ES2895853T3

ES2895853T3 - Modified botulinum neurotoxin

Info

Publication number: ES2895853T3
Application number: ES16714713T
Authority: ES
Inventors: Min Dong; Lisheng Peng; Liang Tao
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: EP3274364B1; EP3981783A1; RU2746736C2; RU2017134357A; HK1248737A1; PT3274364T; RU2017134357A3; EP3274364A1; US11268080B2; CN115925835A; TWI725963B; HK1249119A1; US20180080016A1; US20220154160A1; TW201639877A; DK3274364T3; CN107548402B; WO2016154534A1; CN107548402A; HUE057258T2

Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B- HC), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y, en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.A polypeptide comprising a modified Botulinum clostridial serotype B (B-HC) receptor binding domain, comprising one or more substitution mutations corresponding to substitutions in serotype B, strain 1, wherein one of the substitution mutations is is selected from the group consisting of E1191C and E1191Y, wherein the modified receptor binding domain has 95% or greater amino acid sequence identity with a reference wild-type receptor binding domain of SEQ ID NO: 5, and wherein the polypeptide exhibits better binding to human Syt II compared to an identical molecule lacking one or more substitution mutations.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Neurotoxina botulínica modificadaModified botulinum neurotoxin

Campo de la invenciónfield of invention

La presente invención se refiere al campo de las neurotoxinas modificadas y a su uso para el tratamiento de trastornos médicos y/o estéticos.The present invention relates to the field of modified neurotoxins and their use for the treatment of medical and/or aesthetic disorders.

Antecedentes de la invenciónBackground of the invention

Las neurotoxinas botulínicas son una familia de toxinas bacterianas, que incluye siete serotipos principales (NTBo/A-G)1. Estas toxinas actúan bloqueando la liberación de neurotransmisores desde las neuronas, paralizando así a animales y seres humanos. En los últimos años, las NTBo se han utilizado ampliamente para tratar una lista creciente de afecciones médicas: las inyecciones locales de cantidades mínimas de toxinas pueden atenuar la actividad neuronal en regiones específicas, lo que puede ser beneficioso en muchas afecciones médicas, así como con fines cosméticos2-4.Botulinum neurotoxins are a family of bacterial toxins, which includes seven main serotypes (BoNT/A-G)1. These toxins act by blocking the release of neurotransmitters from neurons, thereby paralyzing animals and humans. In recent years, BoNTs have been widely used to treat a growing list of medical conditions: local injections of trace amounts of toxins can attenuate neuronal activity in specific regions, which may be beneficial in many medical conditions, as well as with cosmetic purposes2-4.

NTBo/A y NTBo/B son las únicas dos NTBo que actualmente están aprobadas por la FDA para su uso en seres humanos2-4. Estas son toxinas purificadas a partir de bacterias sin ninguna modificación de secuencia (definidas como de tipo salvaje, WT). A medida que crece la aplicación de NTBo, se ha informado sobre sus limitaciones y efectos adversos. La principal limitación es la generación de anticuerpos neutralizantes en los pacientes, lo que hace que el tratamiento futuro sea poco eficaz5. La interrupción del uso de NTBo a menudo deja a los pacientes sin otras formas eficaces de tratar/aliviar sus trastornos. La posibilidad de respuestas de anticuerpos está directamente relacionada tanto con las dosis de toxina como con la frecuencia de inyección5. Por lo tanto, esta limitación se produce principalmente en el tratamiento de espasmos musculares, que implica dosis relativamente altas de toxinas. De manera consistente, no se han observado respuestas de anticuerpos en aplicaciones cosméticas, que utilizan dosis de toxinas extremadamente bajas5.BoNT/A and BoNT/B are the only two BoNT that are currently approved by the FDA for use in humans2-4. These are toxins purified from bacteria without any sequence modifications (defined as wild-type, WT). As the application of BoNT grows, its limitations and adverse effects have been reported. The main limitation is the generation of neutralizing antibodies in patients, which makes future treatment ineffective5. Discontinuation of BoNT use often leaves patients with no other effective ways to treat/relieve their conditions. The possibility of antibody responses is directly related to both the dose of toxin and the frequency of injection5. Therefore, this limitation occurs mainly in the treatment of muscle spasms, which involves relatively high doses of toxins. Consistently, no antibody responses have been observed in cosmetic applications, which use extremely low doses of toxins5.

Los principales efectos adversos también se asocian a menudo con el tratamiento de espasmos musculares, pero no con aplicaciones cosméticas. Esto se debe a que los efectos adversos se deben en gran medida a la difusión de toxinas a otras regiones del organismo y la posibilidad de difusión de toxinas está directamente relacionada con las dosis inyectadas. Los efectos adversos van desde eventos transitorios no graves tales como ptosis y diplopía hasta eventos potencialmente mortales, incluso la muerte67. En una carta de petición presentada en 2008 por el Dr. Sidney Wolfe a la FDA, se han documentado un total de 180 eventos adversos graves, incluidas 16 muertes. Como resultado, la FDA ahora requiere la "advertencia de recuadro negro" en todos los productos de NTBo, destacando el riesgo de propagación de toxinas, siguiendo advertencias similares emitidas por la Unión Europea.The main adverse effects are also often associated with the treatment of muscle spasms, but not with cosmetic applications. This is because adverse effects are largely due to diffusion of toxins to other regions of the body, and the potential for diffusion of toxins is directly related to the dose injected. Adverse effects range from transient non-serious events such as ptosis and diplopia to life-threatening events, including death67. In a 2008 petition letter submitted by Dr. Sidney Wolfe to the FDA, a total of 180 serious adverse events, including 16 deaths, have been documented. As a result, the FDA now requires "black box warning" on all BoNT products, highlighting the risk of spreading toxins, following similar warnings issued by the European Union.

Debido a que tanto la generación de anticuerpos neutralizantes como la difusión de la toxina están directamente relacionadas con las dosis inyectadas, es muy deseable reducir las dosis de toxina (mientras se mantienen los mismos niveles de actividad de la toxina), lo que significa que se debe mejorar la eficacia de las moléculas de toxina individuales. Tales NTBo modificadas con una mejor especificidad por las neuronas también reducirán cualquier efecto potencial inespecífico debido a la entrada no específica en otros tipos de células.Because both the generation of neutralizing antibodies and the diffusion of toxin are directly related to injected doses, it is highly desirable to reduce toxin doses (while maintaining the same levels of toxin activity), which means that it should enhance the efficacy of individual toxin molecules. Such modified BoNTs with improved specificity for neurons will also reduce any potential non-specific effects due to non-specific entry into other cell types.

Las NTBo se dirigen a las neuronas y entran en ellas uniéndose a sus receptores específicos a través de sus dominios de unión al receptor, que están bien definidos en la bibliografía (NTB^o-H^c, Figura 1A, B)1. La unión del receptor dicta la eficacia y especificidad de las NTBo para reconocer neuronas. La mejora de la capacidad de unión al receptor de las NTBo aumentará su eficacia y especificidad por las neuronas diana. Se han identificado los receptores para la mayoría de las NTBo (Fig. 1C). NTBo/B, D-C y G comparten dos proteínas de vesículas sinápticas homólogas, sinaptotagmina I y II (Syt I/II) como sus receptores8-13, mientras que NTBo/A, E, D y F utilizan otra proteína de vesícula sináptica, SV2914-18. Además de los receptores de proteínas, todas las NTBo requieren gangliósidos co-receptores de lípidos (Fig. 1D), que son abundantes sobre las superficies neuronales19. Entre las dos isoformas de Syt, Syt II tiene una afinidad de unión aproximadamente 10 veces mayor para NTBo/B que Syt I y también es la isoforma dominante expresada en los terminales de los nervios motores, que son las neuronas diana de las NTBo (Fig. 2A)2021. Por lo tanto, Syt II se considera el principal receptor de toxinas para NTBo/B, D-C y G, mientras que Syt I es un receptor de toxinas minoritario en los terminales de los nervios motores. Este es el caso de los roedores y probablemente de la mayoría de los mamíferos.BoNTs target neurons and enter them by binding to their specific receptors through their receptor-binding domains, which are well defined in the literature (NTB ^or -H ^c , Figure 1A, B)1. Receptor binding dictates the efficacy and specificity of BoNTs to recognize neurons. Improving the receptor binding capacity of BoNTs will increase their efficacy and specificity for target neurons. Receptors for most of the BoNTs have been identified (Fig. 1C). BoNT/B, DC and G share two homologous synaptic vesicle proteins, synaptotagmin I and II (Syt I/II) as their receptors8-13, while BoNT/A, E, D and F use another synaptic vesicle protein, SV2914 -18. In addition to protein receptors, all BoNTs require lipid co-receptor gangliosides (Fig. 1D), which are abundant on neuronal surfaces19. Among the two Syt isoforms, Syt II has approximately 10-fold higher binding affinity for BoNT/B than Syt I and is also the dominant isoform expressed in motor nerve terminals, which are the target neurons of BoNT (Fig. 2A)2021. Therefore, Syt II is considered the main toxin receptor for BoNT/B, DC and G, while Syt I is a minor toxin receptor on motor nerve terminals. This is the case for rodents and probably most mammals.

Se puede argumentar que las NTBo ya tienen una alta especificidad por las neuronas y preguntarse si es posible mejorar aún más su unión a las neuronas. La respuesta es un "Sí" para los seres humanos, al menos en parte a la luz del reciente descubrimiento de que la Syt II humana tienen una enorme disminución de la unión y la función como receptor de NTBo/B debido a un cambio de aminoácido único en Syt II de roedor (rata/ratón) dentro del sitio de unión de la toxina1322. Este es un cambio de fenilalanina (F) a leucina (L) en la posición 54 (secuencia Syt II de ratón) (Fig. 2B). Los alineamientos de secuencias han revelado que la fenilalanina en esta posición está altamente conservada tanto en Syt I como en Syt II en vertebrados, incluidos ornitorrincos, peces, roedores y monos23. Sólo la Syt II humana y de chimpancé contiene leucina en esta posición. Como resultado de este cambio de resto, la Syt II humana y de chimpancé tienen una enorme disminución de la unión a NTBo/B, D-C y G (Fig. 2C) y es significativamente menos eficaz para mediar la entrada de NTBo/B (Fig. 2D), en comparación con la Syt II de ratón. It can be argued that BoNTs already have a high specificity for neurons and ask whether it is possible to further improve their binding to neurons. The answer is "Yes" for humans, at least in part in light of the recent discovery that human Syt II has a vastly decreased binding and function as a BoNT/B receptor due to an amino acid change unique in rodent (rat/mouse) Syt II within the 1322 toxin binding site. This is a change from phenylalanine (F) to leucine (L) at position 54 (mouse Syt II sequence) (FIG. 2B). Sequence alignments have revealed that phenylalanine at this position is highly conserved in both Syt I and Syt II in vertebrates, including platypuses, fish, rodents, and monkeys23. Only human and chimpanzee Syt II contain leucine in this position. As a result of this moiety switch, human and chimpanzee Syt II have greatly decreased binding to BoNT/B, DC, and G (Fig. 2C) and are significantly less effective at mediating BoNT/B entry (Fig. 2D), compared to mouse Syt II.

Dado que la Syt I humana y de chimpancé todavía contienen fenilalanina en la misma posición y se pueden unir a NTBo/B, D-C y G (Fig. 2E), el receptor de alta afinidad para NTBo/B, D-C y G en los seres humanos está restringido al receptor Syt I minoritario. Estos hallazgos proporcionan una explicación de las observaciones clínicas de que se necesita una dosis mucho más alta de NTBo/B que de NTBo/A (que se une a un receptor diferente) para lograr los mismos niveles de efectos terapéuticos en los pacientes2425. Anteriormente, estas observaciones se atribuían a otras razones, tales como el porcentaje de neurotoxina activa en las preparaciones utilizadas. Las observaciones recientes de tales diferencias de unión de NTBo/B a Syt II humana frente a Syt II de otras especies sugieren que pueden estar implicados en la unión a Syt II humana diferentes restos de NTBo/B. Como tal, la modificación de la secuencia de NTBo/B que se espera que afecte la unión a SytII de roedor puede tener efectos impredecibles sobre la unión de NTBo/B a Syt II humana.Since chimpanzee and human Syt I still contain phenylalanine at the same position and can bind to BoNT/B, DC, and G (Fig. 2E), the high-affinity receptor for BoNT/B, DC, and G in humans humans is restricted to the minor Syt I receptor. These findings provide an explanation for clinical observations that a much higher dose of BoNT/B than BoNT/A (which binds to a different receptor) is needed to achieve the same levels of therapeutic effects in patients2425. Previously, these observations were attributed to other reasons, such as the percentage of active neurotoxin in the preparations used. Recent observations of such differences in BoNT/B binding to human Syt II versus Syt II from other species suggest that different BoNT/B residues may be involved in binding to human Syt II. As such, modification of the BoNT/B sequence that is expected to affect binding to rodent SytII may have unpredictable effects on the binding of BoNT/B to human SytII.

Por tanto, existe una gran necesidad de mejorar la unión de NTBo/B al receptor Syt II humano, como una forma de aumentar su eficacia y especificidad para dirigirse a neuronas humanas y disminuir las dosis de toxina necesarias en aplicaciones terapéuticas.Therefore, there is a great need to improve the binding of BoNT/B to the human Syt II receptor, as a way to increase its efficacy and specificity to target human neurons and to decrease the toxin doses required in therapeutic applications.

El documento WO 2013/180799 A1 se refiere a polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) con un dominio de unión al receptor modificado de botulinum Clostridial de serotipo B (B-Hc), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución específicas en el serotipo B, cepa 1.WO 2013/180799 A1 relates to botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides with a modified botulinum Clostridial serotype B (B-Hc) receptor binding domain, comprising one or more substitution mutations corresponding to substitution mutations specific for serotype B, strain 1.

Compendio de la invenciónSummary of the invention

Un aspecto de la invención se refiere a un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial de serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y. El dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra una mejor unión a Syt II humano en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.One aspect of the invention relates to a polypeptide comprising a modified receptor binding domain from Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ), comprising one or more substitution mutations corresponding to substitutions in serotype B, strain 1, in where one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191C and E1191Y. The modified receptor binding domain has 95% or greater amino acid sequence identity with a reference wild-type receptor binding domain of SEQ ID NO: 5, and wherein the polypeptide exhibits improved binding to human Syt II compared to an identical molecule lacking one or more substitution mutations.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa; un sitio de escisión de proteasa; un dominio de translocación; y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial de serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y. El dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido de NTBo muestra una mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de las una o más mutaciones por sustitución.Another aspect of the invention relates to a botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptide comprising a protease domain; a protease cleavage site; a translocation domain; and a modified receptor binding domain from Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ), comprising one or more substitution mutations corresponding to substitutions in serotype B, strain 1, wherein one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191C and E1191Y. The modified receptor binding domain has 95% or greater amino acid sequence identity with a reference wild-type receptor binding domain of SEQ ID NO: 5, and wherein the BoNT polypeptide exhibits improved Syt binding. human II compared to an identical molecule lacking the one or more substitution mutations.

En realizaciones de la invención, el polipéptido o polipéptido de NTBo como se describió anteriormente, pueden ser una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado conectado a una segunda porción.In embodiments of the invention, the BoNT polypeptide or polypeptide as described above may be a chimeric molecule comprising a first portion that is the modified receptor binding domain connected to a second portion.

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos anteriormente, o el vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico.Another aspect of the invention relates to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide or chimeric molecule described above. Another aspect of the invention relates to a nucleic acid vector comprising the nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide or chimeric molecule described above. Another aspect of the invention relates to a cell comprising the nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide or chimeric molecule described above, or the nucleic acid vector comprising the nucleic acid.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos anteriormente.Another aspect of the invention relates to a cell expressing any of the BoNT polypeptides, polypeptides or chimeric molecules described above.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), polipéptidos o moléculas quiméricas descritos anteriormente. En una realización de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides, polypeptides or chimeric molecules described above. In an embodiment of any of the pharmaceutical compositions, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir cualquiera de los polipéptidos o polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos anteriormente, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula que expresa el polipéptido o polipéptido de NTBo en las condiciones en las que dicho polipéptido o polipéptido de NTBo es producido.Another aspect of the invention relates to a method for producing any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides or polypeptides described above, the method comprising the steps of culturing the cell expressing the BoNT polypeptide or polypeptide under the conditions in which said BoNT polypeptide or polypeptide is produced.

Otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos anteriormente para su uso en medicina. Another aspect of the invention relates to any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides or pharmaceutical compositions, or chimeric molecules, or polypeptides described above for use in medicine.

Otro aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos anteriormente, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada, en donde la afección se selecciona del grupo formado por disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno de párpados, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos de músculos, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos de la secreción, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, migraña, y afecciones dermatologicas.Another aspect of the invention relates to any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides, or pharmaceutical compositions, or chimeric molecules, or polypeptides described above, for use in treating a condition associated with unwanted neuronal activity. , wherein the condition is selected from the group consisting of spasmodic dysphonia, spasmodic torticollis, laryngeal dystonia, oromandibular dysphonia, lingual dystonia, cervical dystonia, focal hand dystonia, blepharospasm, strabismus, hemifacial spasm, eyelid disorder, cerebral palsy, spasticity focal and other voice disorders, spasmodic colitis, neurogenic bladder, anismus, spasticity of extremities, tics, tremors, bruxism, anal fissure, achalasia, dysphagia and other muscle tone disorders and other disorders characterized by involuntary movements of muscle groups , lacrimation, hyperhidrosis, excessive salivation, gastrointestinal secretions exc esivas, secretion disorders, pain due to muscle spasms, headache, migraine, and dermatological conditions.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y combinaciones de las mismas. En una realización, (B-H^c) modificado comprende una mutación por sustitución correspondiente a una mutación por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionada del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C e Y1183P. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-H^c) comprende la mutación por sustitución correspondiente a E1191C en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-Hc) modificado comprende la mutación por sustitución correspondiente a E1191V en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (B-HC) modificado comprende dos mutaciones por sustitución.Also disclosed herein is a botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptide comprising a protease domain, a protease cleavage site, a translocation domain, and a modified Botulinum clostridial serotype B (B-Hc) receptor binding domain. , comprising one or more substitution mutations corresponding to substitution mutations in serotype B, strain 1, selected from the group consisting of E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P and combinations thereof. In one embodiment, modified (BH ^c ) comprises a substitution mutation corresponding to a substitution mutation in serotype B, strain 1, selected from the group consisting of E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C and Y1183P. In one embodiment of the polypeptides described herein, (BH ^c ) comprises the substitution mutation corresponding to E1191C in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, (B-Hc ) modified comprises the substitution mutation corresponding to E1191V in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the modified (B-HC) comprises two substitution mutations.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización, otra de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el (BH^c) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199W y W1178Q de serotipo B, cepa 1.Also disclosed herein is a botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptide comprising a protease domain, a protease cleavage site, a translocation domain, and a modified Botulinum clostridial serotype B (B-Hc) receptor binding domain. , comprising two or more substitution mutations corresponding to substitution mutations in serotype B, strain 1, wherein one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L and E1191Y. In one embodiment, another of the substitution mutations corresponds to S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F or S1199L in serotype B, strain 1. In one embodiment of the described polypeptides here the two substitution mutations correspond to E1191M and S1199W, E1191M and W1178Q, E1191C and S1199W; E1191C and S1199Y, E1191C and W1178Q, E1191Q and S1199W, E1191V and S1199W, E1191V and S1199Y, or E1191V and W1178Q, in serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described in As used herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199Y in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191Q and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199Y in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations they correspond to E1191V and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the modified (BH ^c ) comprises three substitution mutations. In one embodiment of the polypeptides described herein, the three substitution mutations are at positions corresponding to E1191, Y1183, and S1199 or E1191, S1199, and W1178 of serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described in Herein, the three substitution mutations correspond to E1191M, S1199W and W1178Q of serotype B, strain 1.

También se describe en la presente memoria un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio proteasa, un sitio de escisión de proteasa, un dominio de translocación y un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-Hc), que comprende una mutación por sustitución en una posición correspondiente a S1199 o S1201 de serotipo B, cepa 1.Also disclosed herein is a botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptide comprising a protease domain, a protease cleavage site, a translocation domain, and a modified Botulinum clostridial serotype B (B-Hc) receptor binding domain. , comprising a substitution mutation at a position corresponding to S1199 or S1201 of serotype B, strain 1.

En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-HC modificado es de la cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y combinaciones de los mismos. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son de serotipo B, cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo A, cepa 1. En una realización de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa B4.In one embodiment of any of the polypeptides described herein, the modified B-HC is from strain 1. In one embodiment of any of the polypeptides described herein, the protease domain, the translocation domain, and the site protease cleavage inhibitors are of the serotype selected from the group consisting of A, B, C, D, E, F, G, and combinations thereof. In one embodiment of any of the polypeptides described herein, the protease domain, translocation domain, and protease cleavage site are serotype B, strain 1. In one embodiment of any of the polypeptides described herein , the protease domain, the translocation domain, and the protease cleavage site are from serotype A, strain 1. In one embodiment of any of the polypeptides described herein, the modified B-Hc is not from the B4 strain.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Botulinum clostridial (B-H^c) que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, seleccionadas del grupo formado por E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, y combinaciones de las mismas. En una realización, el (B-H^c) modificado comprende dos mutaciones por sustitución.Also described herein is a polypeptide comprising a modified Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ) receptor binding domain comprising one or more substitution mutations corresponding to substitution mutations in serotype B, strain 1, selected from the group consisting of E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, and combinations thereof. In one embodiment, the modified (BH ^c ) comprises two substitution mutations.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado del serotipo B de Botulinum clostridial (B-H^c) que comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, una de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria el (BH^c) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199W y W1178Q de serotipo B, cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el BH^cmodificado es de la cepa 1. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa 4. En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.Also described herein is a polypeptide comprising a modified Botulinum clostridial serotype B receptor binding domain (BH ^c ) comprising two or more substitution mutations corresponding to substitution mutations in serotype B, strain 1, in where one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L and E1191Y. In one embodiment of the polypeptides described herein, one of the substitution mutations corresponds to S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F, or S1199L in serotype B strain 1 In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and S1199W, E1191M and W1178Q, E1191C and S1199W; E1191C and S1199Y, E1191C and W1178Q, E1191Q and S1199W, E1191V and S1199W, E1191V and S1199Y, or E1191V and W1178Q, in serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described in As used herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199Y in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and W1178Q in serotype B, strain. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191Q and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199W in serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199Y in serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein specification, the two substitution mutations correspond to E1191V and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein the modified (BH ^c ) comprises three substitution mutations. In one embodiment of the polypeptides described herein, the three substitution mutations are at positions corresponding to E1191, Y1183, and S1199 or E1191, S1199, and W1178 of serotype B strain 1. In one embodiment of the polypeptides described in The three substitution mutations herein correspond to E1191M, S1199W, and W1178Q of serotype B, strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the modified BH ^c is from strain 1. In one embodiment of the polypeptides described herein, the modified B-Hc is not from strain 4. In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8.

Asimismo se describe en la presente memoria una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c) conectado a una segunda porción, en donde el B-HC modificado comprende una o más mutaciones por sustitución seleccionadas del grupo que consiste en E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y combinaciones de las mismas. En una realización, el B-H^cmodificado comprende dos mutaciones por sustitución.Also described herein is a chimeric molecule comprising a first portion that is a modified Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ) receptor binding domain connected to a second portion, wherein the modified B-HC comprises one or more substitution mutations selected from the group consisting of E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, and combinations thereof. In one embodiment, the modified BH ^c comprises two substitution mutations.

Asimismo se describe en la presente memoria una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c) conectado a una segunda porción, en donde el B-H^cmodificado comprende dos o más mutaciones por sustitución correspondientes a mutaciones por sustitución en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L y E1191Y. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, una de las mutaciones por sustitución corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S11199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W; E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191M y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191C y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191Q y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199W en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y S1199Y en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las dos mutaciones por sustitución corresponden a E1191V y W1178Q en el serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el (BHC) modificado comprende tres mutaciones por sustitución. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución están en posiciones que corresponden a E1191, Y1183 y S1199 o a E1191, S1199 y W1178 de serotipo B, cepa 1. En una realización de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, las tres mutaciones por sustitución corresponden a E1191M, S1199^wy W1178Q de serotipo B, cepa 1.Also described herein is a chimeric molecule comprising a first portion that is a modified Botulinum clostridial serotype B receptor binding domain (BH ^c ) connected to a second portion, wherein the modified BH ^c comprises two or more mutations by substitution corresponding to substitution mutations in serotype B, strain 1, wherein one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L and E1191Y. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, one of the substitution mutations corresponds to S1199W, S1199E, S1199H, S11199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F, or S1199L in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein the two substitution mutations correspond to E1191M and S1199W, E1191M and W1178Q, E1191C and S1199W; E1191C and S1199Y, E1191C and W1178Q, E1191Q and S1199W, E1191V and S1199W, E1191V and S1199Y, or E1191V and W1178Q, in serotype B strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two mutations by substitution mutations correspond to E1191M and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191M and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and S1199Y in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191C and W1178Q in serotype B, strain 1. In an In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191Q and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199W in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and S1199Y in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the two substitution mutations correspond to E1191V and W1178Q in serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described herein , the modified (BHC) comprises three substitution mutations. In one embodiment of the chimeric molecules described herein, the three substitution mutations are at positions corresponding to E1191, Y1183, and S1199 or E1191, S1199, and W1178 of serotype B, strain 1. In one embodiment of the chimeric molecules described here, the three substitution mutations correspond to E1191M, S1199 ^w and W1178Q of serotype B, strain 1.

