하여 면역 세포 또는 보체를 통한 세포 장해 활성을 나타내는지의 여부를 조사함으로써 평가할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체는 CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체이다. 이들 모노클로널 항체는 항종양 활성을 발휘할 수 있는 한 어떠한 종류의 항체이어도 좋고, 예를 들면 인간 이외의 동물 항체(예를 들면, 마우스 모노클로널 항체, 래트 모노클로널 항체, 토끼 모노클로널 항체, 닭 모노클로널 항체 등), 재조합 항체[예를 들면, 합성 항체, 다중 특이성 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체(scFv) 등], 인간 항체, 그들의 항체 프래그먼트[예를 들면, Fab나 F(ab')2, Fv 등]를 포함한다. 이들 항체 및 그 프래그먼트는 당업자에게 공지의 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 또한, 피험자가 인간인 경우에는 거절 반응을 회피 또는 억제하기 위해서 인간 항체 또는 인간화 항체인 것이 바람직하다.
상기 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 클래스, 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 IgY, 또는 임의의 서브급, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등이다.
또한, 상기 항체는 글리코실화 이외에 아세틸화, 포르밀화, 아미드화, 인산화 또는 페그(PEG)화 등에 의해 수식되어 있어도 좋다.
여기에서, 「CAPRIN-1 단백질과 특이적으로 결합한다」란 CAPRIN-1 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 이외의 단백질과 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서의 암의 치료 및/또는 예방의 대상인 피험자는 인간, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등의 포유 동물이며, 바람직한 피험자는 인간이다.
이하에 본 발명에 관한 항원의 제작, 항체의 제작 및 의약 조성물에 대해서 설명한다.
<항체 제작용 항원의 제작>
본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체를 취득하기 위한 감작 항원으로서 사용되는 단백질 또는 그 단편은 인간, 개, 소, 말, 마우스, 래트, 닭 등 그 유래가 되는 동물종에는 제한되지 않는다. 단, 세포 융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 포유 동물 유래의 단백질이 바람직하고, 인간 유래의 단백질이 특히 바람직하다. 예를 들면, CAPRIN-1이 인간 CAPRIN-1인 경우 감작 항원으로서 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드, 인간 CAPRIN-1을 발현하는 세포 등을 사용할 수 있다.
인간 CAPRIN-1 및 그 호몰로그의 염기 서열 및 아미노산 서열은, 예를 들면 GenBank(미국 NCBI)에 액세스하여 BLAST, FASTA 등의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)을 이용함으로써 입수할 수 있다.
본 발명에서는 인간 CAPRIN-1의 염기 서열(서열 번호 1 또는 3) 또는 아미노산 서열(서열 번호 2 또는 4)을 기준으로 했을 경우, 이들의 ORF 또는 성숙 부분의 염기 서열 또는 아미노산 서열과 70%~100%, 바람직하게는 80%~100%, 보다 바람직하게는 90%~100%, 더욱 바람직하게는 95%~100%, 예를 들면 97%~100%, 98%~100%, 99%~100% 또는 99.5%~100%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어지는 핵산 또는 단백질이 타겟이 된다. 여기에서, 「% 서열 동일성」은 2개의 서열을 갭을 도입하거나 또는 갭을 도입하지 않고 최대의 유사도 또는 일치도가 되도록 얼라인먼트(정렬)했을 때 아미노산(또는 염기)의 총 수에 대한 동일 아미노산(또는 염기)의 퍼센티지(%)를 의미한다.
CAPRIN-1 단백질의 단편은 항체가 인식하는 최소 단위인 에피토프(항원 결정 기)의 아미노산 길이로부터 상기 단백질의 전체 길이 미만의 길이를 갖는다. 에피토프는 포유 동물, 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성을 갖는 폴리펩티드 단편을 가리키고, 그 최소 단위는 약 7~12아미노산, 예를 들면 8~11아미노산으로 이루어진다.
상기한 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 포함하는 폴리펩티드는, 예를 들면 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 따라서 합성할 수 있다(일본 생화학회 편, 생화학 실험 강좌 1, 단백질의 화학Ⅳ, 화학 수식과 펩티드 합성, 도쿄 화학 동인(일본), 1981년). 또한, 각종 시판된 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 공지의 유전자 공학적 방법(Sambrook 외, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel 외, Short Protocols in Molecular Biology, 제 3 판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons 등)을 사용해서 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 조제하고, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 결합해서 숙주 세포에 도입하고, 상기 숙주 세포 중에서 폴리펩티드를 생산시킴으로써 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 공학적 방법이나 시판된 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 용이하게 조제할 수 있다. 예를 들면, 인간 CAPRIN-1 유전자의 염기 서열을 포함하는 DNA는 인간 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서 사용하고, 서열 번호 1에 기재한 염기 서열을 증폭할 수 있도록 설계한 한쌍의 프라이머를 사용해서 PCR을 행함으로써 조제할 수 있다. PCR의 반응 조건은 적당히 설정할 수 있고, 예를 들면 내열성 DNA 폴리메라아제(예를 들면, Taq 폴리메라아제, Pfu 폴리메라아제 등) 및 Mg2 + 함유 PCR 버퍼를 사용해서 94℃에서 30초간(변성), 55℃에서 30초~1분간(어닐링), 72℃에서 2분간(신장)으로 이루어지는 반응 행정을 1사이클로 해서, 예를 들면 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건 등을 들 수 있지만 이것에 한정되지 않는다. PCR의 방법, 조건 등에 대해서서는, 예를 들면 Ausubel 외, Short Protocols in Molecular Biology, 제 3 판, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995), John Wiley & Sons(특히, 제 15 장)에 기재되어 있다.
또한, CAPRIN-1 유전자의 염기 서열이나 CAPRIN-1 단백질의 아미노산 서열의 정보에 의거하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것을 사용해서 인간 등의 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 소망의 DNA를 단리할 수 있다. cDNA 라이브러리는 CAPRIN-1 단백질을 발현하고 있는 세포, 기관 또는 조직으로부터 제작하는 것이 바람직하다. 그러한 세포나 조직의 예는 정소, 백혈병, 유방암, 림프종, 뇌종양, 폐암, 췌장암, 대장암 등의 암 또는 종양으로부터 유래되는 세포 또는 조직이다. 상기한 프로브 또는 프라이머의 조제, cDNA 라이브러리의 구축, cDNA 라이브러리의 스크리닝 및 목적 유전자의 클로닝 등의 조작은 당업자에게 기지이며, 예를 들면 Sambrook 외, Molecular Cloning, 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology(1989), Ausbel 외(상기) 등에 기재된 방법에 준해서 행할 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 DNA로부터 인간 CAPRIN-1 단백질이나 그 부분 펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.
상기 숙주 세포로서는 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포이면 어떠한 것이어도 좋고, 원핵 세포의 예로서는 대장균 등, 진핵 세포의 예로서는 원숭이 신장 세포 COS1, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO 등의 포유 동물 세포, 인간 태아 신장 세포주 HEK293, 마우스 태자 피부 세포주 NIH3T3, 출아 효모, 분열 효모 등의 효모 세포, 누에 세포, 아프리카 발톱 개구리 난세포 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
숙주 세포로서 원핵 세포를 사용할 경우 발현 벡터로서는 원핵 세포 중에서 복제 가능한 오리진, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 멀티 클로닝 사이트, 터미네이터, 약제 내성 유전자, 영양 요구성 상보 유전자 등을 갖는 발현 벡터를 사용한다. 대장균용 발현 벡터로서는 pUC계, pBluescriptII, pET 발현 시스템, pGEX 발현 시스템 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 결합하고, 상기 벡터에서 원핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 원핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 이때, 상기 폴리펩티드를 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다.
숙주 세포로서 진핵 세포를 사용할 경우 발현 벡터로서는 프로모터, 스플라이싱 영역, 폴리(A) 부가 부위 등을 갖는 진핵 세포용 발현 벡터를 사용한다. 그러한 발현 벡터로서는 pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV 벡터, pRS, pcDNA3, pYES2 등을 예시할 수 있다. 상기와 마찬가지로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이러한 발현 벡터에 결합하고, 상기 벡터에서 진핵 숙주 세포를 형질 전환한 후 얻어진 형질 전환체를 배양하면 상기 DNA가 코딩하고 있는 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포 중에서 발현시킬 수 있다. 발현 벡터로서 pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 등을 사용했을 경우에는 His 태그[예를 들면, (His)6~(His)10], FLAG 태그, myc 태그, HA 태그, GFP 등의 각종 태그를 부가한 융합 단백질로서 상기 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다.
발현 벡터의 숙주 세포로의 도입은 전기 천공법, 인산 칼슘법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 마이크로 인젝션, 바이러스 감염, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드와의 결합 등의 주지의 방법을 사용할 수 있다.
숙주 세포로부터 목적의 폴리펩티드를 단리 정제하기 위해서는 공지의 분리 조작을 조합해서 행할 수 있다. 예를 들면, 요소 등의 변성제나 계면활성제에 의한 처리, 초음파 처리, 효소 소화, 염석이나 용매 분별 침전법, 투석, 원심분리, 한외 여과, 겔 여과, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
<항체의 구조>
항체는 통상 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 헤테로 다량체 당단백질이다. IgM 이외의 면역 글로불린은 2개의 동일한 경(L)쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150kDa의 헤테로 4량체 당단백질이다. 전형적으로는 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있지만, 여러 가지 면역 글로불린 아이소타입의 중쇄간의 디술피드 결합의 수는 변동한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 쇄내 디술피드 결합도 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 단에 가변 도메인(VH 영역)을 갖고, 거기에 몇개의 정상 영역이 계속된다. 각각 경쇄는 가변 도메인(VL 영역)을 갖고, 그 반대의 단에 1개의 정상 영역을 갖는다. 경쇄의 정상 영역은 중쇄의 최초의 정상 영역과 정렬하고 있고, 또한 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬하고 있다. 항체의 가변 도메인은 특정 영역이 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 특정 가변성을 나타내어서 항체에 결합 특이성을 부여한다. 가변 영역이 상대적으로 보존되어 있는 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리고 있다. 완전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 3개의 CDR은 중쇄에서는 그 N말단부터 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3, 마찬가지로 경쇄에서는 CDRL1, CDRL2, CDRL3이라고 부르고 있다. 항체의 항원으로의 결합 특이성에는 CDRH3이 가장 중요하다. 또한, 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 근접한 상태로 함께 유지되고, 다른쪽의 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 정상 영역은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접 기여하지 않지만, 여러 가지 에펙터 기능, 예를 들면 항체 의존성 세포 장해 활성(ADCC)으로의 관여, Fcγ 수용체로의 결합을 통한 식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/클리어런스 속도, 보체 캐스케이드의 C1q 구성 요소를 통한 보체 의존성 세포 장해(CDC)를 나타낸다.
