KR101968873B1 - Cosmetic composition comprising peptide derived from Botulinum toxin having improved cell penetrating ability - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 우수한 피부투과성 및 세포투과성을 나타내고 보툴리늄 독소의 활성이 향상된 신규한 피부투과성 융합단백질, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a novel skin permeable fusion protein exhibiting excellent skin permeability and cell permeability and having improved botulinum toxin activity, and a cosmetic composition containing the same.
구체적으로, 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄, 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역(translocation domain)을 포함하는 보툴리늄 독소 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. Specifically, the present invention relates to a cosmetic composition comprising a protein transporter, a light chain of a botulinum toxin, and a botulinum toxin fusion protein comprising a translocation domain of a heavy chain of a botulinum toxin and a transdermal absorption enhancer.
보툴리늄 독소는 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는 신경독소 단백질이며, 신경세포의 신경전달물질인 아세트콜린 및 카테콜아민의 분비를 억제하는 것으로 보고 되고 있다. 보툴리늄 독소는 A, B, C, D, E, F, G 및 H 타입의 8종류가 있으며, A 및 B 타입이 상업적으로 이용된다. The botulinum toxin is a neurotoxin protein produced by Clostridium botulinum and has been reported to inhibit the secretion of neurotransmitter acetol and catecholamines. There are eight kinds of botulinum toxin types A, B, C, D, E, F, G and H, and types A and B are commercially available.
신경전달물질의 분비를 위해서 신경전달물질을 담지하는 소포체(vesicle)의 표면에 존재하는 시냅토브레빈(synaptobrevin, Vesicle-associate membrane protein, VAMP), 시냅스 전 혈장막(pre-synaptic plasma membrane)에 존재하는 SNAP-25(synaptosomal associated protein 25), 및 신택신(Syntaxin) 3개의 단백질이 스네어(SNARE) 복합체를 형성하고, Ca2+의 자극에 의해 세포 외로 분비된다.In order to secrete neurotransmitters, synaptobrevin (Vesicle-associate membrane protein, VAMP), present on the surface of the vesicle carrying neurotransmitter, and pre-synaptic plasma membrane SNAP-25 (synaptosomal associated protein 25), and
보툴리늄 독소의 서브타입들은 스네어(SNARE) 복합체를 형성하는 VAMP-2, SNAP-25 및 Syntaxin의 특정 위치를 절단하여 스네어(SNARE) 복합체의 형성을 방해하여 신경전달물질의 분비를 억제한다(Schiavo et al. Nature 359, 832-835, 1992). Subtypes of botulinum toxin inhibit the secretion of neurotransmitters by interrupting the formation of SNARE complexes by cleaving specific positions of VAMP-2, SNAP-25 and Syntaxin that form the SNARE complex (Schiavo et < RTI ID = 0.0 > al., Nature 359, 832-835, 1992).
보툴리늄 독소 단백질의 크기는 약 150 kDa이며, N-말단(n-terminal)의 경쇄(light chain)는 Zn2+ 금속 단백질 분해 효소(metalloprotease)로서 50 kDa이며, 중쇄는 100 kDa 이며, 두 개의 단백질은 다이설파이드(disulfide) 결합으로 연결되어 있다. 또한 중쇄는 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)과 C-말단의 수용체 결합 영역(receptor-binding domain)으로 구성되어 있다. The botulinum toxin protein is approximately 150 kDa in size, the light chain in the N-terminal is 50 kDa as Zn 2 + metalloprotease, the heavy chain is 100 kDa, Are connected by a disulfide bond. The heavy chain consists of the N-terminal translocation domain and the C-terminal receptor-binding domain.
보툴리늄 독소는 신경독 단백질로 인간의 반수 치사량은 정맥주사나 근육 주사시 1.3 ∼ 2.1 ng/kg, 흡입할 경우 10 ∼ 13 ng/kg 로 독성이 매우 높은 물질이나, 적정한 양으로 조절시 신경장애, 근육 질환, 다한증, 사각턱 등을 치료하는 약물로 사용될 수 있고, 주름, 종아리 근육 축소 등 미용 용도로 가장 많이 사용되고 있다. 국내에 시판 중인 보툴리늄 독소는 보톡스(엘러간), 보톨렉스, 메디톡신, 디스포트 및 BTXA 등이 있는 것으로 보고되고 있다. The botulinum toxin is a neurotoxin protein. Human lethal dose is 1.3 ~ 2.1 ng / kg for intravenous or intramuscular injection and 10 ~ 13 ng / kg for inhalation. However, It can be used as a medicine for treating diseases, hyperhidrosis, quadriceps, etc., and is most widely used for cosmetic purposes such as wrinkles and calf muscle reduction. Domestic botulinum toxins are reported to be Botox (Allergan), Botolex, Meditoxin, Dysport and BTXA.
이러한 보툴리늄 독소는 근육 주사를 통해 체내에 투여되는 의약품으로 사용되었으며, 최근에 피부로 직접 전달하는 화장품으로 사용하기 위해 여러가지 연구 및 개발이 활발하게 이루어지고 있다.These botulinum toxins have been used as medicines administered to the body through intramuscular injections. Recently, various researches and developments have been actively carried out for use as cosmetics directly delivered to the skin.
그러나, 보툴리늄 독소는 경쇄와 중쇄를 합쳐 150 kDa으로 매우 큰 분자이기 때문에 피부를 투과하기 어렵고, 신경세포 내로의 전달은 보툴리늄 독소의 중쇄가 수용체에 결합하여 내포 작용(endocytosis)을 통해 가능하다. 최근에는 효소 활성을 갖는 경쇄만을 이용하여 단백질 전달체와 융합 단백질을 제조하여 피부 투과 및 세포내 전달을 유도하고 있다. However, because the botulinum toxin is a very large molecule with a light chain and a heavy chain at 150 kDa, it is difficult to penetrate the skin, and the transfer of the botulinum toxin into the nerve cell is possible through the endocytosis of the heavy chain of the botulinum toxin. In recent years, protein transporters and fusion proteins have been produced using only light chains having enzymatic activity to induce skin permeation and intracellular delivery.
단백질 전달체(PTD, Protein Transduction Domain)는 세포 투과 펩타이드(CPP, Cell Permeable Peptide) 또는 막-이동 시퀀스(MTS, Membrane Translocating Sequence)로 불리는 10 ∼ 16 개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드이다. 단백질 전달체는 특별한 수용체의 도움없이 자기 자신 또는 자신과 결합하는 물질들과 함께 혈장 막(plasma membrane)을 통과하여 세포 내에 축적된다. 이들은 DNA, RNA, 헤파린(heparin) 및 시알산(sialic acid)과 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질, 펩타이드, 안티센스(anti-sense) 서열, 플라스미드, 마이크로비즈(microbeads), 리포좀(liposomes) 등을 자유롭게 이동시킬 수 있다. The protein transduction domain (PTD) is a small peptide composed of 10 to 16 amino acids called a cell permeable peptide (CPP) or a membrane-translocating sequence (MTS). Protein transporters accumulate in cells through plasma membranes with substances that bind themselves or with themselves, without the aid of special receptors. They can bind to DNA, RNA, heparin and sialic acid, as well as proteins, peptides, anti-sense sequences, plasmids, microbeads, liposomes, You can move freely.
최초로 단백질 형질도입(protein transduction) 현상이 발견된 단백질은 HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1)의 Tat 단백질이다. Tat 단백질은 86 개의 아미노산으로 이루어진 HIV-1의 전사조절인자(transacting transcription factor)로서, HIV-1의 전사를 활성화(activation)시킬 뿐만이 아니라 만성적으로 감염된 세포 내에서 바이러스 복제 유도에도 영향을 미친다. 또한 휴지기 상태에 있는 감염 세포의 재활성화를 유도한다고 알려져 있다. The protein with the first protein transduction phenomenon is the Tat protein of HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus type 1). The Tat protein is a transacting transcription factor of HIV-1 consisting of 86 amino acids that not only activates transcription of HIV-1 but also affects the induction of viral replication in chronically infected cells. It is also known to induce reactivation of infected cells in the resting state.
