KR101974145B1

KR101974145B1 - 보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101974145B1
Application number: KR1020170178098A
Authority: KR
Inventors: 이형규; 김석호; 김정희; 조성예; 암릿파우델; 이성윤; 이재민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-04-30

Abstract

본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보풀(Sagittaria aginashi Makino) 추출물이 TSLP의 발현을 억제하고, 아토피 피부염이 유발된 마우스에서 아토피 피부염을 개선하는 효과가 있다는 것을 확인하였으며, 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물을 처리하였을 때, 보풀 추출물 또는 쿠세놀 F를 단독으로 처리하는 것에 비해 더욱 증진된 TSLP 발현 저해효과를 나타내므로, 본 발명의 조성물은 아토피 피부염의 치료제, 아토피 피부염 개선용 화장품 또는 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating atopic dermatitis comprising Sagittaria aginashi extract as effective component}

본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염은 주로 영아와 소아에서 발생하는 가장 흔한 피부 질환 중 하나로, 재발률이 높은 만성 피부염이며, 최근 전 세계적으로 증가하고 있는 대표적인 알레르기 피부과 질환으로 소아의 12%에서 15%까지 유병률을 보인다. 2015년 인구 10만 명당 질환별 연령대별 환자 수를 보면, 아토피 피부염은 12세 이하에서 7,685명으로 가장 진료를 많이 받았으며, 13~19세 2,868명, 20대 1,619명 순으로 나타났다. 아토피 피부염은 대개 영유아기부터 시작되는데, 약 90%가 5세 이내에 발병하며, 약 50%가 생후 1세 이내에 발병한다. 아토피 피부염 환자의 약 80% 정도는 성인까지 증상이 지속되거나, 피부병변이 손이나 발의 습진 같은 형태로 변형되어 나타난다. 연령대별 '아토피 피부염 진료현황'을 살펴보면 영유아기 뿐만 아니라 20대의 경우 매년 약 10만 명이 아토피 피부염으로 진료를 받고 있으며, 60대 환자들도 매년 3만 명 가까이 진료를 받는 것으로 나타나 성인 환자 수도 매년 유지되는 것을 확인하였다. 아토피 피부염은 유전적 요인, 면역학적 이상, 피부 장벽의 이상, 신경면역학적 이상, 환경적 요인 등 다양한 요인이 복합적으로 작용하여 발병하기 때문에 치료가 어렵다.

피부 장벽이 손상되면 외부 항원 및 균의 침투를 막기 위하여 피부에서는 각질형성세포와 항원전달세포들을 통하여 즉각적인 선천면역반응이 일어나고, 후천면역반응도 이어지는데, 아토피 피부염 환자들에서는 이들 선천면역계와 후천면역계가 비정상적으로 반응하여서 염증반응이 일어나 피부염이 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아토피 피부염은 정확한 원인을 알 수 없어 특별한 치료제가 없고, 특히 대다수의 환자들이 가려움증으로 인해 병변부위가 쉽게 호전되지 않는다는 것이 가장 큰 문제이다.

일반적으로, 알러지성 질환의 치료를 위하여 항히스타민, 스테로이드성 또는 비스테로이드성 항염증용 의약품 및 류코트리엔 길항제와 같은 의약품이 사용된다. 그러나 이러한 의약품들은 과도한 체액성 면역을 완화하거나 IgE 생산을 억제하는 것으로, 알러지성 질환의 근본적인 치유는 어렵다.

최근 다양한 연구결과들에서 유전 및 여러 환경 요인에 의해 피부 장벽이 손상되어 각종 알레르겐에 노출되면, 각질형성세포에서 IL-7과 유사한 사이토카인인 TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin)를 분비하여 면역반응을 일으킨다고 보고되고 있다. 특히, TSLP의 분비는 피부 내 뉴런세포의 TSLP 수용체에 결합하여 뇌하수체에 병변부위를 반복적으로 긁게 하는 신호를 주어 아토피 피부염을 더욱 악화시키는 것으로 보고되었고, TSLP를 차단함으로써 아토피 피부염을 현저히 감소시키는 결과가 보고됨으로써, 아토피 피부염의 시작과 병변증가에 TSLP가 마스터 스위치 역할을 하고 있음을 보여주었다.