<항체의 제작>
본 발명에 있어서의 항CAPRIN-1 항체란 CAPRIN-1 단백질의 전체 길이 또는 그 단편과 면역학적 반응성을 갖는 항체를 의미한다.
여기에서, 「면역학적 반응성」이란 생체 내에서 항체와 CAPRIN-1 항원이 결합하는 특성을 의미하고, 이러한 결합을 통해 종양을 장해(예를 들면, 사멸, 억제 또는 퇴축)하는 기능이 발휘된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 항체는 CAPRIN-1 단백질과 결합해서 종양, 예를 들면 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종 등을 장해할 수 있으면 그 종류를 상관하지 않는다.
이하에 여러 가지 모노클로널 항체의 제작예를 나타낸다.
예를 들면, CAPRIN-1을 발현하는 유방암 세포주 SK-BR-3 등을 마우스에 투여해서 면역하고, 같은 마우스로부터 비장을 추출하여 세포를 분리한 후 상기 세포와 마우스 미에로마 세포를 융합시키고, 얻어진 융합 세포(하이브리도마) 중으로부터 암세포 증식 억제 작용을 갖는 항체를 산생하는 클론을 선택한다. 암세포 증식 억제 작용을 갖는 모노클로널 항체 산생 하이브리도마를 단리하여 상기 하이브리도마를 배양하고, 배양 상청액으로부터 일반적인 어피니티 정제법에 의해 항체를 정제함으로써 조제하는 것이 가능하다.
모노클로널 항체를 산생하는 하이브리도마는, 예를 들면 이하와 같이 해도 제작할 수 있다. 우선, 공지의 방법에 따라 감작 항원을 동물에게 면역한다. 일반적 방법으로서 감작 항원을 포유 동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는 감작 항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것에 소망에 의해 통상의 아쥬반트, 예를 들면 프로인트 완전 아쥬반트를 적량 혼합하여 유화한 후, 포유 동물에게 4~21일마다 수회 투여한다. 또한, 감작 항원 면역 시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.
이와 같이 포유 동물을 면역하고, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에 포유 동물로부터 면역 세포를 채취하여 세포 융합에 제공하지만 바람직한 면역 세포로서는 특히 지라 세포를 들 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서 포유 동물의 미에로마 세포를 사용한다. 이 미에로마 세포는 공지의 여러 가지 세포주, 예를 들면 P3U1(P3-X63Ag8U1), P3(P3x63Ag8.653)(J. I㎜unol.(1979)123:1548-1550), P3x63Ag 8U.1(Current Topics in Microbiology and I㎜unology(1978)81:1-7), NS-1(Kohler.G. and Milstein, C., Eur. J. I㎜unol.(1976)6:511-519), MPC-11(Margulies.D.H. et al., Cell(1976)8:405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276:269-270), FO(deSt.G roth, S.F. et al., J. I㎜unol. Methods(1980)35:1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148:313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277:131-133) 등이 적합하게 사용된다.
상기 면역 세포와 미에로마 세포의 세포 융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 쾰러와 밀스테인들의 방법(Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981)73:3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.
보다 구체적으로는 상기 세포 융합은, 예를 들면 세포 융합 촉진제의 존재 하에 통상의 영양 배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 의해 융합 효율을 높이기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용할 수도 있다.
면역 세포와 미에로마 세포의 사용 비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미에로마 세포에 대하여 면역 세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 미에로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외에 이 종류의 세포 배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하며, 또한 소태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용할 수도 있다.
세포 융합은 상기 면역 세포와 미에로마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 보다 쉽게 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균 분자량 1000~6000 정도)을 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하여 혼합함으로써 목적으로 하는 하이브리도마를 형성한다. 이어서, 적당한 배양액을 차차 첨가하고, 원심해서 상청액을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포 융합제 등을 제거한다.
이렇게 해서 얻어진 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하는데에 충분한 시간(통상, 수일~수주일) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.
또한, 인간 이외의 동물에게 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 이외에 인간 림프구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염된 인간 림프구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현 세포 또는 그 용해물로 감작하고, 감작 림프구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 미에로마 세포, 예를 들면 U266(등록 번호 TIB196)과 융합시켜 소망의 활성(예를 들면, 세포 증식 억제 활성)을 갖는 인간 항체를 산생하는 하이브리도마를 얻는 것도 가능하다.
이렇게 해서 제작되는 모노클로널 항체를 산생하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대 배양하는 것이 가능하며, 또한 액체 질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.
즉, 소망의 항원이나 소망의 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하여 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로널한 항체 산생 세포(하이브리도마)를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.
여기에서, 인간 항체 산생 마우스로서는, 예를 들면 KM 마우스(기린 파마/Medarex) 및 Xeno 마우스(A㎎en)가 알려져 있다(예를 들면, 국제 공개 제WO 02/43478호, 동 제WO 02/092812호 등). 이러한 마우스를 CAPRIN-1 단백질 또는 그 단편으로 면역할 때에는 완전 인간 폴리클로날 항체를 혈액으로부터 얻을 수 있다. 또한, 면역 후의 마우스로부터 비장 세포를 꺼내 미에로마 세포와 융합법에 의해 인간형 모노클로널 항체를 제작할 수 있다.
항원의 조제는, 예를 들면 동물 세포를 사용한 방법(일본 특허 공표 2007-530068)이나 바큐로바이러스를 사용한 방법(예를 들면, 국제 공개 제WO 98/46777호 등) 등에 준해서 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮을 경우에는 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대 분자와 결합시켜서 면역을 행하면 좋다.
또한, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 결합해서 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용해서 산생시킨 유전자 재조합 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A.K., Borrebaeck, James, W.Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조). 구체적으로는 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사 효소를 사용해서 항체의 가변 영역(V 영역)의 cDNA를 합성한다. 목적으로 하는 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA가 얻어지면 이것을 소망의 항체 정상 영역(C 영역)을 코딩하는 DNA와 연결한 후, 발현 벡터에 결합한다. 또는 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 포함하는 발현 벡터에 결합해도 좋다. 발현 제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어 하에서 발현하도록 발현 벡터에 결합한다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 항체를 발현시킬 수 있다.
상술과 같이 본 발명의 항CAPRIN-1 항체는 인간 이외의 동물의 모노클로널 항체, 인간 모노클로널 항체, 재조합 항체 등의 여러 가지 모노클로널 항체인 것을 특징으로 한다.
인간 이외의 동물의 모노클로널 항체나 인간 모노클로널 항체는 CAPRIN-1 단백질을 면역한 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 인간 항체 산생 마우스, 닭, 토끼 등)로부터의 지라 세포와 미에로마 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마를 배양함으로써 제작될 수 있다.
재조합 항체는 상술과 같이 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 다중 특이성 항체 등을 포함한다.
키메라 항체는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼나 닭 등) 유래의 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결함으로써 얻어지는 융합 유전자를 발현 벡터에 결합해서 이것을 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변 영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상 영역으로 이루어지는 항체 등이다. 키메라 항체의 제작은 공지의 방법을 사용해서 행할 수 있고, 예를 들면 항체 V 영역을 코딩하는 DNA와 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA를 연결하고, 이것을 발현 벡터에 결합해서 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다. 후술하는 실시예에서는 인간-마우스 키메라 항체가 제작되어 항종양 효과가 확인되었다. 본 모노클로널 항체는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역과, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, 여기에서 상기 VH 영역에 서열 번호 5의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 7의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함되고, 상기 VL 영역에 서열 번호 9의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR2 및 서열 번호 11의 아미노산 서열로 나타내어지는 CDR3이 포함된다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해지는 개변 항체이다. 인간화 항체는 면역 동물 유래의 항체의 CDR을 인간 항체의 상보성 결정 영역으로 이식함으로써 구축된다. 즉, 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 중의 CDR 코딩 서열을 그들에 대응하는 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼나 닭 등) 유래의 항체의 CDR 코딩 서열로 치환한 DNA를 제작하고, 그것에 의해서 얻어진 DNA를 각각 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결해서 얻어지는 융합 유전자를 발현 벡터에 결합해서 이것을 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 항체나 닭 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region； FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 결합하고, 이것을 숙주에 도입하여 산생시킴으로써 얻어진다(유럽 특허 출원 공개 제 EP239400호, 국제 공개 제WO 96/02576호 참조). CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research, 1993, 53:851-856). 또한, 여러 가지 인간 항체 유래의 프레임워크 영역에 치환해도 좋다(국제 공개 제WO 99/51743호 참조).
CDR을 통해 연결되는 인간 항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정 영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정 영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변 영역에 있어서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato K. et al., Cancer Research, 1993, 53:851-856).
단쇄 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 링커를 통해 직선상으로 연결된 항체이다. 단쇄 항체를 코딩하는 DNA는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 링커를 코딩하는 DNA 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 결합함으로써 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼나 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다. 또한, 링커는 12~19 아미노산으로 이루어지고, 예를 들면 15 아미노산의 (G4S)3(G.-B. Kim 외, Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432)을 들 수 있다.
다중 특이성 항체는 복수의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능한 항체이다. 예를 들면, 2중 특이성 항체(diabody)의 경우에는 2개의 다른 에피토프와 특이적으로 결합 가능하다. 2중 특이성 항체를 코딩하는 DNA는, 예를 들면 중쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA, 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA, 및 경쇄 가변 영역 A를 코딩하는 DNA를 이 순서로 결합함(단, 경쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA와 중쇄 가변 영역 B를 코딩하는 DNA는 상기와 같은 링커를 코딩하는 DNA를 통해 결합된다)으로써 제작할 수 있다. 여기에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 모두 인간 항체 유래의 것이거나 또는 CDR만 인간 이외의 동물(예를 들면, 마우스, 래트, 토끼나 닭 등) 유래의 항체의 CDR에 의해 치환된 인간 항체 유래의 것이다.