En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el B-H^cmodificado es de la cepa 1. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, el B-Hc modificado no es de la cepa 4. En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the modified BH ^c is from strain 1. In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the modified B-Hc is not from strain 4. In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8.

En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la primera porción y la segunda porción están conectadas covalentemente. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la primera porción y la segunda porción están conectadas de forma no covalente. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción es una molécula bioactiva. En una realización de cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria, la segunda porción es un fármaco polipeptídico o no polipeptídico terapéutico.In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the first portion and the second portion are covalently linked. In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the first portion and the second portion are non-covalently connected. In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the second portion is selected from the group consisting of a small molecule, a nucleic acid, a short polypeptide, and a protein. In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the second portion is a bioactive molecule. In one embodiment of any of the chimeric molecules described herein, the second portion is a therapeutic polypeptide or non-polypeptide drug.

La divulgación se refiere adicionalmente a cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria que muestra una unión significativamente mejorada del B-Hc modificado a SytII humana y/o una unión significativamente reducida de B-Hc modificado a Syt I humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación o las mutaciones por sustitución.The disclosure further relates to any of the BoNT polypeptides, polypeptides, or chimeric molecules described herein that exhibit significantly enhanced binding of modified B-Hc to human SytII and/or significantly reduced binding of modified B-Hc to human Syt. human I compared to an identical molecule lacking the substitution mutation(s).

La divulgación se refiere adicionalmente a cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria en donde la mutación por sustitución produce una unión significativamente mejorada a SytII humana y/o una unión significativamente mejorada a SytI humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la mutación o las mutaciones por sustitución.The disclosure further relates to any of the BoNT polypeptides, polypeptides, or chimeric molecules described herein wherein the substitution mutation results in significantly enhanced binding to human SytII and/or significantly enhanced binding to human SytI compared to a identical molecule that lacks the substitution mutation(s).

Asimismo se describe en la presente memoria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria. Asimismo se describe en la presente memoria un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria. Asimismo se describe en la presente memoria una célula que comprende el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de NTBo, polipéptido o molécula quimérica descritos en la presente memoria, o el vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico.Also disclosed herein is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide, or chimeric molecule disclosed herein. Also disclosed herein is a nucleic acid vector comprising the nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide, or chimeric molecule disclosed herein. Also described herein is a cell comprising the nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide, polypeptide, or chimeric molecule described herein, or the nucleic acid vector comprising the nucleic acid.

Asimismo se describe en la presente memoria una célula que expresa cualquiera de los polipéptidos de NTBo, polipéptidos o moléculas quiméricas descritos en la presente memoria.Also described herein is a cell that expresses any of the BoNT polypeptides, polypeptides, or chimeric molecules described herein.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos en la presente memoria.Also disclosed herein is a pharmaceutical composition comprising any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides disclosed herein.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria.Also disclosed herein is a pharmaceutical composition comprising any of the polypeptides disclosed herein.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las moléculas quiméricas descritas en la presente memoria.Also described herein is a pharmaceutical composition comprising any of the chimeric molecules described herein.

Asimismo se describe en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos o vectores de ácido nucleico descritos en la presente memoria.Also described herein is a pharmaceutical composition comprising any of the nucleic acids or nucleic acid vectors described herein.

En una realización de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.In one embodiment of any of the pharmaceutical compositions described herein, the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

Asimismo se describe en la presente memoria un kit que comprende cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria y las instrucciones para la administración terapéutica de la composición farmacéutica.Also described herein is a kit comprising any of the pharmaceutical compositions described herein and instructions for therapeutic administration of the pharmaceutical composition.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para producir cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) descritos en la presente memoria, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula que expresa el polipéptido de NTBo en condiciones en las que se produce dicho polipéptido de NTBo. En una realización, el método comprende adicionalmente una o más de las etapas de recuperación del polipéptido de NTBo del cultivo, purificación del polipéptido de NTBo, activación del polipéptido de NTBo y/o formulación del polipéptido de NTBo.Also described herein is a method for producing any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides described herein, the method comprising the steps of culturing the cell expressing the BoNT polypeptide under conditions in which said BoNT polypeptide. In one embodiment, the method further comprises one or more of the steps of recovering the BoNT polypeptide from culture, BoNT polypeptide purification, BoNT polypeptide activation, and/or BoNT polypeptide formulation.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para tratar una afección asociada con actividad neuronal no deseada que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de NTBo descrito en la presente memoria a un sujeto para que contacte de ese modo con una o más neuronas que presentan actividad neuronal no deseada, para tratar así la afección. En una disposición descrita, la afección se selecciona del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica (es decir, todas las enfermedades que implican incontinencia urinaria, tales como p. ej. hiperactividad neurogénica del detrusor o vejiga hiperactiva idiopática), anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos de músculos, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor neuropático, dolor inflamatorio, dolor de cabeza (tal como p. ej., migraña), picazón (prurito), acné y afecciones dermatológicas o estéticas/cosméticas.Also described herein is a method of treating a condition associated with unwanted neuronal activity comprising administering a therapeutically effective amount of the BoNT polypeptide described herein to a subject thereby to contact one or more neurons that exhibit unwanted neural activity, thereby treating the condition. In one arrangement described, the condition is selected from the group consisting of spasmodic dysphonia, spasmodic torticollis, laryngeal dystonia, oromandibular dysphonia, lingual dystonia, cervical dystonia, focal hand dystonia, blepharospasm, strabismus, hemifacial spasm, eyelid disorder, paralysis spasticity, focal spasticity and other voice disorders, spasmodic colitis, neurogenic bladder (i.e. all conditions involving urinary incontinence, such as e.g. neurogenic detrusor overactivity or idiopathic overactive bladder), anismus, spasticity of extremities , tics, tremors, bruxism, anal fissure, achalasia, dysphagia and other disorders of muscle tone and other disorders characterized by involuntary movements of muscle groups, lacrimation, hyperhidrosis, excessive salivation, excessive gastrointestinal secretions, secretory disorders, pain due to muscle spasms, neuropathic pain, inflammatory pain, headache ( such as p. migraine), itching (pruritus), acne and dermatological or aesthetic/cosmetic conditions.

Otra disposición descrita se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo) o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos en la presente memoria para su uso en medicina.Another disclosed arrangement relates to any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides or pharmaceutical compositions, or chimeric molecules, or polypeptides described herein for use in medicine.

Otra disposición descrita se refiere a cualquiera de los polipéptidos de neurotoxina botulínica (NTBo), o las composiciones farmacéuticas, o las moléculas quiméricas, o los polipéptidos descritos en la presente memoria, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada.Another disclosed provision relates to any of the botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptides, or pharmaceutical compositions, or chimeric molecules, or polypeptides described herein, for use in treating a condition associated with non-neuronal activity. desired.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para identificar un dominio de unión al receptor modificado de la neurotoxina botulínica para la unión a un receptor que comprende expresar el dominio de unión al receptor modificado como una primera proteína de fusión con la subunidad T18 de la adenilato ciclasa bacteriana en un ensayo de 2 híbridos, y expresar el receptor como una segunda proteína de fusión con la subunidad T25 de la adenilato ciclasa bacteriana en el ensayo de 2 híbridos, analizar una colonia de E. coli clonal que expresa tanto la primera como la segunda proteínas de fusión para detectar la presencia de una indicación positiva por encima de un control negativo, e identificar el dominio de unión al receptor modificado expresado por la colonia que presenta la indicación positiva como unión al receptor. En una realización, la indicación positiva es el desarrollo de color. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el método comprende adicionalmente la etapa de analizar la colonia para la indicación positiva frente a un control débilmente positivo e identificar adicionalmente el dominio de unión al receptor modificado expresado por la colonia que muestra la indicación positiva por encima del control débilmente positivo como unión al receptor con alta afinidad. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el método se realiza con una biblioteca de dominios de unión al receptor modificados, cada uno de los cuales se expresa dentro de las respectivas colonias. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el receptor es humano. En una realización de los métodos descritos en la presente memoria, el dominio de unión al receptor modificado comprende una o más mutaciones por sustitución, en donde una de las mutaciones por sustitución corresponde a una mutación en el serotipo B, cepa 1, seleccionada del grupo que consiste en: E1191M, E1191Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P y S1199Y.Also described herein is a method for identifying a modified receptor-binding domain of botulinum neurotoxin for binding to a receptor comprising expressing the modified receptor-binding domain as a first fusion protein with the T18 subunit of the neurotoxin. bacterial adenylate cyclase in a 2-hybrid assay, and expressing the receptor as a second fusion protein with the T25 subunit of bacterial adenylate cyclase in the 2-hybrid assay, analyze a clonal E. coli colony expressing both the first and the second fusion proteins to detect the presence of a positive indication above a negative control, and to identify the modified receptor binding domain expressed by the colony displaying the positive indication as binding to the receptor. In one embodiment, the positive indication is color development. In one embodiment of the methods described herein, the method further comprises the step of analyzing the colony for the positive indication against a weakly positive control and further identifying the modified receptor binding domain expressed by the colony showing the indication. positive over weakly positive control as high affinity receptor binding. In one embodiment of the methods described herein, the method is performed with a library of modified receptor binding domains, each of which is expressed within respective colonies. In one embodiment of the methods described herein, the recipient is human. In one embodiment of the methods described herein, the modified receptor binding domain comprises one or more substitution mutations, wherein one of the substitution mutations corresponds to a mutation in serotype B, strain 1, selected from the group consisting of: E1191M, E1191Q, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199F, S1199L W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P and S1199Y.

Breve descripción de los dibujosBrief description of the drawings

La Figura 1A - Figura 1D (datos publicados para antecedentes) muestran modelos esquemáticos de cómo las NTBo se dirigen a las neuronas (Figura 1A), su estructura proteica general (Figura 1B), una lista de receptores identificados (Figura 1C) y el modelo estructural para NTBo/B que se une a sus receptores Syt y gangliósidos (Figura 1D). (Figura 1A) Una vista esquemática de las acciones de NTBo: las NTBo reconocen las neuronas al unirse a sus receptores específicos (etapa 1), entran en las neuronas a través de la endocitosis mediada por receptores (etapa 2), las cadenas ligeras de las NTBo se translocan a continuación a través de las membranas endosomales hacia el citosol (etapa 3), donde estas cadenas ligeras actúan como proteasas para escindir las proteínas diana del anfitrión (etapa 4). La Figura 1A está adaptada de Arnon, S. et al, JAMA, 285:1059, 200124. (Figura 1B) Las NTBo se componen de una cadena ligera y una cadena pesada, conectadas mediante un enlace disulfuro. La cadena pesada se puede dividir adicionalmente en dos dominios: el dominio de translocación (HN) y el dominio de unión al receptor (HC). Estos dominios funcionales se pueden cambiar entre diferentes NTBo. Por ejemplo, se puede utilizar NTBo/B-Hc para reemplazar NTBo/A-Hc para generar toxinas quiméricas. (Figura 1C) Una lista de receptores de toxinas identificados. (Figura 1D) Un modelo estructural que muestra la unión de NTBo/B a su receptor de proteína, Syt (I/II), así como a su co-receptor de lípidos, gangliósidos, sobre la superficie celular. La identificación de la Figura 1D está adaptada de Chai et al., Nature, 444:1096, 200631. Figure 1A - Figure 1D (published data for background) show schematic models of how BoNTs target neurons (Figure 1A), their general protein structure (Figure 1B), a list of identified receptors (Figure 1C), and the model structure for BoNT/B that binds to its Syt receptors and gangliosides (Figure 1D). (Figure 1A) A schematic view of BoNT actions: BoNT recognize neurons by binding to their specific receptors (stage 1), enter neurons via receptor-mediated endocytosis (stage 2), light chains of BoNTs then translocate across endosomal membranes into the cytosol (step 3), where these light chains act as proteases to cleave host target proteins (step 4). Figure 1A is adapted from Arnon, S. et al, JAMA, 285:1059, 200124. (Figure 1B) BoNTs are composed of a light chain and a heavy chain, connected by a disulfide bond. The heavy chain can be further divided into two domains: the translocation domain (HN) and the receptor binding domain (HC). These functional domains can be switched between different BoNTs. For example, BoNT/B-Hc can be used to replace BoNT/A-Hc to generate chimeric toxins. (Figure 1C) A list of identified toxin receptors. (Figure 1D) A structural model showing the binding of BoNT/B to its protein receptor, Syt (I/II), as well as to its lipid co-receptor, gangliosides, on the cell surface. The identification of Figure 1D is adapted from Chai et al., Nature, 444:1096, 200631.

La Figura 2A - Figura 2D muestran datos anteriores adaptados de la bibliografía publicada que indica que Syt II humana no es un receptor eficaz para NTBo/B, D-C y G. (A) Syt II humana se diferencia de Syt II de ratón/rata en un solo resto dentro del sitio de unión de la toxina (resto 54 en Syt II de ratón, 51 en Syt II humana). (La SytII (ratón) que se muestra es SEQ ID NO: 1 y la SytII (humana) que se muestra es SEQ ID NO: 14). (Figura 2^b) Syt II de ratón recombinante 1-87 (m-Syt II) etiquetada con glutatión S-transferasa (GST) y un mutante de Syt II 1-87 de ratón que imita Syt II humana (F54^l, aquí y posteriormente designada h-Syt II para simplificar el texto) fueron inmovilizadas sobre cuentas de glutatión-sefarosa, y se utilizaron para precipitar NTBo/B, NTBo/D-C o NTBo/G, con o sin la presencia de gangliósido (Gangl). Las tres toxinas se unen a m-Syt II 1-87, pero no a h-Syt II en los ensayos de precipitación. (Figura 2C) Las neuronas del hipocampo de rata cultivadas solo expresan Syt I pero no Syt II8. Por lo tanto, modificar Syt I para reducir su expresión (KD) genera neuronas sin receptores de toxinas endógenas. A continuación, se expresaron m-Syt II y h-Syt II de longitud completa en neuronas del hipocampo Syt I KD, y estas neuronas se expusieron a NTBo/B (20 nM, exposición de 5 min, incubación de 24 horas) o NTBo/D-C (0,3 nM, 5 min de exposición, 6 horas de incubación) o NTBo/G (40 nM, 5 min de exposición, 24 horas de incubación). Se encontró que h-Syt II era significativamente menos eficaz para mediar la entrada de NTBo/B, NTBo/D-C y NTBo/G en las neuronas con Syt I KD en comparación con Syt II de ratón de tipo salvaje, como lo demuestran los grados de escisión del sustrato de la toxina sinaptobrevina (Syb). (Figura 2D) Se utilizaron Syt I 1-83 de rata y Syt I 1-80 humana para precipitar NTBo/B, NTBo/D-C y NTBo/G, como se describe en el panel C. Syt I humana medió niveles de unión a toxina similares a los de Syt I de rata para las tres toxinas. Esta figura está adaptada de la publicación reciente de los autores de la presente invención: Peng et al., J. Cell Science, 201213.Figure 2A - Figure 2D show earlier data adapted from published literature indicating that human Syt II is not an efficient receptor for BoNT/B, DC and G. (A) Human Syt II differs from mouse/rat Syt II in a single residue within the toxin binding site (residue 54 in mouse Syt II, 51 in human Syt II). (SytII (mouse) shown is SEQ ID NO: 1 and SytII (human) shown is SEQ ID NO: 14). (Figure 2b) Mouse ^Syt II recombinant 1-87 (m-Syt II) tagged with glutathione S-transferase (GST) and a mouse Syt II 1-87 mutant that mimics human Syt II (F54 ^l , here and hereafter designated h-Syt II to simplify the analysis). text) were immobilized on glutathione-sepharose beads, and were used to precipitate BoNT/B, BoNT/DC or BoNT/G, with or without the presence of ganglioside (Gangl). All three toxins bind to m-Syt II 1-87, but not to h-Syt II in precipitation assays. (Figure 2C) Cultured rat hippocampal neurons only express Syt I but not Syt II8. Therefore, modifying Syt I to reduce its expression (KD) generates neurons without receptors for endogenous toxins. Full-length m-Syt II and h-Syt II were then expressed in Syt I KD hippocampal neurons, and these neurons were exposed to BoNT/B (20 nM, 5 min exposure, 24 hour incubation) or BoNT /DC (0.3 nM, 5 min exposure, 6 h incubation) or BoNT/G (40 nM, 5 min exposure, 24 h incubation). h-Syt II was found to be significantly less effective in mediating BoNT/B, BoNT/DC, and BoNT/G entry into Syt I KD neurons compared to wild-type mouse Syt II, as evidenced by the degrees cleavage of the toxin synaptobrevin (Syb) substrate. (Figure 2D) Rat Syt I 1-83 and human Syt I 1-80 were used to precipitate BoNT/B, BoNT/DC, and BoNT/G, as described in panel C. Human Syt I measured binding levels to toxin similar to those of rat Syt I for all three toxins. This figure is adapted from our recent publication: Peng et al., J. Cell Science, 201213.

La Figura 3A - Figura 3B muestran los restos ubicados en la interfaz de unión de Syt II sobre NTB^o/B-H^c, que son candidatos para la mutagénesis dirigida al sitio para modificar la afinidad de unión. (Figura 3A) Aquí se muestra una vista de primer plano de la interfaz de unión entre NTBoB-Hc y Syt II de ratón. Los restos en NTBoB-Hc que contribuyen a la unión están marcados en negrita, mientras que los restos en Syt II no están en negrita. El resto F54 en Syt II, en el medio y mostrado en un tamaño de letra ligeramente mayor, cambia al resto L en Syt II humana. (Figura 3B) Una lista de 19 restos clave en NTBo/B que forman el bolsillo de unión del dominio de unión de Syt II en NTBo/B. Estos restos son candidatos para la mutagénesis dirigida al sitio.Figure 3A - Figure 3B show residues located at the Syt II binding interface on NTB ^or /BH ^c , which are candidates for site-directed mutagenesis to modify binding affinity. (Figure 3A) A close-up view of the binding interface between NTBoB-Hc and mouse Syt II is shown here. Residues in NTBoB-Hc that contribute to binding are marked in bold, while residues in Syt II are not in bold. Residue F54 in Syt II, in the middle and shown in slightly larger font size, changes to residue L in human Syt II. (Figure 3B) A list of 19 key residues in BoNT/B that form the binding pocket of the Syt II binding domain in BoNT/B. These residues are candidates for site-directed mutagenesis.

La Figura 4A - Figura 4B son ilustraciones del sistema de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (BACTH) que se utiliza para escrutar mutantes de NTBoB-Hc para determinar su capacidad para unirse a Syt II humana. (Figura 4A) Se genera una reserva de mutantes de NTBoB-Hc que cubren los 20 aminoácidos diferentes en la posición seleccionada mediante amplificación por PCR con cebadores que contienen trinucleótidos aleatorios (NNN) en el sitio seleccionado. Se generaron un total de 19 reservas distintas para los 19 restos seleccionados en la Figura 3B. (Figura 4B) Una ilustración esquemática del sistema BACTH. Brevemente, la adenilato ciclasa bacteriana se divide en dos dominios, denominados T25 y T18. T25 se fusiona con Syt II humana (restos 1-87) que contiene el sitio de unión de la toxina, mientras que T18 se fusiona con NTBoB-Hc generada como se describe en la Figura 4A. Estas dos proteínas de fusión se codifican en dos plásmidos separados y se transforman conjuntamente en la misma bacteria. La unión de NTBoB-Hc mutada a Syt II humana reúne los dominios T25 y T18 en bacterias, lo que restaura la actividad de la adenilato ciclasa bacteriana. Esto conduce a la producción de AMPc en bacterias, lo que activa la proteína CAP y desencadena la expresión del gen informador lacZ que codifica la p-galactosidasa. La actividad de la p-galactosidasa conduce a colonias de color azul sobre las placas de X-gal que pueden identificarse fácilmente. Los plásmidos que codifican NTBoB-Hc se pueden extraer a continuación de las colonias de color azul y se pueden secuenciar para identificar las mutaciones específicas en NTBoB-Hc.Figure 4A - Figure 4B are illustrations of the bacterial adenylate cyclase two-hybrid (BACTH) system being used to screen NTBoB-Hc mutants for their ability to bind human Syt II. (Figure 4A) A pool of NTBoB-Hc mutants covering the 20 different amino acids at the selected position is generated by PCR amplification with primers containing random trinucleotides (NNN) at the selected site. A total of 19 distinct pools were generated for the 19 selected residues in Figure 3B. (Figure 4B) A schematic illustration of the BACTH system. Briefly, bacterial adenylate cyclase is divided into two domains, designated T25 and T18. T25 fuses with human Syt II (residues 1-87) containing the toxin binding site, while T18 fuses with NTBoB-Hc generated as depicted in Figure 4A. These two fusion proteins are encoded on two separate plasmids and co-transformed in the same bacterium. Binding of mutated NTBoB-Hc to human Syt II brings together the T25 and T18 domains in bacteria, restoring bacterial adenylate cyclase activity. This leads to the production of cAMP in bacteria, which activates the CAP protein and triggers expression of the lacZ reporter gene encoding p-galactosidase. The activity of p-galactosidase leads to blue colonies on X-gal plates that can be easily identified. Plasmids encoding NTBoB-Hc can then be extracted from blue colonies and sequenced to identify specific mutations in NTBoB-Hc.

La Figura 5A - Figura 5B son tablas que resumen los resultados del escrutinio BACTH de los mutantes de NTBoB-H^c. (Figura 5A) Lista de colonias totales y número de colonias de color azul para cada reserva de mutantes de NTBoB-Hc fusionados con T18, expresados conjuntamente en bacterias con Syt II humana fusionada con T25. Según la ecuación de Clark-Carbon, el número total de colonias debe ser superior a 380 para lograr 99,8% de posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos posibles en una sola posición. cuatro posiciones dieron como resultado un número significativo de colonias de color azul (68 horas después del cultivo en placa). (Figura 5B) Los plásmidos de las colonias de color azul identificadas en la Figura 5A se extrajeron y secuenciaron para determinar el resto específico introducido en la posición indicada en NTBo/B-Hc. Se enumeran los restos identificados. Es de destacar que las colonias de color azul se dividieron adicionalmente en "colonias de color azul oscuro", que se encontraron con la posición 1191 de NTBo/B-Hc y "colonias de color azul claro", que se encontraron con las posiciones 1183, 1199 y 1178. El experimentador juzgó artificialmente el término "colonias de color azul oscuro" frente a "colonias de color azul claro" basándose en las diferencias entre el color azul de las colonias.Figure 5A - Figure 5B are tables summarizing the results of BACTH screening of NTBoB-H ^c mutants. (Figure 5A) List of total colonies and number of blue colonies for each pool of T18-fused NTBoB-Hc mutants co-expressed in bacteria with T25-fused human Syt II. According to the Clark-Carbon equation, the total number of colonies must be greater than 380 to achieve a 99.8% chance of covering all 20 possible amino acids at a single position. four positions resulted in a significant number of blue colonies (68 hours after plating). (Figure 5B) Plasmids from the blue colonies identified in Figure 5A were extracted and sequenced for the specific moiety introduced at the indicated position in BoNT/B-Hc. Identified remains are listed. Of note, the blue colonies were further divided into "dark blue colonies", which were found at position 1191 of BoNT/B-Hc, and "light blue colonies", which were found at position 1183 , 1199 and 1178. The experimenter artificially judged the term "dark blue colonies" versus "light blue colonies" based on the differences between the blue color of the colonies.

La Figura 6A - Figura 6B muestran resultados experimentales que indican la medición semicuantitativa de las interacciones entre los mutantes de NTBoB-Hc indicados con Syt II humana en el ensayo BACTH. (Figura 6A) La actividad p-galactosidasa se midió a partir de productos lisados de bacterias que expresan tanto Syt II humana fusionada con T25 como los mutantes de NTBoB-Hc indicados fusionados con T18. La actividad p-galactosidasa probablemente refleja la fuerza de las interacciones entre Syt II humana y NTBo/B-Hc. WT NTBoB-Hc sirvió como control. El intercambio de los restos E1191 por M, C, V o Q proporcionó la expresión más fuerte de p-galactosidasa. El intercambio de los restos E1191 por S/A/T/N, Y1183 por C/P, S1199 por W/E/Y/H, W1178 por Y/Q/S mostró ligeros aumentos de las interacciones. N = 6 muestras/grupo. (Figura 6B) La unión de los mutantes de NTBoB-Hc indicados a Syt II de ratón (m-Syt II) o Syt II humana (h-Syt II), cuyos sitios de unión se muestran en la Figura 2A, se sometió a ensayo mediante un ensayo de precipitación. El intercambio de los restos E1191 por M, C, V o Q también mostró la unión más fuerte a h-Syt II.Figure 6A - Figure 6B show experimental results indicating semi-quantitative measurement of interactions between the indicated NTBoB-Hc mutants with human Syt II in the BACTH assay. (FIG. 6A) p-galactosidase activity was measured from lysates of bacteria expressing both T25-fused human Syt II and the indicated T18-fused NTBoB-Hc mutants. The p-galactosidase activity likely reflects the strength of the interactions between human Syt II and BoNT/B-Hc. WT NTBoB-Hc served as a control. Exchanging residues E1191 for M, C, V or Q gave the strongest expression of p-galactosidase. The exchange of residues E1191 for S/A/T/N, Y1183 for C/P, S1199 for W/E/Y/H, W1178 for Y/Q/S showed slight increases in interactions. N = 6 samples/group. (Figure 6B) Binding of the indicated NTBoB-Hc mutants to mouse Syt II (m-Syt II) or human Syt II (h-Syt II), whose binding sites are shown in Figure 2A, was subjected to assay by a precipitation assay. Swapping residues E1191 for M, C, V or Q also showed the strongest binding to h-Syt II.