그 외에 HSV-1(Herpes Simplex Virus type 1)의 envelope protein과 캡시드(capsid) 사이에 존재하는 외피 단백질(tegument protein)인 VP22, 및 초파리의 발달과정 및 신경 형성에 관여하는 전사인자(transcription factor)로서 호메오단백질(homeoprotein)의 일종인 안테나페디아 단백질(antennapedia protein)과 같은 다양한 종의 단백질 형질도입(protein transduction)을 유도하는 서열들이 보고되었다. In addition, VP22, a skin protein existing between the envelope protein and capsid of HSV-1 (Herpes Simplex Virus type 1), and the transcription factor involved in the development of the fruit fly and neuron formation, Have been reported to induce protein transduction of various species such as the antennapedia protein, which is a type of homeoprotein.
인간의 단백질 전달체는 Hox-A5와 같은 호메오단백질에서 발견되었고, 세포내 유입을 유도하는데 매우 중요한 역할을 한다. 그 외에도 최근에는 합성을 통해 세포 막을 통과하는 성질을 갖는 단백질 전달체가 개발되고 있다. The human protein transporter has been found in home proteins such as Hox-A5 and plays an important role in inducing intracellular entry. Recently, a protein transporter having a property of passing through a cell membrane through synthesis has been developed.
단백질 전달체에 의한 세포내 전달은 내포 작용(endocytosis)과 같은 기존의 단백질 전달과는 전혀 다른 메커니즘으로 작용한다. 염기성 아미노산인 아르기닌을 많이 포함하는 양전하 단백질 전달체의 경우에는 대음세포작용(macropinocytosis)으로 세포 내로 전달되며, 소수성 단백질 전달체의 경우에는 인지질과 결합하여 뒤집힌 미셀(inverted micelle)을 형성하여 세포 내로 전달되는 것으로 알려져 있다. Intracellular delivery by the protein transporter is a completely different mechanism than conventional protein delivery, such as endocytosis. In the case of a positively charged protein transporter containing a basic amino acid arginine, it is transferred into the cell by macropinocytosis. In the case of the hydrophobic protein transporter, the inverted micelle is formed by binding with the phospholipid, It is known.
최근 단백질 전달체와 보툴리늄 독소의 경쇄로 이루어진 융합단백질을 화장품으로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 융합단백질을 피부에 적용할 경우 우수한 피부투과 및 세포투과성을 갖는지에 대한 문제 뿐만 아니라, 세포 내에서 우수한 보툴리늄 독소의 효과를 나타내는지 여부에 대해서도 충분한 검증이 이루어지지 않고 있다.Recently, an attempt has been made to use a fusion protein composed of a protein carrier and a light chain of a botulinum toxin as a cosmetic product. However, when such a fusion protein is applied to skin, not only a problem of having excellent skin permeability and cell permeability but also a sufficient effect of a botulinum toxin in a cell is not sufficiently verified.
본 발명자는 피부에 직접 적용할 경우에도 세포 내에서 보툴리늄 독소의 활성을 향상시키기 위하여, 보툴리늄 독소의 중쇄 중 세포질에서 타겟 단백질의 전좌(translocation)에 중요한 역할을 하는 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)을 보툴리늄 독소의 경쇄에 융합하여, 본 발명을 완성하였다.In order to improve the activity of the botulinum toxin in the cell even when applied directly to the skin, the inventors of the present invention have found that the translocation domain of the N-terminal, which plays an important role in the translocation of the target protein in the cytoplasm of the heavy chain of the botulinum toxin ) Was fused to the light chain of the botulinum toxin to complete the present invention.
또한, 본 발명자는 상기 융합단백질의 피부 투과성 및 세포투과성을 향상시키기 위하여, 상기 융합단백질에 가장 적합한 단백질 전달체를 확인하여 융합하였다.In order to improve the skin permeability and cell permeability of the fusion protein, the present inventors identified and fused the protein carrier most suitable for the fusion protein.
즉, 본 발명은 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄, 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.That is, the present invention relates to a fusion protein comprising a protein transporter, a light chain of a botulinum toxin, and a translocation domain at the N-terminal of the heavy chain of the botulinum toxin.
또한, 본 발명은 상기 보툴리늄 독소 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition comprising the botulinum toxin fusion protein as an active ingredient.
구체적으로 본 발명은 경피를 통한 전달이 가능하고, 보툴리늄 독소의 우수한 활성을 나타내며, 피부 자극을 나타내지 않는 보툴리늄 독소 융합단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 융합단백질의 세포 침투를 향상시키는 경피흡수촉진제를 추가로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. Specifically, the present invention provides a transdermal absorption enhancer which comprises a botulinum toxin fusion protein capable of transdermal delivery, exhibiting excellent activity of a botulinum toxin, exhibiting no skin irritation, as an active ingredient, and enhancing cell penetration of the fusion protein Which further comprises a cosmetic composition.
또한, 본 발명은 보툴리늄 독소 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 피부 주름의 개선 또는 예방 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a cosmetic composition having an effect of improving or preventing skin wrinkles comprising a botulinum toxin fusion protein and a transdermal absorption promoter.
본 발명은 단백질 전달체들 중에서 양이온 전달체와 소수성 단백질 전달체를 포함한 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체를 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드의 운반체로 이용한다.The present invention utilizes a protein transporter consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10 as a carrier of a light chain peptide of a botulinum toxin, which comprises a cation transporter and a hydrophobic protein transporter.
본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체와 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.The present invention relates to a fusion protein comprising a protein carrier consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10 and a light chain peptide of a botulinum toxin.
본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공한다.The present invention provides a fusion protein comprising a protein carrier comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10, a light chain peptide of a botulinum toxin, and a translocation domain peptide of a botulinum toxin heavy chain.
구체적으로 상기 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. Specifically, the botulinum toxin light chain peptide may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
구체적으로 상기 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. Specifically, the translocation domain peptide of the botulinum toxin heavy chain may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
구체적으로 상기 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드의 순으로 이루어진 융합단백질에 있어서, 상기 단백질 전달체와 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드 사이 및/또는 상기 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드 사이에 링커를 포함할 수 있다. Specifically, a fusion protein consisting of the protein transporter, the light chain peptide of the botulinum toxin, and the translocation domain peptide of the botulinum toxin heavy chain, wherein the protein carrier and the botulinum toxin light chain peptide and / or the botulinum toxin light chain peptide and the botulinum toxin heavy chain Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI >
구체적으로 상기 링커는 (G)N으로 표시되고, 이때 N이 1 내지 20의 정수이고, G는 글라이신인 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 링커는 GGGGG일 수 있다.Specifically, the linker may be composed of (G) N , wherein N is an integer of 1 to 20, and G is an amino acid sequence of glycine. Preferably, the linker may be GGGGG.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention also provides a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a protein transporter consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10, a light chain peptide of a botulinum toxin, and a translocation domain peptide of a heavy chain of a botulinum toxin.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. The present invention also provides a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.The present invention also provides a bacterium transformed with said recombinant expression vector.
상기 단백질 전달체의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어질 수 있다.The polynucleotide of the protein transporter may be any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 11 to 20.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition comprising a protein carrier comprising an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10, a light chain peptide of a botulinum toxin, and a fusion protein comprising a heavy chain translocation domain peptide of a botulinum toxin.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.Specifically, the present invention relates to a cosmetic composition comprising a protein carrier consisting of an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 10, a light chain peptide of a botulinum toxin, and a fusion protein comprising a translocation domain peptide of a heavy chain of a botulinum toxin and a transdermal absorption enhancer .