키메라 항체나 인간화 항체를 제작한 후에 가변 영역(예를 들면, FR)이나 정상 영역 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 등 해도 좋다.
아미노산의 치환은, 예를 들면 15 미만, 10 미만, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하의 아미노산, 바람직하게는 1~5 아미노산, 보다 바람직하게는 1 또는 2 아미노산의 치환이며, 치환 항체는 미치환 항체와 기능적으로 동등해야 한다. 치환은 보존적 아미노산 치환이 바람직하고, 이것은 전하, 측쇄, 극성, 방향족성 등의 성질이 유사한 아미노산간의 치환이다. 성질이 유사한 아미노산은, 예를 들면 염기성 아미노산(아르기닌, 리진, 히스티딘), 산성 아미노산(아스파르트산, 글루탐산), 무전하극성 아미노산(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신), 무극성 아미노산(류신, 이소류신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌), 분기쇄 아미노산(류신, 발린, 이소류신), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘) 등으로 분류할 수 있다.
항체 수식물로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체 수식물에 있어서는 결합되는 물질은 한정되지 않는다. 이러한 항체 수식물을 얻기 위해서는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
여기에서, 「기능적으로 동등」이란 대상이 되는 항체가 본 발명의 항체와 같은 생물학적 또는 생화학적 활성, 구체적으로는 종양을 장해하는 기능을 갖는 것, 인간으로의 적용 시에 거절 반응을 본질적으로 일으키지 않는 것 등을 가리킨다. 이러한 활성으로서는, 예를 들면 세포 증식 억제 활성 또는 결합 활성을 예시할 수 있다.
어떤 폴리펩티드와 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 조제하기 위한 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자이면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al., (1995)Gene, 152:271-275, Zoller, MJ., and Smith, M. (1983) Methods Enzymol., 100:468-500, Kramer, W. et al., (1984) Nucleic Acids Res., 12:9441-9456, Kramer, W. and Fritz, HJ., (1987) Methods Enzymol., 154:350-367, Kunkel, TA., (1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 82:488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol.,85:2763-2766) 등을 사용하고, 본 발명의 항체에 적당히 변이를 도입함으로써, 상기 항체로 기능적으로 동등한 항체를 조제할 수 있다.
상기 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 인식하는 항체는 당업자에게 공지의 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항CAPRIN-1 항체가 인식하는 CAPRIN-1 단백질의 에피토프를 통상의 방법(예를 들면, 에피토프 매핑 등)에 의해 결정하고, 상기 에피토프에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 면역원으로 해서 항체를 제작하는 방법이나, 통상의 방법에 의해 제작된 항체의 에피토프를 결정하고, 항CAPRIN-1 항체와 에피토프가 같은 항체를 선택하는 방법 등에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 항체의 친화 정수 Ka(kon/koff)는 바람직하게는 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5×108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5×109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5×1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5×1011M-1, 적어도 1012M-1 또는 적어도 1013M-1이다.
본 발명의 항체는 항종양제와 콘주게이트할 수 있다. 항체와 항종양제의 결합은 아미노기, 카르복실기, 히드록시기, 티올기 등과 반응성의 기(예를 들면, 숙신산 이미딜기, 포르밀기, 2-피리딜디티오기, 말레이이미딜기, 알콕시카르보닐기, 히드록시기 등)를 갖는 스페이서를 통해 행할 수 있다.
항종양제의 예는 문헌 등에서 공지의 하기의 항종양제, 즉 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉사트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로설판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 카르보퀀, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸롤멜라민(trimethylolomelamine), 뷸라타신, 뷸라타시논, 캠토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토파이신1, 크립토파이신8, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아미신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노피린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(Adryamycin)(adriamycin), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 퀘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스탄틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에녹시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine); 안드로겐류, 예를 들면 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프로린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트라세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 디메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미토산트론, 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나멧(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아진산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine)A, 안귀딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 독세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴, 옥사리플라틴, 카르보플라틴, 빈브라스틴, 에토포시드, 이포스파미드, 마이톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트레세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소메라제 억제제, 디플루오로메틸롤니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체와, 항종양제를 병용 투여함으로서 보다 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 본 방법은 CAPRIN-1이 발현되어 있는 암환자에 대하여 외과적 수술 전후 어디에 있어서도 적응할 수 있다. 특히, 수술 후에 종래 항종양제 단독으로 처치되고 있었던 CAPRIN-1이 발현되어 있는 암에 대하여 보다 높은 암 재발 방지나 생존 기간의 연장이 얻어진다.
본 발명의 항체와의 병용 투여에 사용되는 항종양제의 예는 문헌 등에서 공지의 하기 항종양제, 즉 파클리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 시클로포스파미드, 메토트렉사트, 5-플루오로우라실, 티오테파, 부설판, 임프로술판, 피포설판, 벤조도파(benzodopa), 카르보퀀, 메투레도파(meturedopa), 우레도파(uredopa), 알트레타민(altretamine), 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌티오포스포아미드(triethilenethiophosphoramide), 트리메틸롤멜라민(trimethylolomelamine), 뷸라타신, 뷸라타시논, 캠토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴(callystatin), 크립토파이신1, 크립토파이신8, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로나파진(chloRNAphazine), 콜로포스파미드(cholophosphamide), 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥시드히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨(novembichin), 페네스테린(phenesterine), 프레드니무스틴(prednimustine), 트로포스파미드(trofosfamide), 우라실머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신(chlorozotocin), 포테무스틴(fotemustine), 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아미신(calicheamicin), 다이네마이신, 클로드로네이트, 에스페라마이신, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오스라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신(bleomycin), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신, 카르지노피린(carzinophilin), 크로모마이신(chromomycin), 닥티노마이신, 데토르비신(detorbicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(adriamycin), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신(marcellomycin), 마이토마이신 C, 마이코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신, 포트피로마이신(potfiromycin), 퓨로마이신, 퀘라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘(tubercidin), 우베니멕스, 지노스탄틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin), 데노프테린(denopterin), 프테로프테린(pteropterin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 플루다라빈(fludarabine), 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘(azacitidine), 6-아자우리딘(azauridine), 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에녹시타빈(enocitabine), 플록스우리딘(floxuridine), 칼루스테론(calusterone), 프로피온산 드로모스타놀론, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스토락톤(testolactone), 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프로린산(frolinic acid), 아세글라톤, 알도포스파미드글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트라세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 디메콜신(demecolcine), 디아지콘(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 아세트산 엘립티늄(elliptinium), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 렌티난, 로니다민(lonidamine), 메이탄신(maytansine), 안사미토신(ansamitocine), 미토구아존(mitoguazone), 미토산트론, 모피단몰(mopida㎚ol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴, 페나멧(phenamet), 피라루비신, 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드, 프로카바진, 라족산(razoxane), 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄(spirogermanium), 테누아진산(tenuazonic acid), 트리아지콘(triaziquone), 로리딘(roridine)A, 안귀딘(anguidine), 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴(mannomustine), 미토브로니톨, 미토락톨(mitolactol), 피포브로만(pipobroman), 가시토신(gacytosine), 독세탁셀, 클로람부실, 젬시타빈(gemcitabine), 6-티오구아닌, 메르캅토푸린, 시스플라틴(dysprosium), 옥사리플라틴, 카르보플라틴, 빈브라스틴, 에토포시드, 이포스파미드, 마이톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론(novantrone), 테니포시드, 에다트레세이트(edatrexate), 다우노마이신, 아미노프테린(aminopterin), 젤로다(xeloda), 이반드로네이트(ibandronate), 이리노테칸, 토포이소메라제 억제제, 디플루오로메틸롤니틴(DMFO), 레티노산, 카페시타빈(capecitabine) 및 그들의 약학적으로 허용 가능한 (공지의)염 또는 (공지의)유도체를 포함한다. 상기 중, 특히 시클로포스파미드, 파클리탁셀, 독세탁셀, 비노렐빈이 바람직하게 사용된다.
또는, 본 발명의 항체에는 문헌 등에서 공지의 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 175Lu, 176Lu 등의 방사성 동위체를 결합하는 것도 가능하다. 방사성 동위체는 종양의 치료나 진단을 위해서 유효한 것이 바람직하다.
본 발명의 항체는 CAPRIN-1과 면역학적 반응성을 갖는 항체, CAPRIN-1을 특이적으로 인식하는 항체 또는 CAPRIN-1과 특이적으로 결합하는 항체로서, 암에 대한 세포 장해 활성 또는 종양 증식 억제 작용을 나타내는 항체이다. 상기 항체는 그것을 투여하는 대상 동물에 있어서 거절 반응이 거의 또는 전혀 회피되는 구조를 갖는 항체이어야 한다. 그러한 항체로서는, 예를 들면 대상 동물이 인간일 경우 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체(예를 들면, 인간-마우스 키메라 항체), 단쇄 항체, 2중 특이성 항체 등을 들 수 있다. 이들 항체는 (1) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 항체 유래의 것이거나 (2) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 이외의 동물 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 것이거나 또는 (3) 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 인간 이외의 동물 항체 유래의 것이고, 또한 중쇄 및 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 것인 재조합 항체이다. 바람직한 항체는 (1) 또는 (2)의 항체이다.
이들 재조합 항체는 다음과 같이 해서 제작할 수 있다. 하이브리도마 등의 항체 산생 세포로부터 인간 CAPRIN-1에 대한 모노클로널 항체(예를 들면, 인간 모노클로널 항체, 마우스 모노클로널 항체, 래트 모노클로널 항체, 토끼 모노클로널 항체, 닭 모노클로널 항체 등)를 코딩하는 DNA를 클로닝하고, 이것을 주형으로 해서 상기 항체의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 RT-PCR법 등에 의해 제작하고, Kabat EU numbering system(Kabat 외, Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, 5thEd. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991))에 의거해서 경쇄 및 중쇄의 각 가변 영역의 서열 또는 각 CDR1, CDR2, CDR3의 서열을 결정한다.