La Figura 7A - Figura 7B muestran los resultados experimentales del escrutinio de mutaciones secundarias además de la posición E1191 que pueden potenciar la unión a h-Syt II. (Figura 7A) Se crearon mutaciones dobles combinando E1191M con los otros diez cambios de restos identificados en la Figura 5B en las posiciones S1199/Y1183/W1178, respectivamente. Estas dobles mutaciones se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para unirse a h-Syt II mediante un ensayo de precipitación. Los mutantes que muestran una fuerte unión a h-Syt II se indican con un * (Figura 7B). Las mutaciones propuestas para la combinación que pueden mejorar la afinidad entre NTBo/B y Syt II humana se enumeran en la tabla.Figure 7A - Figure 7B show the experimental results of screening for secondary mutations other than position E1191 that can enhance h-Syt II binding. (Figure 7A) Double mutations were created combining E1191M with the other ten residue changes identified in Figure 5B at positions S1199/Y1183/W1178, respectively. These double mutations were tested for their ability to bind h-Syt II by a precipitation assay. Mutants showing strong binding to h-Syt II are indicated by * (FIG. 7B). The mutations proposed for the combination that can improve the affinity between BoNT/B and human Syt II are listed in the table.

La Figura 8A - Figura 8B muestran la medición cuantitativa de la afinidad de unión entre la NTBoB-HC indicada y h-Syt II. (Figura 8A) Se midió la unión de h-Syt II etiquetada con GST a WT NTB^oB-H^cetiquetada con His y E1191M/S1199Y mediante un ensayo de interferometría de biocapa. Brevemente, se cargaron biosensores anti-GST con GST-h-Syt II. Los biosensores cargados se incubaron con proteínas NTBoB-Hc 1 pM para medir la cinética de asociación, seguido de etapas de lavado para medir la cinética de disociación. Se muestran las curvas representativas de asociación y disociación. (Figura 8B) Las afinidades de unión entre la NTBo/B-Hc indicada y Syt II se midieron mediante un ensayo de interferometría de biocapa como se describe en el panel A. Se calcularon los parámetros cinéticos (kon y koff) y las afinidades de unión generales (Kd) a partir de un ajuste no lineal de curvas de asociación y disociación. La unión de WT NTBoB-Hc a h-Syt II es demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una estimación de K^dmás allá del límite de detección (> 20 pM), mientras que la mayoría de los mutantes dobles y triples mostraron un drástico aumento de la afinidad de unión en el intervalo de 0,59 a 4,30 pM. Figure 8A - Figure 8B show the quantitative measurement of the binding affinity between the indicated NTBoB-HC and h-Syt II. (FIG. 8A) Binding of GST-tagged h-Syt II to His-tagged WT NTB ^or BH ^c and E1191M/S1199Y was measured by biolayer interferometry assay. Briefly, anti-GST biosensors were loaded with GST-h-Syt II. Loaded biosensors were incubated with 1 pM NTBoB-Hc proteins to measure association kinetics, followed by wash steps to measure dissociation kinetics. Representative association and dissociation curves are shown. (Figure 8B) Binding affinities between the indicated BoNT/B-Hc and Syt II were measured by biofilm interferometry assay as described in panel A. Kinetic parameters (kon and koff) and binding affinities were calculated. general binding (Kd) from a non-linear fit of association and dissociation curves. The binding of WT NTBoB-Hc to h-Syt II is too weak to be reliably determined, with an estimate of K ^d beyond the limit of detection (>20 pM), while most double and triple mutants showed a dramatic increase in binding affinity in the range of 0.59 to 4.30 pM.

La Figura 9A - Figura 9C muestran resultados experimentales que indican que los mutantes de NTBo/B-Hc seleccionados tienen una mejor unión a Syt I humana. (Figura 9A) Se purificaron WT NTBoB-Hc y el mutante E1191M como proteínas recombinantes etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) y se incubaron con h-Syt I (1-80) etiquetada con GST inmovilizada, con o sin la presencia de gangliósidos co-receptores (Gangl). La unión de WT NTBo/B-Hc a h-Syt I requiere la presencia de gangliósidos co-receptores, lo que indica interacciones relativamente débiles entre WT NTBoB-Hc y h-Syt. El mutante E1191M puede unirse a h-Syt I sin gangliósidos, mostrando una mejor afinidad de unión a h-Syt I. (Figura 9B) Se midió la unión de NTBoB-Hc WT y mutante indicado a h-Syt I mediante interferometría de biocapa como se describe en la Figura 8A. (Figura 9^c) Los parámetros cinéticos (kon y koff) y las afinidades generales (Kd) para WT NTBo/B-Hc, NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y) ("B Hc MY") y NTBoB-Hc (E1191V/S1199Y) ("B Hc VY") a h-Syt I se midieron y se calcularon como se describe en la Figura 8B. La unión de WT NTBoB-Hc (B Hc wt) a h-Syt I no se puede determinar de manera confiable, con una KD estimada por encima del límite de detección (> 20 pM). NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y, B Hc, MY) y NTBoB-Hc (E1191V/S1199Y, B Hc VY) mostraron un aumento drástico de la afinidad de unión, con una K^da 2,9 pM y 5,82 pM, respectivamente.Figure 9A - Figure 9C show experimental results indicating that selected BoNT/B-Hc mutants have better binding to human Syt I. (Figure 9A) WT NTBoB-Hc and mutant E1191M as His6-tagged recombinant proteins ("His6" disclosed as SEQ ID NO: 13) were purified and incubated with immobilized GST-tagged h-Syt I (1-80), with or without the presence of ganglioside co-receptors (Gangl). Binding of WT NTBo/B-Hc to h-Syt I requires the presence of ganglioside co-receptors, indicating relatively weak interactions between WT NTBoB-Hc and h-Syt. Mutant E1191M can bind h-Syt I without gangliosides, showing better binding affinity to h-Syt I. (Figure 9B) Binding of NTBoB-Hc WT and indicated mutant to h-Syt I was measured by biofilm interferometry. as described in Figure 8A. (Figure ^9c ) The kinetic parameters (kon and koff) and overall affinities (Kd) for WT NTBo/B-Hc, NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y) ("B Hc MY"), and NTBoB-Hc (E1191V/ S1199Y) ("B Hc VY") to h-Syt I were measured and calculated as described in Figure 8B. The binding of WT NTBoB-Hc (B Hc wt) to h-Syt I cannot be reliably determined, with an estimated KD above the detection limit (>20 pM). NTBoB-Hc (E1191M/S1199Y, B Hc, MY) and NTBoB-Hc (E1191V/S1199Y, B Hc VY) showed a dramatic increase in binding affinity, with K ^d at 2.9 pM and 5.82 pM , respectively.

La Figura 10A - Figura 10B son fotografías del análisis de inmunotinción in situ que indican que H^cB^mymostró una unión robusta a las neuronas humanizadas que expresaban h-Syt II. (Figura 10A) Se crearon neuronas humanizadas modificando Syt I endógena para reducir su expresión y expresando h-Syt II de longitud completa en neuronas corticales de rata cultivadas. Las neuronas que expresan m-Syt II o m-Syt II (F54L) de longitud completa sirvieron como controles adicionales. Estas neuronas fueron expuestas a WT HcB, seguido de análisis de inmunotinción. El HcB unido se detectó a través de una etiqueta HA fusionada a HcB. La sinapsina se marcó como marcador de terminales presinápticos. WT HcB se unió a las sinapsis de las neuronas WT pero no a las neuronas Syt I KD. La expresión de m-Syt II de longitud completa mediante transducción lentiviral restauró la unión de HcB, mientras que la expresión de m-Syt II de longitud completa (F54L) o h-Syt II de longitud completa no logró rescatar la unión. (Figura 10B) Syt I KD también abolió la unión de H^cB^mya las neuronas. La unión se rescató mediante la expresión de m-Syt II, m-Syt II (F54L) y h-Syt II de longitud completa.Figure 10A - Figure 10B are photographs of in situ immunostaining analysis indicating that H ^c B ^my showed robust binding to humanized neurons expressing h-Syt II. (FIG. 10A) Humanized neurons were created by modifying endogenous Syt I to reduce its expression and expressing full-length h-Syt II in cultured rat cortical neurons. Neurons expressing full-length m-Syt II or m-Syt II (F54L) served as additional controls. These neurons were exposed to WT HcB, followed by immunostaining analysis. Bound HcB was detected via an HA tag fused to HcB. Synapsin was labeled as a marker for presynaptic terminals. WT HcB bound to synapses on WT neurons but not Syt I KD neurons. Expression of full-length m-Syt II by lentiviral transduction restored HcB binding, whereas expression of full-length m-Syt II (F54L) or full-length h-Syt II failed to rescue binding. (FIG. 10B) Syt I KD also abolished H ^c B ^my binding to neurons. The binding was rescued by expression of full-length m-Syt II, m-Syt II (F54L), and h-Syt II.

La Figura 11A - Figura 11c son resultados experimentales que indican que NTBo/Bmy mostró una mayor eficacia en el bloqueo de la neurotransmisión en neuronas humanizadas. (Figura 11 A) Se crearon neuronas humanizadas como se describe en la Figura 11A. Estas neuronas se expusieron a un gradiente de concentraciones de WT NTBo/B o NTBo/BMY de longitud completa durante 24 horas. Los productos lisados celulares se recogieron y se sometieron a análisis de inmunotransferencia. La p-tubulina sirvió como control de carga interno. Se escindió más VAMP2 por NTBo/Bmi que por WT NTBo/B a las mismas concentraciones, lo que indica que NTBo/Bmy entró en las neuronas de manera más eficiente que WT NTBo/B. Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de concentraciones de WT NTBo/B o NTB^o/B^mydurante 24 horas y después se registró la actividad de mIPSc mediante un enfoque de pinzamiento zonal de células completas. (Figura 11B) muestra registros de mIPSc representativos con toxinas 30 pM. (Figura 11^c) representa las actividades de mIPSc frente a las concentraciones de toxina, normalizadas a neuronas que no estuvieron expuestas a ninguna toxina. La concentración inhibidora semimáxima (c Isü) es 89 pM para WT NTBo/B y 7,8 pM para NTBo/Bmy, lo que demuestra que la mejor unión a los receptores humanos dio como resultado una mayor eficacia de la toxina a niveles funcionales en las neuronas. Figure 11A - Figure 11c are experimental results indicating that BoNT/Bmy showed greater efficacy in blocking neurotransmission in humanized neurons. (Figure 11A) Humanized neurons were created as described in Figure 11A. These neurons were exposed to a full-length WT BoNT/B or WT BoNT/BMY concentration gradient for 24 hours. Cell lysates were collected and subjected to immunoblot analysis. p-tubulin served as internal loading control. More VAMP2 was cleaved by BoNT/Bmi than by WT BoNT/B at the same concentrations, indicating that BoNT/Bmy entered neurons more efficiently than WT BoNT/B. Humanized neurons were exposed to a concentration gradient of WT BoNT/B or NTB ^o /B ^my for 24 hours and then mIPSc activity was recorded by a whole cell patch-clamp approach. (Figure 11B) shows representative mIPSc recordings with 30 pM toxins. (FIG. 11c) depicts ^mIPSc activities versus toxin concentrations, normalized to neurons that were not exposed to any toxin. The half-maximal inhibitory concentration (cIsü) is 89 pM for WT BoNT/B and 7.8 pM for BoNT/Bmy, demonstrating that better binding to human receptors resulted in higher toxin efficacy at functional levels in neurons.

La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de NTBo/B-Hc (cepa 1; cepa NTBo/B1 Okra). Restos 857-1291 de NTBo/B, cepa 1, GenBank: AB232927.1. (SEQ ID NO: 2).Figure 12 is the amino acid sequence of BoNT/B-Hc (strain 1; BoNT/B1 Okra strain). Residues 857-1291 of BoNT/B, strain 1, GenBank: AB232927.1. (SEQ ID NO: 2).

La Figura 13 es la secuencia de ácido nucleico que codifica los restos 857-1291 de NTBo/B-Hc (cepa B1, cepa Okra) de NTBo/B, cepa B1, basada en GenBank: AB232927.1), que se ha optimizado para la expresión en E. coli. (SEQ ID NO: 3)Figure 13 is the nucleic acid sequence encoding residues 857-1291 of BoNT/B-Hc (B1 strain, Okra strain) from BoNT/B strain B1, based on GenBank: AB232927.1), which has been optimized for expression in E. coli. (SEQ ID NO: 3)

La Figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de c. botulinum serotipo A (1296 a.a.). (SEQ ID NO: 4) La Figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo B (1291 a.a.). (SEQ ID NO: 5) La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo C1 (1291 a.a.). (SEQ ID NO: 6) La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo D (1276 a.a.). (SEQ ID NO: 7) La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo E (1252 a.a.). (SEQ ID NO: 8)Figure 14 shows the amino acid sequence of c. botulinum serotype A (1296 aa). (SEQ ID NO: 4) Figure 15 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype B (1291 aa). (SEQ ID NO: 5) Figure 16 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype C1 (1291 aa). (SEQ ID NO: 6) Figure 17 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype D (1276 aa). (SEQ ID NO: 7) Figure 18 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype E (1252 aa). (SEQ ID NO: 8)

La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo F (1274 a.a.). (SEQ ID NO: 9)Figure 19 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype F (1274 aa). (SEQ ID NO: 9)

La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo G (1297 a.a.). (SEQ ID NO: 10) La Figura 21 muestra la secuencia de aminoácidos de C. botulinum serotipo B, Cepa Eklund 17B (NTBo/B4) (SEQ ID NO: 11) Genbank Ref: EF051570.1.Figure 20 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype G (1297 aa). (SEQ ID NO: 10) Figure 21 shows the amino acid sequence of C. botulinum serotype B, Eklund Strain 17B (NTBo/B4) (SEQ ID NO: 11) Genbank Ref: EF051570.1.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

Los aspectos de la invención se refieren a la generación de polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, que comprenden un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial (serotipo B (B-H^c)), y más particularmente al polipéptido de la neurotoxina de C. botulinum (NTBo) que presenta mejor unión a sus receptores humanos mediante la incorporación de un dominio de unión al receptor modificado, y ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. A partir de estos hallazgos, se puede crear una nueva generación de NTBo terapéuticas utilizando el dominio de unión al receptor modificado identificado en la presente memoria, con mejor eficacia y especificidad para dirigirse a neuronas humanas que las WT NTBo actualmente utilizadas.Aspects of the invention relate to the generation of polypeptides and nucleic acids encoding polypeptides, comprising a modified receptor-binding domain of Botulinum clostridial (serotype B (BH ^c )), and more particularly to the neurotoxin polypeptide of C. botulinum (BoNT) exhibiting improved binding to its human receptors by incorporation of a modified receptor-binding domain, and polypeptide-encoding nucleic acids. From these findings, a new generation of therapeutic BoNTs can be created using the modified receptor binding domain identified herein, with better efficacy and specificity for targeting human neurons than currently used WT BoNTs.

DefinicionesDefinitions

Como se emplea en la presente memoria, el término "afinidad de unión" significa qué tan fuerte es la actividad de unión de una molécula para un sistema receptor particular. En general, una alta afinidad de unión resulta de una mayor fuerza intermolecular entre un dominio de unión y su sistema receptor, mientras que una baja afinidad de unión implica menos fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor. La alta afinidad de unión implica un tiempo de residencia más largo para el dominio de unión en su sitio de unión al receptor que en el caso de una baja afinidad de unión. Como tal, una molécula con una alta afinidad de unión significa que se requiere una concentración más baja de esa molécula para ocupar al máximo los sitios de unión de un sistema receptor y desencadenar una respuesta fisiológica. Por el contrario, una afinidad de unión baja significa que se requiere una concentración relativamente alta de una molécula antes de que los sitios de unión al receptor de un sistema receptor estén ocupados al máximo y se logre la respuesta fisiológica máxima. Por tanto, una neurotoxina botulínica de la presente invención con una mayor actividad de unión debido a una afinidad de unión alta permitirá la administración de menores dosis de la toxina, reduciendo o previniendo así los efectos secundarios no deseados asociados con la dispersión de la toxina a zonas no elegidas como diana.As used herein, the term "binding affinity" means how strong a molecule's binding activity is for a particular receptor system. In general, high binding affinity results from a higher intermolecular force between a binding domain and its receptor system, while low binding affinity implies less intermolecular force between the ligand and its receptor. High binding affinity implies a longer residence time for the binding domain at its receptor binding site than is the case with low binding affinity. As such, a molecule with a high binding affinity means that a lower concentration of that molecule is required to maximally occupy the binding sites of a receptor system and trigger a physiological response. In contrast, low binding affinity means that a relatively high concentration of a molecule is required before the receptor binding sites of a receptor system are maximally occupied and maximal physiological response is achieved. Thus, a botulinum neurotoxin of the present invention with increased binding activity due to high binding affinity will allow administration of lower doses of the toxin, thus reducing or preventing undesirable side effects associated with dispersion of the toxin to untargeted areas.

Un parámetro que se utiliza a menudo para medir la afinidad de unión se define como Kd de unión. Debido a que la K^dse define como la razón entre la constante de disociación (Koff) y la constante de asociación (Kon), cuanto menor sea el valor de KD, mayor será la afinidad de unión.A parameter that is often used to measure binding affinity is defined as the Kd of binding. Because the ^Kd is defined as the ratio of the dissociation constant (Koff) to the association constant (Kon), the lower the KD value, the higher the binding affinity.

Como se emplea el término en la presente memoria, "unión significativamente mejorada" cuando se utiliza para describir la afinidad de unión de una molécula de neurotoxina de C. botulinum, o fragmento de unión de NTBo/B-Hc de la misma, de la presente invención a un receptor específico (p. ej., Syt II humana o Syt I humana), se refiere a un aumento en la afinidad de unión para un receptor específico que se incrementa sustancialmente (p. ej., en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la afinidad de unión de la molécula de tipo salvaje) en comparación con la versión no sustituida de la molécula. En una realización, la mejor unión de la molécula sustituida se demuestra por una afinidad de unión que tiene un orden de magnitud o más que la afinidad de unión de la molécula no sustituida (p. ej., la neurotoxina con una molécula de NTBo He de origen natural). Dicho de otra manera, la Kd de la molécula sustituida es un orden de magnitud o más menor que la K^dde la molécula no sustituida. En una realización, la mejor unión se demuestra por una afinidad de unión que es significativamente mayor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la afinidad de unión de la molécula no sustituida. Dicho de otra manera, la Kd de la molécula sustituida es significativamente menor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la K^dde la molécula no sustituida. En una realización, la mejor unión demostrada está en el intervalo de aproximadamente 0,59 pM a 5,82 pM de Kd. En una realización, la mejor unión demostrada está en el intervalo de aproximadamente 0,59 pM a 4,3 pM de K^d. En una realización, la mejor unión se demuestra por una K^dá 5,82 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una Kd á 4,30 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una Kd á 2,9 pM. En una realización, la mejor unión se demuestra por una K^dde aproximadamente 0,59 pM.As the term is used herein, "significantly enhanced binding" when used to describe the binding affinity of a C. botulinum neurotoxin molecule, or BoNT/B-Hc binding fragment thereof, to the present invention to a specific receptor (eg, human Syt II or human Syt I), refers to an increase in binding affinity for a specific receptor that is increased substantially (eg, by 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% of the binding affinity of the wild-type molecule) compared to the unsubstituted version of the molecule. In one embodiment, better binding of the substituted molecule is demonstrated by a binding affinity that is one order of magnitude or greater than the binding affinity of the unsubstituted molecule (eg, the neurotoxin with a BoNT molecule He of natural origin). Stated another way, the Kd of the substituted molecule is an order of magnitude or more lower than the ^Kd of the unsubstituted molecule. In one embodiment, better binding is demonstrated by a binding affinity that is significantly higher (eg, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, etc.) than the binding affinity of the unsubstituted molecule. Stated another way, the Kd of the substituted molecule is significantly lower (eg, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, etc.) than the ^Kd of the unsubstituted molecule. In one embodiment, the best binding demonstrated is in the range of about 0.59 pM to 5.82 pM Kd. In one embodiment, the best binding demonstrated is in the range of about 0.59 pM to 4.3 pM K ^d . In one embodiment, the best binding is demonstrated by a K ^d = 5.82 pM. In one embodiment, the best binding is demonstrated by a Kd of 4.30 pM. In one embodiment, the best binding is demonstrated by a Kd = 2.9 pM. In one embodiment, the best binding is demonstrated by a K ^d of approximately 0.59 pM.

En una realización, la K^dde la molécula sustituida para Syt II humana es á 10 pM, preferiblemente á 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 pM, más preferiblemente á 1 o 0,6 pM. En una realización, la K^dde la molécula sustituida para Syt I humana es á 10 pM, preferiblemente á 9, 8, 7, 6, 5, 4 pM, más preferiblemente á 3 pM. En una realización, la K^dde la molécula sustituida para Syt II humana es á 7 pM y la Kd de la molécula sustituida para Syt I humana es á 6 pM. En una realización preferida, la K^dde la molécula sustituida para Syt II humana es á 1 pM y la K^dde la molécula sustituida por Syt I humana es < 3 pM.In one embodiment, the K ^d of the substituted molecule for human Syt II is 10 pM, preferably 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 pM, more preferably 1 or 0.6 pM. In one embodiment, the K ^d of the substituted molecule for human Syt I is 10 pM, preferably 9.8, 7, 6, 5, 4 pM, more preferably 3 pM. In one embodiment, the K ^d of the substituted molecule for human Syt II is 7 pM and the K d of the substituted molecule for human Syt I is 6 pM. In a preferred embodiment, the K ^d of the substituted molecule for human Syt II is 1 pM and the K ^d of the molecule substituted for human Syt I is < 3 pM.

En una realización, la mejor unión da como resultado una unión detectable a Syt I humana en ausencia de gangliósidos co-receptores, tal como se ilustra mediante los experimentos descritos en la presente memoria.In one embodiment, enhanced binding results in detectable binding to human Syt I in the absence of ganglioside co-receptors, as illustrated by the experiments described herein.

Los términos "unión significativamente mejorada" o "unión significativamente reducida" cuando se emplean para describir la afinidad de unión de un fragmento de unión de NTBoB-Hc producido por las mutaciones puntuales descritas en la presente memoria se refiere a un aumento o disminución, respectivamente, en la afinidad de unión del dominio de unión modificado (p. ej., expresado como un fragmento aislado o en el contexto del polipéptido más grande) a un receptor específico (p. ej., Syt II humana o Syt I humana) como se discutió directamente más arriba. Como se emplea el término en la presente memoria, "unión significativamente reducida" cuando se utiliza para describir la afinidad de unión de la molécula de neurotoxina botulínica o fragmento de unión de la misma (p. ej., NTBo/B-Hc), de la presente invención a un receptor específico (p. ej., Syt I humana o Syt II humana), se refiere a una disminución en la afinidad de unión para el receptor específico que está sustancialmente disminuida (p. ej., en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o el 90% de la afinidad de unión de la molécula de tipo salvaje) en comparación con la versión no sustituida de la molécula. En una realización, la disminución de la unión de la molécula sustituida da como resultado una afinidad de unión que es un orden de magnitud o más menor que la afinidad de unión de la neurotoxina no sustituida (p. ej., la neurotoxina con una molécula de NTBo Hc de origen natural). Dicho de otra manera, la K^dde la molécula sustituida es un orden de magnitud o más mayor que la K^dde la neurotoxina no sustituida. En una realización, la reducción de la unión de la molécula sustituida da como resultado una afinidad de unión que es significativamente menor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la afinidad de unión de la molécula no sustituida. Dicho de otra manera, la K^dde la molécula sustituida es significativamente mayor (p. ej., 1,5X, 2,0X, 2,5X, 3,0X, etc.) que la K^dde la molécula no sustituida. En una realización, la unión significativamente reducida da como resultado la pérdida de unión detectable a Syt I humana en ausencia de gangliósidos co-receptores.The terms "significantly enhanced binding" or "significantly reduced binding" when used to describe the binding affinity of an NTBoB-Hc binding fragment produced by the point mutations described herein refer to an increase or decrease, respectively. , on the binding affinity of the modified binding domain (eg, expressed as an isolated fragment or in the context of the larger polypeptide) to a specific receptor (eg, human Syt II or human Syt I) as discussed directly above. As the term is used herein, "significantly reduced binding" when used to describe the binding affinity of the botulinum neurotoxin molecule or binding fragment thereof (eg, BoNT/B-Hc), of the present invention to a specific receptor (eg, human Syt I or human Syt II), refers to a decrease in binding affinity for the specific receptor that is substantially decreased (eg, by 10% , 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% of the binding affinity of the wild-type molecule) compared to the unsubstituted version of the molecule. In one embodiment, decreased binding of the substituted molecule results in a binding affinity that is an order of magnitude or more lower than the binding affinity of the unsubstituted neurotoxin (eg, the neurotoxin with a substituted molecule). of NTBoHc of natural origin). Stated another way, the K ^d of the substituted molecule is an order of magnitude or more greater than the K ^d of the unsubstituted neurotoxin. In one embodiment, reducing the binding of the substituted molecule results in a binding affinity that is significantly lower (eg, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, etc.) than the binding affinity of the unsubstituted molecule. Stated another way, the K ^d of the substituted molecule is significantly higher (eg, 1.5X, 2.0X, 2.5X, 3.0X, etc.) than the K ^d of the unsubstituted molecule. In one embodiment, significantly reduced binding results in detectable loss of binding to human Syt I in the absence of ganglioside co-receptors.