상기 "경피흡수촉진제"는 유화제 중에서 피부투과에 영향을 주는 성분들로 통상적으로 경피패취제에 사용되는 성분이다. 본 발명에서는 융합단백질의 피부투과 및 세포침투를 증대시키는 역할을 하는 것으로, 레시틴(Lecithin), 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 글리세롤 모노올리에이트(Glycerol Monooleate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol Monolaurate), 프로필렌 글리콜 모노라우레이트(Propylene Glycol Monolaurate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노올리에이트(Sorbitan Monooleate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The " transdermal absorption enhancer " is an ingredient that affects skin permeation among emulsifiers and is usually used in transdermal patches. In the present invention, the fusion protein has a role of enhancing the penetration of the skin and penetration of cells. Examples of the protein include lecithin, lauryl pyrrolidone, glycerol monooleate, glycerol monolaurate ), Propylene glycol monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), polyoxyethylene sorbitan monolaurate But are not limited to, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, sorbitan monooleate, sorbitan monostearate, sorbitan monolaurate, and the like.
본 발명의 경피흡수촉진제는 바람직하게 레시틴, 라우릴 피롤리돈, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 또는 소르비탄 모노스테아레이트일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 레시틴일 수 있다.The transdermal absorption enhancer of the present invention may preferably be lecithin, lauryl pyrrolidone, polyoxyethylene sorbitan monooleate or sorbitan monostearate, more preferably lecithin.
또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드(Medium Chain Glyceride)를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a cosmetic composition comprising the fusion protein, transdermal absorption promoter and medium chain glyceride of the present invention.
상기 융합단백질, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드는 화장료 조성물에서 미셀(micelle)을 형성할 수 있다. 미셀(micelle)이란 계면활성제가 일정농도 이상일 때 집합체로 형성된 미립구 형태를 갖는다. 본 발명에서는 유효성분과 계면활성제만으로 미셀을 형성하기 어려워, 중쇄 글리세라이드와 같은 오일 성분을 추가하여 미셀이 형성되도록 하는 것이 바람직하다. The fusion proteins, transdermal absorption enhancers and heavy chain glycerides may form micelles in cosmetic compositions. Micelle is a microparticle formed as aggregate when surfactant is above a certain concentration. In the present invention, it is difficult to form micelles only with an active ingredient and a surfactant, and it is preferable to add an oil component such as an heavy chain glyceride to form micelles.
통상적으로 경피흡수촉진제는 각질의 인지질층에 유동성을 부여하여 비교적 작은 분자량(500Da이하)의 화합물들을 투과시키도록 도와주지만, 본 발명의 융합단백질의 분자량이 100kDa 이상으로 매우 크기 때문에 각질의 유동화만으로는 융합단백질의 피부투과 및 세포침투가 어려워 미셀을 형성함으로써, 미셀 형태로 세포내 이입(endocytosis)되어 피부투과 및 세포침투가 증대될 수 있다.Usually, the transdermal absorption enhancer imparts fluidity to the horny phospholipid layer to help to transmit relatively small molecular weight (less than 500 Da) compounds. However, since the molecular weight of the fusion protein of the present invention is as high as 100 kDa or more, Skin permeation of proteins and penetration of cells are difficult to form micelles, so that they can be intracellularly transferred into micelles, thereby increasing skin permeation and cell penetration.
본 발명의 중쇄 글리세라이드는 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The heavy chain glyceride of the present invention can be, but is not limited to, caprylic / capric triglyceride.
본 발명에서 경피흡수촉진제로 작용하는 레시틴은 조성물 총 중량에 대하여 0.5 중량% 이상에서 피부투과도가 급격히 상승하고, 이는 미셀을 형성하는 임계농도(CMC; Critical Micelle Concentration)에 해당한다.In the present invention, lecithin acting as a transdermal absorption enhancer rapidly increases the skin permeability at a concentration of 0.5% by weight or more based on the total weight of the composition, which corresponds to a critical micelle concentration (CMC) forming micelles.
또한, 본 발명의 조성물은 융합단백질을 안정화시키는 당알코올을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 당알코올은 만니톨, 에리스리톨, 자일리톨, 소르비톨 등일 수 있으며, 바람직하게는 만니톨일 수 있다.In addition, the composition of the present invention may further comprise sugar alcohol to stabilize the fusion protein, and the sugar alcohol may be mannitol, erythritol, xylitol, sorbitol, etc., and preferably mannitol.
본 발명의 조성물은 피부 주름의 개선 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.The composition of the present invention relates to a cosmetic composition for improving or preventing skin wrinkles.
본 발명에서 "피부투과성"이란, 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 융합단백질과 이를 포함하는 조성물은 통상의 보툴리늄 독소와 비교하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.The term " skin permeability " in the present invention means the ability or property to permeate through the skin to penetrate into the skin, and the fusion protein of the present invention and the composition containing the same have significantly superior skin permeability compared to the conventional botulinum toxin. .
본 발명에서 "융합단백질"이란, 상기 피부투과성 펩타이드(단백질 전달체)가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질이다. 본 발명에 따른 융합단백질의 구성을 도 1에 나타내었다. In the present invention, "fusion protein" is a protein artificially synthesized so that the skin permeable peptide (protein transporter) binds to another protein or peptide. The structure of the fusion protein according to the present invention is shown in Fig.
본 발명의 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.The fusion protein of the present invention or the polypeptide constituting the fusion protein may be produced by a chemical peptide synthesis method known in the art, or may be prepared by amplifying the gene encoding the fusion protein by PCR (polymerase chain reaction) Followed by expression and cloning into an expression vector.
본 발명에서 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.As used herein, the term "expression vector" refers to a recombinant vector capable of expressing a target peptide in a desired host cell, and a gene construct containing an essential regulatory element operatively linked to the expression of the gene insert. The expression vector includes expression control elements such as an initiation codon, a termination codon, a promoter, an operator, etc. The initiation codon and the termination codon are generally regarded as part of the nucleotide sequence encoding the polypeptide, and when the gene product is administered, And must be in coding sequence and in frame. The promoter of the vector may be constitutive or inducible.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 본 발명의 피부투과성 펩타이드(단백질 전달체)와 보툴리늄 독소의 경쇄 및 중쇄의 N-말단을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 피부투과성 펩타이드와 보툴리늄 독소의 경쇄 및 중쇄의 N-말단을 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. In the present invention, the expression vector may include a nucleotide sequence encoding a skin permeable peptide (protein transporter) of the present invention and a fusion protein comprising the light chain of the botulinum toxin and the N-terminus of the heavy chain. Is not particularly limited as long as it is capable of producing a fusion protein comprising the light-permeable peptide of the present invention and the N-terminal of the light chain and the heavy chain of the botulinum toxin.
본 발명의 "H6Ub 단백질"은 히스티딘 단백질 6개(H6)가 유비퀴틴(Ubiquitin) 단백질에 결합된 단백질이다. 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질이다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제(Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다. The "H6Ub protein" of the present invention is a protein in which six histidine proteins (H6) are bound to a Ubiquitin protein. Ubiquitin is a protein known as an expression derivative that helps expression of a target protein. Ubiquitin is cleaved and removed by Ubiquitin Specific Protease (USP) during the purification process.