또한, 이들 각 가변 영역을 코딩하는 DNA 또는 각 CDR을 코딩하는 DNA를 유전자 재조합 기술[Sambrook 외, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)] 또는 DNA 합성기를 사용해서 제작한다. 여기에서, 상기 인간 모노클로널 항체 산생 하이브리도마는 인간 항체 산생 동물(예를 들면, 마우스)에 인간 CAPRIN-1을 면역한 후 상기 면역 동물로부터 절제한 지라 세포와 미에로마 세포를 융합시킴으로써 제작할 수 있다. 이와는 별도로 필요에 따라 유전자 재조합 기술 또는 DNA 합성기를 사용해서 인간 항체 유래의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역 및 정상 영역을 코딩하는 DNA를 제작한다.
제작된 재조합 DNA를 1개 또는 복수개의 적당한 벡터에 결합하고, 이것을 숙주 세포(예를 들면, 포유 동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등)에 도입하여 (공)발현시킴으로써 재조합 항체를 제작할 수 있다(P. J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J. W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS).
상기 방법에 의해 제작되는 본 발명의 항체는, 예를 들면 후술하는 실시예에서 취득된 이하의 (a)의 항체를 들 수 있다.
(a) 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(예를 들면, 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역으로 구성되는 항체).
여기에서, 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열은 마우스 항체 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이며, 또한 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열은 각각 마우스 항체 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이다.
또한, 본 발명의 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체는, 예를 들면 이하의 (ⅰ) (ⅱ) 또는 (ⅲ)의 항체이다.
(ⅰ) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
(ⅱ) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 및 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열 및 인간 항체 유래의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.
(ⅲ) 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 중쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래의 아미노산 서열을 포함하고, 및 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 경쇄의 정상 영역이 인간 항체 유래로부터 나타내는 아미노산 서열을 포함해서 이루어지는 항체.
또한, 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 정상 영역 및 가변 영역의 서열은, 예를 들면 NCBI(미국: GenBank, UniGene 등)로부터 입수 가능하며, 예를 들면 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 J00228, 인간 IgG2 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 J00230, 인간 IgG3 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 X03604, 인간 IgG4 중쇄 정상 영역에 대해서는 등록 번호 K01316, 인간 경쇄 κ 정상 영역에 대해서는 등록 번호 V00557, X64135, X64133 등, 인간 경쇄 λ 정상 영역에 대해서는 등록 번호 X64132, X64134 등의 서열을 참조할 수 있다.
상기 항체는 바람직하게는 세포 장해 활성을 갖고 있고, 이것에 의해 항종양 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 상기 항체에 있어서의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이나 CDR의 특정 서열은 단지 예시를 목적으로 한 것이며, 특정 서열에 한정되지 않는 것은 명백하다. 인간 CAPRIN-1에 대한 별도의 인간 항체 또는 인간 이외의 동물 항체(예를 들면, 마우스 항체)를 산생할 수 있는 하이브리도마를 제작하고, 하이브리도마가 산생하는 모노클로널 항체를 회수하여 인간 CAPRIN-1과의 면역학적 결합성 및 세포 장해 활성을 지표로 해서 목적의 항체인지의 여부를 판정한다. 그것에 의해 목적의 모노클로널 항체 산생 하이브리도마를 식별한 후, 상기한 바와 같이 상기 하이브리도마로부터 목적의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 제작하여 서열 결정하고, 상기 DNA를 별도의 항체의 제작을 위해서 이용한다.
또한, 상기 항체는 CAPRIN-1을 특이적으로 인식한다는 특이성을 갖는 한, 상기 (a)의 각 항체의 특히 프레임워크 영역의 서열 및/또는 정상 영역의 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실(缺失) 또는 부가가 있어도 좋다. 여기서 수개란 바람직하게는 2~5개, 보다 바람직하게는 2개 또는 3개를 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 항체를 코딩하는 DNA, 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 DNA, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA도 제공한다. 그러한 DNA는, 예를 들면 항체(a)의 경우 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 등을 포함한다.
이들 서열의 DNA에 의해 코딩되는 상보성 결정 영역(CDR)은 항체의 특이성을 결정하는 영역이기 때문에 항체의 그 이외의 영역(즉, 정상 영역 및 프레임워크 영역)을 코딩하는 서열은 다른 항체 유래의 서열이어도 좋다. 여기에서, 다른 항체란 인간 이외의 생물 유래의 항체도 포함하지만, 부작용 저감의 관점으로부터는 인간 유래의 것이 바람직하다. 즉, 상기 DNA에서는 중쇄 및 경쇄의 각 프레임워크 영역 및 각 정상 영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA의 다른 예는, 예를 들면 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA 등이다. 여기에서, 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 13에 나타내는 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 예는 서열 번호 14에 나타내는 염기 서열이다. 이들 DNA에서도 중쇄 및 경쇄의 각 정상 영역을 코딩하는 영역이 인간 항체 유래의 대응 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
이들 항체의 DNA는, 예를 들면 상기 방법 또는 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 우선, 본 발명의 항체에 관계되는 하이브리도마로부터 시판된 RNA 추출 키트를 사용해서 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 사용해서 역전사 효소에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서, 기지의 마우스 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자의 각 가변 영역에 있어서 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코딩하는 서열에 대해서는 기지의 서열을 PCR법에 의해 증폭함으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기 서열은 서열 결정용 플러스미드 또는 파지에 결합하는 등 해서 상법에 따라 결정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체에 의한 CAPRIN-1 발현 암세포에 대한 항종양 효과는 CAPRIN-1 발현 세포의 이펙터 세포 항체 의존적 세포 장해성(ADCC) 및 CAPRIN-1 발현 세포의 보체 의존적 세포 장해성(CDC)에 의해 일어나는 것으로 생각된다.
또한, 상기 기서에 의한 항종양 효과는 암세포의 세포 표면에 발현되는 항체가 결합하는 표적 분자의 수에 상관되는 것이 알려져 있다(Niwa R., Clinical Cancer Research 2005 Mar 15;11(6):2327-2336). 암세포의 세포 표면에 발현되는 표적 분자의 수는 세포 표면의 분자수를 측정할 수 있는 기존의 측정 키트를 사용해서 조사하는 것이 가능하다. 즉, 항체가 결합하는 표적 분자의 수는 표적 분자에 대한 항체 등을 1차 항체로서 암세포에 반응시키고, 미리 분자수가 알려진 검량선 비즈와 함께 형광 표식된 항1차 항체를 반응시켜 샘플의 평균 형광 강도를 측정하고, 검량선을 얻어서 표적 분자의 수를 알 수 있다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체의 활성 평가는 이하 실시예에 구체적으로 나타내어지는 바와 같이 생체 외에서 CAPRIN-1을 발현하는 암세포에 대하여 상기 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 측정하는 것 또는 본 발명에 있는 항CAPRIN-1 항체를 1차 항체로서 사용했을 경우의 암세포의 세포 표면에 발현되는 CAPRIN-1 분자의 수를 조사함으로써 평가할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항CAPRIN-1 항체는 암세포 상의 CAPRIN-1 단백질과 결합하여 상기 활성에 의해 항종양 작용을 나타내는 점에서 암의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 생각된다. 즉, 본 발명은 항CAPRIN-1 항체를 유효 성분으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물을 제공한다. 항CAPRIN-1 항체를 인체에 투여할 목적(항체 치료)으로 사용할 경우에는 면역원성을 저하시키기 때문에 인간 항체나 인간화 항체로 하는 것이 바람직하다.
또한, 항CAPRIN-1 항체와 암세포 표면 상의 CAPRIN-1 단백질의 결합 친화성이 높을수록 항CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 따라서, CAPRIN-1 단백질과 높은 결합 친화성을 갖는 항CAPRIN-1 항체를 획득할 수 있으면 보다 강한 항종양 효과를 기대할 수 있고, 암의 치료 및/또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서 적응하는 것이 가능해진다. 높은 결합 친화성으로서 상술한 바와 같이 결합 정수(친화 정수) Ka(kon/koff)가 바람직하게는 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 5×108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 5×109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 5×1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 5×1011M-1, 적어도 1012M-1 또는 적어도 1013M-1인 것이 바람직하다.
또한, 항CAPRIN-1 항체와 결합하는 암세포 표면 상의 CAPRIN-1 분자의 수가 많을수록 항CAPRIN-1 항체에 의한 보다 강한 항종양 활성이 얻어진다. 항종양 효과를 기대하기 위해서는 CAPRIN-1 분자의 수는 본 발명에 있는 항CAPRIN-1 항체를 측정에 사용했을 경우에 상기 항체가 결합하는 암세포 1개당 CAPRIN-1 분자의 수가 104개 이상, 바람직하게는 105개 이상이 바람직하다.
<항원 발현 세포로의 결합>
항체가 CAPRIN-1에 결합하는 능력은 실시예에서 설명되는, 예를 들면 ELISA, 웨스턴 블로트법, 면역 형광 및 플로우 사이토메트리 분석 등을 사용한 결합 측정법를 이용해서 특정할 수 있다.
<면역 조직 화학 염색>
CAPRIN-1을 인식하는 항체는 당업자에게 주지인 방법에 의한 면역 조직 화학에 의해 외과 수술 사이에 환자로부터 얻은 조직이나, 자연히 또는 트랜스펙션 후에 CAPRIN-1을 발현하는 세포계를 접종한 이종 이식 조직을 담지하는 동물로부터 얻은 조직으로부터 파라포름알데히드 또는 아세톤 고정한 동결 절편 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 포매한 조직 절편을 사용해서 CAPRIN-1과의 반응성에 관해서 시험할 수 있다.
면역 조직 화학 염색을 위해서 CAPRIN-1에 대하여 반응성이 있는 항체를 여러 가지 방법으로 염색시킬 수 있다. 예를 들면, 호스래시디 페록시다아제 복합 염소 항 마우스 항체, 염소 항 토끼 항체나 염소 항 닭 항체를 반응시킴으로써 가시화할 수 있다.