Como se emplea en la presente memoria, el término "neurotoxina botulínica" significa cualquier polipéptido que pueda ejecutar el mecanismo celular general por el que una toxina de C. botulinum entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores. Este mecanismo abarca la unión de una toxina de C. botulinum a un complejo receptor de baja o alta afinidad, la internalización de la toxina, la translocación de la cadena ligera de la toxina al citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de la toxina de C. botulinum. Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria, en referencia a la molécula de neurotoxina de C. botulinum y fragmentos de la misma.As used herein, the term "botulinum neurotoxin" means any polypeptide that can execute the general cellular mechanism by which a C. botulinum toxin enters a neuron and inhibits neurotransmitter release. This mechanism involves binding of a C. botulinum toxin to a low- or high-affinity receptor complex, internalization of the toxin, translocation of the toxin light chain to the cytoplasm, and enzymatic modification of a C. botulinum toxin substrate. C. botulinum. The terms "polypeptide" and "protein" are used interchangeably herein, referring to the C. botulinum neurotoxin molecule and fragments thereof.

Un "dominio de unión al receptor modificado" o "H^cmodificado", como se emplea el término en la presente memoria, facilita la unión de la molécula de neurotoxina de C. botulinum en la que está comprendida, a un receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula diana. Tal molécula se genera típicamente mediante tecnología de recombinación genética. El H^cmodificado tiene una actividad de unión al receptor para la neurotoxina de C. botulinum ubicada en la superficie de una célula diana. Como se emplea en la presente memoria, el término "actividad de unión" significa que una molécula está en contacto directamente o indirectamente con otra molécula a través de al menos una fuerza intermolecular o intramolecular, que incluye, sin limitación, un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace metálico, un enlace de hidrógeno, una interacción hidrófoba, una interacción de van der Waals y similares, o cualquier combinación de las mismas. "Unido" y "unir" se consideran términos para la unión.A "modified receptor binding domain" or "modified ^Hc ", as the term is used herein, facilitates the binding of the C. botulinum neurotoxin molecule in which it is comprised, to a receptor for the neurotoxin. of C. botulinum located on the surface of a target cell. Such a molecule is typically generated by recombinant genetic technology. The modified H ^c has a receptor binding activity for C. botulinum neurotoxin located on the surface of a target cell. As used herein, the term "binding activity" means that one molecule is in contact directly or indirectly with another molecule through at least one intermolecular or intramolecular force, including, without limitation, a covalent bond, an ionic bond, metallic bond, hydrogen bond, hydrophobic interaction, van der Waals interaction, and the like, or any combination thereof. "United" and "join" are considered terms for union.

Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio proteasa de la toxina de C. botulinum" significa un dominio de la toxina de C. botulinum que puede ejecutar la etapa de modificación de la diana enzimática del proceso de intoxicación. Por lo tanto, un dominio proteasa de la toxina de C. botulinum se dirige específicamente a un sustrato de la toxina de C. botulinum y abarca la escisión proteolítica de un sustrato de la toxina de C. botulinum, tal como, p. ej., proteínas SNARE como un sustrato SNAP-25, un sustrato VAMP y un sustrato Sintaxina.As used herein, the term " C. botulinum toxin protease domain" means a domain of the C. botulinum toxin that can execute the enzymatic target modification step of the intoxication process. Thus, a C. botulinum toxin protease domain specifically targets a C. botulinum toxin substrate and encompasses proteolytic cleavage of a C. botulinum toxin substrate, such as, e.g. eg, SNARE proteins such as a SNAP-25 substrate, a VAMP substrate, and a Syntaxin substrate.

Los ejemplos no limitantes de dominios proteasa de la toxina de C. botulinum se proporcionan en las Tablas 1 y 2. Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio de translocación de toxina de C. botulinum" o "Hⁿ" significa un dominio de la toxina de C. botulinum que puede ejecutar la etapa de translocación del proceso de intoxicación que media la translocación de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum. Por lo tanto, un Hⁿfacilita el movimiento de una cadena ligera de la toxina de C. botulinum a través de una membrana y abarca el movimiento de una cadena ligera de la toxina de C. botulinum a través de la membrana en una vesícula intracelular al citoplasma de una célula. Los ejemplos no limitantes de Hⁿincluyen una NTBo/A Hⁿ, una NTBo/B Hⁿ, una NTBo/C1 Hⁿ, una NTBo/D Hⁿ, una NTBo/E Hⁿ, una NTBo/F Hⁿy una NTBo/G Hⁿ, cuyas secuencias de aminoácidos se proporcionan en la Tabla 1 y en las Figuras 12, 14-20.Non-limiting examples of C. botulinum toxin protease domains are provided in Tables 1 and 2. As used herein, the term " C. botulinum toxin translocation domain" or "H ⁿ " means a C. botulinum toxin domain that can execute the translocation step of the intoxication process that mediates C. botulinum toxin light chain translocation. Thus, an H ⁿ facilitates the movement of a C. botulinum toxin light chain across a membrane and encompasses the movement of a C. botulinum toxin light chain across the membrane in an intracellular vesicle to the cytoplasm of a cell. Non-limiting examples of H ⁿ include a BoNT/AH ⁿ , a BoNT/BH ⁿ , a BoNT/C1H ⁿ , a BoNT/DH ⁿ , a BoNT/EH ⁿ , a BoNT/FH ⁿ and a BoNT/GH ⁿ , whose amino acid sequences are provided in Table 1 and Figures 12, 14-20.

Como se emplea en la presente memoria, el término "dominio de unión al receptor de C. botulinum" es sinónimo de "dominio H^c" y se refiere a cualquier dominio de unión al receptor de C. botulinum de origen natural que puede ejecutar la etapa de unión celular del proceso de intoxicación, que incluye, p. ej., la unión de la toxina de C. botulinum a un sistema receptor específico de la toxina de C. botulinum ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se prevé que el reemplazo de la actividad de unión se pueda lograr, p. ej., reemplazando la totalidad del dominio H^cde C. botulinum por un dominio H^cmodificado (p. ej., mejorado).As used herein, the term " C. botulinum receptor binding domain" is synonymous with "H ^c domain" and refers to any naturally occurring C. botulinum receptor binding domain that can execute the cell attachment stage of the intoxication process, including e.g. e.g., binding of C. botulinum toxin to a specific C. botulinum toxin receptor system located on the membrane surface plasma of a target cell. It is envisioned that replacement of binding activity can be achieved, e.g. eg, by replacing the entire ^C. botulinum Hc domain ^with a modified (eg, improved) Hc domain.

Como se emplea en la presente memoria, el término "célula diana de la toxina de C. botulinum" significa una célula que es una célula de origen natural que puede ser intoxicada por la toxina de C. botulinum, incluidas, sin limitación, las neuronas motoras; neuronas sensoriales; neuronas autónomas; tales como, p. ej., neuronas simpáticas y neuronas parasimpáticas; neuronas no peptidérgicas, tales como, p. ej., neuronas colinérgicas, neuronas adrenérgicas, neuronas noradrenérgicas, neuronas serotoninérgicas, neuronas GABAérgicas; y neuronas peptidérgicas, tales como, p. ej., neuronas de Sustancia P, neuronas de Péptidos Relacionados con el Gen de Calcitonina, neuronas de péptidos intestinales vasoactivos, neuronas de Neuropéptido Y, neuronas de colecistoquinina.As used herein, the term " C. botulinum toxin target cell" means a cell that is a naturally occurring cell that can be intoxicated by C. botulinum toxin, including, without limitation, neurons. motor; sensory neurons; autonomic neurons; such as e.g. eg, sympathetic neurons and parasympathetic neurons; non-peptidergic neurons, such as, e.g. eg, cholinergic neurons, adrenergic neurons, noradrenergic neurons, serotonergic neurons, GABAergic neurons; and peptidergic neurons, such as, e.g. eg, Substance P neurons, Calcitonin Gene-Related Peptide neurons, vasoactive intestinal peptide neurons, Neuropeptide Y neurons, cholecystokinin neurons.

Por "aislado" se entiende un material que está libre en diversos grados de los componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo. "Aislar" denota un grado de separación de la fuente original o los alrededores, p. ej. de ADN flanqueante o de la fuente natural del ADN, o de aminoácidos flanqueantes.By "isolate" is meant a material that is free to varying degrees from its normally accompanying components as found in its native state. "Isolate" denotes a degree of separation from the original source or surroundings, e.g. eg of flanking DNA or from the natural source of the DNA, or of flanking amino acids.

El término "purificado" se utiliza para referirse a una sustancia tal como un polipéptido que es "sustancialmente pura", con respecto a otros componentes de una preparación (p. ej., otros polipéptidos). Se puede referir a un polipéptido que es al menos aproximadamente 50%, 60%, 70% o 75%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puro, con respecto a otros componentes. Recapitulando, los términos "sustancialmente puro" o "esencialmente purificado", con respecto a un polipéptido, se refieren a una preparación que contiene menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 15%, 10%, 8%, 7%, más preferiblemente menos de aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de 1% de uno o más de otros componentes (p. ej., otros polipéptidos o componentes celulares).The term "purified" is used to refer to a substance such as a polypeptide that is "substantially pure" relative to other components of a preparation (eg, other polypeptides). It can refer to a polypeptide that is at least about 50%, 60%, 70%, or 75%, preferably at least about 85%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% pure, relative to to other components. To recapitulate, the terms "substantially pure" or "essentially purified", with respect to a polypeptide, refer to a preparation that contains less than about 20%, more preferably less than about 15%, 10%, 8%, 7%, more preferably less than about 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, or less than 1% of one or more other components (eg, other polypeptides or cellular components).

Los términos "conservativa" o "mutación por sustitución conservativa" como se emplean en la presente memoria se refieren a una mutación en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría una estructura secundaria, propiedades químicas y/o naturaleza hidropática del polipéptido sustancialmente sin cambios. Los siguientes grupos de aminoácidos se han sustituido históricamente entre sí como cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Otras sustituciones conservativas comúnmente aceptadas se enumeran a continuación:The terms "conservative" or "conservative substitution mutation" as used herein refer to a mutation in which one amino acid is replaced by another amino acid having similar properties, such that one skilled in the art of chemical of peptides would expect a substantially unchanged secondary structure, chemical properties and/or hydropathic nature of the polypeptide. The following groups of amino acids have historically substituted for each other as conservative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, be, try, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his. Other commonly accepted conservative substitutions are listed below:

El término "mutación por sustitución" sin la referencia a un aminoácido específico, puede incluir cualquier aminoácido distinto del resto de tipo salvaje que normalmente se encuentra en esa posición. Tales sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos no polares (hidrófobos), tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano y prolina. Las sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos polares (hidrófilos) tales como serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Las sustituciones pueden consistir en el reemplazo por aminoácidos cargados eléctricamente, p. ej. aminoácidos cargados eléctricamente negativamente, tales como ácido aspártico y ácido glutámico, y aminoácidos cargados eléctricamente positivamente, tales como lisina, arginina e histidina.The term "substitution mutation" without reference to a specific amino acid, may include any amino acid other than the wild-type residue normally found at that position. Such substitutions may consist of replacement with nonpolar (hydrophobic) amino acids, such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline. Substitutions may consist of replacement by amino acids polar (hydrophilic) such as serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine. Substitutions may consist of replacement by electrically charged amino acids, e.g. eg electrically negatively charged amino acids, such as aspartic acid and glutamic acid, and electrically positively charged amino acids, such as lysine, arginine, and histidine.

Las mutaciones por sustitución descritas en la presente memoria consistirán típicamente en el reemplazo por un resto de aminoácido de origen natural diferente, pero en algunos casos también se pueden sustituir restos de aminoácido de origen no natural. Los aminoácidos no naturales, como se emplea el término en la presente memoria, son aminoácidos no proteinogénicos (es decir, no codificantes de proteínas) que se encuentran de forma natural o se sintetizan químicamente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, p-aminoácidos (p3 y p2), homoaminoácidos, derivados de prolina y ácido pirúvico, derivados de alanina sustituidos en posición 3, derivados de glicina, derivados de fenilalanina y tirosina de anillo sustituido, aminoácidos de núcleo lineal, diaminoácidos, D-aminoácidos y N-metil aminoácidos. En algunas realizaciones, el aminoácido puede estar sustituido o no sustituido. El aminoácido sustituido o sustituyente puede ser un aminoácido aromático o alifático halogenado, una modificación alifática o aromática halogenada en la cadena lateral hidrófoba o una modificación alifática o aromática.The substitution mutations described herein will typically consist of replacement with a different naturally occurring amino acid residue, but non-naturally occurring amino acid residues may also be substituted in some cases. Non-natural amino acids, as the term is used herein, are non-proteinogenic (ie, non-protein coding) amino acids that occur naturally or are chemically synthesized. Examples include, but are not limited to, p-amino acids (p3 and p2), homoamino acids, proline and pyruvic acid derivatives, 3-substituted alanine derivatives, glycine derivatives, ring-substituted phenylalanine and tyrosine derivatives, amino acids linear core, diamino acids, D-amino acids and N-methyl amino acids. In some embodiments, the amino acid may be substituted or unsubstituted. The substituted or substituent amino acid may be a halogenated aliphatic or aromatic amino acid, a halogenated aliphatic or aromatic modification on the hydrophobic side chain, or an aliphatic or aromatic modification.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para efectuar una reducción terapéuticamente significativa en uno o más síntomas de la afección cuando se administra a un sujeto típico que tiene la afección. Una reducción terapéuticamente significativa de un síntoma es, p. ej. aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100% o más en comparación con un sujeto de control o no tratado.The term "therapeutically effective amount" refers to an amount that is sufficient to effect a therapeutically significant reduction in one or more symptoms of the condition when administered to a typical subject having the condition. A therapeutically significant reduction in a symptom is e.g. eg about 10%, about 20%, about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%, about 80%, about 90%, about 100% or more compared to a control subject or not treaty.

Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un tratamiento terapéutico en donde el objetivo es eliminar o disminuir los síntomas. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, eliminación de síntomas, alivio de síntomas, disminución de la extensión de la afección, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la afección, retraso o ralentización de la progresión de la afección.The terms "treat" or "treatment" refer to a therapeutic treatment where the goal is to eliminate or lessen symptoms. Beneficial or desired clinical outcomes include, but are not limited to, elimination of symptoms, relief of symptoms, decreased extent of the condition, stabilized (i.e., not worsening) state of the condition, retardation or slowing of progression of the condition

Como se emplea en la presente memoria, un "sujeto" se refiere a un ser humano o un animal. Por lo general, el animal es un vertebrado, tal como un primate, un roedor, un animal doméstico o un animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cinomolgos, monos araña y macacos, p. ej., Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, p. ej., gato doméstico, especies caninas, p. ej., perro, zorro, lobo, especies de aves, p. ej., pollo, emú, avestruz y peces, p. ej., trucha, barbo y salmón. Paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, p. ej., todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como seres humanos, primates o roedores. En ciertas realizaciones de los aspectos descritos en la presente memoria, el sujeto es un mamífero, p. ej., un primate, p. ej., un ser humano. Los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Un sujeto puede ser hombre o mujer. Un sujeto puede ser un sujeto completamente desarrollado (p. ej., un adulto) o un sujeto que experimenta el proceso de desarrollo (p. ej., un niño, un bebé o un feto).As used herein, a "subject" refers to a human or an animal. Typically, the animal is a vertebrate, such as a primate, rodent, domestic animal, or game animal. Primates include chimpanzees, cynomolgus monkeys, spider monkeys, and macaques, e.g. eg, Rhesus. Rodents include mice, rats, woodchucks, ferrets, rabbits, and hamsters. Domestic and game animals include cattle, horses, pigs, deer, bison, buffalo, feline species, e.g. eg, domestic cat, canine species, e.g. dog, fox, wolf, bird species, e.g. e.g. chicken, emu, ostrich and fish, e.g. eg, trout, barbel and salmon. Patient or subject includes any subset of the above, e.g. eg, all of the above, but excluding one or more groups or species such as humans, primates, or rodents. In certain embodiments of the aspects described herein, the subject is a mammal, e.g. eg, a primate, e.g. eg, a human being. The terms "patient" and "subject" are used interchangeably herein. A subject can be male or female. A subject may be a fully developed subject (eg, an adult) or a subject undergoing the process of development (eg, a child, infant, or fetus).

Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Se pueden utilizar ventajosamente mamíferos distintos de los seres humanos como sujetos que representan modelos animales de trastornos asociados con actividad neuronal no deseada. Además, los métodos y composiciones descritos en la presente memoria se pueden utilizar para tratar animales domésticos y/o mascotas.Preferably, the subject is a mammal. The mammal can be a human, a non-human primate, a mouse, a rat, a dog, a cat, a horse or a cow, but is not limited to these examples. Mammals other than humans can be advantageously used as subjects representing animal models of disorders associated with unwanted neuronal activity. In addition, the methods and compositions described herein can be used to treat domestic animals and/or pets.

Realizacionesachievements

La observación de que la NTBo/B es menos específica y potente en seres humanos debido a su incapacidad para unirse a Syt II humana, puede explicar por qué se requieren dosis comparativamente más altas que de la NTBo/A. Las dosis más altas de NTBo/B corresponden a mayores posibilidades de desencadenar respuestas de anticuerpos y de que se produzcan efectos secundarios graves. Por lo tanto, la mejor unión de NTBo/B al receptor Syt II humano, para aumentar su eficacia y especificidad para las neuronas humanas diana, debería permitir una reducción de la cantidad de las dosis de toxina utilizadas en aplicaciones terapéuticas.The observation that BoNT/B is less specific and potent in humans due to its inability to bind human Syt II may explain why comparatively higher doses than BoNT/A are required. Higher doses of BoNT/B correspond to greater chances of triggering antibody responses and serious side effects. Therefore, the better binding of BoNT/B to the human Syt II receptor, to increase its efficacy and specificity for target human neurons, should allow a reduction in the amount of toxin doses used in therapeutic applications.

Los aspectos de la invención surgen del hallazgo de que la modificación de la secuencia de proteínas de NTBoB-H^cmodifica la unión del fragmento que contiene el dominio de unión al receptor al receptor Syt II humano. Se han identificado modificaciones específicas que mejoran la unión, generando así un dominio que se une a Syt II humana con alta afinidad. La NTBo/B-Hc modificada, cuando está en el contexto de una proteína NTBo de longitud completa, conserva estas propiedades de unión. La incorporación de un dominio de unión al receptor modificado con mejor unión, a una molécula que comprende los otros dominios de NTBo, genera por tanto una molécula de NTBo de longitud completa con una mejor unión al receptor de manera similar. Como tales, se generan nuevas versiones de NTBo con unión de alta afinidad a Syt II humana. La NTBo con una unión significativamente mejorada se puede utilizar en terapias similares, aunque a dosis más bajas que las moléculas de NTBo disponibles actualmente, proporcionando así métodos de tratamiento más seguros. Aspects of the invention arise from the finding that modification of the NTBoB-H ^c protein sequence modifies the binding of the receptor-binding domain-containing fragment to the human Syt II receptor. Specific modifications have been identified that enhance binding, thus generating a domain that binds human Syt II with high affinity. Modified BoNT/B-Hc, when in the context of a full-length BoNT protein, retains these binding properties. Incorporation of a modified receptor-binding domain with enhanced binding to a molecule comprising the other BoNT domains thus generates a full-length BoNT molecule with enhanced receptor binding in a similar manner. As such, new versions of BoNT with high affinity binding to human Syt II are generated. BoNT with significantly improved binding can be used in similar therapies, albeit at lower doses than currently available BoNT molecules, thus providing safer treatment methods.

Los polipéptidos de NTBo, incluidos los polipéptidos de NTBo de longitud completa y los fragmentos o dominios de polipéptidos de NTBo descritos en la presente memoria (p. ej., la NTB^o/H^cmodificada), y las moléculas de ácido nucleico que las codifican, están explícitamente incluidas en la invención. Estos polipéptidos y moléculas de ácido nucleico se pueden generar mediante procedimientos de ADN recombinante conocidos en la técnica. Tales polipéptidos se denominan típicamente "polipéptidos recombinantes" o "ácidos nucleicos recombinantes".BoNT polypeptides, including full-length BoNT polypeptides and BoNT polypeptide fragments or domains described herein (e.g., modified /H ^c NT ^or ), and nucleic acid molecules that make them encode, are explicitly included in the invention. These polypeptides and nucleic acid molecules can be generated by recombinant DNA methods known in the art. Such polypeptides are typically referred to as "recombinant polypeptides" or "recombinant nucleic acids."

Proteína de neurotoxina botulínicaBotulinum neurotoxin protein

En la presente memoria se describe una proteína de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende un dominio de unión al receptor modificado (p. ej., de Botulinum clostridial serotipo B), como se describe en la presente memoria. La proteína NTBo comprende adicionalmente un dominio proteasa, un dominio de translocación y un sitio de escisión de proteasa. Típicamente, estos están dispuestos en un orden de polipéptido único de amino a carboxilo lineal de dominio proteasa, sitio de escisión de proteasa, dominio de translocación y dominio de unión al receptor modificado. Sin embargo, se espera que funcionen adecuadamente las diferentes disposiciones de los diversos dominios. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado comprende una o más mutaciones por sustitución que conducen a una unión significativamente mejorada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano.Described herein is a botulinum neurotoxin (BoNT) protein comprising a modified receptor binding domain (eg, from Botulinum clostridial serotype B), as described herein. The BoNT protein further comprises a protease domain, a translocation domain and a protease cleavage site. Typically, these are arranged in a linear amino to carboxyl single polypeptide order of protease domain, protease cleavage site, translocation domain, and modified receptor binding domain. However, the different arrangements of the various domains are expected to work properly. In one embodiment, the modified receptor binding domain comprises one or more substitution mutations that lead to significantly improved binding to the human Syt I receptor and/or the human Syt II receptor.

La proteína NTBo puede comprender adicionalmente un dominio que es útil para la purificación de la molécula, tal como una etiqueta de hexahistidina (His6) (SEQ ID NO: 13), o una etiqueta epitópica, tal como una etiqueta de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)). Varios de estos dominios se conocen y se utilizan en la técnica para tales fines.The BoNT protein may further comprise a domain that is useful for purification of the molecule, such as a hexahistidine (His6) tag (SEQ ID NO: 13), or an epitope tag, such as a hemagglutinin (HA) tag ( YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)). Several of these domains are known and used in the art for such purposes.

La NTBo tiene la estructura general que se muestra en la Figura 1B. La NTBo se compone de tres dominios, cada dominio tiene una función específica e independiente: un dominio proteasa (también denominado cadena ligera), un dominio de translocación (HN) y un dominio de unión al receptor (HC). Se ha demostrado que los dominios de las diversas cepas de neurotoxina de C. botulinum son en gran medida intercambiables (como lo demuestran las toxinas quiméricas naturales tales como la NTBo/CD, que se compone de la cadena ligera y Hn de NTBo/C, con e1Hc de NTBo/D34, en la Patente de Estados Unidos 8.052.979). La proteína puede estar en forma monocatenaria o en forma bicatenaria. La forma bicatenaria resulta del procesamiento por proteasa de origen natural de un sitio de escisión de proteasa ubicado entre el dominio proteasa y el dominio de translocación. La proteína se mantiene en forma bicatenaria después del procesamiento con la proteasa por la presencia de un enlace disulfuro.BoNT has the general structure shown in Figure 1B. BoNT is composed of three domains, each domain has a specific and independent function: a protease domain (also called light chain), a translocation domain (HN) and a receptor binding domain (HC). The domains of the various neurotoxin strains of C. botulinum have been shown to be largely interchangeable (as demonstrated by natural chimeric toxins such as BoNT/CD, which is composed of the light chain and Hn of BoNT/C, with e1Hc of BoNT/34D, in US Patent 8,052,979). The protein may be in single-stranded form or in double-stranded form. The double-stranded form results from naturally occurring protease processing of a protease cleavage site located between the protease domain and the translocation domain. The protein is held in a double-stranded form after protease processing by the presence of a disulfide bond.

Las cepas de Clostridium botulinum producen siete tipos antigénicamente distintos de toxinas botulínicas, que se han identificado mediante la investigación de brotes de botulismo en el hombre (NTBo/A, /B, /E y /F), animales (NTBo/C1 y /D) o aisladas del suelo (NTBo/G). Si bien los siete serotipos de NTBo tienen una estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno también muestra características bacteriológicas heterogéneas. La diversidad genética de las cepas de C. botulinum ha sido descrita en detalle por Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, Núm. 3, pág. 818-832 (2007))35. En una realización, la NTBo descrita en la presente memoria tiene dominios que son todos del mismo serotipo (A, B, C, D, E, F o G). En una realización, uno o más de esos dominios del mismo serotipo difieren en cuanto a su cepa y/o subtipo. Clostridium botulinum strains produce seven antigenically distinct types of botulinum toxins, which have been identified through investigation of botulism outbreaks in man (BoNT/A, /B, /E and /F), animals (BoNT/C1 and / D) or isolated from the ground (NTBo/G). Although the seven BoNT serotypes have similar structure and pharmacological properties, each also exhibits heterogeneous bacteriological characteristics. The genetic diversity of C. botulinum strains has been described in detail by Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, pp. 818-832 (2007))35. In one embodiment, the BoNT described herein has domains that are all from the same serotype (A, B, C, D, E, F, or G). In one embodiment, one or more of those domains from the same serotype differ in terms of their strain and/or subtype.