본 발명의 "링커"는 융합 단백질 내에서 도메인과 도메인 사이에 물리 화학적 거리를 두거나, 혹은 연결을 위하여 사용되는 펩타이드이다. 본 발명의 융합 단백질은 피부투과성 펩타이드와 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드 사이 및/또는 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리늄 독소 중쇄의 N-말단 펩타이드 사이에 링커를 포함할 수 있다.The " linker " of the present invention is a peptide used for physicochemical distances or binding between domains and domains in a fusion protein. The fusion protein of the present invention may comprise a linker between the skin permeable peptide and the botulinum toxin light chain peptide and / or between the botulinum toxin light chain peptide and the N-terminal peptide of the botulinum toxin heavy chain.
본 발명의 융합단백질, 및 이를 포함하는 조성물은 피부투과성 및 세포투과성을 향상시키고, 보툴리늄 독소의 활성을 개선한 장점을 갖는다.The fusion proteins of the present invention and compositions comprising them have the advantage of improving skin permeability and cell permeability and improving the activity of botulinum toxin.
도 1은 본 발명에 따른 융합단백질의 도메인 구성을 나타낸다.
도 2는 융합단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 pATP 벡터를 제한 효소로 처리한 결과를 나타낸다.
도 3은 E. coli 균주에서 융합단백질을 발현시킨 결과를 나타낸다.
도 4는 보툴리늄 독소 융합단백질의 펩타이드를 정제한 결과를 나타낸다.
도 5는 융합단백질에 따른 세포내 보툴리늄 독소의 전달 실험결과를 나타낸다.
도 6은 피부 투과성 분석에 사용되는 프란츠 확산 셀(Franz Diffusion Cell)의 모식도이다.
도 7은 융합단백질에 따른 피부 투과 분석 실험결과를 나타낸다.
도 8은 복합근 활동전위 시험에서 좌골신경을 2 Hz 로 50회 자극하여 기록된 복합근 활동전위의 평균을 나타낸다.
도 9는 융합단백질 주사 후 시간에 따른 복합근 활동전위 측정결과를 나타낸다. Figure 1 shows the domain structure of the fusion protein according to the present invention.
Fig. 2 shows the results of treatment of a pATP vector into which a DNA encoding a fusion protein is inserted, with a restriction enzyme.
Fig. 3 shows the result of expressing a fusion protein in an E. coli strain.
Fig. 4 shows the result of purifying the peptide of the botulinum toxin fusion protein.
FIG. 5 shows experimental results of transfer of botulinum toxin to the fusion protein.
Figure 6 is a schematic diagram of a Franz Diffusion Cell used for skin permeability analysis.
FIG. 7 shows the result of skin permeation assay according to the fusion protein.
Figure 8 shows the average of the composite muscle activity potentials recorded by stimulation of the sciatic nerve at 50 Hz at 2 Hz in the complex muscle activity potential test.
FIG. 9 shows the result of measuring the complex muscle activity potential with time after injection of the fusion protein.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
[실시예 1 내지 3][Examples 1 to 3]
융합 단백질의 발현 및 정제Expression and purification of fusion proteins
(1) 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC); (2) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG) 및 보툴리늄 독소의 경쇄(LC)의 순으로 이루어진 아미노산 (S+LC 융합단백질); 및 (3) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG), LC, 링커(GGGGG) 및 보툴리튬 독소의 중쇄의 전좌 영역의 순으로 이루어진 아미노산(S+LC+HC 융합단백질)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하였다(도 1). (1) the light chain (LC) of the botulinum toxin; (2) an amino acid (S + LC fusion protein) consisting of a protein carrier represented by SEQ ID NO: 2, a linker (GGGGG) and a light chain (LC) of a botulinum toxin; And (3) an amino acid (S + LC + HC fusion protein) in the order of the protein transducer, the linker (GGGGG), the LC, the linker (GGGGG) and the translocation domain of the heavy chain of the botulism toxin, (Fig. 1). ≪ tb > < TABLE >
합성된 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터인 pAPT에 삽입하여, 3 종의 융합단백질에 대한 발현 벡터를 제조하였다. 발현을 유도하기 위한 융합파트너로 H6Ub 단백질을 사용하였다. The synthesized polynucleotide was inserted into the expression vector pAPT to prepare expression vectors for the three fusion proteins. H6Ub protein was used as a fusion partner to induce expression.
상기 융합단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질전환시킨 BL21(DE3) starpLysS E. coli 균주 (Invitrogen, NY, USA) 를 카나마이신 (50 mg/L)을 포함하는 37℃의 LB (Luria-Bertani) 배지에서 600 nm 에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 융합단백질의 발현결과를 도 2에 나타내었다.BL21 (DE3) starpLysS E. coli strain (Invitrogen, NY, USA) transformed with the plasmid encoding the fusion protein was cultured in LB (Luria-Bertani) medium containing kanamycin (50 mg / nm until absorbance at 0.6 was obtained. The expression results of the fusion protein are shown in Fig.
0.1M 의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 로 단백질 발현을 유도하고 세포를 16시간 동안 추가적으로 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 라이시스 완충액 (50 mM NaH2PO4, 100 mM NaCl, 5mM 이미다졸, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, pH 8.0)에 재 현탁시키고, 초음파로 분쇄하였다. 그 다음 13,000 rpm, 4℃ 에서 15분간 원심분리하고, 상층액을 SDS-PAGE 를 통해 융합단백질의 발현율과 수용성 정도를 확인하였다. 제한효소 처리결과를 도 3에 나타내었다.Protein expression was induced with 0.1 M IPTG (isopropyl- beta -D-thiogalactopyranoside) and cells were further cultured for 16 hours. Collect cells by centrifugation, resuspended in buffer and
융합단백질의 정제는 상층액을 IMAC 6FF (GE Healthcare Life Sciences) 및 Q FF (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 정제한 후, Sephadex G-25 (GE Healthcare Life Science)를 이용하여 안정화 완충액으로 완충액을 교체하였다. Purification of the fusion protein was carried out by purifying the supernatant using IMAC 6FF (GE Healthcare Life Sciences) and Q FF (GE Healthcare Life Sciences), and then using a Sephadex G-25 (GE Healthcare Life Science) Respectively.
융합 단백질의 정제는 상층액을 HisPrep FF(GE Healthcare Life Sciences) 및 HighTrep Desalting(GE Healthcare Life Science)을 이용하여 정제하였다. 정제된 융합단백질을 도 4에 나타내었다.Purification of the fusion protein was carried out by purifying the supernatant using HisPrep FF (GE Healthcare Life Sciences) and HighTrep Desalting (GE Healthcare Life Science). The purified fusion protein is shown in Fig.
상기 (1) 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC); (2) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG) 및 보툴리늄 독소의 경쇄(LC)의 순으로 이루어진 아미노산 (S+LC 융합단백질); 및 (3) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG), LC, 링커(GGGGG) 및 보툴리튬 독소의 중쇄의 전좌 영역의 순으로 이루어진 아미노산(S+LC+HC 융합단백질)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 폴리펩타이드를 실시예 1 내지 3으로 하였다.(1) the light chain (LC) of the botulinum toxin; (2) an amino acid (S + LC fusion protein) consisting of a protein carrier represented by SEQ ID NO: 2, a linker (GGGGG) and a light chain (LC) of a botulinum toxin; And (3) an amino acid (S + LC + HC fusion protein) in the order of the protein transducer, the linker (GGGGG), the LC, the linker (GGGGG) and the translocation domain of the heavy chain of the botulism toxin, . The polypeptides synthesized from the polynucleotides of Examples 1 to 3 were as follows.
[제조예 1 내지 12][Production Examples 1 to 12]
보툴리늄 유래 융합단백질을 포함하는 조성물Composition comprising a botulinum-derived fusion protein
실시예 3의 융합단백질과 경피흡수촉진제를 포함하는 조성물을 하기의 방법으로 제조하였다.A composition comprising the fusion protein of Example 3 and a transdermal absorption enhancer was prepared by the following method.