<의약 조성물>
본 발명의 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물의 표적은 CAPRIN-1 유전자를 발현하는 암(세포)이면 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 「종양」 및 「암」이라는 용어는 악성 신생물을 의미하고, 호환적으로 사용된다.
본 발명에 있어서 대상이 되는 암으로서는 CAPRIN-1 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하고 있는 암이며, 바람직하게는 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종이다.
이들 특정 암에는, 예를 들면 유선암, 복합형 유선암, 유선 악성 혼합 종양, 유관내 유두상선암, 폐선암, 편평상피암, 소세포암, 대세포암, 신경상피 조직성 종양인 신경아교종, 뇌실상의종, 신경세포성 종양, 태아형의 신경외 배엽성 종양, 신경초종, 신경섬유종, 수막종, 만성형 림프구성 백혈병, 림프종, 소화관형 림프종, 소화기형 림프종, 소~중 세포형 림프종, 맹장암, 상행 결장암, 하행 결장암, 횡행 결장암, S상 결장암, 직장암, 난소상피암, 배세포종양, 간질세포종양, 췌장관암, 침윤성 췌장관암, 췌장암의 선암, 선방세포암, 선편평상피암, 거세포종, 췌장관내 유두점액성 종양, 점액성 낭포선암, 췌장모세포종, 장액성 낭포선암, 고체 유두상암, 가스트린종, 글루카콘종, 인슐린종, 다발성 내분비선종증1(Wermer 증후군), 비기능성 도세포종, 소마토스타틴종, VIP 산생 종양이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
또한, 대상이 되는 바람직한 피험자는 포유 동물이며, 예를 들면 영장류, 애완 동물, 가축류, 경기용 동물 등을 포함하는 포유 동물이며, 특히 인간, 개 및 고양이가 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 항체를 의약 조성물로서 사용할 경우에는 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비이클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합해서 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비이클을 사용해서 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조 약을 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리솔베이트 80(TM), HCO-60과 병용해도 좋다.
유성액으로서는 참깨유, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
투여는 경구 또는 비경구이며, 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 적당히 투여 방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해서 체중 1㎏당 0.0001㎎~1000㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면 환자당 0.001~100000㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있지만 이들의 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자이면 적당히 선택하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트를 포함하는 상기 의약 조성물을 피험자에게 투여함으로써 암, 바람직하게는 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종를 치료 및/또는 예방할 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물을 위에서 예시한 항종양제 또는 항종양제를 포함하는 의약 조성물과 조합해서 피험자에게 병용 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제는 동시에, 또는 따로따로 피험자에게 투여될 수 있다. 따로따로 투여할 경우에는 어느 의약 조성물이 앞이어도 또는 뒤이어도 좋고, 그들의 투여 간격, 투여량, 투여 경로 및 투여 횟수는 전문의에 의해 적당히 선택될 수 있다. 동시에 투여하는 다른 의약제형에는, 예를 들면 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체(또는 매체) 중에서 혼합하여 제제화해서 얻어지는 의약 조성물도 포함되는 것으로 한다. 또한, 항종양제를 함유하는 상기 의약 조성물 및 제형의 어느 것에 대해서나 본 발명의 항체를 함유하는 의약 조성물 및 제형에 관한 처방, 제제화, 투여 경로, 용량, 암 등의 설명을 적용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 의약 조성물과, 상기에서 예시한 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품도 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 프래그먼트와 항종양제를 약리학상 허용되는 담체와 함께 포함하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물도 제공한다.
<폴리펩티드 및 DNA>
본 발명은 상기 항체 (a)에 관계되는 이하의 폴리펩티드 및 DNA도 더 제공한다.
(ⅰ) 서열 번호 8 및 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 예를 들면 서열 번호 13 및 서열 번호 14에 나타내는 염기 서열을 포함하는 DNA.
(ⅱ) 서열 번호 5, 6 및 7에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 CDR 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
(ⅲ) 서열 번호 9, 10 및 11에 나타내는 아미노산 서열로부터 선택되는 경쇄 CDR 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
이들 폴리펩티드 및 DNA는 상기한 바와 같이 유전자 재조합 기술을 사용해서 제작할 수 있다.
<본 발명의 요약>
위에서 설명한 본 발명을 이하에 요약한다.
(1) 서열 번호 5, 6 및 7의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트.
(2) (1)에 있어서, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 2중 특이성 항체인 항체 또는 그 프래그먼트.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 항종양제와 콘주게이트한 항체 또는 그 프래그먼트.
(4) 서열 번호 5, 6 및 7의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
(5) (4)에 있어서, 상기 암이 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종인 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
(6) (4) 또는 (5) 중 어느 하나에 기재된 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물과, 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함해서 이루어지는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.
(7) (1) 또는 (2)에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 코딩하는 DNA.
(8) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트, (4) 또는 (5)에 기재된 의약 조성물, 또는 (6)에 기재된 조합 의약품을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 및/또는 예방 방법.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들의 구체예에 의해 제한되지 않는 것으로 한다.
<실시예 1 각 조직에서의 CAPRIN-1 유전자의 발현 해석>
CAPRIN-1 유전자의 개 및 인간의 정상 조직 및 각종 세포주에 있어서의 발현을 WO 2010/016526의 실시예 1(4)에 따라서 RT-PCR법에 의해 조사했다. 그 결과, 건상한 개 조직에서는 정소에 강한 발현이 보이고, 한편 개 유방암 및 선암조직에서 발현이 보였다. 또한, 인간 조직에서의 발현을 함께 확인한 결과, 개 CAPRIN-1 유전자와 마찬가지로 정상 조직에서 발현이 확인된 것은 정소뿐이었지만, 암세포에서는 인간 유방암 세포주 7종(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1) 및 췌장암 세포주 4종(Capan-2, MIAPaCa-2, Panc-1, BxPc-3) 등 다종류의 암세포주에서 발현이 검출되었다. 이 결과로부터 CAPRIN-1은 정소 이외의 정상 조직에서는 발현이 보이지 않고, 한편 각종 암세포주에 발현되어 있는 것이 확인되었다.
<실시예 2 CAPRIN-1에 대한 마우스 모노클로널 항체의 제작>
WO 2010/016526의 실시예 3에서 조제한 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 CAPRIN-1 단백질 100㎍을 등량의 MPL+TDM 아쥬반트(Sigma-Aldrich Co. LLC.제)와 혼합하고, 이것을 마우스 1마리당 항원 용액으로 했다. 항원 용액을 6주령의 Balb/cc 마우스(Japan SLC, Inc.제)의 복강 내에 투여 후, 1주일마다 7회 투여를 행하여 면역을 완료했다. 최후의 면역으로부터 3일 후에 적출한 각각의 비장을 멸균한 2매의 슬라이드 글라스에 끼워서 갈아 으깨고, PBS(-)(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD제)를 사용해서 세정하고, 1500rpm으로 10분간 원심해서 상청액을 제거하는 조작을 3회 반복해서 비장 세포를 얻었다. 얻어진 비장 세포와 마우스 미에로마 세포 SP2/0(ATCC으로부터 구입)을 10:1의 비율로 혼화하고, 거기에 37℃로 가온한 10% FBS를 포함하는 RPMI1640배지 200㎕와 PEG1500(Boehringer Ingelheim사제) 800㎕를 혼화해서 조제한 PEG 용액을 첨가하고 5분간 정치해서 세포 융합을 행했다. 1700rpm으로 5분간 원심하여 상청액을 제거한 후 Gibco사제의 HAT 용액을 2%당량 첨가한 15% FBS를 포함하는 RPMI1640배지(HAT 선택 배지) 150㎖로 세포를 현탁하고, 96구멍 플레이트(Nunc사제)의 1웰당 100㎕씩, 플레이트 15매에 파종했다. 7일간, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양함으로써 비장 세포와 미에로마 세포가 융합한 하이브리도마를 얻었다.
제작한 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. WO 2010/016526의 실시예 3에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1㎍/㎖를 96구멍 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% Bovine Serum Albumin(BSA) 용액(Sigma-Aldrich Co. LLC.제)을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하고, 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청액을 1웰당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정한 후 PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후, TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 15~30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 사용해서 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, 흡광도값이 높은 항체를 산생하는 하이브리도마를 복수개 선발했다.
선발한 하이브리도마를 96구멍 플레이트 1웰당 0.5개가 되도록 플레이트에 첨가하여 배양했다. 1주일 후 웰 중에 단일의 콜로니를 형성하고 있는 하이브리도마가 관찰되었다. 그들 웰의 세포를 더 배양해서 클로닝된 하이브리도마가 산생하는 항체의 CAPRIN-1 단백에 대한 결합 친화성을 지표로 하이브리도마를 선발했다. WO 2010/016526의 실시예 3에서 조제한 CAPRIN-1 단백 용액 1㎍/㎖를 96구멍 플레이트 1웰당 100㎕ 첨가하고, 4℃에서 18시간 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정 후, 0.5% BSA 용액을 1웰당 400㎕ 첨가해서 실온에서 3시간 정치했다. 용액을 제거하여 1웰당 400㎕의 PBS-T로 웰을 3회 세정 후, 상기에서 얻어진 하이브리도마의 각 배양 상청액을 1웰당 100㎕ 첨가하여 실온에서 2시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, PBS로 5000배로 희석한 HRP 표식 항 마우스 IgG(H+L) 항체(Invitrogen사제)를 1웰당 100㎕ 첨가해서 실온에서 1시간 정치했다. PBS-T로 웰을 3회 세정한 후 TMB 기질 용액(Thermo사제)을 1웰당 100㎕ 첨가해서 15~30분간 정치해서 발색 반응을 행했다. 발색 후 1규정 황산을 1웰당 100㎕ 첨가해서 반응을 정지시키고, 흡광도계를 사용해서 450㎚와 595㎚의 흡광도값을 측정했다. 그 결과, CAPRIN-1 단백에 반응성을 나타내는 모노클로널 항체를 산생하는 112개의 하이브리도마주를 얻었다.