Las toxinas de los diversos serotipos/cepas de C. botulinum comparten la misma organización de dominios funcionales y la misma arquitectura estructural general. Las toxinas de C. botulinum se traducen cada una como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se escinde mediante escisión proteolítica dentro de un bucle de disulfuro por una proteasa de origen natural, tal como, por ejemplo, una proteasa de la toxina de C. botulinum endógena o proteasas naturales producidas en el medio ambiente. Este procesamiento postraduccional produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen unidas por un solo enlace disulfuro e interacciones no covalentes. Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio proteolítico ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores; 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino-terminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC de las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión que se encuentra dentro de la mitad carboxilo-terminal de la HC que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina al complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana. Las ubicaciones de los dominios específicos dentro de la toxina de varios serotipos/cepas se proporcionan en la Tabla 1:Toxins from the various serotypes/strains of C. botulinum share the same functional domain organization and general structural architecture. The C. botulinum toxins are each translated as a single-chain polypeptide of approximately 150 kDa that is subsequently cleaved by proteolytic cleavage within a disulfide loop by a naturally occurring protease, such as, for example, a C. botulinum toxin protease. C. botulinum endogenous or natural proteases produced in the environment. This post-translational processing produces a double-stranded molecule comprising an approximately 50 kDa light chain (LC) and an approximately 100 kDa heavy chain (HC) held together by a single disulfide bond and non-covalent interactions. Each mature double-stranded molecule comprises three functionally distinct domains: 1) a proteolytic domain located in the LC that includes a metalloprotease region containing zinc-dependent endopeptidase activity that specifically targets core components of the neurotransmitter release apparatus; 2) a translocation domain contained within the amino-terminal half of the HC (Hn) that facilitates the release of LC from intracellular vesicles into the cytoplasm of the target cell; and 3) a binding domain found within the carboxyl-terminal half of the HC that determines the binding activity and binding specificity of the toxin to the receptor complex located on the surface of the target cell. The locations of the specific domains within the toxin of various serotypes/strains are provided in Table 1:

TABLA 1TABLE 1

Las secuencias de aminoácidos completas de las toxinas se proporcionan en las Figuras 14-21.The complete amino acid sequences of the toxins are provided in Figures 14-21.

La unión, la translocación y la actividad proteasa de estos tres dominios funcionales son todas necesarias para la toxicidad. El mecanismo general de intoxicación celular por el cual las toxinas de C. botulinum entran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del serotipo o subtipo. Sin desear vincularse a ninguna teoría, el mecanismo de intoxicación implica al menos cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana de la proteasa. El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina de C. botulinum se une a un receptor específico de la toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de unión de un complejo receptor se logra, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y receptores de proteínas. Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor se internalizan por endocitosis y las vesículas internalizadas se clasifican en rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación se desencadena por la acidulación del compartimento de la vesícula. Una vez translocada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera desde la vesícula intracelular al citosol, donde se dirige específicamente a una de las tres proteínas conocidas como componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores (proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, proteína asociada sinaptosomal de 25 kDa (SNAP-25) y Sintaxina). Estos componentes centrales son necesarios para el acoplamiento y la fusión de vesículas sinápticas en el terminal del nervio y constituyen miembros de la familia de receptores de proteínas de anclaje al factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE). NTBo/A y NTBo/E escinden SNAP-25 en la región carboxilo-terminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y NTBo/C1 también escinde SNAP-25 cerca del extremo carboxilo terminal. Los serotipos de botulinum NTBo/B, NTBo/D, NTBo/F y NTBo/G, y la toxina del tétanos, actúan sobre la porción central conservada de VAMP y liberan la porción amino-terminal de VAMP al citosol. NTBo/C1 escinde la sintaxina en un solo sitio cerca de la superficie de la membrana plasmática citosólica. La proteólisis selectiva de las SNARE sinápticas explica el bloqueo de la liberación de neurotransmisores causado por las toxinas de C. botulinum in vivo. Las dianas de la proteína SNARE de las toxinas de C. botulinum son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad de la peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véanse, p. ej., Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431 437, (2003).The binding, translocation, and protease activity of these three functional domains are all required for toxicity. The general mechanism of cellular intoxication by which C. botulinum toxins enter a neuron and inhibit neurotransmitter release is similar, regardless of serotype or subtype. Without wishing to be bound by theory, the mechanism of intoxication involves at least four steps: 1) receptor binding, 2) complex internalization, 3) light chain translocation, and 4) protease target modification. The process is initiated when the Hc domain of a C. botulinum toxin binds to a toxin-specific receptor located on the plasma membrane surface of a target cell. The binding specificity of a receptor complex is believed to be achieved, in part, by specific combinations of gangliosides and receptor proteins. Once bound, the toxin/receptor complexes are internalized by endocytosis, and the internalized vesicles are sorted into specific intracellular pathways. The translocation step is triggered by acidulation of the vesicle compartment. Once translocated, the toxin light chain endopeptidase is released from the intracellular vesicle into the cytosol, where it specifically targets one of three proteins known as core components of the neurotransmitter release apparatus (vesicle-associated membrane protein (VAMP). )/sinaptobrevin, 25 kDa synaptosomal associated protein (SNAP-25) and Syntaxin). These core components are required for the docking and fusion of synaptic vesicles at the nerve terminal and constitute members of the soluble N-ethylmaleimide-responsive factor-anchoring protein receptor (SNARE) family. BoNT/A and BoNT/E cleave SNAP-25 at the carboxyl-terminal region, releasing a segment of nine or twenty-six amino acids, respectively, and BoNT/C1 also cleave SNAP-25 near the carboxyl-terminus. Botulinum serotypes BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, and BoNT/G, and tetanus toxin act on the conserved central portion of VAMP and release the amino-terminal portion of VAMP into the cytosol. BoNT/C1 cleaves syntaxin at a single site near the surface of the cytosolic plasma membrane. Selective proteolysis of synaptic SNAREs accounts for the blockade of neurotransmitter release caused by C. botulinum toxins in vivo. The SNARE protein targets of C. botulinum toxins are common to exocytosis in a variety of non-neuronal types; in these cells, as in neurons, light chain peptidase activity inhibits exocytosis, see p. eg, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431 437, (2003).

Dominios y neurotoxinas quiméricasChimeric domains and neurotoxins

Las neurotoxinas botulínicas descritas en la presente memoria comprenden un dominio de unión al receptor modificado (HC). El dominio de unión al receptor modificado muestra una unión significativamente mejorada a uno o más receptores humanos típicamente unidos y utilizados por una o más cepas de toxinas de C. botulinum (p. ej., SytII, SytI). El dominio de unión al receptor modificado puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. Se proporcionan en la presente memoria ejemplos de dominios de unión a receptores modificados específicos. El polipéptido del dominio de unión al receptor modificado aislado descrito en la presente memoria también está incluido en la presente descripción, al igual que la molécula de ácido nucleico aislada por la que está codificado. En una realización, y según la invención, e1HC es del serotipo B. En una realización, el HC es del serotipo A. The botulinum neurotoxins described herein comprise a modified receptor binding domain (HC). The modified receptor binding domain shows significantly enhanced binding to one or more human receptors typically bound to and utilized by one or more strains of C. botulinum toxins (eg, SytII, SytI). The modified receptor binding domain can be of any serotype (A, B, C, D, E, F, or G), strain, or subtype (as described herein). This may be the same or different serotype, strain/subtype as one or more other domains within BoNT. Examples of specific modified receptor binding domains are provided herein. The isolated modified receptor binding domain polypeptide described herein is also included in the present disclosure, as is the isolated nucleic acid molecule by which it is encoded. In one embodiment, and according to the invention, e1HC is serotype B. In one embodiment, the HC is serotype A.

La neurotoxina botulínica de la presente invención también comprende un dominio proteasa, también denominado en la técnica variante de cadena ligera. La variante de cadena ligera puede ser una variante de cadena ligera de origen natural, tal como, p. ej., isoformas de cadena ligera de toxina de C. botulinum y subtipos de cadenas ligeras de toxina de C. botulinum; o una variante de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum de origen no natural, tal como, p. ej., variantes de la cadena ligera de la toxina de C. botulinum con una sustitución conservativa. El dominio proteasa puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. En una realización, el dominio proteasa es del serotipo B. En una realización, el dominio proteasa es del serotipo A.The botulinum neurotoxin of the present invention also comprises a protease domain, also referred to in the art as light chain variant. The light chain variant may be a naturally occurring light chain variant, such as, e.g. eg, C. botulinum toxin light chain isoforms and C. botulinum toxin light chain subtypes ; or a non-naturally occurring C. botulinum toxin light chain variant, such as, e.g. eg, C. botulinum toxin light chain variants with a conservative substitution. The protease domain can be from any serotype (A, B, C, D, E, F, or G), strain, or subtype (as described herein). This may be the same or different serotype, strain/subtype as one or more other domains within BoNT. In one embodiment, the protease domain is serotype B. In one embodiment, the protease domain is serotype A.

La neurotoxina botulínica de la presente invención también comprende un dominio de translocación de la toxina (Hⁿ). El dominio de translocación de la toxina puede ser de cualquier serotipo (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo (como se describe en la presente memoria). Este puede ser el mismo o diferente serotipo, cepa/subtipo que uno o más de otros dominios dentro de la NTBo. En una realización, el Hⁿes del serotipo B. En una realización, e1Hⁿes del serotipo A.The botulinum neurotoxin of the present invention also comprises a toxin translocation domain (H ⁿ ). The toxin translocation domain can be of any serotype (A, B, C, D, E, F, or G), strain, or subtype (as described herein). This may be the same or different serotype, strain/subtype as one or more other domains within BoNT. In one embodiment, the H ⁿ is serotype B. In one embodiment, the H ⁿ is serotype A.

Los diversos dominios descritos en la presente memoria (p. ej., Hⁿ, H^c, o dominio proteasa) incluyen, sin limitación, variantes de origen natural, tales como, p. ej., isoformas y subtipos; variantes de origen no natural, tales como, p. ej., mutaciones por sustitución conservativas. Variantes no naturales, se refiere a un dominio que tiene al menos un cambio de aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia (p. ej., de la Tabla 1 o las Figuras 14, 16-23) y se puede describir en porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia.The various domains described herein (eg, H ⁿ , H ^c , or protease domain) include, without limitation, naturally occurring variants, such as, e.g. eg, isoforms and subtypes; variants of non-natural origin, such as, e.g. eg, conservative substitution mutations. Non-natural variants, refers to a domain that has at least one amino acid change from the corresponding region of the reference sequences (eg, from Table 1 or Figures 14, 16-23) and can be described in percent identity with the corresponding region of that reference sequence.

Los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de toxina de C. botulinum puede haber variantes de dominio de C. botulinum de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Una variante de dominio de toxina de C. botulinum de origen natural (p. ej., cadena ligera, Hⁿo H^c) prevista para su uso en la generación de la NTBo de la presente invención puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de C. botulinum de origen natural y se puede sustituir por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.Those skilled in the art recognize that within each C. botulinum toxin serotype there may be naturally occurring C. botulinum domain variants that differ somewhat in their amino acid sequence and also in the nucleic acids encoding these proteins. A naturally occurring C. botulinum toxin domain variant (eg, light chain, H ⁿ or H ^c ) intended for use in generating the BoNT of the present invention may function in substantially the same manner as the reference C. botulinum toxin domain on which the naturally occurring C. botulinum domain variant is based and may be substituted for the reference C. botulinum toxin domain in any aspect of the present invention.

Un ejemplo no limitante de una variante del dominio de toxina de C. botulinum de origen natural es una isoforma de dominio de toxina de C. botulinum tal como, p. ej., una isoforma de dominio de NTBo/A, una isoforma de dominio de NTBo/B, una isoforma de dominio de NTBo/C1, una isoforma de dominio de NTBo/D, una isoforma de dominio de NTBo/E, una isoforma de dominio de NTBo/F, y una isoforma de dominio de NTBo/G. Una isoforma de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la isoforma del dominio de la toxina de C. botulinum, y se puede sustituir por el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.A non-limiting example of a naturally occurring C. botulinum toxin domain variant is a C. botulinum toxin domain isoform such as, e.g. g., a domain isoform of BoNT/A, a domain isoform of BoNT/B, a domain isoform of BoNT/C1, a domain isoform of BoNT/D, a domain isoform of BoNT/E, an isoform domain of BoNT/F, and a domain isoform of BoNT/G. A C. botulinum toxin domain isoform may function in substantially the same manner as the reference C. botulinum toxin domain on which the C. botulinum toxin domain isoform is based , and may be substituted. by the reference C. botulinum toxin domain in any aspect of the present invention.

Otro ejemplo no limitante de una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen natural es un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum tal como, p. ej., un dominio del subtipo NTBo/A1, NTBo/A2, NTBo/A3, NTBo/A4, NTBo/A5; un dominio del subtipo NTBo/B1, NTBo/B2, NTBo/B3, ⁿT^bo/B4, N^tB^o/B5, NTBo/B6, NTBo/B7; un dominio del subtipo NTBo/C1-1, NTBo/C1-2, NTBo/D-C; un dominio del subtipo NTBo/E1, NTBo/E2, NTBo/E3, NTBo/E4, NTBo/E5, NTBo/E6, NTBo/E7, NTBo/E8; y un dominio del subtipo NTBo/F1, NTBo/F2, NTBo/F3, NTBo/F4, NTBo/F5, NTBo/F6, NTBo/F7. Un subtipo de dominio de toxina de C. botulinum puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa el subtipo del dominio de toxina de C. botulinum y se puede sustituir por el dominio de toxina de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención.Another non-limiting example of a naturally occurring C. botulinum toxin domain variant is a C. botulinum toxin domain subtype such as, e.g. eg, a domain of the BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, BoNT/A5 subtype; a domain of the BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, ^nTbo / ^B4 , ^NtBo ^/ B5, BoNT/B6, BoNT/B7 subtype domain; a domain of the BoNT/C1-1, BoNT/C1-2, BoNT/DC subtype; a domain of the BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7, BoNT/E8 subtype domain; and a domain of the BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6, BoNT/F7 subtype. A C. botulinum toxin domain subtype may function in substantially the same manner as the reference C. botulinum toxin domain on which the C. botulinum toxin domain subtype is based and may be substituted for the C. botulinum toxin domain subtype. reference C. botulinum toxin domain in any aspect of the present invention.

Como se emplea en la presente memoria, el término "variante de origen no natural" (p. ej., variante de cadena ligera de la toxina de C. botulinum, H^cy Hⁿ) significa un dominio de C. botulinum producido con la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, dominios producidos por ingeniería genética utilizando mutagénesis aleatoria o diseño racional y dominios de C. botulinum producidos por síntesis química. Los ejemplos no limitantes de variantes de dominio de C. botulinum de origen no natural incluyen, p. ej., variantes de dominio de C. botulinum conservativas. Como se emplea en la presente memoria, el término "variante del dominio de C. botulinum conservativa" significa un dominio de C. botulinum que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del dominio de C. botulinum de referencia (p. ej., Tabla 1 y Figuras 12, 14-21). La variante puede tener una, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con la secuencia del dominio de referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño, topografía, carga, carácter hidrófobo, carácter hidrófilo, carácter lipófilo, capacidad de unión covalente, capacidad de unión por puentes de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica o similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante del dominio de C. botulinum conservativa puede funcionar sustancialmente de la misma manera que el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de la toxina de C. botulinum conservativa y se puede sustituir por el dominio de C. botulinum de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. As used herein, the term "non-naturally occurring variant" (eg, C. botulinum toxin light chain variant, H ^c and H ⁿ ) means a C. botulinum domain produced with the aid of human manipulation, including, without limitation, domains produced by genetic engineering using random mutagenesis or rational design and C. botulinum domains produced by chemical synthesis. Non-limiting examples of non-naturally occurring C. botulinum domain variants include, e.g. eg, conservative C. botulinum domain variants. As used herein, the term "conservative C. botulinum domain variant" means a C. botulinum domain that has at least one amino acid substituted by another amino acid or amino acid analog that has at least one property similar to that of C. botulinum. from the original amino acid of the reference C. botulinum domain sequence (eg, Table 1 and Figures 12, 14-21). The variant may have one, two, three, four, five or more conservative amino acid substitutions compared to the reference domain sequence. Examples of properties include, without limitation, size, topography, charge, hydrophobicity, hydrophilicity, lipophilicity, covalent binding capacity, hydrogen bonding capacity, a physicochemical property, or the like, or any combination thereof. A conservative C. botulinum toxin domain variant may function in substantially the same manner as the reference C. botulinum toxin domain on which the conservative C. botulinum toxin domain variant is based and may be substituted by the reference C. botulinum domain in any aspect of the present invention.

Una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen no natural puede sustituir uno o más aminoácidos (p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más) del dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia. Una variante del dominio de la toxina de C. botulinum de origen no natural de acuerdo con la invención también posee 95% o más (p. ej., 96%, 97%, 98% o 99%) de identidad de aminoácidos con el dominio de la toxina de C. botulinum de referencia en el que se basa la variante del dominio de C. botulinum de origen natural.A variant of the non-naturally occurring C. botulinum toxin domain may substitute one or more amino acids (eg, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more) of the toxin domain. the reference C. botulinum toxin on which the reference C. botulinum toxin domain is based. A non-naturally occurring C. botulinum toxin domain variant according to the invention also possesses 95% or greater (eg, 96%, 97%, 98%, or 99%) amino acid identity to the C. botulinum toxin domain. reference C. botulinum toxin domain on which the naturally occurring C. botulinum domain variant is based.

Varias neurotoxinas de C. botulinum o dominios específicos de las mismas, se describen en las Publicaciones de Patentes Internacionales WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 y WO99/17806. La neurotoxina de C. botulinum o el dominio específico de la misma descritos en la presente memoria contendrán típicamente restos de aminoácidos de origen natural, pero en algunos casos también pueden estar presentes restos de aminoácidos de origen no natural. Por lo tanto, los denominados ''miméticos de péptidos" y "análogos de péptidos", que pueden incluir estructuras químicas que no son aminoácidos que imitan la estructura de un aminoácido o péptido particular, también se pueden utilizar en el contexto de la invención. Tales miméticos o análogos se caracterizan generalmente por mostrar características físicas similares tales como tamaño, carga o carácter hidrófobo, y la orientación espacial apropiada que se encuentra en sus contrapartes de péptidos naturales. Un ejemplo específico de un compuesto mimético de péptido es un compuesto en el que el enlace amida entre uno o más de los aminoácidos se reemplaza, por ejemplo, por un enlace carbono-carbono u otro enlace no amida, como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo Sawyer, en Peptide Based Drug Design, pág. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995).Various C. botulinum neurotoxins, or specific domains thereof, are described in International Patent Publications WO95/32738, WO96/33273, WO98/07864 and WO99/17806. The C. botulinum neurotoxin or the specific domain thereof described herein will typically contain naturally occurring amino acid residues, but in some cases non-naturally occurring amino acid residues may also be present. Thus, so-called "peptide mimetics" and "peptide analogs", which may include non-amino acid chemical structures that mimic the structure of a particular amino acid or peptide, may also be used in the context of the invention. Such mimetics or analogs are generally characterized by displaying similar physical characteristics such as size, charge, or hydrophobicity, and the proper spatial orientation found in their natural peptide counterparts.A specific example of a peptide mimetic compound is a compound in the that the amide bond between one or more of the amino acids is replaced, for example, by a carbon-carbon or other non-amide bond, as is well known in the art (see, eg, Sawyer, in Peptide Based Drug Design, pg. 378-422, ACS, Washington DC 1995).

La neurotoxina botulínica (NTBo) de la presente invención comprende un dominio de unión al receptor modificado de C. botulinum de serotipo B (NTBoB-Hc). El NTBo/B-Hc modificado comprende una o más mutaciones por sustitución que conducen a una unión significativamente mejorada al receptor Syt I humano y/o al receptor Syt II humano. En una realización, la NTBo/B-Hc es de NTBo/B1 (Número de acceso de GenBank: AB232927.1). La secuencia de aminoácidos de NTBo/B1-Hc cepa Okra, utilizada como molde de referencia en la presente invención, se muestra en la Figura 12. También se prevé la generación de B-H^ca partir de otras cepas y subtipos mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria, al igual que la generación de moléculas más largas que incorporan B-Hc tal como NTBo completa o un polipéptido que comprende B-Hc modificado. Algunas de tales moléculas también están incluidas en la invención. En una realización, la NTBo o el polipéptido descrito en la presente memoria comprenden un dominio de unión al receptor modificado que no es una cepa de NTBo/B4 conocida tal como la cepa Eklund (Secuencia de referencia NCBI: YP_001893661.1, Ref. Genbank: EF051570.1), que se muestra en la Figura. 21. En una realización, B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.The botulinum neurotoxin (BoNT) of the present invention comprises a modified receptor binding domain of C. botulinum serotype B (BoNT-Hc). The modified BoNT/B-Hc comprises one or more substitution mutations leading to significantly improved binding to the human Syt I receptor and/or the human Syt II receptor. In one embodiment, the BoNT/B-Hc is from BoNT/B1 (GenBank Accession Number: AB232927.1). The amino acid sequence of the BoNT/B1-Hc strain Okra, used as a reference template in the present invention, is shown in Figure 12. The generation of BH ^c from other strains and subtypes by substituting the amino acids corresponding to the specified position(s) in B1 described herein, as well as the generation of longer molecules incorporating B-Hc such as complete BoNT or a polypeptide comprising modified B-Hc. Some of such molecules are also included in the invention. In one embodiment, the BoNT or polypeptide described herein comprises a modified receptor binding domain that is not a known BoNT/B4 strain such as the Eklund strain (NCBI Reference Sequence: YP_001893661.1, Ref. Genbank : EF051570.1), which is shown in Figure. 21. In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8.

La difusión de toxinas y la generación de anticuerpos neutralizantes son un problema asociado pero no limitado a NTBo/B, ya que también se observan con NTBo/A. La mejora de la afinidad de unión de NTBo/A a su receptor SV2 aliviaría estos problemas. Debido a que la unión de NTBo/B a Syt I/II tiene una afinidad mucho mayor que la unión de NTBo/A a SV214,20,26,27, también se puede utilizar un dominio de unión al receptor de NTBo/B modificado (NTBoB-Hc) con la capacidad de unirse a Syt II humana para reemplazar NTBo/A-Hc para generar una NTBo/A quimérica modificada que pueda tener mayor eficacia y especificidad para las neuronas humanas que la NTBo/A WT.282930 Diffusion of toxins and generation of neutralizing antibodies are a problem associated with, but not limited to, BoNT/B, as they are also seen with BoNT/A. Improving the binding affinity of BoNT/A to its SV2 receptor would alleviate these problems. Because the binding of BoNT/B to Syt I/II has a much higher affinity than the binding of BoNT/A to SV214,20,26,27, a modified BoNT/B receptor binding domain can also be used. (BoNT-Hc) with the ability to bind human Syt II to replace BoNT/A-Hc to generate a modified chimeric BoNT/A that may have higher efficacy and specificity for human neurons than BoNT/A WT.282930

Adicionalmente, se prevé que el H^cmodificado descrito anteriormente (p. ej., NTBo/B-Hc) se pueda utilizar para reemplazar el H^cde todos los demás serotipos/cepas de NTBo. Como tal, también se describe en la presente memoria un polipéptido de NTBo que comprende un dominio de unión al receptor modificado (H^c) de serotipo (A, B, C, D, E, F o G), conectado a uno o más dominios de un serotipo diferente (A, B, C, D, E, F o G), cepa o subtipo para producir de ese modo una neurotoxina quimérica. La región Hc de cada NTBo está bien definida y las respectivas regiones Hc se pueden intercambiar en la molécula de NTBo (p. ej., mediante ingeniería genética). Tal manipulación la realiza habitualmente el médico experto mediante la fusión por PCR convencional de ADN que codifica NTBo/B-Hc con la cadena ligera (LC) y el dominio de translocación (Hn), o Hn-LC, de otras NTBo, que ha sido bien establecida en la técnica. Además, el reemplazo también se puede realizar utilizando la porción C-terminal de NTBoB-Hc (designado H^cc), que es la región que contiene el sitio de unión para los receptores de proteínas y los gangliósidos en cada NTBo. Las toxinas quiméricas resultantes tendrán la capacidad de dirigirse a neuronas humanas mediante la unión a Syt I/II humana. Como ejemplo no limitante, se puede utilizar NTBo/B-Hc modificado (o NTBo/B-Hcc) para reemplazar el Hc (o Hcc) de NTBo/A. Algunos de los polipéptidos resultantes están incluidos en la presente invención, como se describe en otra parte. Estas toxinas quiméricas pueden tener una mayor eficacia y especificidad en el direccionamiento a las neuronas humanas que WT NTBo/A. Tal toxina NTBo/A quimérica se puede utilizar para aplicaciones terapéuticas en seres humanos y ofrece mejoras significativas con respecto a WT NTBo/A.Additionally, it is envisioned that the modified ^Hc described above (eg, BoNT/B-Hc) can be used to replace the ^Hc of all other BoNT serotypes/strains. As such, a BoNT polypeptide comprising a modified receptor-binding domain (H ^c ) of serotype (A, B, C, D, E, F or G), connected to one or more domains of a different serotype (A, B, C, D, E, F or G), strain or subtype to thereby produce a chimeric neurotoxin. The Hc region of each BoNT is well defined, and the respective Hc regions can be interchanged in the BoNT molecule (eg, by genetic engineering). Such manipulation is usually performed by the expert physician by conventional PCR fusion of DNA encoding BoNT/B-Hc with the light chain (LC) and translocation domain (Hn), or Hn-LC, of other BoNT, which has been well established in the art. In addition, replacement can also be performed using the C-terminal portion of BoNTB-Hc (designated H ^cc ), which is the region that contains the binding site for protein receptors and gangliosides on each BoNT. The resulting chimeric toxins will have the ability to target human neurons by binding to human Syt I/II. As a non-limiting example, modified BoNT/B-Hc (or BoNT/B-Hcc) can be used to replace the Hc (or Hcc) of BoNT/A. Some of the resulting polypeptides are included in the present invention, as described elsewhere. These chimeric toxins may have a higher efficiency and specificity in targeting human neurons than WT BoNT/A. Such a chimeric BoNT/A toxin can be used for therapeutic applications in humans and offers significant improvements over WT BoNT/A.