세테아릴알코올 및 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 혼합한 용액과 글리세린, 만니톨, 아르기닌, 페녹시에탄올 및 정제수를 혼합한 용액을 70℃에서 각각 용해한 후, 혼합하여 호모믹서에서 3000rpm으로 5분 동안 유화하였다. 이후, 융합단백질 및 카르복시폴리머 용액을 첨가하여 5분간 혼합하여 제조예 1을 제조하였다A mixture of glycerin, mannitol, arginine, phenoxyethanol and purified water was dissolved at 70 ° C, and the mixture was mixed and homogenized in a homomixer at 3000 rpm for 5 minutes Lt; / RTI > Then, the fusion protein and the carboxy polymer solution were added and mixed for 5 minutes to prepare Preparative Example 1
또한, 세테아릴알코올, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 및 레시틴을 혼합한 용액과 글리세린, 만니톨, 아르기닌, 페녹시에탄올 및 정제수를 혼합한 용액을 70℃에서 각각 용해한 후, 혼합하여 호모믹서에서 3000rpm으로 5분 동안 유화하였다. 이후, 융합단백질 및 카르복시폴리머 용액을 첨가하여 5분간 혼합하여 제조예 2를 제조하였다. Further, a solution prepared by mixing a mixture of cetearyl alcohol, caprylic / capric triglyceride and lecithin, glycerin, mannitol, arginine, phenoxyethanol and purified water was dissolved at 70 ° C, And emulsified at 3000 rpm for 5 minutes. Then, the fusion protein and the carboxy polymer solution were added and mixed for 5 minutes to prepare Preparative Example 2.
제조예 1 및 2의 성분 및 함량은 하기 표 1과 같다. The components and contents of Production Examples 1 and 2 are shown in Table 1 below.
또한, 제조예 2의 경피흡수촉진제인 레시틴(Lecithin) 대신, 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 글리세롤 모노올리에이트(Glycerol Monooleate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol Monolaurate), 프로필렌 글리콜 모노라우레이트(Propylene Glycol Monolaurate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노올리에이트(Sorbitan Monooleate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate)를 첨가하여, 제조예 3-12를 제조하였다.In place of lecithin, which is a transdermal absorption enhancer of Production Example 2, lauryl pyrrolidone, glycerol monooleate, glycerol monolaurate, propylene glycol monolaurate ( Propylene glycol monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, sorbitan monooleate, Preparation Examples 3-12 were prepared by adding Sorbitan Monooleate, Sorbitan Monostearate, and Sorbitan Monolaurate.
[시험예 1][Test Example 1]
융합단백질의 세포내 전달 효과Intracellular delivery effect of fusion protein
세포내 보툴리늄 독소의 효과를 분석하기 위해, 상기 실시예 1 내지 3의 폴리펩타이드에 대하여 각각 형광물질인 FITC(Sigma, Fluorescein-5-isothiocyanate, 27072-45-3)를 레이블링하여 FACs(FACSCalibur, Becton Dickinson)으로 분석하였다. PC 12 세포(Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721)에 반응시간은 1시간으로 동일하게 반응시켰다. To analyze the effect of the intracellular botulinum toxin, FITC (Sigma, Fluorescein-5-isothiocyanate, 27072-45-3), which is a fluorescent substance, was labeled on the polypeptides of Examples 1 to 3 and labeled with FACs (FACSCalibur, Becton Dickinson). PC 12 cells (Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721) were reacted at the same reaction time for 1 hour.
상기 실험결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2 및 3은 높은 세포내 전달효과를 나타내었으며, 실시예 3이 실시예 2 보다 더 우수한 세포내 전달 효과를 나타내는 것을 확인하였다.The results of the experiment are shown in Fig. As shown in FIG. 5, Examples 2 and 3 showed high intracellular delivery effect, and Example 3 showed better intracellular delivery effect than Example 2.
[시험예 2][Test Example 2]
프란츠 확산 셀(Franz Diffusion cell)을 이용한 피부 투과 효과Skin permeation effect using Franz Diffusion cell
피부투과도의 분석을 위해 가장 많이 사용되고 있는 프란츠 확산 셀(Franz Diffusing Cell)을 이용하여 Flux를 분석하였다(도 6).Flux was analyzed using the Franz Diffusing Cell, which is the most widely used for the analysis of skin permeability (Fig. 6).
시험에 사용되는 피부로는 기니피그(Hartley Guinea Pig)를 사용하였다. 항온수조를 이용하여 32℃를 유지하고, receptor의 medium은 PBS이고, 600 rpm 으로 하였다. 10시간 동안 2시간 간격으로 샘플링(sampling)을 진행하여 피부투과속도(Flux)를 계산하였다. Guinea pig (Hartley Guinea Pig) was used for the test. The temperature was maintained at 32 ° C using a constant-temperature water bath, and the medium of the receptor was PBS at 600 rpm. The skin permeation rate (Flux) was calculated by sampling at intervals of 2 hours for 10 hours.
실시예 1 및 3의 폴리펩타이드에 Cy5 Fast conjugation kit(ab188288)를 이용하여 Cy-5를 접합하여 사용하였고, Waters 2475 Fluorescence Detector(excitation 630nm, emission 660nm)를 이용하여 분석하였다. Cy-5 was conjugated to the polypeptides of Examples 1 and 3 using the Cy5 Fast conjugation kit (ab188288), and analyzed using a Waters 2475 Fluorescence Detector (excitation 630 nm, emission 660 nm).
단백질 전달체에 따른 프란츠 확산 셀(Franz Diffusion Cell)에서의 피부 투과 분석 결과를 도 7에 나타내었다.The results of the skin permeation analysis in the Franz Diffusion Cell according to the protein carrier are shown in FIG.
도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 3의 피부투과를 분석한 결과, 실시예 3의 융합단백질의 피부투과성이 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄만 있는 경우보다 초기에 2-3배 이상 현저히 우수한 것을 확인하였다.As shown in Fig. 7, the skin permeation of Examples 1 and 3 was analyzed. As a result, it was found that the skin permeability of the fusion protein of Example 3 was significantly higher than that of the botulinum toxin of Example 1 Excellent.
[시험예 3][Test Example 3]
카테콜아민 분비억제능 분석Catecholamine secretion inhibition assay
카테콜아민은 교감신경자극전달물질로 부신수질-교감신경계 기능을 고찰하는 중요한 지표이다. 보툴리늄 독소는 신경세포의 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육을 마비시키기 때문에, 신경전달물질 분비 억제 기능을 확인하고자 카테콜아민 한 종류인 도파민 및 노르에피네프린 분비 억제 효과를 분석하였다. Catecholamines are an important indicator of sympathetic nervous system functioning as a sympathetic nerve stimulator. Because botulinum toxin paralyzes muscles by inhibiting the secretion of neurotransmitters from neurons, we examined the inhibitory effects of dopamine and norepinephrine on the secretion of catecholamines.
PC 12 세포(Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721)를 2 mM L-글루타민, 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 10% FBS를 넣은 F-12K 배지(Gibco) 15 ml에서 배양하였다. 2일 동안 세포 배양 플라스크인 T75(Nunc)에서 세포 밀도가 625,000 세포/㎠ 이 되도록 배양하였다. PC 12 cells (Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721) were cultured in 15 ml of F-12K medium (Gibco) containing 2 mM L-glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate and 10% FBS. And cultured for 2 days in a cell culture flask T75 (Nunc) to a cell density of 625,000 cells / cm2.