이어서, 그들 모노클로널 항체 중 CAPRIN-1이 발현되는 유방암 세포의 세포 표면에 반응성을 나타내는 것을 선발했다. 구체적으로는 106개의 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231V를 1.5㎖ 용량의 마이크로 원심튜브로 원심 분리하고, 이것에 상기 각 하이브리도마의 배양 상청액 100㎕를 첨가하여 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 500배 희석한 FITC 표식 염소 항 마우스 IgG 항체(Invitrogen사제)를 첨가하여 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정 후 Becton, Dickinson and Company의 FACS 칼리버로 형광 강도를 측정했다. 한편, 상기와 마찬가지의 조작을 항체 대신에 아무 처리하고 있지 않은 6주령의 Balb/c 마우스의 혈청을 하이브리도마 배양용 배지로 500배 희석한 것을 사용해서 행하여 컨트롤로 했다. 그 결과, 컨트롤에 비해 형광 강도가 강한, 즉 유방암 세포의 세포 표면에 반응하는 모노클로널 항체 1개(#1)를 선발했다.
<실시예 3 선발한 모노클로널 항체의 특징>
실시예 2에서 얻어진 모노클로널 항체에 대하여 WO 2010/016526의 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 그 아미노산 서열을 해석했다. 그 결과, 모노클로널 항체 #1는 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 것이었다. 얻어진 모노클로널 항체 #1의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 13에, 및 아미노산 서열을 서열 번호 8에, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자 서열을 서열 번호 14에, 및 아미노산 서열을 서열 번호 12에 나타낸다.
즉, 모노클로널 항체 #1는 서열 번호 8에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 12에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역으로 이루어지고, 그 중 중쇄 가변 영역 중의 CDR1~3이 각각 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 중의 CDR1~3이 각각 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 것이 확인되었다.
<실시예 4 인간-마우스 키메라 모노클로널 항체의 제작>
실시예 3에서 얻어진 서열 번호 13으로 나타내는 유전자 서열로 이루어지는 마우스 모노클로널 항체 #1의 중쇄 가변 영역을 포함하는 유전자 증폭 단편의 양단을 제한 효소 처리한 후 정제하고, 마우스 항체 유래의 리더 서열과 서열 번호 37을 포함하는 인간 IgG1의 H쇄 정상 영역을 이미 삽입이 완료된 pcDNA4/myc-His(Invitrogen사제) 벡터에 상법에 따라서 삽입했다. 또한, 서열 번호 14로 나타내는 유전자 서열로 이루어지는 마우스 모노클로널 항체 #1의 경쇄 가변 영역을 포함하는 유전자 증폭 단편의 양단을 제한 효소 처리한 후 정제하고, 마우스 항체 유래의 리더 서열과 서열 번호 38을 포함하는 인간 IgG1의 L쇄 정상 영역을 이미 삽입 완료된 pcDNA 3.1/myc-His(Invitrogen사제) 벡터에 상법에 따라서 삽입했다.
이어서, 서열 번호 13으로 나타내어지는 마우스 모노클로널 항체 #1의 중쇄 가변 영역이 삽입된 상기 재조합 벡터와, 서열 번호 14로 나타내어지는 마우스 모노클로널 항체 #1의 경쇄 가변 영역이 삽입된 상기 재조합 벡터를 CHO-K1 세포(Cell Bank, RIKEN BioResource Center로부터 입수)에 도입했다. 구체적으로는 12구멍 배양 플레이트의 1웰당 1㎖의 10% FBS를 포함하는 Ham's F12 배지(Invitrogen사제)로 배양된 2×105개의 CHO-K1 세포를 PBS(-)로 세정한 후에 1웰당 1㎖의 10% FBS를 포함하는 Ham'sF12 배지를 새롭게 첨가한 웰에 30㎕의 OptiMEM(Invitrogen사제)에 용해한 상기 각 벡터 250ng과 Polyfect transfection reagent(QIAGEN사제) 30㎕를 혼합한 것을 첨가했다. 상기 재조합 벡터를 도입한 CHO-K1 세포를 200㎍/㎖ 제오신(Invitrogen사제) 및 200㎍/㎖ 게네티신(Roche Diagnostics K.K.제)을 첨가한 10% FBS를 포함하는 Ham's F12 배지로 배양한 후 96웰 플레이트의 1웰당 0.5개가 되도록 상기 재조합 벡터를 도입한 CHO-K1 세포를 파종해서 마우스 모노클로널 항체 #1의 가변 영역을 갖는 인간-마우스 키메라 모노클로널 항체 #1(#1)를 안정적으로 산생하는 세포주를 제작했다.
제작한 세포주를 150㎠ 플라스크를 사용해서 5×105개/㎖로 혈청을 포함하지 않는 OptiCHO 배지(Invitrogen사제) 30㎖를 사용해서 5일간 배양하고, 인간-마우스 키메라 모노클로널 항체 #1를 포함하는 배양 상청액을 얻었다.
또한, 비교 항체로서 WO 2010/016526에 기재되는 마우스 유래의 항CAPRIN-1 모노클로널 항체에서 서열 번호 15의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 16의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 1, 서열 번호 17의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 18의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 2, 서열 번호 19의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 20의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 3, 서열 번호 21의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 22의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 4, 서열 번호 23의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 24의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 5, 서열 번호 25의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 26의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 6, 서열 번호 27의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 28의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 7, 서열 번호 29의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 30의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 8, 서열 번호 31의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 32의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 9, 서열 번호 33의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 34의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 10, 서열 번호 35의 중쇄 가변 영역과 서열 번호 36의 경쇄 가변 영역으로 이루어지는 비교 항체 11에 대해서도 상기와 마찬가지로 해서 인간-마우스 키메라 비교 모노클로널 항체 1~11을 안정적으로 산생하는 세포주를 제작하고, 제작한 세포주를 150㎠ 플라스크를 사용해서 5×105개/㎖로 혈청을 포함하지 않는 OptiCHO 배지(Invitrogen사제) 30㎖를 사용해서 5일간 배양하여 인간-마우스 키메라 비교 항체 1~11을 포함하는 배양 상청액을 얻었다.
<실시예 5 항CAPRIN-1 항체 #1를 사용한 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1의 발현>
이어서, CAPRIN-1 유전자의 발현이 확인된 인간 유방암 세포주(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1), 신장암 세포주(Caki-1, Caki-2, A498, ACHN), 방광암 세포주(T24), 난소암 세포주(SKOV3), 폐암 세포주(QG56, A549), 췌장암 세포주(Capan-2, MIAPaCa-2), 전립선암 세포주(PC3), 자궁경부암 세포주(SW756), 섬유육종 세포주(HT1080), 뇌종양 세포주(T98G, U87MG, U251, SNB19, U373), 위암 세포주(MNK28, MNK45), 대장암 세포주(HT29, Lovo, CaCo2, SW480, HCT116), 백혈병 세포주(AML5), 림프종 세포주(Ramos)에 대해서 상기 실시예 4에서 얻어진 #1를 포함하는 배양 상청액을 사용해서 각 세포의 세포 표면 상에서의 CAPRIN-1 단백질의 발현을 조사했다. 각 세포주 각각 5×105 세포를 1.5㎖ 용량의 마이크로 원심튜브로 원심 분리했다. 항체 #1를 포함하는 각 세포 배양 상청액(100㎕)을 첨가하여 빙상에서 1시간 정치했다. PBS로 세정한 후, 0.1% FBS를 포함하는 PBS로 희석한 FITC 표식 염소 항 마우스IgG(H+L) 항체(Jackson I㎜unoResearch사제)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 정치했다. PBS로 세정 후 Becton, Dickinson and Company의 FACS 칼리버로 형광 강도를 측정했다. 음성 컨트롤에는 2차 항체만을 반응한 것을 사용했다. 그 결과, 항체 #1를 첨가한 세포는 음성 컨트롤에 비해 형광 강도가 35% 이상 강했다. 이 점에서 상기 인간 암세포주의 세포막 표면 상에 CAPRIN-1 단백질이 발현되어 있는 것이 확인되었다. 또한, 상기 형광 강도의 증강률은 각 세포에 있어서의 평균 형광 강도(MFI값)의 증가율로 나타내어져 이하의 계산식에 의해 산출했다.
평균 형광 강도의 증가율(형광 강도의 증강률)(%)=((항CAPRIN-1 항체를 반응시킨 세포의 MFI값)-(컨트롤 MFI값))÷컨트롤 MFI값)×100.