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido de dominio de unión al receptor modificado, aislado y purificado. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado es NTBo/B-Hc (p. ej., de NTBo/B1). En una realización, el B-Hc se genera a partir de una cepa y/o subtipo diferentes de NTBo mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria. En una realización, el H^ces del subtipo B2, B3, B4, B5, B6 o B7. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8. Also described herein is an isolated and purified modified receptor binding domain polypeptide. In one embodiment, the modified receptor binding domain is BoNT/B-Hc (eg, from BoNT/B1). In one embodiment, the B-Hc is generated from a different BoNT strain and/or subtype by substituting amino acids corresponding to the specified position(s) in B1 described herein. In one embodiment, the H ^c is of the B2, B3, B4, B5, B6, or B7 subtype. In one embodiment, the modified receptor binding domain is not from BoNT/B4 (the Eklund strain). In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8.

La presente descripción abarca la NTBo muíante de longitud completa que contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria, para aplicaciones terapéuticas en seres humanos. En una realización, la NTBo de longitud completa contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con una sustitución de aminoácidos en uno o en una combinación de restos de aminoácidos correspondientes a la posición E1191, S1199, Y1183 y W1178 de B1 (p. ej., seleccionados entre los enumerados en la Tabla 2). En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-H^c) con una sustitución de un solo aminoácido como se describe en la presente memoria. En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-Hc) con dos sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria. En una realización, la NTBo contiene un He modificado (p. ej., B-H^c) con tres sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente memoria. Las mutaciones se pueden realizar de la misma manera que se describe en la presente memoria para NTBo/He, (p. ej., utilizando uno cualquiera de los subtipos de NTBo/B o cualquier serotipo como molde). En una realización, la NTBo mutante de longitud completa contiene un Hc modificado que no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8.The present disclosure encompasses full-length mutant BoNT containing a modified He (eg, B-Hc) with amino acid substitutions as described herein, for therapeutic applications in humans. In one embodiment, the full-length BoNT contains a modified He (eg, B-Hc) with an amino acid substitution at one or a combination of amino acid residues corresponding to position E1191, S1199, Y1183, and W1178 of B1 (eg, selected from those listed in Table 2). In one embodiment, the BoNT contains a modified He (eg, BH ^c ) with a single amino acid substitution as described herein. In one embodiment, the BoNT contains a modified He (eg, B-Hc) with two amino acid substitutions as described herein. In one embodiment, the BoNT contains a modified He (eg, BH ^c ) with three amino acid substitutions as described herein. Mutations can be made in the same manner as described herein for BoNT/He, (eg, using any one of the BoNT/B subtypes or any serotype as a template). In one embodiment, the full-length mutant BoNT contains a modified non-BoNT/B4 Hc (the Eklund strain). In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8.

La toxina NTBo resultante puede tener una unión significativamente mejorada a la Syt II humana y, por lo tanto, alcanzará una mayor eficacia y especificidad para dirigirse a las neuronas humanas que la WT NTBo. El mutante resultante puede mantener adicionalmente una unión similar a Sytl humana, tener una unión significativamente mejorada a Sytl humana o tener una unión significativamente reducida a Sytl humana.The resulting BoNT toxin may have significantly improved binding to human Syt II and thus will achieve higher efficiency and specificity in targeting human neurons than WT BoNT. The resulting mutant may further maintain similar binding to human Sytl, have significantly enhanced binding to human Sytl, or have significantly reduced binding to human Sytl.

Polipéptidos y polipéptidos quiméricosPolypeptides and chimeric polypeptides

Asimismo se describe en la presente memoria un polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado (p. ej., del serotipo A, B, C, D, E, F o G). En una realización, e1Hc modificado, en el contexto del polipéptido, tiene una unión significativamente mejorada a Syt II y/o Syt I humanas, en comparación con el polipéptido análogo con aminoácidos WT en las posiciones específicas modificadas en e1Hc (la contraparte de tipo salvaje). En una realización, el dominio de unión al receptor modificado es NTBo/B-Hc (p. ej., de NTBoB1). En una realización, el He modificado se genera a partir de un serotipo, cepa y/o subtipo diferente de NTBo mediante la sustitución de los aminoácidos que corresponden a la posición o posiciones especificadas en B1 descritas en la presente memoria. En una realización, el Hc modificado no es de NTBo/B4 (la cepa Eklund). En una realización, el B-Hc modificado no es de la cepa 3, 7 ni 8. En una realización, el dominio de unión al receptor modificado tiene una o más modificaciones (sustituciones de aminoácidos) en la porción C-terminal de NTBoB-He (designado como Hcc), que es la región que contiene el sitio de unión para los receptores de proteínas y los gangliósidos en cada NTBo. En una realización, el polipéptido resultante tiene la capacidad de dirigirse a neuronas humanas mediante la unión a SytI/II humana.Also disclosed herein is a polypeptide comprising the modified receptor binding domain (eg, serotype A, B, C, D, E, F, or G). In one embodiment, the modified e1Hc, in the context of the polypeptide, has significantly enhanced binding to human Syt II and/or Syt I, compared to the analogous polypeptide with WT amino acids at the specific positions modified in e1Hc (the wild-type counterpart). ). In one embodiment, the modified receptor binding domain is NTBo/B-Hc (eg, from NTBoB1). In one embodiment, the modified He is generated from a different BoNT serotype, strain, and/or subtype by substituting amino acids corresponding to the specified position(s) in B1 described herein. In one embodiment, the modified Hc is not from BoNT/B4 (the Eklund strain). In one embodiment, the modified B-Hc is not from strain 3, 7, or 8. In one embodiment, the modified receptor binding domain has one or more modifications (amino acid substitutions) in the C-terminal portion of NTBoB- He (designated Hcc), which is the region that contains the binding site for protein receptors and gangliosides on each BoNT. In one embodiment, the resulting polypeptide has the ability to target human neurons by binding to human SytI/II.

El polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado puede ser una proteína de fusión del dominio de unión al receptor y otro polipéptido funcional (p. ej., un polipéptido funcional utilizado en un sistema de 2 híbridos (cebo o presa tal como T18 o T25, o glutatión S transferasa (GST)). Esto también se puede denominar molécula polipeptídica quimérica. Alternativamente, puede ser una fusión del dominio de unión al receptor modificado y una etiqueta polipeptídica con fines de identificación y/o fines de purificación (p. ej., una etiqueta de hexahistidina (His6) (SEQ ID NO: 13), o una etiqueta epitópica tal como una etiqueta de hemaglutinina (HA) (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)), o GST), muchas de las cuales son conocidas y se utilizan comúnmente en la técnica. La fusión puede tener un tramo de aminoácidos entre los respectivos dominios funcionales que facilita la conexión, sirve como un sitio de escisión o para preservar la conformación y/o función independientes. En una realización, la conexión conserva la función del dominio de unión al receptor modificado. En una realización la conexión enmascara la función del dominio de unión al receptor modificado. Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de tales polipéptidos que están de acuerdo con la invención. The polypeptide comprising the modified receptor binding domain may be a fusion protein of the receptor binding domain and another functional polypeptide (eg, a functional polypeptide used in a 2-hybrid system (bait or prey such as T18 or T25, or glutathione S transferase (GST). This may also be referred to as a chimeric polypeptide molecule. Alternatively, it may be a fusion of the modified receptor binding domain and a polypeptide tag for identification purposes and/or purification purposes (eg eg, a hexahistidine (His6) tag (SEQ ID NO: 13), or an epitope tag such as a hemagglutinin (HA) tag (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)), or GST), many of the which are known and commonly used in the art The fusion may have a stretch of amino acids between the respective functional domains that facilitates connection, serves as a cleavage site, or preserves independent conformation and/or function. Alization, the connection retains the function of the modified receptor-binding domain. In one embodiment the connection masks the function of the modified receptor binding domain. Another aspect of the invention relates to a nucleic acid molecule encoding any such polypeptides that are in accordance with the invention.

La NTBo/He modificada (p. ej., B-Hc) se puede conectar a otros agentes (p. ej., proteínas, moléculas pequeñas, polipéptidos cortos, ácidos nucleicos) covalentemente (p. ej., como una proteína de fusión) o no covalentemente. Como tal, otro aspecto de la invención se refiere a una molécula quimérica que comprende una primera porción que es un dominio de unión al receptor modificado de C. botulinum (p. ej., serotipo B) de acuerdo con la invención, como se describe en la presente memoria, unido a una segunda porción. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva (o "biológicamente activa") tal como un agente terapéutico (p. ej., un fármaco polipeptídico o no polipeptídico tal como una molécula pequeña o ácido nucleico). La conexión de la primera y segunda porciones de la molécula puede ser covalente (p. ej., en forma de una proteína de fusión) o no covalente. Los métodos de tal enlace son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados fácilmente por el médico experto. Uno de tales usos de una molécula quimérica de la invención es como herramienta de suministro para el direccionamiento a neuronas en seres humanos. Por ejemplo, la NTBo/He modificada se puede unir a otros agentes terapéuticos, para que sirvan como vehículo de direccionamiento para suministrar los agentes terapéuticos a las neuronas en seres humanos mediante la unión a Syt I y/o Syt II humanas.Modified BoNT/He (eg, B-Hc) can be linked to other agents (eg, proteins, small molecules, short polypeptides, nucleic acids) covalently (eg, as a fusion protein ) or noncovalently. As such, another aspect of the invention relates to a chimeric molecule comprising a first portion that is a modified receptor binding domain from C. botulinum (eg, serotype B) according to the invention, as described herein, attached to a second portion. The second portion of the molecule can be a bioactive (or "biologically active") molecule such as a therapeutic agent (eg, a polypeptide or non-polypeptide drug such as a small molecule or nucleic acid). The connection of the first and second portions of the molecule can be covalent (eg, in the form of a fusion protein) or non-covalent. Methods of such binding are known in the art and can be readily applied by the skilled physician. One such use of a chimeric molecule of the invention is as a delivery tool for targeting neurons in humans. For example, the modified BoNT/He can be linked to other therapeutic agents, to serve as a targeting vehicle to deliver the therapeutic agents to neurons in humans by binding to human Syt I and/or Syt II.

Modificaciones del dominio de unión al receptor (Hc)Receptor binding domain (Hc) modifications

Como se analiza en la presente memoria, la invención se refiere a un Hc modificado y polipéptidos que comprenden el Hc modificado (p. ej., NTBo o un polipéptido quimérico o de fusión). La modificación de la secuencia de aminoácidos de He utilizada para generar estos diversos polipéptidos de la invención se puede realizar mediante varios métodos conocidos por el médico experto. Los ejemplos incluyen, sin limitación, mutagénesis dirigida (mutagénesis dirigida al sitio) o mutagénesis aleatoria de cada resto de aminoácido dentro de la región conocida por unirse a Syt I/II. Estas regiones de unión a Syt están bien definidas por estudios previos relacionados con los receptores Syt de ratón o rata1-29’36’31’32 pero no se han determinado claramente para las interacciones entre NTBo/B-HC y receptores Syt humanos. Se pueden utilizar diferentes subtipos de NTBo/B, u otros serotipos que se unen a Syt I/II (D-C o G), como molde para crear mutaciones iguales o similares mediante la generación de las mutaciones correspondientes descritas en la presente memoria para B1-H^c. La posición correspondiente para los restos seleccionados que se van a mutar se puede identificar fácilmente mediante el alineamiento de secuencia con el subtipo B1. Algunos de los productos polipeptídicos resultantes están incluidos en la presente invención (como se describe en otra parte), al igual que los polipéptidos que comprenden dichos productos y las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos y productos.As discussed herein, the invention relates to a modified Hc and polypeptides comprising the modified Hc (eg, BoNT or a chimeric or fusion polypeptide). Modification of the amino acid sequence of He used to generate these various polypeptides of the invention can be accomplished by various methods known to the skilled physician. Examples include, without limitation, site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) or random mutagenesis of each amino acid residue within the region known to bind Syt I/II. These Syt-binding regions are well defined by previous studies involving mouse or rat Syt1-29'36'31'32 receptors but have not been clearly determined for interactions between BoNT/B-HC and human Syt receptors. Different BoNT/B subtypes, or other serotypes that bind Syt I/II (DC or G), can be used as a template to create the same or similar mutations by generating the corresponding mutations described herein for B1- ^Hc . The corresponding position for the selected residues to be mutated can be readily identified by sequence alignment with the B1 subtype. Certain of the resulting polypeptide products are included in the present invention (as described elsewhere), as are the polypeptides comprising said products and the nucleic acid molecules encoding said polypeptides and products.

Las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de H^cpara producir el dominio de unión al receptor modificado pueden ser la mutación de un único resto a un aminoácido diferente (sustitución de un solo sitio), la mutación de varios restos al mismo tiempo (sustitución de varios sitios), la deleción de uno o más restos (deleción) y la inserción de uno o más restos (inserción), así como combinaciones de las mismas. Los métodos para la mutación de proteínas son bien conocidos en la técnica (p. ej., sustituciones dirigidas de un solo sitio y de múltiples sitios en el ADN que codifica la secuencia de NTBo/H^c).Modifications to the amino acid sequence of H ^c to produce the modified receptor binding domain can be mutation of a single residue to a different amino acid (single-site substitution), mutation of several residues at the same time (substitution of multiple sites), the deletion of one or more residues (deletion), and the insertion of one or more residues (insertion), as well as combinations thereof. Methods for protein mutation are well known in the art (eg, single-site and multi-site directed substitutions in the DNA encoding the BoNT/H ^c sequence).

En una realización, se modifican uno o más restos en H^cque contactan con Syt II de roedor o las regiones circundantes, según la bibliografía anterior sobre el dominio de unión al receptor de NTBo/B29 y la estructura de NTBo/B-Syt II referida (ID de PDB: 2NM1)3132. Estos incluyen, sin limitación, aquellas posiciones que corresponden a la posición Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, Y1256, D1115, E1203 de NTB^oB-B1. En una realización, uno o más de estos restos se reemplazan sistemáticamente por otros aminoácidos. También se prevén combinaciones de diversas modificaciones, que incluyen, sin limitación, mutaciones de dos o más posiciones enumeradas, a cualquier variedad de aminoácidos, tales como los enumerados en la presente memoria.In one embodiment, one or more residues in H ^c that contact rodent Syt II or surrounding regions are modified, based on previous literature on the BoNT/B29 receptor binding domain and BoNT/B-Syt II structure. referred (PDB ID: 2NM1)3132. These include, without limitation, those positions that correspond to position Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, Y1256, D1115, E1203 of NTB ^or B-B1. In one embodiment, one or more of these residues are systematically replaced by other amino acids. Combinations of various modifications, including, without limitation, mutations of two or more listed positions, to any variety of amino acids, such as those listed herein, are also envisioned.

Se pueden generar sustituciones de múltiples sitios (p. ej., 2 o 3) combinando mutaciones en estos restos clave identificados. Tales mutantes por sustitución de múltiples sitios pueden tener una unión aún más mejorada a h-Syt II y pueden mantener o tener adicionalmente una mejor unión a Syt I humana. En una realización, e1H^cmodificado tiene una primera sustitución de aminoácidos que corresponde a E1191 de serotipo B, cepa 1, sustituido por Q, M, C, V, L o Y. En una realización, el H^cmodificado tiene una segunda sustitución de sitio que corresponde a S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L de serotipo B, cepa 1. En una realización, el H^ctiene una sustitución de múltiples sitios que corresponde a E1191M y S1199W, E1191M y W1178Q, E1191C y S1199W, E1191C y S1199Y, E1191C y W1178Q, E1191Q y S1199W, E1191V y S1199W, E1191V y S1199Y, o E1191V y W1178Q, de serotipo B, cepa 1. En la invención, e1H^cmodificado tiene una primera sustitución de aminoácidos que corresponde a E1191 de serotipo B, cepa 1, sustituido por C o Y.Multi-site substitutions (eg, 2 or 3) can be generated by combining mutations at these identified key residues. Such multiple site substitution mutants may have even more improved binding to h-Syt II and may maintain or additionally have better binding to human Syt I. In one embodiment, the modified e1H ^c has a first amino acid substitution that corresponds to E1191 serotype B, strain 1, substituted with Q, M, C, V, L, or Y. In one embodiment, the modified H ^c has a second amino acid substitution. that corresponds to S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F, or S1199L of serotype B, strain 1. In one embodiment, the H ^c has a multisite substitution that corresponds a E1191M and S1199W, E1191M and W1178Q, E1191C and S1199W, E1191C and S1199Y, E1191C and W1178Q, E1191Q and S1199W, E1191V and S1199W, E1191V and S1199Y, or E1191V and W1178 strain, serotype e1HQ, Invention modified ^c has a first amino acid substitution corresponding to E1191 serotype B, strain 1, substituted by C or Y.

En una realización, el dominio de unión al receptor modificado comprende una mutación por sustitución en una posición correspondiente a Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191, E1245, D1115, E1203 o Y1256 de serotipo B, cepa 1. En una realización, la mutación por sustitución es A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y o V sustituidos por S. En una realización, la posición corresponde a S1199 o S1201 de serotipo B, cepa 1. En una realización, la mutación por sustitución es W, E o H. En una realización, la mutación por sustitución está en S1199, y es W, E o H. En una realización, la mutación por sustitución está en S1201 y es V. En una realización, las posiciones corresponden a W1178, Y1183 o E1191. En una realización, la posición corresponde a W1178 y la mutación por sustitución es Y, Q, A o S. En una realización, la posición corresponde a Y1183 y la mutación por sustitución es C o P. En una realización, la posición corresponde a E1191 y la mutación por sustitución es C, V, L o Y.In one embodiment, the modified receptor binding domain comprises a substitution mutation at a position corresponding to Y1181, P1197, A1196, F1204, F1194, P1117, W1178, Y1183, V1118, S1116, K1113, K1192, S1199, S1201, E1191 , E1245, D1115, E1203, or Y1256 serotype B, strain 1. In one embodiment, the substitution mutation is A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, T, W, Y, or V substituted for S. In one embodiment, the position corresponds to S1199 or S1201 serotype B, strain 1. In one embodiment, the substitution mutation is W, E, or H. In one embodiment, the substitution mutation is W, E, or H. embodiment, the substitution mutation is at S1199, and is W, E, or H. In one embodiment, the substitution mutation is at S1201, and is V. In one embodiment, the positions correspond to W1178, Y1183, or E1191. In one embodiment, the position corresponds to W1178 and the substitution mutation is Y, Q, A, or S. In one embodiment, the position corresponds to Y1183 and the substitution mutation is C or P. In one embodiment, the position corresponds to E1191 and the substitution mutation is C, V, L, or Y.

También se describe un H^cmodificado con una mutación por sustitución de un solo aminoácido que se muestra a continuación en la Tabla 2, como su incorporación en los diversos polipéptidos descritos en la presente memoria. A modified H ^c with a single amino acid substitution mutation shown in Table 2 below is also described as being incorporated into the various polypeptides described herein.

Tabla 2Table 2

En una realización, el He comprende una o más mutaciones que corresponden a E1191C/V/L/Y (E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y), S1199W/E/H (S1199W, S1199E o S1199H), W1178Y/Q/A/S (W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S) y/o Y1183C/P (Y1183C o Y1183P) de serotipo B, cepa 1 (Figura 3A, B).In one embodiment, He comprises one or more mutations corresponding to E1191C/V/L/Y (E1191C, E1191V, E1191L or E1191Y), S1199W/E/H (S1199W, S1199E or S1199H), W1178Y/Q/A/ S (W1178Y, W1178Q, W1178A or W1178S) and/or Y1183C/P (Y1183C or Y1183P) of serotype B, strain 1 (Figure 3A, B).

En una realización, el HC tiene dos mutaciones por sustitución en donde una es una mutación por sustitución correspondiente a la posición 1191 seleccionada de la Tabla 2. En una realización, e1Hc tiene una mejor unión a h-Syt II en comparación con el polipéptido análogo que tiene aminoácidos WT en las posiciones especificadas (también denominado en la presente memoria contraparte de tipo salvaje). En una realización, el mutante generado también mantiene o tiene una unión significativamente mejorada a Syt I humana en comparación con la contraparte de tipo salvaje. En particular, la mutación es E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y. Más particularmente, la mutación que corresponde a la posición E1191C, E1191V, E1191L o E1191Y se combina con una segunda mutación (p. ej., tales como las descritas en la presente memoria) para generar un H^cmodificado que tiene una mejor unión a h-Syt II en comparación con el polipéptido análogo que tiene aminoácidos WT en las posiciones especificadas (también denominado aquí contraparte de tipo salvaje). En una realización, el mutante generado también mantiene o tiene una unión significativamente mejorada a Syt I humana en comparación con la contraparte de tipo salvaje (Figura 4A). En una realización, la segunda mutación es una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para la posición 1183, 1199, 1201, 1178, 1117 o 1181 en la Tabla 2. En una realización, la segunda mutación es S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F o S1199L. En una realización, el He tiene dos mutaciones por sustitución que corresponden a las mostradas para el serotipo B, cepa 1, en la Tabla 3:In one embodiment, the HC has two substitution mutations where one is a substitution mutation corresponding to position 1191 selected from Table 2. In one embodiment, e1Hc has better binding to h-Syt II compared to the analogous polypeptide having WT amino acids at the specified positions (herein also referred to as the wild-type counterpart). In one embodiment, the generated mutant also maintains or has significantly enhanced binding to human Syt I compared to the wild-type counterpart. In particular, the mutation is E1191C, E1191V, E1191L or E1191Y. More particularly, the mutation corresponding to position E1191C, E1191V, E1191L, or E1191Y is combined with a second mutation (eg, such as those described herein) to generate a modified H ^c that has better binding to h-Syt II compared to the analogous polypeptide having WT amino acids at the specified positions (also referred to herein as wild-type counterpart). In one embodiment, the generated mutant also maintains or has significantly enhanced binding to human Syt I compared to the wild-type counterpart (FIG. 4A). In one embodiment, the second mutation is a substitution mutation corresponding to a substitution shown for position 1183, 1199, 1201, 1178, 1117, or 1181 in Table 2. In one embodiment, the second mutation is S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P, S1199F or S1199L. In one embodiment, He has two substitution mutations corresponding to those shown for serotype B, strain 1, in Table 3:

Tabla 3Table 3

En una realización, el He tiene tres mutaciones por sustitución, también denominadas en la presente memoria mutación triple. En una realización de la mutación triple, la primera mutación corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S de serotipo B, cepa 1. En una realización, la segunda mutación corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S de serotipo B, cepa 1 (excluida la posición que actúa como primera mutación). En una realización, la tercera sustitución corresponde a E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, W1178A o W1178S de serotipo B, cepa 1 (excluyendo las posiciones que actúan como primera y segunda mutaciones). En una realización descrita en la presente memoria, la mutación doble o triple no contiene una Q sustituida en ambas posiciones correspondientes a E1191 y W1178.In one embodiment, He has three substitution mutations, also referred to herein as a triple mutation. In one embodiment of the triple mutation, the first mutation corresponds to E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, W1178Q, or W1178Q, W1178Q, or W1178Q, W1178Q, or W1178Q. B, strain 1. In one embodiment, the second mutation corresponds to E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178QS, W1178A8, W1178A8, W1178A8, W1178A8, W1178A8 serotype B, strain 1 (excluding the position acting as the first mutation). In one embodiment, the third substitution corresponds to E1191Q, E1191M, E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, S1199Y, S1199F, S1199L, Y1183C, Y1183P, W1178Y, serotype B1178Q, W1178A or W1178A strain. (excluding positions that act as first and second mutations). In one embodiment described herein, the double or triple mutation does not contain a substituted Q at both positions corresponding to E1191 and W1178.

En una realización de la mutación triple, una mutación es una mutación por sustitución que corresponde a una sustitución mostrada para E1191 en la Tabla 2 (p. ej., E1191Q/M/C/V/L o Y). La segunda mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para S1199 en la Tabla 2 (p. ej., S1199W/E/H/Y/F o L). La tercera mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para W1178 en la Tabla 2 (p. ej., W1178Y/Q/A o S). Alternativamente, la tercera mutación puede ser una mutación por sustitución correspondiente a una sustitución mostrada para Y1183 en la Tabla 2 (p. ej., Y1183C, Y1183P). En una realización, la mutación triple corresponde a E1191M/S1199W/W1178Q.In one embodiment of the triple mutation, a mutation is a substitution mutation that corresponds to a substitution shown for E1191 in Table 2 (eg, E1191Q/M/C/V/L or Y). The second mutation may be a substitution mutation corresponding to a substitution shown for S1199 in Table 2 (eg, S1199W/E/H/Y/F or L). The third mutation may be a substitution mutation corresponding to a substitution shown for W1178 in Table 2 (eg, W1178Y/Q/A or S). Alternatively, the third mutation may be a substitution mutation corresponding to a substitution shown for Y1183 in Table 2 (eg, Y1183C, Y1183P). In one embodiment, the triple mutation corresponds to E1191M/S1199W/W1178Q.