따라서 본 발명은 안정성이 입증된 천연물을 이용하여 TSLP 분비를 저해하여 아토피 피부염의 개시 및 병변증가를 개선하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1114506호에는 빈랑자 및 정향수피의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 TSLP 저해능에 의한 아토피 피부염 개선능을 가지는 한방 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 보풀 추출물; 또는 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 상기 조성물이 TSLP의 발현을 억제하고, 아토피 피부염이 유발된 마우스에서 아토피 피부염을 개선하는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보풀 추출물이 TSLP의 발현을 저해하고, 아토피 피부염이 유발된 동물모델에서 아토피 피부염을 개선하는 효과가 우수하며, 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물이 보풀 또는 쿠세놀 F에 비해 TSLP의 발현을 억제하는 효과가 더욱 증진되었으므로, 보풀 추출물; 또는 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 아토피 피부염의 치료제, 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장품; 또는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 소재로 사용할 수 있다.

도 1은 보풀 추출물의 인간 각질형성세포에 대한 세포독성을 확인한 결과이다. N은 음성대조군이고, Dex는 덱사메타손 처리군이다.
도 2는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 인간 각질형성세포에 보풀 추출물을 농도별로 처리한 후 TSLP의 발현 변화를 ELISA로 확인한 결과이다. N은 음성대조군이고, P는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 군이며, D는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 후 아토피 치료제로 사용되는 덱사메타손을 처리한 군이다.
도 3은 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)를 처리하여 귀 부위에 아토피 피부염이 유발된 마우스에 보풀 추출물을 경구투여한 후 귀 두께 변화를 확인한 결과이다. Con은 아토피 피부염을 유발하지 않은 음성대조군이고, AD는 아토피 피부염을 유발한 군이며, AD+B1은 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 1mg/kg 경구투여한 군이고, AD+B5는 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 5mg/kg 경구투여한 군이고, AD+B25는 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 25mg/kg 경구투여한 군이며, AD+Dex는 아토피 피부염 유발 후 아토피 피부염 치료제인 덱사메타손을 1mg/kg 경구투여한 군이다.
도 4는 집먼지 진드기 추출물 및 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)를 처리하여 귀 부위에 아토피 피부염이 유도된 마우스에 보풀 추출물을 경구투여한 후 귀의 피부 변화를 관찰한 사진이다. Con은 아토피 피부염을 유발하지 않은 음성대조군이고, AD는 아토피 피부염을 유발한 군이며, AD+2는 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 2mg/kg 경구투여한 군이고, AD+10은 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 10mg/kg 경구투여한 군이고, AD+50은 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 50mg/kg 경구투여한 군이며, AD+Dex1은 아토피 피부염 유발 후 아토피 피부염 치료제인 덱사메타손을 1mg/kg 경구투여한 군이다.
도 5는 마우스에서 보풀 추출물의 투여 후 시간에 따른 마우스 체중 변화를 확인한 결과이다. Con은 아토피 피부염을 유발하지 않은 음성대조군이고, AD는 아토피 피부염을 유발한 군이며, B2는 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 2mg/kg 경구투여한 군이고, B10은 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 10mg/kg 경구투여한 군이고, B50은 아토피 피부염 유발 후 보풀 추출물을 50mg/kg 경구투여한 군이며, Dex1은 아토피 피부염 유발 후 아토피 피부염 치료제인 덱사메타손을 1mg/kg 경구투여한 군이다.
도 6은 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 인간 각질형성세포에 쿠세놀 F; 보풀 추출물; 또는 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물을 처리하여 TSLP 저해 효과를 확인한 결과이다. N은 음성대조군이고, P는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 군이고, Dex는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 후 아토피 치료제로 사용되는 덱사메타손을 처리한 군이고, KF는 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 후 쿠세놀 F를 처리한 군이고, 보풀은 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 후 보풀 추출물을 처리한 군이며, KF+보풀은 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 후 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물을 처리한 군이다.
도 7은 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물의 인간 각질형성세포에 대한 세포독성을 확인한 결과이다. None는 아무것도 처리하지 않은 음성대조군이고, DMSO는 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물의 용매인 DMSO를 처리한 군이며, Ku+보풀은 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물을 100㎍/ml 처리한 군이다.