이후 배양한 세포를 원심분리하여 상등액을 제거하고 동일 부피의 F-12K 배지와 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 각각 첨가하여 하루 동안 배양하였다. 이를 10uM 농도의 Ca2+으로 자극하여 분비되는 도파민 및 노르에피네프린의 양을 액체크로마토그래피-질량분석법(LC/Mass)을 통해 분석하였다.Then, the cultured cells were centrifuged to remove the supernatant, and the same volume of F-12K medium and the fusion proteins of Examples 1 to 3 were added, respectively, and cultured for one day. The amount of dopamine and norepinephrine secreted by stimulation with Ca 2+ at a concentration of 10 uM was analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC / Mass).
실시예 1 내지 3의 융합단백질은 10-5 M 및 10-6 M의 농도로 처리하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.The fusion proteins of Examples 1 to 3 were treated at a concentration of 10 -5 M and 10 -6 M, and the results are shown in Table 2 below.
표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄는 양성 대조군과 비교하여 신경전달물질 분비량에 차이가 없었고, 카테콜아민의 분비의 억제 효과가 없는 것을 확인하였다. As shown in Table 2, the light chain of the botulinum toxin of Example 1 had no difference in secretion amount of neurotransmitter compared to the positive control, and it was confirmed that there was no inhibitory effect on catecholamine secretion.
실시예 2 및 3의 융합단백질은 신경전달물질의 분비를 억제하는 효과를 나타내었으며, 실시예 3은 실시예 2 보다 더 우수한 억제 효과를 나타내었다.The fusion proteins of Examples 2 and 3 showed the effect of suppressing the secretion of neurotransmitters, and Example 3 showed more excellent inhibitory effect than that of Example 2.
[시험예 4][Test Example 4]
복합근 활동전위 시험Complex muscle activity potential test
보툴리늄 독소는 신경세포의 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육을 마비시키기 때문에 보툴리늄 독소의 성능을 확인하기 위해서는 신경을 전기자극하여 해당 근육의 복합근 활동전위(compound muscle action potentials, CMAP)를 기록하여 평가하는 것이 일반적인 성능 평가시험이다. In order to confirm the performance of the botulinum toxin, electrical stimulation of the nerve should be performed to record the compound muscle action potentials (CMAP) of the muscle in question, because the botulinum toxin paralyzes the muscles by inhibiting the secretion of neurotransmitters Evaluation is a general performance evaluation test.
상기 실시예 1 내지 3의 융합단백질에 대한 복합근활동전위를 다음과 같이 분석하였다.The complex muscle activity potentials of the fusion proteins of Examples 1 to 3 were analyzed as follows.
랫트(rat)를 마취한 후, 복와위(업드린 자세)로 두고 뒷다리의 고관절, 슬관절, 발목관절이 90°가 되게 구부려 고정하고, 전경골근에 BOTOX Cosmetics (onabotulinum toxin A, Allergan), 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 주사하였다.After rats were anesthetized, they were placed in a prone position (upright posture), and the hip, knee, and ankle joints were bent and fixed to 90 °. BOTOX cosmetics (onabotulinum toxin A, Allergan) 1 to 3 fusion proteins were injected.
BOTOX Cosmetics의 주사방법은 제조사가 제시하는 100 unit을 2.5 mL의 0.9% 생리식염수에 녹여 5uL를 1회 주사하는 방법을 사용하였다. 또한, 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 각 100 ng/5uL의 농도로 1회 주사하여 비교하였다. The injection method of BOTOX Cosmetics was performed by dissolving 100 units of the manufacturer in 2.5 mL of 0.9% physiological saline and injecting 5 uL once. In addition, the fusion proteins of Examples 1 to 3 were each injected at a concentration of 100 ng / 5 uL and compared.
0.2 Unit의 BOTOX Cosmetics을 주사한 경우, 3주 경과까지 완벽하게 근육이 마비되었며, 이를 비교예로 하였다.When 0.2 unit of BOTOX Cosmetics was injected, muscle was paralyzed completely by 3 weeks, and this was compared.
좌골신경(sciatic nerve)을 전기 자극하여 전경골근에서 복합근 활동전위의 진폭을 측정하였다. 좌골신경을 2 Hz 로 50회 자극하여 기록된 복합근 활동전위의 평균을 도 8에 나타내었다. Electrical stimulation of the sciatic nerve was used to measure the amplitude of the complex muscle activity potential in the tibialis anterior. Fig. 8 shows the mean of the complex muscle activity potentials recorded by stimulating the sciatic nerve 50 times at 2 Hz.
최대 진폭을 야기하는 자극크기의 150% 내외의 자극을 2 Hz, 20 Hz 로 50 회 반복 자극하여 반복 복합근 활동전위를 유발하였고, 주사 후 각각 1주, 2주, 3주, 4주에 복합근 활동전위의 진폭을 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. Stimulation of 150% of the stimulus size causing the maximum amplitude was repeated 50 times at 2 Hz and 20 Hz to induce repeated complex muscle activity potentials. After 1, 2, 3, and 4 weeks of injection, The results of measuring the amplitude of the muscle activity potential are shown in Fig.
도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC)의 경우, 세포 내로의 전달이 전혀 이루어지지 않아 근육 마비의 효과가 나타나지 않았다. 반면, 실시예 2 및 3의 융합단백질의 경우 각각 근육 마비효과가 점차 증가하였으며, 실시예 3의 융합단백질은 실시예 2의 융합단백질보다 더 우수한 근육마비 효과를 나타내었으며, 1주에는 비교예와 거의 동일한 근육마비 효과를 나타내었다.As shown in Fig. 9, in the case of the light chain (LC) of the botulinum toxin of Example 1, no effect was given to the cells and no effect of muscle paralysis was observed. On the other hand, the fusion proteins of Examples 2 and 3 gradually increased the muscle paralysis effect. The fusion protein of Example 3 showed more excellent muscle paralysis than the fusion protein of Example 2, And showed almost the same muscle paralysis effect.
[시험예 5][Test Example 5]
피부자극실험Skin irritation experiment
실시예 3의 융합단백질에 대해 피부 자극시험을 실시하였다. A skin irritation test was conducted on the fusion protein of Example 3.
실험동물은 뉴질랜드 백색 계통의 토끼 수컷 3마리를 이용하였다. 시험물질 적용 24시간 전에 전기 제모기를 이용하여 토끼의 배부 피부에 상처가 나지 않도록 제모된 건강한 피부를 만들었다. 제모된 피부는 좌우로 나누어 좌를 적용구획, 우를 대조구획으로 하였다. Three male New Zealand white rabbits were used as experimental animals. 24 hours before application of the test substance, an electric epilator was used to make a healthy skin that was epilated so as not to injure the skin of the rabbit. The epilated skin was divided into left and right, and the left was applied to the compartment and the right was made to the contrast compartment.
적용방법으로는 2.5 cm X 2.5 cm 의 적용구획 피부 위에 0.5ml(1mg/ml의 농도)의 시험물질을 적용한 후, 거즈를 덮어 시험물질과 피부가 잘 접촉할 수 있도록 하였다. 대조구획에는 거즈만 덮어 주었다. 거즈 위에는 시험물질의 증발을 막기 위해 침투성이 없고 자극성이 낮은 테이프를 감아 주었다. As a method of application, 0.5 ml (concentration of 1 mg / ml) of the test substance was applied onto the skin of application area of 2.5 cm × 2.5 cm, and the gauze was covered so that the test substance and the skin were in good contact with each other. The control compartment covered only gauze. On the gauze, a non-permeable, non-irritating tape was wrapped around to prevent evaporation of the test material.