Moléculas de ácido nucleiconucleic acid molecules

Otro aspecto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos descritos en la presente memoria según la invención (p. ej., dominio de unión al receptor modificado, o un polipéptido que comprende el dominio de unión al receptor modificado, o la neurotoxina botulínica que comprende el dominio de unión al receptor modificado, descrito en la presente memoria). En una realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 13. Tales moléculas de ácido nucleico pueden ser producidas por un médico experto, por ejemplo, mediante técnicas de ADN recombinante. La mutación por sustitución de aminoácidos deseada se realiza, por ejemplo, mediante modificación del ADN codificante. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos descritos en la presente memoria se generan mutando el codón de ácido nucleico que codifica el aminoácido especificado al aminoácido deseado utilizando el código genético que se muestra a continuación:Another aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the polypeptides described herein according to the invention (eg, modified receptor binding domain, or a polypeptide comprising the modified receptor binding domain, or the botulinum neurotoxin comprising the modified receptor binding domain, described herein). In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises the nucleic acid sequence shown in Figure 13. Such nucleic acid molecules can be produced by a skilled clinician, for example, by recombinant DNA techniques. The desired amino acid substitution mutation is made, for example, by modification of the encoding DNA. For example, the nucleic acid sequences encoding the polypeptides described herein are generated by mutating the nucleic acid codon encoding the specified amino acid to the desired amino acid using the genetic code shown below:

En una realización, la secuencia de ácido nucleico se optimiza para la expresión en E. coli (p. ej., la secuencia de ácido nucleico basada en GenBank AB232927.1, cuya porción relevante se muestra en la Figura 13).In one embodiment, the nucleic acid sequence is optimized for expression in E. coli (eg, the GenBank-based nucleic acid sequence AB232927.1, the relevant portion of which is shown in Figure 13 ).

Otro aspecto de la invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria según la invención. En una realización, el vector es un vector de expresión. Tal vector de expresión se denomina en la presente memoria construcción de expresión, y comprende una molécula de ácido nucleico divulgada en la presente memoria conectada operablemente al vector de expresión útil para expresar la molécula de ácido nucleico en una célula o extracto libre de células. Se puede emplear una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una neurotoxina de C. botulinum de la presente invención que incluye, sin limitación, un vector de expresión viral; un vector de expresión procariótico; vectores de expresión eucarióticos, tales como, p. ej., un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero; y un vector de expresión de extracto libre de células. Se entiende adicionalmente que los vectores de expresión útiles para poner en práctica aspectos de estos métodos pueden incluir aquellos que expresan la neurotoxina de C. botulinum bajo el control de un elemento promotor constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible, elemento potenciador o ambos. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con los reactivos bien establecidos y las condiciones para preparar y utilizar una construcción de expresión a partir de tales vectores de expresión, están fácilmente disponibles de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; y Stratagene, La Jolla, Calif. La selección, elaboración y uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.Another aspect of the invention relates to a nucleic acid vector comprising the nucleic acid molecule described herein according to the invention. In one embodiment, the vector is an expression vector. Such an expression vector is referred to herein as an expression construct, and comprises a nucleic acid molecule disclosed herein operably linked to the expression vector useful for expressing the nucleic acid molecule in a cell or cell-free extract. A wide variety of expression vectors can be employed to express a nucleic acid molecule encoding a C. botulinum neurotoxin of the present invention including, without limitation, a viral expression vector; a prokaryotic expression vector; eukaryotic expression vectors, such as, e.g. eg, a yeast expression vector, an insect expression vector, and a mammalian expression vector; and a cell-free extract expression vector. It is further understood that expression vectors useful for practicing aspects of these methods may include those that express the C. botulinum neurotoxin under the control of a constitutive, tissue-specific, cell-specific, or inducible promoter element, enhancer element, or both of them. Non-limiting examples of expression vectors, along with well-established reagents and conditions for preparing and using an expression construct from such expression vectors, are readily available from commercial vendors including, without limitation, BD Biosciences-Clontech , Palo Alto, Calif.; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.; Invitrogen, Inc, Carlsbad, Calif.; EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wis.; QIAGEN, Inc., Valencia, Calif.; and Stratagene, La Jolla, Calif. Selection, making, and use of an appropriate expression vector are routine procedures within the purview of one of skill in the art and the teachings herein.

Célulascells

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende la molécula de ácido nucleico o la construcción de expresión descrita en la presente memoria según la invención. La célula puede ser para la propagación del ácido nucleico o para la expresión del ácido nucleico, o ambas. Tales células incluyen, sin limitación, células procarióticas que incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aerobias, microaerófilas, capnófilas, anaerobias facultativas, gramnegativas y grampositivas tales como las derivadas, p. ej., de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucarióticas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales como, p. ej., las derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas celulares derivadas de insectos, tales como, p. ej., las derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamífero y líneas celulares derivadas de células de mamífero, tales como, p. ej., las derivadas de ratón, rata, hámster, súido, bóvido, équido, primate y ser humano. Las líneas celulares se pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo, la Colección Europea de Cultivos Celulares y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares. Los ejemplos no limitantes de los protocolos específicos para seleccionar, elaborar y utilizar una línea celular apropiada se describen, por ejemplo, en INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F.A. Goosen et al. Eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL And APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4a ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3a ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, más arriba, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2a ed. 2002); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, más arriba, (2004). Estos protocolos son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria.Another aspect of the invention relates to a cell comprising the nucleic acid molecule or expression construct described herein according to the invention. The cell may be for nucleic acid propagation or nucleic acid expression, or both. Such cells include, without limitation, prokaryotic cells including, without limitation, aerobic, microaerophilic, capnophilic, facultative anaerobic, gram-negative, and gram-positive bacterial cell strains such as those derived from, e.g. eg, from Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens, and Salmonella typhimurium; and eukaryotic cells including, without limitation, yeast strains, such as, e.g. eg, those derived from Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and Yarrowia lipolytica; insect cells and insect-derived cell lines, such as, e.g. eg, those derived from Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster, and Manduca sexta; and mammalian cells and cell lines derived from mammalian cells, such as, e.g. eg, those derived from mouse, rat, hamster, swine, bovid, equid, primate and human. Cell lines can be obtained from the American Type Culture Collection, the European Cell Culture Collection, and the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Non-limiting examples of specific protocols for selecting, making and using an appropriate cell line are described, for example, in INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F.A. Goosen et al. Eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2nd ed. 2002); and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004). These protocols are routine procedures within the purview of one of skill in the art and the teachings herein.

La célula puede estar destinada a la expresión del ácido nucleico para generar así el polipéptido codificado. Como tal, otro aspecto de la invención es un método para producir una proteína de neurotoxina botulínica, una HC aislada o un polipéptido que comprende una HC modificada, descrita en la presente memoria según la invención. Tales polipéptidos se producen cultivando la célula anfitriona que tiene en su interior un ácido nucleico que codifica el polipéptido, en el contexto de una construcción de expresión. El cultivo se realiza en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido de NTBo. El polipéptido expresado se puede recuperar del cultivo, purificar y formular mediante métodos conocidos en la técnica. El polipéptido expresado también se puede activar según sea necesario mediante métodos conocidos en la técnica. Un método para activar el polipéptido expresado es mediante escisión (o mella) por proteasas en una forma bicatenaria activa. Tales métodos se pueden adaptar de los conocidos en la técnica, por ejemplo, como describen Peter F. Bonventre y Lloyd L. KLempe (J. Bacteriol 1960, 79 (1): 23 y Michaeal L. Dekleva y Bibhuti R. DasGupta (Biochemical and Biophysical Research Communications 1989, 162: 767-772). Composiciones farmacéuticasThe cell may be targeted for expression of the nucleic acid to thereby generate the encoded polypeptide. As such, another aspect of the invention is a method of producing a botulinum neurotoxin protein, an isolated HC, or a polypeptide comprising a modified HC, described herein in accordance with the invention. Such polypeptides are produced by culturing the host cell having within it a nucleic acid encoding the polypeptide, in the context of an expression construct. The cultivation is carried out under conditions suitable for the production of the BoNT polypeptide. The expressed polypeptide can be recovered from culture, purified, and formulated by methods known in the art. The expressed polypeptide can also be activated as needed by methods known in the art. One method of activating the expressed polypeptide is by cleavage (or nick) by proteases in an active double-chain form. Such methods can be adapted from those known in the art, for example, as described by Peter F. Bonventre and Lloyd L. KLempe (J. Bacteriol 1960, 79(1):23 and Michaeal L. Dekleva and Bibhuti R. DasGupta (Biochemical and Biophysical Research Communications 1989, 162: 767-772).Pharmaceutical compositions

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina de C. botulinum, o molécula quimérica descrita en la presente memoria según la invención. En una realización, el polipéptido descrito en la presente memoria es un ingrediente activo en una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable (denominado en la presente memoria composición farmacéutica). Un "portador farmacéuticamente aceptable" significa cualquier medio farmacéuticamente aceptable para mezclar y/o suministrar la composición de suministro dirigida a un sujeto. El término "portador farmacéuticamente aceptable" como se emplea en la presente memoria significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptables, tal como una carga, diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, implicado en el acarreo o transporte de los agentes en cuestión desde un órgano, o parte del organismo, a otro órgano o parte del organismo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y compatible con la administración a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. Tales composiciones se pueden formular específicamente para la administración mediante una o más de varias rutas, tales como las rutas de administración descritas en la presente memoria. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos complementarios. Cuando un agente, formulación o composición farmacéutica descritos en la presente memoria se administran a un sujeto, preferiblemente, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se emplea en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que da como resultado una mejora o reparación de la afección. En una realización, la composición farmacéutica se formula para su administración mediante inyección. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica encapsulada en microesferas. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica formulada para el suministro transepitelial. En una realización, la composición farmacéutica implica la neurotoxina botulínica formulada para liberación lenta.Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the C. botulinum neurotoxin, or chimeric molecule described herein according to the invention. In one embodiment, the polypeptide described herein is an active ingredient in a composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier (referred to herein as a pharmaceutical composition). A "pharmaceutically acceptable carrier" means any pharmaceutically acceptable means of mixing and/or delivering the delivery composition to a subject. The term "pharmaceutically acceptable carrier" as used herein means a pharmaceutically acceptable material, composition, or vehicle, such as a liquid or solid filler, diluent, excipient, solvent, or encapsulating material, involved in the carrier or transport of the agents. in question from one organ, or body part, to another organ or body part. Each carrier must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients of the composition and compatible with administration to a subject, eg, a human. Such compositions may be specifically formulated for administration by one or more of a number of routes, such as the routes of administration described herein. Supplementary active ingredients may also be incorporated into the compositions. When an agent, formulation, or pharmaceutical composition described herein is administered to a subject, preferably, a therapeutically effective amount is administered. As used herein, the term "therapeutically effective amount" refers to an amount that results in an amelioration or repair of the condition. In one embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for administration by injection. In one embodiment, the pharmaceutical composition involves botulinum neurotoxin encapsulated in microspheres. In one embodiment, the pharmaceutical composition involves botulinum neurotoxin formulated for transepithelial delivery. In one embodiment, the pharmaceutical composition involves botulinum neurotoxin formulated for slow release.

En una realización, la neurotoxina botulínica, polipéptido o molécula quimérica de la presente invención están en forma de una fórmula de liberación controlada. Tales composiciones y métodos de administración se proporcionan en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2007/0020295.In one embodiment, the botulinum neurotoxin, polypeptide or chimeric molecule of the present invention is in the form of a controlled release formulation. Such compositions and methods of administration are provided in US Patent Publication No. 2007/0020295.

La neurotoxina botulínica se puede obtener estableciendo y haciendo crecer cultivos de Clostridium botulinum en un fermentador y a continuación recolectando y purificando la mezcla fermentada de acuerdo con procedimientos conocidos. Todos los serotipos de toxina botulínica se sintetizan inicialmente como proteínas monocatenarias inactivas que deben ser escindidas o melladas por proteasas para volverse neuroactivas. Las cepas bacterianas que producen los serotipos A y G de la toxina botulínica poseen proteasas endógenas y, por lo tanto, los serotipos A y G se pueden recuperar de cultivos bacterianos predominantemente en su forma activa. Por el contrario, los serotipos C1, D y E de toxina botulínica son sintetizados por cepas no proteolíticas y, por lo tanto, típicamente se desactivan cuando se recuperan del cultivo. Los serotipos B y F son producidos por cepas proteolíticas y no proteolíticas y, por lo tanto, se pueden recuperar en forma activa o inactiva. Las cepas proteolíticas que producen, por ejemplo, el serotipo de tipo B de toxina botulínica pueden escindir solo una porción de la toxina producida. La proporción exacta de moléculas melladas con respecto a no melladas depende de la duración de la incubación y la temperatura del cultivo. Por tanto, un cierto porcentaje de una preparación, por ejemplo, de toxina botulínica de tipo B puede estar inactivo. En una realización, la neurotoxina de la presente invención se encuentra en un estado activo. En una realización, la neurotoxina está en un estado inactivo. En una realización, se prevé una combinación de neurotoxina activa e inactiva.Botulinum neurotoxin can be obtained by establishing and growing cultures of Clostridium botulinum in a fermenter and then collecting and purifying the fermented mixture according to known procedures. All botulinum toxin serotypes are initially synthesized as inactive single-chain proteins that must be cleaved or nicked by proteases to become neuroactive. Bacterial strains that produce botulinum toxin serotypes A and G possess endogenous proteases, and therefore serotypes A and G can be recovered from bacterial cultures predominantly in their active form. In contrast, botulinum toxin serotypes C1, D, and E are synthesized by non-proteolytic strains and thus are typically inactivated when recovered from culture. Serotypes B and F are produced by proteolytic and non-proteolytic strains and can therefore be recovered in active or inactive form. Proteolytic strains that produce, for example, the botulinum toxin type B serotype can cleave only a portion of the toxin produced. The exact ratio of nicked to unnicked molecules depends on the duration of incubation and the temperature of the culture. Thus, a certain percentage of a preparation of, for example, botulinum toxin type B may be inactive. In one embodiment, the neurotoxin of the present invention is in an active state. In one embodiment, the neurotoxin is in an inactive state. In one embodiment, a combination of active and inactive neurotoxin is envisioned.

Kitskits

Asimismo se describe en la presente memoria un kit que comprende la NTBo o el polipéptido divulgado en la presente memoria (p. ej., en forma de una composición farmacéutica). El kit puede comprender una o más de las composiciones descritas en la presente memoria envasadas en un vial. El kit puede comprender adicionalmente una herramienta o dispositivo de suministro para la administración terapéutica de la composición y/o instrucciones para la administración terapéutica. El kit puede tener todos los componentes envasados en un recipiente formado.Also described herein is a kit comprising the BoNT or polypeptide disclosed herein (eg, in the form of a pharmaceutical composition). The kit may comprise one or more of the compositions described herein packaged in a vial. The kit may further comprise a tool or delivery device for therapeutic administration of the composition and/or instructions for therapeutic administration. The kit may have all the components packaged in a formed container.

Asimismo se describe en la presente memoria una herramienta o dispositivo de suministro para la administración de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria, precargados con la composición farmacéutica (p. ej., para un solo uso). Tales dispositivos pueden ser una jeringa o un dispositivo de microagujas para suministrar las composiciones. La jeringa puede ser una jeringa de un solo uso precargada con una cantidad eficaz de la composición. El dispositivo de microagujas puede comprender una o más microagujas recubiertas con la composición descrita en la presente memoria, tal como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2010/0196445, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria en su totalidad.Also described herein is a delivery tool or device for the administration of the pharmaceutical compositions described herein, pre-filled with the pharmaceutical composition (eg, for single use). Such devices can be a syringe or a microneedle device for delivering the compositions. The syringe may be a single use syringe pre-filled with an effective amount of the composition. The microneedle device may comprise one or more microneedles coated with the composition described herein, such as described in US Patent Publication 2010/0196445, the content of which is incorporated herein in its entirety.

Métodos de tratamientotreatment methods

Asimismo se describen en la presente memoria métodos para tratar una afección normalmente tratada con una neurotoxina (p. ej., afecciones del músculo esquelético, afecciones del músculo liso, afecciones glandulares, un trastorno neuromuscular, un trastorno del sistema nervioso autónomo, dolor o una afección estética/cosmética). Tales afecciones están asociadas con una actividad neuronal no deseada, según lo determine el médico experto. La presente invención incluye polipéptidos o polipéptidos de NTBo, o compuestos farmacéuticos descritos en la presente memoria según la invención, para su uso en medicina o para su uso en el tratamiento de afecciones asociadas con actividad neuronal no deseada, por ejemplo, utilizando un método descrito. El método comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una NTBo o polipéptido/molécula quimérica descritos en la presente memoria (p. ej., en forma de una composición farmacéutica) en la ubicación apropiada en el mamífero para reducir la actividad neuronal no deseada, para tratar de ese modo la afección. La administración se realiza por una ruta que pone en contacto una cantidad eficaz de la composición con las neuronas que presentan la actividad no deseada.Also described herein are methods of treating a condition normally treated with a neurotoxin (eg, skeletal muscle conditions, smooth muscle conditions, glandular conditions, a neuromuscular disorder, an autonomic nervous system disorder, pain, or an aesthetic/cosmetic condition). Such conditions are associated with unwanted neuronal activity, as determined by the skilled physician. The present invention includes BoNT polypeptides or polypeptides, or pharmaceutical compounds described herein according to the invention, for use in medicine or for use in the treatment of conditions associated with unwanted neuronal activity, for example, using a method described . The method comprises the step of administering a therapeutically effective amount of a BoNT or polypeptide/chimeric molecule described herein (eg, in the form of a pharmaceutical composition) to the appropriate location in the mammal to reduce non-responsive neuronal activity. desired, to thereby treat the condition. Administration is by a route that brings an effective amount of the composition into contact with the neurons exhibiting the undesired activity.

Las afecciones específicas previstas para el tratamiento mediante los métodos descritos en la presente memoria incluyen, sin limitación, disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica (es decir, todas las enfermedades que implican incontinencia urinaria, tales como p. ej., hiperactividad neurogénica del detrusor o vejiga hiperactiva idiopática), cáncer de próstata y otras formas de cáncer, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas así como otros trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor neuropático, dolor inflamatorio, dolor de cabeza, tal como p. ej. migraña, picor (prurito), acné. Además, la presente invención se puede utilizar para tratar afecciones dermatológicas o estéticas/cosméticas, por ejemplo, reducción de los surcos de las cejas, reducción de las arrugas de la piel. La presente invención también se puede utilizar en el tratamiento de lesiones deportivas.Specific conditions intended for treatment by the methods described herein include, without limitation, spasmodic dysphonia, spasmodic torticollis, laryngeal dystonia, oromandibular dysphonia, lingual dystonia, cervical dystonia, focal hand dystonia, blepharospasm, strabismus, hemifacial spasm , eyelid disorder, cerebral palsy, focal spasticity and other voice disorders, spasmodic colitis, neurogenic bladder (ie all diseases involving urinary incontinence, such as e.g. neurogenic detrusor overactivity or idiopathic overactive bladder) , prostate cancer and other forms of cancer, anismus, spasticity of the limbs, tics, tremors, bruxism, anal fissure, achalasia, dysphagia and other disorders of muscle tone and other disorders characterized by involuntary movements of muscle groups, lacrimation, hyperhidrosis, excessive salivation, excessive gastrointestinal secretions as well as o other secretory disorders, muscle spasm pain, neuropathic pain, inflammatory pain, headache, such as e.g. eg migraine, itching (pruritus), acne. Furthermore, the present invention can be used to treat dermatological or aesthetic/cosmetic conditions, eg, reduction of brow furrows, reduction of skin wrinkles. The present invention can also be used in the treatment of sports injuries.

Además, la neurotoxina modificada se puede administrar para tratar otros trastornos neuromusculares utilizando técnicas bien conocidas que se realizan comúnmente con botulinum tipo A. Por ejemplo, la presente invención se puede utilizar para tratar el dolor, por ejemplo, dolor de cabeza, dolor por espasmos musculares y diversas formas de dolor inflamatorio. Por ejemplo, Aoki en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.721.215 y Aoki en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.113.915 describe métodos de uso de toxina botulínica tipo A para tratar el dolor.In addition, the modified neurotoxin can be administered to treat other neuromuscular disorders using well-known techniques that are commonly performed with botulinum type A. For example, the present invention can be used to treat pain, eg, headache, spasm pain. muscular and various forms of inflammatory pain. For example, Aoki in US Patent No. 5,721,215 and Aoki in US Patent No. 6,113,915 describe methods of using botulinum toxin type A to treat pain.

Los trastornos del sistema nervioso autónomo también se pueden tratar con una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el mal funcionamiento de las glándulas es un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento de las glándulas incluye sudoración excesiva y salivación excesiva. El mal funcionamiento respiratorio es otro ejemplo de un trastorno del sistema nervioso autónomo. El mal funcionamiento respiratorio incluye enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma. Sanders et al. en la Patente de Estados Unidos Núm.Autonomic nervous system disorders can also be treated with a modified neurotoxin. For example, gland malfunction is a disorder of the autonomic nervous system. Malfunctioning of the glands includes excessive sweating and excessive salivation. Respiratory malfunction is another example of an autonomic nervous system disorder. Respiratory malfunction includes chronic obstructive pulmonary disease and asthma. Sanders et al. in United States Patent No.

5.766.605 divulgan métodos para tratar el sistema nervioso autónomo; por ejemplo, el tratamiento de trastornos del sistema nervioso autónomo tales como sudoración excesiva, salivación excesiva, asma, etc., utilizando toxinas botulínicas existentes de forma natural. En una realización, se pueden emplear métodos sustancialmente similares a los de Sanders et al., pero utilizando una neurotoxina modificada, para tratar trastornos del sistema nervioso autónomo tales como los discutidos anteriormente. Por ejemplo, se puede aplicar localmente una neurotoxina modificada a la cavidad nasal del mamífero en una cantidad suficiente para degenerar las neuronas colinérgicas del sistema nervioso autónomo que controlan la secreción mucosa en la cavidad nasal.5,766,605 disclose methods of treating the autonomic nervous system; for example, the treatment of disorders of the autonomic nervous system such as excessive sweating, excessive salivation, asthma, etc., using naturally existing botulinum toxins. In one embodiment, methods substantially similar to those of Sanders et al., but using a modified neurotoxin, can be employed to treat autonomic nervous system disorders such as those discussed above. For example, a modified neurotoxin can be applied locally to the nasal cavity of the mammal in an amount sufficient to degenerate cholinergic neurons of the autonomic nervous system that control mucous secretion in the nasal cavity.

El dolor que se puede tratar con una neurotoxina modificada incluye dolor causado por tensión muscular o espasmo, o dolor que no está asociado con espasmo muscular. Por ejemplo, Binder en la Patente de Estados Unidos Núm.Pain that can be treated with a modified neurotoxin includes pain caused by muscle tension or spasm, or pain that is not associated with muscle spasm. For example, Binder in US Patent No.

5.714.468 divulga que el dolor de cabeza causado por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía se puede tratar con una toxina botulínica de origen natural, por ejemplo Botulinum tipo A. En una realización, se pueden emplear métodos sustancialmente similares a los de Binder, pero utilizando una neurotoxina modificada, para tratar el dolor de cabeza, especialmente el causado por alteraciones vasculares, tensión muscular, neuralgia y neuropatía. El dolor causado por un espasmo muscular también se puede tratar mediante la administración de una neurotoxina modificada. Por ejemplo, el documento WO2006001676 (Kang Ahn) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor en la articulación de la rodilla causado por atrapamiento del nervio safeno, el documento WO2008059126 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor inducido por quimioterapia,el documento WO2008090287 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor inducido por el tratamiento anti-VIH, el documento WO2009130600 (Christine Favre et al.) divulga métodos de uso de una neurotoxina botulínica para tratar el dolor asociado con la neuropatía diabética, y el documento WO2007144493 (Michel Auguet et al.) divulga métodos para utilizar una neurotoxina botulínica combinada con un derivado opiáceo para tratar el dolor. Además, se puede administrar una neurotoxina modificada a un mamífero para tratar el dolor que no está asociado con un trastorno muscular, tal como un espasmo. En una realización amplia, los métodos descritos o las composiciones para su uso según la presente invención para el tratamiento del dolor no relacionado con el espasmo incluyen la administración central o la administración periférica de la neurotoxina modificada.U.S. 5,714,468 discloses that headache caused by vascular disturbances, muscle tension, neuralgia, and neuropathy can be treated with a naturally occurring botulinum toxin, for example, Botulinum type A. In one embodiment, methods substantially similar to those of Binder, but using a modified neurotoxin, to treat headaches, especially those caused by vascular disorders, muscle tension, neuralgia and neuropathy. Pain caused by muscle spasm can also be treated by administering a modified neurotoxin. For example, WO2006001676 (Kang Ahn) discloses methods of using a botulinum neurotoxin to treat knee joint pain caused by saphenous nerve entrapment, WO2008059126 (Christine Favre et al.) discloses methods of using a botulinum neurotoxin to treat pain induced by chemotherapy, WO2008090287 (Christine Favre et al.) discloses methods of using a botulinum neurotoxin to treat pain induced by anti-HIV treatment, WO2009130600 (Christine Favre et al. ) discloses methods of using a botulinum neurotoxin to treat pain associated with diabetic neuropathy, and WO2007144493 (Michel Auguet et al.) discloses methods of using a botulinum neurotoxin combined with an opiate derivative to treat pain. In addition, a modified neurotoxin can be administered to a mammal to treat pain that is not associated with a muscle disorder, such as spasm. In a broad embodiment, the disclosed methods or compositions for use according to the present invention for the treatment of non-spasm related pain include central administration or peripheral administration of the modified neurotoxin.