본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 유효성분은 보풀 추출물에 쿠세놀 F를 추가로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 보풀 추출물 1 중량부에 대하여 0.3~3 중량부의 쿠세놀 F를 추가로 더 포함하는 것이고, 더 바람직하게는 보풀 추출물 1 중량부에 대하여 1 중량부의 쿠세놀 F를 추가로 더 포함하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 보풀 추출물; 또는 보풀 추출물 및 쿠세놀 F의 혼합물은 TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin)의 발현을 억제하는 특징이 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 보풀 추출물의 용매는 물, C₁~C₇의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄, 에텔, 헥산 또는 이들의 혼합물이고, 바람직하게는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물이며, 더 바람직하게는 메탄올이지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 보풀 추출물은 전초, 지상부 또는 지하부를 사용하여 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 전초를 사용하여 추출한 것이지만, 이에 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 보풀 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 피부외용 연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 보풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은 아토피 피부염을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 보풀 추출물의 제조

보풀의 전초를 건조하여 분쇄한 가루 40g에 메탄올 400㎖를 첨가한 후, 초음파 추출기를 이용하여 8시간 동안 추출하였다. 추출된 용액을 여과지로 여과한 후 감압농축하여 보풀 추출물 3.5g을 획득하였다.

제조예 2. 쿠세놀 F의 분리 및 정제

건조한 고삼(Sophora flavescence) 뿌리 3kg을 분쇄한 후 메탄올 5ℓ를 첨가한 다음 초음파 추출기를 이용하여 8시간 동안 추출한 후 여과하는 과정을 총 2회 수행하였다. 그 후, 여과한 메탄올 추출액을 감압하여 약 500g의 메탄올 추출물을 획득하였다. 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후 증류수와 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 분배시키고 정치하여 에틸아세테이트 층을 획득하였다. 상기 증류수 및 에틸아세테이트를 첨가하고, 에틸아세테이트 층을 획득하는 과정을 2회 더 반복한 후, 획득한 에틸아세테이트 분획물을 감압 농축하여 약 200g의 고삼 에틸아세테이트 분획물을 획득하였다. 이 중 80g을 취해 1차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(실리카겔 약 2.5g)를 실시하였고, 클로로포름:메탄올이 99:1, 95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 50:50 부피비로 혼합된 용출용매를 단계별로 흘려주면서 용출물 1.5ℓ마다 박층크로마토그래피를 실시하고, 그 결과에 따라 하위 분획으로 나누었다. 각각의 분획은 감압농축하였으며, 그 중 4번째 분획을 이용하여 2차 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여 쿠세놀 F 약 15㎎을 획득하였다. 쿠세놀 F의 화학구조는 표준폼과 NMR, MS 등의 기기분석자료를 비교하여 동정하였고, 화학식 1로 나타내었다.

(MS m/z 424 [M]+; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.37(1H, d, J= 8.3 Hz, H-6'), 6.41(1H, dd, J = 8.3, 2.4 Hz, H-5'), 6.37(1H, d, J= 2.4 Hz, H-3'), 6.15(1H, s, H-8'), 5.60(1H, dd, J= 11.1, 5.0 Hz, H-2), 5.05(1H, t, J= 6.7 Hz, H-4"), 4.62(1H, d, J= 2.1 Hz, H-9"a), 4.60 (1H, d, J= 2.1 Hz, H-9"b), 1.61(3H, s, 10"-CH3), 1.56 (3H, s, 6"-CH3), 1.45 (3H, s, 7"-CH3); 13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 17.8(C-7"), 19.1(C-10"), 25.8(C-6"), 27.1(C-1"), 31.9(C-3"), 42.8(C-3), 47.8(C-2"), 75.3(C-2), 95.1(C-8), 102.7(C-10), 103.4(C-3'), 107.8(C-5'), 108.2(C-6), 111.2(C-9"), 117.8 (C-1'), 124.4(C-4"), 128.6(C-6'), 131.6(C-5"), 149.1(C-8"), 156.1(C-4'), 159.4 (C-2'), 162.1(C-5), 163.0(C-9), 165.3(C-7), 197.8(C-4))