시험물질의 적용은 1회 적용하여 24시간 경과 후 제거하고, 시험물질이 잔류하지 않도록 생리식염수로 가볍게 씻어내었다. 시험물질 적용 후, 24시간, 48시간, 72시간째에 도포 국소 부위의 홍반, 부종, 출혈, 가피 형성 등의 변화를 육안적으로 관찰하였다. 하기 표 3 및 표 4에 피부반응 평가 기준을 나타내었다.The application of the test substance was applied once after 24 hours, and was gently rinsed with physiological saline so that the test substance did not remain. Changes in erythema, edema, hemorrhage, scar formation and the like at the applied local sites were visually observed at 24 hours, 48 hours, and 72 hours after application of the test substance. Table 3 and Table 4 show skin reaction evaluation criteria.
피부 반응을 채점한 것을 이용하여 24 시간, 72 시간 때의 홍반 평점과 부종 평점을 더해서 평균치를 산출하였고 이 수치로 피부 자극성을 평가하였다. 피부 자극성의 비교에는 1차 피부자극 지수 값을 이용하였다. 1차 피부 자극 지수(PII, Primary Irritation Index)는 개체별 피부 반응 채점결과의 평균 합을 4로 나눈 값이다. 하기 표 5에 1차 피부 자극 지수에 따른 자극성 정도를 나타내었다.Using the scoring of the skin reaction, the mean value was calculated by adding the erythema rating and edema score at 24 hours and 72 hours, and the skin irritation was evaluated by this value. The primary skin irritation index was used for comparison of skin irritation. The primary irritation index (PII) is the average sum of skin response scores for each individual divided by four. Table 5 shows the degree of irritation according to the primary skin irritation index.
실시예 3의 융합단백질의 적용에 따라, 24 시간째 가벼운 홍반이 토끼 3마리 모두에서 관찰되었고, 48 시간 및 72 시간째는 토끼 1마리 만이 가벼운 홍반이 관찰되었다. 이를 통해, 실시예 3의 융합단백질은 일차피부자극지수(PII) 값이 0.25인 비자극성 물질이라는 것을 확인하였다.According to the application of the fusion protein of Example 3, mild erythema was observed in all three rabbits at 24 hours and mild erythema was observed in only one rabbit at 48 hours and 72 hours. Thus, it was confirmed that the fusion protein of Example 3 was a non-magnetic substance having a primary skin irritation index (PII) value of 0.25.
[시험예 6][Test Example 6]
피부 주름 개선 효과Wrinkle improvement effect
실시예 3의 융합단백질을 함유한 화장품 조성물의 피부주름 개선 정도를 알아보기 위해 30세 이상의 건강한 여성 15명에 대하여 임상효능 평가를 실시하였다.To evaluate the degree of skin wrinkle improvement of the cosmetic composition containing the fusion protein of Example 3, the clinical efficacy of 15 healthy women over 30 years old was evaluated.
제품 사용에 따른 주름개선 효과를 피부화상분석기(Visiometer)를 이용하여 분석하였다. 이를 위하여 0주, 4주, 8주 경과시 지정된 눈가 부위의 모사판을 제작하였다. 상기 모사판은 항온 항습(22±2℃, 40%∼60% 습도) 조건에서 실리콘 재질을 이용하여 제작되었다. The effect of wrinkle improvement according to product use was analyzed using a skin image analyzer (Visiometer). For this purpose, a specimen of eye area was prepared at 0, 4, and 8 weeks. The simulated plate was made of silicon material under constant temperature and humidity (22 ± 2 ° C, 40% ~ 60% humidity) conditions.
상기 모사판은 피부화상분석기(Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Gemany)의 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. The simulated plate was analyzed using software of a skin image analyzer (Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Gemany).
상기 모사판의 분석은 분광법으로 수행하였다. 구체적으로 인공 광원에서 방출된 빛이 실리콘 재질을 투과하면서 생기는 빛의 세기를 람베르트-베르의 법칙(Lambert & Beer's law)으로 분석하였으며, 피부주름 개선 정도를 측정하였다. Analysis of the simulated plate was performed by spectroscopy. Specifically, the intensity of light emitted from the light emitted from the artificial light source through the silicone material was analyzed by the Lambert & Beer's law, and the degree of improvement of the skin wrinkles was measured.
상기 피부화상분석기에 의한 측정 변수는 R2로 표시되며, 이는 최대 거칠기(Maximum Roughness)를 나타낸다. 상기 변수의 값이 작아질수록 피부주름이 개선되어 주름의 깊이가 낮아짐을 의미한다. 본 발명에 따른 화장품 조성물의 피부주름 개선 평가시험에서의 피부주름 개선율(%)을 하기 표 6에 표시하였다.The measurement variable by the skin image analyzer is represented by R2, which represents the maximum roughness. The smaller the value of the variable is, the more the wrinkles of the skin are improved and the depth of the wrinkles is lowered. The skin wrinkle improvement rate (%) in the skin wrinkle improvement evaluation test of the cosmetic composition according to the present invention is shown in Table 6 below.
상기 모사판은 피부화상분석기(Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Gemany)의 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. The simulated plate was analyzed using software of a skin image analyzer (Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Gemany).
상기 실험결과를 통하여 본 발명에 따른 실시예 3의 융합단백질을 함유한 화장품은 우수한 주름개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.From the results of the above experiment, it was confirmed that the cosmetic containing the fusion protein of Example 3 according to the present invention exhibited excellent wrinkle-reducing effect.
[시험예 7][Test Example 7]
보툴리늄 유래 융합단백질을 포함하는 조성물의 피부투과 시험Skin permeation test of a composition comprising a botulinum-derived fusion protein
제조예 1 내지 12의 조성물에 대하여, 피부투과의 정도를 측정하기 위하여 시험예 2와 같은 방법으로 피부투과 시험을 수행하였으며, 여기서는 10시간 동안의 누적 피부투과량을 측정하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.Skin permeation tests were conducted in the same manner as in Test Example 2 to measure the degree of skin permeation of the compositions of Production Examples 1 to 12, wherein the cumulative skin permeation amount for 10 hours was measured, Respectively.
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 경피흡수촉진제를 첨가한 제조예 2-12가 경피흡수촉진제를 첨가하지 않은 제조예 1 보다 2-3배 정도 더 우수한 피부 투과성을 나타내는 것을 확인하였다. As shown in Table 7, it was confirmed that Production Example 2-12 to which a transdermal absorption enhancer was added showed a skin permeability about 2-3 times better than that of Production Example 1 to which no transdermal absorption promoter was added.
또한, 레시틴을 포함하는 제조예 2가 가장 우수한 피부 투과성을 나타내었고, 라우릴 피롤리돈을 포함하는 제조예 3, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 제조예 8, 및 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 제조예 11이 15㎍/cm2 이상의 우수한 피부 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.Production Example 2 including lecithin exhibited the best skin permeability, and Production Example 3 containing lauryl pyrrolidone, Production Example 8 containing polyoxyethylene sorbitan monostearate, and sorbitan monostearate the Preparation 11 containing rate was found to exhibit superior skin permeability than 15㎍ / cm 2.
[시험예 8][Test Example 8]
보툴리늄 유래 융합단백질 및 레시틴을 포함하는 조성물의 피부투과 시험Skin permeation test of a composition comprising botulinum-derived fusion protein and lecithin
보툴리늄 독소 및 레시틴을 포함하는 조성물에 있어서, 레시틴의 함량에 따른 피부투과성을 확인하는 시험을 수행하기 위하여 제조예 2와 동일한 방법으로 제조예 13 내지 15를 제조하였다.Preparation Examples 13 to 15 were prepared in the same manner as in Preparation Example 2, in order to carry out a test for confirming the skin permeability according to the content of lecithin in a composition containing botulinum toxin and lecithin.
시험예 7의 방법과 동일한 방법으로 피부투과성 시험을 수행하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.The skin permeability test was carried out in the same manner as in Test Example 7, and the results are shown in Table 8 below.