<실시예 6 CAPRIN-1에 대한 항체의 암세포에 대한 항종양 효과(ADCC 활성)>
상기 실시예 4에서 얻은 CAPRIN-1에 대한 항체의 인간-마우스 키메라 모노클로널 항체 #1가 CAPRIN-1을 발현하는 암세포를 장해할 수 있는지의 여부를 ADCC 활성을 측정함으로써 검토했다. #1를 산생하는 세포 배양 상청액을 Hitrap ProteinA SepharoseFF(GE Healthcare제)를 사용해서 정제하고, PBS(-)로 치환해서 0.22㎛의 필터(Millipore Corporation제)로 여과한 것을 활성 측정용의 항체로서 사용했다. 106개의 CAPRIN-1의 발현이 확인되어 있는 인간 유방암 세포주 MCF7, 인간 대장암 세포주 HCT-116, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2, 인간 신장암 세포주 Caki-2, 인간 폐암 세포주 QG56을 50㎖ 용량의 원심 튜브에 모아 100μCi의 크로뮴51을 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 그 후 10%의 FBS를 포함하는 RPMI1640 배지로 3회 세정하고, 96 구멍 V바닥 플레이트 1구멍당 2×103개씩 첨가해서 표적 세포로 했다. 이것에 상기 정제 항체 #1 및 상기 실시예 4에서 얻은 인간-마우스 키메라 비교 항체 1~11을 각각 1㎍ 첨가하고, 인간 말초혈 림프구 세포로부터 정법을 사용해서 분리한 인간 NK 세포를 포함하는 세포 집단을 1구멍당 2×105개 첨가해서 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 4시간 배양했다. 배양 후 장해를 받은 종양 세포로부터 방출되는 배양 상청액 중의 크로뮴51의 양을 측정하여 항CAPRIN-1 항체에 의한 암세포에 대한 세포 장해 활성을 산출했다. 음성 컨트롤에는 아이소타입 컨트롤 항체를 첨가한 것을 사용했다. 상기 NK 세포를 포함한 세포는 정법에 따라 인간 말초혈로부터 인간 말초혈 단핵구 세포 분리용의 비중 분리액 Histopaque(Sigma-Aldrich Co. LLC.)를 사용해서 분리한 인간 말초혈 단핵구 세포를 FITC 형광 색소가 표식된 각종 항체[항인간 CD3 항체, 항인간 CD20 항체, 항인간 CD19 항체, 항인간 CD11c 항체, 항HLA-DR 항체(Becton, Dickinson and Company)]에서 반응시키고, 셀 소터[FACS Vantage SE(Becton, Dickinson and Company)]를 사용해서 상기 항체로 물들지 않은 세포 집단을 분리한 것 또는 인간 NK 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec K.K.제)를 사용해서 분리한 것을 사용했다. 암세포에 대한 세포 장해 활성의 평가의 결과, 아이소타입 컨트롤 항체를 사용했을 경우 및 비교 항체 1~비교 항체 11을 사용했을 경우의 세포 장해 활성은 모두 5% 미만이었던 것에 대하여 항체 #1 항체는 인간 유방암 세포주 MCF7, 인간 대장암 세포주 HCT-116, 인간 췌장암 세포주 MIAPaCa-2, 인간 신장암 세포주 Caki-2, 인간 폐암 세포주 QG56에 대하여 각각 20%, 17%, 27%, 21%, 10%의 세포 장해 활성을 나타냈다. 마찬가지로 다른 암세포, 유방암 세포주ZR75-1, T47D, Hs578T, BT-20, SK-BR-3, MDA-MB-231V, MRK-nu-1, 글리오마 세포주 T98G, U373, 폐암 세포주 A549, 신장암 세포주 Caki-1, ACHN, 자궁경부암 세포주 SW756, 방광암 세포주 T24, 위암 세포주 MKN28, MKN45, 대장암 세포주 SW480, 백혈병 세포주 AML5 및 림프종 세포주 Ramos에 대해서 아이소타입 컨트롤 항체를 사용했을 경우 및 비교 항체 1~비교 항체 11을 사용했을 경우는 모두 4% 미만이었던 것에 대하여 항체 #1는 10% 이상의 세포 장해 활성이 확인되었다. 이상의 결과로부터 취득한 CAPRIN-1에 대한 모노클로널 항체 #1는 ADCC 활성에 의해 CAPRIN-1을 발현하는 암세포를 장해하는 것이 나타어지고, 비교 항체 1~비교 항체 11에 비해 항체 #1는 인간 암세포에 대하여 강한 세포 장해 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
또한, 세포 장해 활성은 상기한 바와 같이 본 발명에서 사용되는 CAPRIN-1에 대한 항체, 림프구(NK 세포를 포함하는 집단) 세포 및 크로뮴51을 받아들인 2×103개의 각 암세포주를 혼합해서 4시간 배양하고, 배양 후 배지에 방출된 크로뮴51의 양을 측정해서 이하의 계산식에 의해 산출한 암세포주에 대한 세포 장해 활성을 나타낸 결과이다.
식: 세포 장해 활성(%)=CAPRIN-1에 대한 항체 및 림프구(NK 세포를 포함하는 집단) 세포를 첨가했을 때의 표적 세포로부터의 크로뮴51 유리량÷1N 염산을 첨가한 표적 세포로부터의 크로뮴51 유리량×100.
이어서, 상기 실시예 4에서 얻은 인간-마우스 키메라 모노클로널 항체 #1의 담암 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 효과를 평가했다. 사용한 항체는 항체 #1를 산생하는 각 세포의 배양 상청액을 컬럼 정제한 것을 사용했다. 마찬가지로 해서 상기 실시예 4에서 제작한 항CAPRIN-1 항체의 인간-마우스 키메라 비교 모노클로널 항체 1~11에 대해서도 담암 마우스 생체 내에 있어서의 항종양 효과를 평가했다.
CAPRIN-1을 발현하는 인간 유래의 암세포주를 이식한 담암 마우스를 사용해서 #1의 항체의 항종양 효과를 검토했다. 65마리의 Balb/c 누드 마우스(Japan SLC, Inc.제)의 배부 피하에 1마리당 2×106개의 인간 췌장암 세포주 Capan-2 세포(ATCC로부터 구입)를 이식하고, 종양이 직경 5㎜ 정도의 크기가 될 때까지 성장시켰다. 상기 담암 마우스에 #1의 항체 및 인간-마우스 키메라 비교 항체 1~11을 각각 1마리당 200㎍(200㎕)씩 1 항체에 대해서 5마리에 복강내 투여했다. 그 후, 2일간 계3회, 동량의 각 항체를 각 담암 마우스의 복강에 투여하고, 매일 종양의 크기를 계측하여 항종양 효과를 관찰했다. 한편, 나머지 5마리의 담암 마우스에 대하여 항체 대신에 PBS(-)를 투여하고, 이것을 컨트롤 군으로 했다. 또한, 종양의 크기는 0.5×(긴 지름×짧은 지름×짧은 지름)의 계산식을 사용해서 체적을 산출했다.
항종양 효과의 관찰의 결과, CAPRIN-1에 대한 항체 #1를 투여한 검토군은 항체 투여 후 29일째에는 같은 날의 컨트롤 군의 종양의 크기를 100%로 했을 때에 인간-마우스 키메라 비교 항체 1~11을 투여한 마우스는 종양의 크기가 약 85%이었던 것에 대하여 #1의 항체는 80%의 항종양 효과가 얻어졌다. 이 결과로부터 취득한 CAPRIN-1에 대한 항체 #1는 CAPRIN-1을 발현하는 암세포에 대하여 생체 내에서 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어졌다. 또한, 비교 항체 1~11에 비해 항체 #1는 생체 내에서 보다 강한 항종양 효과를 발휘하는 것이 나타내어졌다.
<실시예 7 항CAPRIN-1 항체 #1가 인식하는 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1의 분자수>
인간 유방암 세포주(ZR75-1, MCF7, T47D, SK-BR-3, MDA-MB-157, BT-20, MDA-MB-231V, MRK-nu-1), 신장암 세포주(Caki-1, Caki-2, A498, ACHN), 방광암 세포주(T24), 난소암 세포주(SKOV3), 폐암 세포주(QG56, A549), 췌장암 세포주(MIAPaCa-2, Capan-2), 전립선암 세포주(PC3), 자궁경부암 세포주(SW756), 섬유육종 세포주(HT1080), 뇌종양 세포주(T98G, U87MG, U251, SNB19, U373), 위암 세포주(MNK28, MNK45), 대장암 세포주(HT29, Lovo, CaCo2, SW480, HCT116), 백혈병 세포주(AML5), 림프종 세포주(Ramos)에 대해서 항CAPRIN-1 항체 #1가 인식하는 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1 분자의 수를 분자수 측정 키트 QIFIKIT(Dako제)를 사용해서 조사했다. 마찬가지로 해서 상기 실시예 4에서 제작한 항CAPRIN-1 모노클로널 항체인 비교 항체 1~비교 항체 11에 대해서도 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1 분자의 수를 조사했다.
첨부 프로토콜에 따라 각 세포주에 항체 #1 및 비교 항체 1~비교 항체 11을 최종 농도가 5㎍/㎖가 되도록 PBS로 희석하고, 각 세포주에 첨가해서 30분 반응시켰다. PBS로 세정한 후 키트에 첨부된 검량 비즈와 함께 각 세포주로 키트에 첨부된 형광 표식된 2차 항체 항 마우스 IgG 항체를 첨가해서 빙상에서 45분간 정치했다. 각 세포주 및 검량 비즈를 PBS로 세정 후 Becton, Dickinson and Company의 FACS칼리버로 형광 강도를 측정해서 평균 형광 강도값(mean)을 얻었다. 또한, 비교 항체에 대해서도 마찬가지의 측정을 행하여 mean을 얻었다. 음성 컨트롤에는 아이소타입 컨트롤 항체를 반응시킨 것을 사용하여 mean을 얻었다. 각 평균 형광 강도값(mean)을 사용해서 키트에 첨부된 방법에 따라 분자수를 산출했다. 그 결과, 항체 #1가 인식하는 각종 암세포 표면에서의 CAPRIN-1의 분자수는 조사한 모든 인간 암세포에 있어서 세포 1개당 105개 이상이었다. 한편, 비교 모노클로널 항체 1~11에 대해서는 세포 1개당 105개보다 적었다.