[화학식 1]

실시예 1. 보풀 추출물 처리에 의한 TSLP 발현의 변화

제조예 1의 보풀 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 96 웰 플레이트에 인간 각질형성세포(keratinocyte)를 3×10⁴개 접종하고, 플레이트의 80%까지 자라도록 배양한 후, 덱사메타손 또는 제조예 1의 농도별(1, 10, 100 및 1000㎍/㎖) 보풀 추출물을 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 20㎕의 MTT 용액(5mg/㎖)을 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 배지는 제거하고 DMSO를 첨가하여 생성된 결정을 녹인 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 덱사메타손 및 100㎍/㎖ 농도 이하의 보풀 추출물은 세포독성이 나타나지 않았으나, 1000㎍/㎖ 농도의 보풀 추출물은 세포독성이 나타나는 것을 확인하여 이후 실험에서는 100㎍/㎖ 농도 이하의 보풀 추출물을 사용하였다.

보풀 추출물의 TSLP 저해효과는 Th2 면역유도 사이토카인(IL-4 100ng/㎖, IL-13 100ng/㎖, TNF-α 20ng/㎖ cytokine mixture 및 Flagellin 100ng/㎖)을 처리하여 TSLP의 발현을 유도한 인간 각질형성세포(keratinocyte)에 상기 독성을 나타내지 않은 100㎍/㎖ 농도 이하의 보풀 추출물을 처리하여 확인하였다.

24 웰 플레이트에 2×10⁵개의 세포를 접종하고, 플레이트의 80%까지 자라도록 배양한 다음 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 들어있지 않은 배양액으로 교체한 후 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 TSLP의 발현을 유도하였으며, 보풀 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 반응하였다.

보풀 추출물의 TSLP 저해효과는 인간 TSLP 듀오세트 ELISA(Human TSLP DuoSet ELISA, R&D system)를 사용하였고, 포획 항체(capture antibody)를 실온에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 1%(w/v) BSA를 첨가하여 만든 희석용 시약(reagent diluent) 200㎕로 교체한 후 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 그 후 샘플(상기 보풀 추출물 처리 후 24시간 동안 반응시킨 배양 배지) 또는 표본(standard) 100㎕로 교체한 후 2시간 동안 실온에서 결합시킨 다음 검출용 항체(detection antibody) 100㎕로 교체하여 2시간 동안 실온에서 결합시켰다. 그 후 발색반응 측정을 위해 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100㎕를 20분 동안 처리하고, 그 후 TMB 기질 100㎕를 20분 동안 반응시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 Th2 면역유도 사이토카인을 처리하여 유도된 TSLP의 발현은 보풀 추출물을 처리하였을 때 감소하였고, 보풀 추출물의 농도가 증가될수록 TSLP 발현 감소효과가 우수하였다.

실시예 2. 아토피 피부염 동물모델에서 보풀 추출물 처리에 의한 효과 확인

집먼지 진드기 추출물(house dust mite extract, Dermatophagoides farinae extract, DFE) 및 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)를 귀 부위에 처리하여 아토피 피부염이 유도된 마우스에 보풀 추출물을 경구투여한 후 귀 두께 변화를 확인하여 보풀 추출물의 아토피 피부염 개선효과를 확인하였다.