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 레시틴의 함량이 0.1 및 0.3 중량%인 경우 피부 투과량이 8.2 및 9.7㎍/cm2로 유사하였으나, 레시틴의 함량이 0.5 중량%인 경우 20.3 ㎍/cm2로 급격하게 증가하는 것을 확인하였다.As shown in Table 8, when the content of the lecithin is 0.1 and 0.3 wt% of the skin permeation amount of 8.2 and were similar to 9.7㎍ / cm 2, when the content of the lecithin is 0.5% by weight drastically by 20.3 ㎍ / cm 2 Respectively.
경피흡수촉진제는 각질의 인지질층에 유동성을 부여하여 비교적 작은 분자량(500Da이하)의 화합물들을 투과시키도록 도와주는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 융합단백질의 경우에 분자량이 100kDa 이상으로 상당히 크기 때문에 각질의 유동화만으로는 융합단백질의 피부투과가 어렵다. It is known that transdermal absorption enhancers impart fluidity to the keratinous phospholipid layer to help transmit relatively small molecular weight (less than 500 Da) compounds. In the case of the fusion protein of the present invention, since the molecular weight is as large as 100 kDa or more, permeation of the fusion protein to the skin is difficult only by the fluidization of the keratin.
본 실험을 통하여 관찰한 결과, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드(Medium Chain Glyceride)의 한 종류인 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)가 융합단백질과 함께 미셀(micelle)을 형성하여, 미셀 형태로 세포내 이입(endocytosis)되어 피부투과가 증대되는 것을 확인하였다. As a result of the experiment, Caprylic / Capric Triglyceride, which is one kind of transdermal absorption promoter and Medium Chain Glyceride, forms a micelle together with the fusion protein , Endocytosis in the form of micelles, and increased skin permeation.
경피흡수촉진제인 레시틴의 함량이 0.5 중량% 이상에서 피부투과도가 급격히 상승하는 실험결과로부터, 상기 함량이 미셀을 형성하는 임계농도(CMC; Critical Micelle Concentration)인 것을 알 수 있다. From the results of experiments in which the skin permeability increases sharply at a content of lecithin as a transdermal absorption promoter of 0.5 wt% or more, it can be seen that the above content is a critical micelle concentration (CMC) forming micelles.
<110> Iphama CO.,LTD. ICURE Pharmaceutical Inc. <120> Cosmetic composition comprising peptide derived from Botulinum toxin having improved cell penetrating ability <130> P170021 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetratin <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 2 Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 3 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 4 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kFGF <400> 5 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyarginine(R9) <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPG <400> 7 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YTA2 <400> 8 Tyr Thr Ala Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YTA4 <400> 9 Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pVEC <400> 10 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 11 aggcagatca agatctggtt ccagaacagg aggatgaagt ggaagaag 48 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 12 aggaagaaga agaggaggca gaggaggagg 30 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 13 aacgccaaga ccaggaggca cgagaggagg aggaagctgg ccatcgagag g 51 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 14 aaggagacct ggtgggagac ctggtggacc gagtggagcc agcccaagaa gaagaggaag 60 gtg 63 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 15 gccgccgtgg ccctgctgcc cgccgtgctg ctggccctgc tggccccc 48 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 16 aggaggagga ggaggaggag gaggagg 27 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 17 ggcgccctgt tcctgggctt cctgggcgcc gccggcagca ccatgggcgc c 51 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 18 tacaccgcca tcgcctgggt gaaggccttc atcaggaagc tgaggaag 48 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 19 atcgcctggg tgaaggcctt catcaggaag ctgaggaagg gccccctggg c 51 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 20 ctgctgatca tcctgaggag gaggatcagg aagcaggccc acgcccacag caag 54 <210> 21 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum toxin light chain peptide <400> 21 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The translocation domain peptide of the Botulinum toxin heavy chain <400> 22 Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser 1 5 10 15 Leu Lys Asp <110> Iphama CO., LTD. ICURE Pharmaceutical Inc. <120> Cosmetic composition comprising peptide derived from Botulinum toxin having improved cell penetrating ability <130> P170021 <160> 22 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetratin <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 2 Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 3 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 4 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kFGF <400> 5 Ala Ala Val Ala Leu Ala Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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aggaagaaga agaggaggca gaggaggagg 30 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 13 aacgccaaga ccaggaggca cgagaggagg aggaagctgg ccatcgagag g 51 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 14 aaggagacct ggtgggagac ctggtggacc gagtggagcc agcccaagaa gaagaggaag 60 gtg 63 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 15 gccgccgtgg ccctgctgcc cgccgtgctg ctggccctgc tggccccc 48 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 16 aggaggagga ggaggaggag gaggagg 27 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 17 ggcgccctgt tcctgggctt cctgggcgcc gccggcagca ccatgggcgc c 51 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 18 tacaccgcca tcgcctgggt gaaggccttc atcaggaagc tgaggaag 48 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 19 atcgcctggg tgaaggcctt catcaggaag ctgaggaagg gccccctggg c 51 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 20 ctgctgatca tcctgaggag gaggatcagg aagcaggccc acgcccacag caag 54 <210> 21 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum toxin light chain peptide <400> 21 Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 1 5 10 15 Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro 20 25 30 Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 35 40 45 Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 50 55 60 Ala Lys Gln Val Val Ser Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 85 90 95 Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 100 105 110 Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 115 120 125 Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr 130 135 140 Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 180 185 190 Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu 210 215 220 Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn 225 230 235 240 Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu 245 250 255 Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn 275 280 285 Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The translocation domain of the Botulinum toxin heavy chain <400> 22 Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser 1 5 10 15 Leu Lys Asp
Claims (14)
상기 보툴리늄 독소 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드, 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌(translocation) 영역 펩타이드로 이루어지고,
상기 융합단백질은 단백질 전달체, 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드의 순으로 융합되며,
상기 경피흡수촉진제는 레시틴(Lecithin), 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate) 및 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
A botulinum toxin fusion protein and a transdermal absorption promoter,
The botulinum toxin fusion protein comprises a protein carrier comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a botulinum toxin light chain peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and a translocation domain peptide of the botulinum toxin heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: Lt; / RTI &
The fusion protein is fused in the order of a protein transporter, a botulinum toxin light chain peptide, and a translocation domain peptide of a botulinum toxin heavy chain,
The transdermal absorption enhancer may be at least one selected from the group consisting of lecithin, lauryl pyrrolidone, polyoxyethylene sorbitan monooleate and sorbitan monostearate. Wherein the cosmetic composition is a cosmetic composition.
The cosmetic composition according to claim 1, wherein the cosmetic composition comprises a linker between at least one of the protein carrier and the botulinum toxin light chain peptide, and between the botulinum toxin light chain peptide and the translocation domain peptide of the botulinum toxin heavy chain.
5. The cosmetic composition according to claim 4, wherein the linker is represented by (G) N , wherein N is an integer of 1 to 20, and G is glycine.
The cosmetic composition according to claim 5, wherein the linker is GGGGG.
The cosmetic composition according to claim 1, wherein the transdermal absorption enhancer is lecithin.
The cosmetic composition according to claim 7, wherein the lecithin is contained in an amount of 0.5% by weight or more based on the total weight of the composition.
The cosmetic composition according to claim 7, further comprising a medium chain glyceride.
The cosmetic composition according to claim 9, wherein the heavy chain glyceride is caprylic / capric triglyceride
11. The cosmetic composition according to claim 10, wherein the fusion protein, lecithin and caprylic / capric triglyceride form micelles.
The cosmetic composition according to claim 1, further comprising a sugar alcohol for stabilizing the fusion protein
13. The cosmetic composition according to claim 12, wherein the sugar alcohol is mannitol
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