본 발명의 항체는 암의 치료 및/또는 예방을 위해서 유용하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서에 있어서 포함하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Toray Industries, Inc. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment and Prevention of Cancer <130> PH-5302-PCT <150> JP 2011-171379 <151> 2011-08-04 <160> 38 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 5562 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (190)..(2319) <223> <400> 1 cagagggctg ctggctggct aagtccctcc cgctcccggc tctcgcctca ctaggagcgg 60 ctctcggtgc agcgggacag ggcgaagcgg cctgcgccca cggagcgcgc gacactgccc 120 ggaagggacc gccacccttg ccccctcagc tgcccactcg tgatttccag cggcctccgc 180 gcgcgcacg atg ccc tcg gcc acc agc cac agc ggg agc ggc agc aag tcg 231 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser 1 5 10 tcc gga ccg cca ccg ccg tcg ggt tcc tcc ggg agt gag gcg gcc gcg 279 Ser Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala 15 20 25 30 gga gcc ggg gcc gcc gcg ccg gct tct cag cac ccc gca acc ggc acc 327 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr 35 40 45 ggc gct gtc cag acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat gat gaa gtg cgg act gac ctg aaa caa ggt ttg aat 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acc gag gcc atg aag cag att ctc ggg gtg atc gac 375 Gly Ala Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp 50 55 60 aag aaa ctt cgg aac ctg gag aag aaa aag ggt aag ctt gat gat tac 423 Lys Lys Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr 65 70 75 cag gaa cga atg aac aaa ggg gaa agg ctt aat caa gat cag ctg gat 471 Gln Glu Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp 80 85 90 gcc gtt tct aag tac cag gaa gtc aca aat aat ttg gag ttt gca aaa 519 Ala Val Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys 95 100 105 110 gaa tta cag agg agt ttc atg gca cta agt caa gat att cag aaa aca 567 Glu Leu Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gln Lys Thr 115 120 125 ata aag aag aca gca cgt cgg gag cag ctt atg aga gaa gaa gct gaa 615 Ile Lys Lys Thr Ala Arg Arg Glu Gln Leu Met Arg Glu Glu Ala Glu 130 135 140 cag aaa cgt tta aaa act gta ctt gag cta cag tat gtt ttg gac aaa 663 Gln Lys Arg Leu Lys Thr Val Leu Glu Leu Gln Tyr Val Leu Asp Lys 145 150 155 ttg gga gat 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270 cag gta cct gaa gct gaa cct gag cca gca gaa gag tac act gag caa 1047 Gln Val Pro Glu Ala Glu Pro Glu Pro Ala Glu Glu Tyr Thr Glu Gln 275 280 285 agt gaa gtt gaa tca aca gag tat gta aat aga cag ttc atg gca gaa 1095 Ser Glu Val Glu Ser Thr Glu Tyr Val Asn Arg Gln Phe Met Ala Glu 290 295 300 aca cag ttc acc agt ggt gaa aag gag cag gta gat gag tgg aca gtt 1143 Thr Gln Phe Thr Ser Gly Glu Lys Glu Gln Val Asp Glu Trp Thr Val 305 310 315 gaa acg gtt gag gtg gta aat tca ctc cag cag caa cct cag gct gca 1191 Glu Thr Val Glu Val Val Asn Ser Leu Gln Gln Gln Pro Gln Ala Ala 320 325 330 tcc cct tca gta cca gag ccc cac tct ttg act cca gtg gct cag gca 1239 Ser Pro Ser Val Pro Glu Pro His Ser Leu Thr Pro Val Ala Gln Ala 335 340 345 350 gat ccc ctt gtg aga aga cag cga gta caa gac ctt atg gca caa atg 1287 Asp Pro Leu Val Arg Arg Gln Arg Val Gln Asp Leu Met Ala Gln Met 355 360 365 cag ggt ccc tat aat ttc ata cag gat tca atg ctg gat ttt gaa aat 1335 Gln Gly Pro Tyr Asn Phe Ile Gln Asp Ser Met Leu Asp 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Ala Ser Gln Pro Gln Val Phe Gln 480 485 490 gct ggg aca agc aaa cct tta cat agc agt gga atc aat gta aat gca 1719 Ala Gly Thr Ser Lys Pro Leu His Ser Ser Gly Ile Asn Val Asn Ala 495 500 505 510 gct cca ttc caa tcc atg caa acg gtg ttc aat atg aat gcc cca gtt 1767 Ala Pro Phe Gln Ser Met Gln Thr Val Phe Asn Met Asn Ala Pro Val 515 520 525 cct cct gtt aat gaa cca gaa act tta aaa cag caa aat cag tac cag 1815 Pro Pro Val Asn Glu Pro Glu Thr Leu Lys Gln Gln Asn Gln Tyr Gln 530 535 540 gcc agt tat aac cag agc ttt tct agt cag cct cac caa gta gaa caa 1863 Ala Ser Tyr Asn Gln Ser Phe Ser Ser Gln Pro His Gln Val Glu Gln 545 550 555 aca gag ctt cag caa gaa cag ctt caa aca gtg gtt ggc act tac cat 1911 Thr Glu Leu Gln Gln Glu Gln Leu Gln Thr Val Val Gly Thr Tyr His 560 565 570 ggt tcc cca gac cag tcc cat caa gtg act ggt aac cac cag cag cct 1959 Gly Ser Pro Asp Gln Ser His Gln Val Thr Gly Asn His Gln Gln Pro 575 580 585 590 cct cag cag aac act gga ttt cca cgt agc aat cag ccc tat tac aat 2007 Pro Gln 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tgctctgttt ctaaaactta atcttggacc 2414 caaattttaa tttttgaatg atttaatttt ccctgttact atataaactg tcttgaaaac 2474 tagaacatat tctcttctca gaaaaagtgt ttttccaact gaaaattatt tttcaggtcc 2534 taaaacctgc taaatgtttt taggaagtac ttactgaaac atttttgtaa gacatttttg 2594 gaatgagatt gaacatttat ataaatttat tattcctctt tcattttttt gaaacatgcc 2654 tattatattt tagggccaga caccctttaa tggccggata agccatagtt aacatttaga 2714 gaaccattta gaagtgatag aactaatgga atttgcaatg ccttttggac ctctattagt 2774 gatataaata tcaagttatt tctgactttt aaacaaaact cccaaattcc taacttattg 2834 agctatactt aaaaaaaatt acaggtttag agagtttttt gtttttcttt tactgttgga 2894 aaactacttc ccattttggc aggaagttaa cctatttaac aattagagct agcatttcat 2954 gtagtctgaa attctaaatg gttctctgat ttgagggagg ttaaacatca aacaggtttc 3014 ctctattggc cataacatgt ataaaatgtg tgttaaggag gaattacaac gtactttgat 3074 ttgaatacta gtagaaactg gccaggaaaa aggtacattt ttctaaaaat taatggatca 3134 cttgggaatt actgacttga ctagaagtat caaaggatgt ttgcatgtga atgtgggtta 3194 tgttctttcc caccttgtag catattcgat gaaagttgag ttaactgata gctaaaaatc 3254 tgttttaaca gcatgtaaaa agttatttta tctgttaaaa gtcattatac agttttgaat 3314 gttatgtagt ttctttttaa cagtttaggt aataaggtct gttttcattc tggtgctttt 3374 attaattttg atagtatgat gttacttact actgaaatgt aagctagagt gtacactaga 3434 atgtaagctc catgagagca ggtaccttgt ctgtcttctc tgctgtatct attcccaacg 3494 cttgatgatg gtgcctggca catagtaggc actcaataaa tatttgttga atgaatgaa 3553 <210> 4 <211> 694 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Ser Ala Thr Ser His Ser Gly Ser Gly Ser Lys Ser Ser Gly 1 5 10 15 Pro Pro Pro Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ala Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln His Pro Ala Thr Gly Thr Gly Ala 35 40 45 Val Gln Thr Glu Ala Met Lys Gln Ile Leu Gly Val Ile Asp Lys Lys 50 55 60 Leu Arg Asn Leu Glu Lys Lys Lys Gly Lys Leu Asp Asp Tyr Gln Glu 65 70 75 80 Arg Met Asn Lys Gly Glu Arg Leu Asn Gln Asp Gln Leu Asp Ala Val 85 90 95 Ser Lys Tyr Gln Glu Val Thr Asn Asn Leu Glu Phe Ala Lys Glu Leu 100 105 110 Gln Arg Ser Phe Met Ala Leu Ser Gln 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12 Ala Phe Phe Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln 100 <210> 13 <211> 333 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 ggacctgacc tggtgaagcc tggggcttca gtgaagatat cctgcaaggc ttctggttac 60 tcattcactg cctactacat gcactgggtg aagcagagcc atggaaagag ccttgagtgg 120 attggacgtg ttaatcctaa caatggtggt actacctaca accagaagtt caagggcaag 180 gccatattaa ctgtagataa gtcatccagc acagcctaca tggagctccg cagcctgaca 240 tttgaggact ctgcggtcta ttactgtgca agaaggattt actacggcta ctttgactac 300 tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca 333 <210> 14 <211> 312 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 gcattctttg 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120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr 145 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn 35 40 45 Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp 100 105 110 Ser Thr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Asn Pro Tyr Asp 130 135 <210> 17 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu His Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Arg Ser Tyr Asp Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr 145 <210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Ala Val Leu Arg Cys Ser Arg Gly Leu Leu Val Ile Trp Ile Ser Asp 1 5 10 15 Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Thr Ala Gly Glu 20 25 30 Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Trp Ser Val 35 40 45 Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Arg Gln Pro 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Glu Ser Trp Val Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Thr 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PRT <213> Mus musculus <400> 20 Arg Thr Thr Ser His Met Asp Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro 1 5 10 15 Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg 20 25 30 Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln 35 40 45 Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 50 55 60 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gln His Phe Trp Ser Thr Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105 110 Ile Lys Gln Ser Asp 115 <210> 21 <211> 148 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Glu Trp Ser Gly Val Phe Ile Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu His Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 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Gln His Asn Arg Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ser Ser 85 90 95 Val Gln Val Pro Arg Arg Arg Ser Asn 100 105 <210> 25 <211> 100 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Asp Ile Leu Gln Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn 1 5 10 15 Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile 20 25 30 Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys 35 40 45 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 50 55 60 Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp 65 70 75 80 Gly Val Trp Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 85 90 95 Val Ser Ser Lys 100 <210> 26 <211> 90 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala 1 5 10 15 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 20 25 30 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Asp Thr Gly Leu Pro Asp Arg Phe Pro Gly 35 40 45 Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Thr Asn Val Gln Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Glu Asp Tyr Phe Cys 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musculus <400> 36 Thr Ile Leu Trp Arg Glu Gly Pro Phe Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser 1 5 10 15 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro 20 25 30 Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 35 40 45 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 50 55 60 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 65 70 75 80 Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Glu Val Pro Ser Trp Arg 85 90 95 Ser Asn Lys <210> 37 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 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Claims (8)

  1. 서열 번호 5, 6 및 7의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 9, 10 및 11의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또한 CAPRIN-1 단백질과 면역학적 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체 또는 다중 특이성 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항종양제가 콘주게이트된 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 프래그먼트.
  4. 제 1 항에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 암이 유방암, 신장암, 췌장암, 대장암, 폐암, 뇌종양, 위암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 방광암, 식도암, 백혈병, 림프종, 섬유육종, 비만세포종 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물.
  6. 제 4 항에 기재된 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물과, 항종양제를 포함하는 의약 조성물을 포함해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 암의 치료 및/또는 예방을 위한 조합 의약품.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 항체 또는 그 프래그먼트를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  8. 삭제
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