마우스 귀를 반창고로 3-4회 반복하여 스트리핑(striping)한 후, 10mg/㎖로 희석한 DFE를 매주 월요일에 마우스 귀의 앞·뒤 면에 20㎕씩 도포하였다. AOO(아세톤/올리브오일을 1:3 부피비로 혼합한 용액)에 녹인 1%(w/v) DNCB는 매주 금요일에 마우스 귀의 앞·뒤 면에 20㎕씩 도포하고, 매주 화요일 및 토요일마다 귀 두께를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 DFE 및 DNCB를 마우스 피부에 도포하면 아토피 피부염이 유발되어 귀 두께가 증가하지만, DFE 및 DNCB 도포와 더불어 보풀 추출물의 경구투여를 시행하면 귀 두께의 증가가 감소하는 것을 확인하였다. 귀 두께 감소효과는 보풀 추출물의 농도가 증가할수록 크게 나타났고, 도 4에 개시한 바와 같이 귀 두께 감소효과뿐만 아니라 육안으로도 아토피 피부염이 유발되었던 귀 부위 피부의 증상을 완화시켰다.

또한, 보풀 추출물이 마우스에 독성을 일으키지 않는다는 것을 마우스 체중변화로 확인한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 보풀 추출물을 투여한 경우에도 체중의 변화는 거의 없는 것으로 나타났다.

이를 통해 보풀 추출물은 개체에 독성을 나타내지 않으며, 아토피 피부염 개선효과가 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물 처리에 의한 TSLP 발현의 변화

본 발명의 제조예 1 및 제조예 2의 보풀 추출물, 쿠세놀 F 또는 이들의 혼합물이 TSLP의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

24 웰 플레이트에 2×10⁵개의 세포를 접종하고, 플레이트의 80%까지 자라도록 배양한 다음 하이드로코르티손(hydrocortisone)이 들어있지 않은 배양액으로 교체한 후 Th2 면역유도 사이토카인(IL-4 100ng/㎖, IL-13 100ng/㎖, TNF-α 20ng/㎖ cytokine mixture 및 Flagellin 100ng/㎖)을 처리하여 TSLP의 발현을 유도하였으며, 보풀 추출물 100㎍/㎖, 쿠세놀 F 100㎍/㎖ 또는 이들의 혼합물(보풀 추출물 50㎍/㎖+쿠세놀 F 50㎍/㎖) 100㎍/㎖을 1㎖의 배지에 분주하여 24시간 동안 반응하였다.

보풀 추출물, 쿠세놀 F 또는 이들의 혼합물에 의한 TSLP 저해효과는 인간 TSLP 듀오세트 ELISA(Human TSLP DuoSet ELISA, R&D system)를 사용하였고, 포획 항체(capture antibody)를 실온에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 1%(w/v) BSA를 첨가하여 만든 희석용 시약(reagent diluent) 200㎕로 교체한 후 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 그 후 샘플(상기 24시간 동안 반응시킨 배양 배지) 또는 표본(standard) 100㎕로 교체한 후 2시간 동안 실온에서 결합시킨 다음 검출용 항체(detection antibody) 100㎕로 교체하여 2시간 동안 실온에서 결합시킨다. 그 후 발색반응 측정을 위해 스트렙타비딘-HRP(streptavidin-HRP) 100㎕를 20분 동안 처리하고, 그 후 TMB 기질 100㎕를 20분 동안 반응시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 쿠세놀 F, 보풀 추출물 각각의 TSLP 저해효과를 확인하였으며, 이들을 혼합한 혼합물은 쿠세놀 F 또는 보풀 추출물을 단독으로 처리한 군에 비해 더욱 증진된 TSLP 저해효과를 나타냈다.

또한, 도 7과 같이 본 발명에 사용된 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물은 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인함으로써 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물이 세포독성없이 TSLP 저해효과를 나타내는 것을 확인하였다.

이를 통해 본 발명의 보풀 추출물, 쿠세놀 F 및 이들의 혼합물은 세포독성을 나타내지 않고, TSLP 저해효과가 우수하며, 특히 보풀 추출물 및 쿠세놀 F 혼합물의 TSLP 저해효과가 현저하다는 것을 확인하였다.

Claims

보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물에 쿠세놀 F를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 TSLP의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물에 쿠세놀 F를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 보풀 C₁~C₄의 저급 알코올 추출물에 쿠세놀 F를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.