Un dolor agudo o crónico que no está asociado con un espasmo muscular también se puede aliviar con una administración periférica local de la neurotoxina modificada para su uso según la presente invención en un lugar de dolor real o percibido en el mamífero. En una realización, la neurotoxina modificada se administra por vía subcutánea en o cerca del lugar del dolor, por ejemplo, en o cerca de un corte. En algunas realizaciones, la neurotoxina modificada se administra por vía intramuscular en o cerca del lugar del dolor, por ejemplo, en o cerca del lugar de un hematoma en el mamífero. En algunas realizaciones, la neurotoxina modificada se inyecta directamente en una articulación de un mamífero, para tratar o aliviar el dolor causado por afecciones artríticas. Asimismo, la inyección o infusión repetida y frecuente de la neurotoxina modificada en un lugar de dolor periférico está dentro del alcance de la presente descripción.Acute or chronic pain that is not associated with muscle spasm can also be relieved by local peripheral administration of the neurotoxin modified for use according to the present invention to a site of actual or perceived pain in the mammal. In one embodiment, the modified neurotoxin is administered subcutaneously at or near the site of pain, eg, at or near a cut. In some embodiments, the modified neurotoxin is administered intramuscularly at or near the site of pain, eg, at or near the site of a hematoma in the mammal. In some embodiments, the modified neurotoxin is injected directly into a joint in a mammal to treat or relieve pain caused by arthritic conditions. Likewise, frequent and repeated injection or infusion of the modified neurotoxin into a peripheral pain site is within the scope of the present disclosure.

Las rutas de administración para tales métodos son conocidas en la técnica y se adaptan fácilmente a los métodos descritos en la presente memoria por el médico experto (p. ej., véase por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), editado por Anthony Fauci et al., 14a edición, publicado por McGraw Hill). A modo de ejemplo no limitante, el tratamiento de un trastorno neuromuscular puede comprender una etapa de administración local de una cantidad eficaz de la molécula a un músculo o grupo de músculos, el tratamiento de un trastorno autónomo puede comprender una etapa de administración local de una cantidad eficaz de la molécula a una glándula o glándulas, y el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administración de una cantidad eficaz de la molécula en el lugar del dolor. Además, el tratamiento del dolor puede comprender una etapa de administración de una cantidad eficaz de una neurotoxina modificada a la médula espinal.Routes of administration for such methods are known in the art and are readily adapted to the methods described herein by the skilled physician (eg, see, for example, Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), edited by Anthony Fauci et al., 14th edition, published by McGraw Hill). By way of non-limiting example, the treatment of a neuromuscular disorder may comprise a step of local administration of an effective amount of the molecule to a muscle or group of muscles, the treatment of an autonomic disorder may comprise a step of local administration of a effective amount of the molecule to a gland or glands, and treating pain may comprise a step of administering an effective amount of the molecule to the site of pain. Furthermore, the treatment of pain may comprise a step of administering an effective amount of a modified neurotoxin to the spinal cord.

También se prevé que el H^cmodificado (p. ej., B-H^c) descrito en la presente memoria se pueda utilizar como una herramienta de suministro para el direccionamiento a neuronas y otros tipos de células que expresan sinaptotagmina II humana en seres humanos. Por ejemplo, el H^cmodificado conectado a otra molécula bioactiva (p. ej., agente terapéutico) de forma covalente o no covalente para formar de ese modo una molécula quimérica descrita en la presente memoria, puede servir como vehículo de direccionamiento para suministrar la molécula bioactiva a las neuronas y otros tipos de células que expresan sinaptotagmina II humana en seres humanos mediante la unión a Syt I y/o Syt II humanas. Como tal, otra disposición descrita se refiere al uso de una molécula polipeptídica quimérica descrita en la presente memoria para suministrar la molécula bioactiva a una neurona en un sujeto humano. La segunda porción de la molécula puede ser una molécula bioactiva tal como un agente terapéutico (p. ej., un polipéptido o fármaco). La conexión de la primera y segunda porciones de la molécula puede ser covalente (p. ej., en forma de una proteína de fusión) o no covalente. Los métodos de tal conexión son conocidos en la técnica y pueden ser aplicados fácilmente por el médico experto. La molécula de polipéptido quimérico se administraría por una ruta que da como resultado el contacto del polipéptido con las neuronas que expresan el receptor al que se une específicamente el B-H^cmodificado (la neurona diana), como se describe en la presente memoria.It is also envisioned that the modified H ^c (eg, BH ^c ) described herein may be used as a delivery tool for targeting neurons and other cell types expressing human synaptotagmin II in humans. For example, modified H ^c linked to another bioactive molecule (eg, therapeutic agent) covalently or non-covalently to thereby form a chimeric molecule described herein, can serve as a targeting vehicle to deliver the bioactive molecule to neurons and other cell types expressing human synaptotagmin II in humans by binding to human Syt I and/or Syt II. As such, another disclosed arrangement relates to the use of a chimeric polypeptide molecule disclosed herein to deliver the bioactive molecule to a neuron in a human subject. The second portion of the molecule can be a bioactive molecule such as a therapeutic agent (eg, a polypeptide or drug). The connection of the first and second portions of the molecule can be covalent (eg, in the form of a fusion protein) or non-covalent. Methods of such connection are known in the art and can be readily applied by the skilled physician. The chimeric polypeptide molecule would be administered by a route that results in contact of the polypeptide with neurons expressing the receptor to which the modified BH ^c specifically binds (the target neuron), as described herein.

Identificación de la actividad de unión al receptorIdentification of receptor binding activity

Asimismo se describe en la presente memoria un método para identificar un dominio de unión al receptor de NTBo modificado por su capacidad para unirse a un receptor (p. ej., una Syt I humana o Syt II humana o SV2 humano). El método utiliza el sistema de ensayo de 2 híbridos y utiliza proteínas de fusión elaboradas del receptor y de1H^cmodificado respectivamente fusionadas (expresadas como proteínas de fusión) a las respectivas subunidades "cebo" y "presa" utilizadas en el ensayo de 2 híbridos (p. ej., sistema de activación de la transcripción Gal 4 que utiliza un dominio de activación y un dominio de unión a a DN). El ensayo de 2 híbridos se realiza típicamente en levadura (S. cerevisiae), pero se han desarrollado sistemas de ensayo similares para su uso en otros organismos unicelulares, así como en E. coli. Esos sistemas son igualmente comparables. En una realización, se utiliza el ensayo de 2 híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (Karimova et al., Proc Natl Acad Sci USA. 12 de mayo de 1998; 95(10): 5752-5756). El sistema utiliza T18 y T25 como cebo y presa, y pueden utilizar células de E. coli BTH101. Also described herein is a method for identifying a modified BoNT receptor binding domain for its ability to bind to a receptor (eg, a human Syt I or human Syt II or human SV2). The method uses the 2-hybrid assay system and uses fusion proteins made from the receptor and modified ^Hc respectively fused (expressed as fusion proteins) to the respective "bait" and "prey" subunits used in the 2-hybrid assay ( eg, Gal 4 transcriptional activation system using an activation domain and an aa-binding domain DN). The 2-hybrid assay is typically performed in yeast ( S. cerevisiae), but similar assay systems have been developed for use in other single-celled organisms, as well as E. coli. Those systems are equally comparable. In one embodiment, the bacterial adenylate cyclase 2-hybrid assay (Karimova et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998 May 12;95(10):5752-5756) is used. The system uses T18 and T25 as bait and prey, and can use E. coli BTH101 cells.

El H^cmodificado se expresa como una proteína de fusión con T18 (denominada primera proteína de fusión) en el ensayo de 2 híbridos de E. coli. En el método, el receptor (o un fragmento de unión del mismo, tal como h-Syt II aa 1-87) se expresa conjuntamente como una proteína de fusión con T25 (denominada segunda proteína de fusión) en el ensayo de 2 híbridos de E. coli. El ensayo utiliza un indicador de interacción positivo entre las moléculas respectivas a través de sus respectivas fusiones. Un posible indicador positivo es el desarrollo del color. Las colonias clonales de E. coli que expresan tanto la primera como la segunda proteínas de fusión se cultivan en medios sólidos que contienen los medios de información y selectivos apropiados (p. ej., ampicilina, kanamicina, X-gal e IPTG) durante un período de tiempo que permita la generación de una indicación positiva (p. ej., generación de color) a partir de colonias positivas. La unión del dominio de unión modificado al fragmento del receptor conducirá a la indicación positiva (p. ej., la expresión del gen LacZ y dará como resultado la generación de un color azul en las colonias cultivadas sobre placas de X-gal).The modified H ^c is expressed as a fusion protein with T18 (referred to as the first fusion protein) in the E. coli 2-hybrid assay. In the method, the receptor (or a binding fragment thereof, such as h-Syt II aa 1-87) is co-expressed as a fusion protein with T25 (referred to as a second fusion protein) in the 2-hybrid assay. E. coli. The assay uses a positive interaction indicator between the respective molecules through their respective fusions. A possible positive indicator is color development. Clonal E. coli colonies expressing both the first and second fusion proteins are grown on solid media containing the appropriate selective and selective media (eg, ampicillin, kanamycin, X-gal, and IPTG) for a period of time. period of time that allows the generation of a positive indication (eg, color generation) from positive colonies. Binding of the modified binding domain to the receptor fragment will lead to the positive indication (eg, expression of the LacZ gene and will result in the generation of a blue color in colonies grown on X-gal plates).

Las colonias se analizan para determinar tal indicación positiva (p. ej., desarrollo de color) cuando se comparan con los controles apropiados (positivos y negativos). El análisis puede ser visualmente o por medio de una máquina no humana. Se utiliza un control negativo apropiado que no produce una indicación positiva apreciable (p. ej., expresión de LacZ) (p. ej., una colonia clonal que carece de un componente clave del sistema de ensayo, por ejemplo tiene cebo y presa que se expresan sin una fusión). También se puede utilizar un control positivo fuerte apropiado. Un ejemplo de un control positivo fuerte para el receptor Syt II humano en el ensayo es un B1-Hc con una mutación por sustitución en E1191 (M/C/V o Q). También se puede utilizar un control débilmente positivo para identificar la fuerza de la unión. Un ejemplo de un control débilmente positivo para el receptor Syt II humano en el ensayo es un B1-Hc con una mutación por sustitución en W1178 (Q/Y/A o S). La identificación de la indicación positiva (p. ej., desarrollo de color) indica que el He modificado se une al receptor. La identificación de una indicación positiva fuerte, tal como un desarrollo de color fuerte (p. ej., por encima de un control positivo débil) indica que e1H^cse une al receptor con alta afinidad.Colonies are tested for such a positive indication (eg, color development) when compared to appropriate controls (positive and negative). The analysis can be visual or by means of a non-human machine. An appropriate negative control that does not produce an appreciable positive indication (eg, LacZ expression) is used (eg, a clonal colony that lacks a key component of the assay system, eg, has bait and prey that are expressed without a merger). An appropriate strong positive control can also be used. An example of a strong positive control for the human Syt II receptor in the assay is a B1-Hc with a substitution mutation in E1191 (M/C/V or Q). A weak positive control can also be used to identify binding strength. An example of a weak positive control for the human Syt II receptor in the assay is a B1-Hc with a substitution mutation in W1178 (Q/Y/A or S). Identification of the positive indication (eg, development colored) indicates that the modified He binds to the receptor. Identification of a strong positive indication, such as strong color development (eg, above a weak positive control) indicates that e1H ^c binds to the receptor with high affinity.

El He modificado utilizado en el ensayo puede ser cualquier He modificado divulgado en la presente memoria. A modo de ejemplo no limitante, el He modificado puede contener una, dos o tres mutaciones por sustitución tales como las divulgadas en la presente memoria. El He modificado puede ser de cualquier serotipo/cepa o subtipo como se divulga en la presente memoria.The modified He used in the assay can be any modified He disclosed herein. By way of non-limiting example, the modified He may contain one, two or three substitution mutations such as those disclosed herein. The modified He can be of any serotype/strain or subtype as disclosed herein.

Las realizaciones descritas aquí y en los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos, y dentro del alcance de la invención se incluyen diversas modificaciones o cambios evidentes para los expertos en la técnica. A menos que se defina lo contrario en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados con relación a la presente solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Adicionalmente, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.The embodiments described herein and in the following examples are for illustrative purposes only, and various modifications or changes apparent to those skilled in the art are included within the scope of the invention. Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present application shall have the meanings commonly understood by those skilled in the art. Additionally, unless the context requires otherwise, singular terms shall include pluralities and plural terms shall include the singular.

Se debe entender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en la presente memoria y, como tales, pueden variar. La terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que está definida únicamente por las reivindicaciones.It is to be understood that this invention is not limited to the particular methodology, protocols, reagents, etc., described herein and, as such, may vary. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the present invention, which is defined solely by the claims.

Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, se debe entender que todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente memoria están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se emplea para describir la presente invención, con relación a porcentajes significa ± 1%.Apart from working examples, or where otherwise indicated, it is to be understood that all numbers expressing amounts of ingredients or reaction conditions used herein are in all instances modified by the term "about". The term "approximately" when used to describe the present invention, in relation to percentages, means ± 1%.

En un aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos descritos en la presente memoria, como esenciales para la invención, pero abiertos a la inclusión de elementos no especificados, esenciales o no ("que comprende"). En algunas realizaciones, otros elementos que se van a incluir en la descripción de la composición, método o componente respectivo de la misma se limitan a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la invención ("que consiste esencialmente en"). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un método descrito así como a las composiciones y componentes del mismo. En otras realizaciones, se pretende que las invenciones, composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos, descritos en la presente memoria, sean exclusivos de cualquier elemento no considerado un elemento esencial del componente, composición o método ("que consiste en").In one aspect, the present invention relates to the compositions, methods, and respective components thereof described herein, as essential to the invention, but open to the inclusion of unspecified elements, essential or not ("comprising" ). In some embodiments, other elements to be included in the description of the respective composition, method, or component thereof are limited to those that do not materially affect the basic and novel features of the invention ("consisting essentially of") . This applies equally to steps within a described method as well as compositions and components thereof. In other embodiments, the inventions, compositions, methods, and respective components thereof, described herein, are intended to be exclusive of any element not considered an essential element of the component, composition, or method ("consisting of").

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones identificadas tienen el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían utilizar con relación a la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido se debe interpretar como una admisión de que los autores de la presente invención no tienen derecho a prefechar tal divulgación en virtud de una invención anterior o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones sobre la fecha o la representación sobre el contenido de estos documentos se basan en la información disponible para los solicitantes y no constituyen ninguna admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de estos documentos.All identified patents, patent applications, and publications are for the purpose of describing and disclosing, for example, the methodologies described in such publications that may be used in connection with the present invention. These publications are provided solely for disclosure prior to the filing date of this application. Nothing in this regard should be construed as an admission that the inventors of the present invention have no right to pre-date such disclosure by virtue of prior invention or for any other reason. All statements as to the date or representation as to the content of these documents are based on information available to applicants and do not constitute any admission as to the accuracy of the dates or content of these documents.

Referencias de antecedentes y descripción detalladaBackground references and detailed description

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La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes adicionales.The invention is further illustrated by the following examples, which are not to be construed as further limiting.

Ejemplosexamples

Identificación de mutaciones únicas que mejoran la unión de NTBo/B a h-Syt IIIdentification of unique mutations that enhance the binding of BoNT/B to h-Syt II

La estructura cocristalina de NTBo/B unida al dominio luminal Syt II de rata ha sido resuelta por dos estudios en 200625,26. La información estructural proporcionó una base sólida para que los autores de la presente invención se centraran en un número limitado de restos dentro de la interfase de unión para estudios de mutagénesis de diseño racional. La fenilalanina conservada en la posición 54 forma múltiples contactos hidrófobos con NTBo/B. Debido a que la leucina (en seres humanos) también es hidrófoba, es probable que la interrupción de la unión de NTBo/B se deba a las diferencias de tamaño/forma entre la fenilalanina y la leucina. La clave fue identificar posibles cambios en la región NTBo/B H^cque puedan adaptarse al cambio de fenilalanina a leucina.The co-crystal structure of BoNT/B bound to the rat Syt II luminal domain has been resolved by two studies in 200625,26. The structural information provided a strong basis for us to focus on a limited number of residues within the binding interface for rational design mutagenesis studies. The conserved phenylalanine at position 54 forms multiple hydrophobic contacts with BoNT/B. Because leucine (in humans) is also hydrophobic, disruption of BoNT/B binding is likely due to size/shape differences between phenylalanine and leucine. The key was to identify possible changes in the BoNT/BH ^c region that may accommodate the change from phenylalanine to leucine.

Se examinaron todos los restos en NTBo/B que contribuyen a las interacciones entre NTBo/B y Syt II. Estos restos estaban bien definidos por la estructura cocristalina de NTBo/B-Syt II, incluidos K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245 e Y1256 (Fig.3), un total de 19 posiciones. La estrategia fue reemplazar primero sistemáticamente los restos en cada una de estas 19 posiciones por los demás 19 aminoácidos posibles y después someter a prueba la unión de estos NTBo/B-H^cmutados a h-Syt II. Por lo tanto, fue necesario generar y someter a prueba un total de 19 x 19 = 361 mutaciones puntuales únicas.All residues in BoNT/B that contribute to interactions between BoNT/B and Syt II were examined. These residues were well defined by the BoNT/B-Syt II co-crystal structure, including K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245 and Y1256 (Fig.3), a total of 19 positions. The strategy was to first systematically replace residues at each of these 19 positions with the other 19 possible amino acids and then test these mutated BoNT/BH ^c for binding to h-Syt II. Therefore, a total of 19 x 19 = 361 unique point mutations needed to be generated and tested.

Se utilizó un sistema de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana (BACTH) para generar estas 361 mutaciones y someter a prueba su unión a h-Syt II como se describe en la Fig. 4. Brevemente, se subclonó NTBo/B-Hc de tipo salvaje (WT) en un vector en marco con el fragmento dividido (T18) de la adenilato ciclasa bacteriana. Esta construcción de fusión T18-NTBo/B-Hc se amplificó mediante PCR con cebadores que albergaban trinucleótidos aleatorios (NNN) en la posición seleccionada en NTBo/B-Hc (Fig. 4A). Esto generó una reserva de construcciones que codificaban los 20 aminoácidos diferentes en el sitio seleccionado. Esta reserva de construcciones se co transformaron a continuación en bacterias (E. colicepa BTH101), junto con una construcción que expresaba h-Syt II (1-87) fusionada con la otra mitad de la adenilato ciclasa bacteriana dividida (T25). La unión de una NTBo/B-Hc mutante a h-Syt II unió T18 y T25 y recuperó la actividad de la adenilato ciclasa, lo que condujo a la expresión del gen lacZ y dio como resultado colonias de color azul en las placas de X-gel (Fig. 4B). Las mutaciones específicas introducidas en NTBo/B-Hc se identificaron extrayendo y secuenciando las construcciones de estas colonias de color azul.A bacterial adenylate cyclase two-hybrid (BACTH) system was used to generate these 361 mutations and test their binding to h-Syt II as described in Fig. 4. Briefly, BoNT/B-Hc type wild type (WT) in a vector in frame with the cleaved fragment (T18) of bacterial adenylate cyclase. This T18-BoNT/B-Hc fusion construct was amplified by PCR with primers harboring random trinucleotides (NNN) at the selected position in BoNT/B-Hc (FIG. 4A). This generated a pool of constructs encoding the 20 different amino acids at the selected site. This pool of constructs was then co-transformed into bacteria ( E. coli strain BTH101), along with a construct expressing h-Syt II (1-87) fused to the other half of the cleaved bacterial adenylate cyclase (T25). Binding of a mutant BoNT/B-Hc to h-Syt II bound T18 and T25 and restored adenylate cyclase activity, leading to expression of the lacZ gene and resulting in blue colonies on X plates. -gel (Fig. 4B). Specific mutations introduced in BoNT/B-Hc were identified by extracting and sequencing constructs from these blue colonies.

Utilizando este método BACTH, se escrutaron los 19 sitios seleccionados en NTBo/B-Hc. El número de colonias totales y de colonias de color azul para cada sitio se enumeran en la Figura 5A. Se contaron más de 380 colonias totales para cada posición. El número total de colonias determinó la posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos en el sitio de mutación seleccionado. Esto se calculó mediante la ecuación de Clark-Carbon: P = 1-(1-f)N, donde f refleja el número de restos posibles (f = 1/20 aquí ya que hay 20 aminoácidos diferentes), y N es el número total de colonias. Con un número mínimo de 380 colonias, la probabilidad de cubrir los 20 aminoácidos en una posición es de 99,8%. Por lo tanto, es probable que se hayan cubierto los 20 restos posibles una vez que el número de colonias en las placas supere las 380.Using this BACTH method, the 19 selected sites in BoNT/B-Hc were screened. The number of total colonies and blue colonies for each site are listed in Figure 5A. More than 380 total colonies were counted for each position. The total number of colonies determined the possibility of covering all 20 amino acids at the selected mutation site. This was calculated using the Clark-Carbon equation: P = 1-(1-f)N, where f reflects the number of possible residues (f = 1/20 here since there are 20 different amino acids), and N is the number total colonies. With a minimum number of 380 colonies, the probability of covering all 20 amino acids in a position is 99.8%. Therefore, it is likely that all 20 possible residues have been covered once the number of colonies on the plates exceeds 380.

Como se muestra en la Figura 5A, se encontró que cuatro posiciones dieron como resultado colonias de color azul, incluyendo E1191 (22,7%), W11178 (7,8%), Y1183 (4,0%) y S1199 (5,1%). Entre estas cuatro posiciones, E1191 tuvo los niveles más altos de colonias de color azul. Además, las colonias de color azul de E1191 también mostraron un color azul más oscuro en comparación con los otros tres sitios, lo que sugirió que la interacción entre NTBo/B-Hc y h-Syt II podría ser más fuerte con mutaciones E1191. Se extrajeron los plásmidos y se secuenciaron a partir de estas colonias de color azul. Los restos identificados en cada sitio se enumeran en la Figura 5B: E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183/C/P, S1199W/E/Y/H, W1178Y/Q/A/S.As shown in Figure 5A, four positions were found to result in blue colonies, including E1191 (22.7%), W11178 (7.8%), Y1183 (4.0%), and S1199 (5, 1%). Among these four positions, E1191 had the highest levels of blue colonies. Furthermore, the blue colonies of E1191 also showed a darker blue color compared to the other three sites, suggesting that the interaction between BoNT/B-Hc and h-Syt II might be stronger with E1191 mutations. Plasmids were extracted and sequenced from these blue colonies. Residues identified at each site are listed in Figure 5B: E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183/C/P, S1199W/E/Y/H, W1178Y/Q/A/S.

Las interacciones entre Syt II humana y los mutantes identificados se verificaron adicionalmente midiendo los niveles de p-galactosidasa producida en bacterias, que eran proporcionales al nivel total de actividad de adenilato ciclasa reconstituida por interacciones entre T18-NTBo/B-H^cy T25-h-Syt II. Cuatro mutaciones en los sitios E1191, E1191M/C/V/Q, mostraron la actividad p-galactosidasa más fuerte entre todas las mutaciones probadas (Figura 6A), lo que sugiere que el reemplazo de E1191 por uno de estos cuatro restos mejoraba significativamente la unión de T18-NTBo/B-Hc a T25-h-Syt II.Interactions between human Syt II and the identified mutants were further verified by measuring the levels of p-galactosidase produced in bacteria, which were proportional to the total level of adenylate cyclase activity reconstituted by interactions between T18-NTBo/BH ^c and T25-h- Sit II. Four mutations at the E1191 sites, E1191M/C/V/Q, showed the strongest p-galactosidase activity among all mutations tested (Figure 6A), suggesting that replacement of E1191 by one of these four residues significantly enhanced the p-galactosidase activity. binding of T18-BoNT/B-Hc to T25-h-Syt II.

Unión de NTBo/B-Hc mutante a h-Syt II se analizó adicionalmente utilizando un ensayo de precipitación como un enfoque alternativo (Figura 6B). Brevemente, el dominio luminal Syt II de ratón marcado con GST (m-Syt II) y el dominio luminal Syt II humano (h-Syt II) se inmovilizaron sobre cuentas de GST y se utilizaron para precipitar la NTBo/B-Hc mutante expresada en bacterias. La unión de NTBo/B-Hc a Syt II etiquetada con GST se detectó mediante análisis de inmunotransferencia, detectando la etiqueta HA fusionada con NTBo/B-H^c. Como se muestra en la Figura 6B, E1191M/C/V/Q dio como resultado niveles significativos de unión a h-Syt II, lo que fue compatible con el hallazgo de que estas cuatro mutaciones también mostraban la actividad p-galactosidasa más fuerte (Figura 6A). En conjunto, estos resultados indicaron que E1191M/C/V/Q son cuatro mutaciones primarias que adquieren la capacidad de unirse a h-Syt II de forma robusta.Binding of mutant BoNT/B-Hc to h-Syt II was further analyzed using a precipitation assay as an alternative approach (FIG. 6B). Briefly, GST-labeled mouse Syt II luminal domain (m-Syt II) and human Syt II luminal domain (h-Syt II) were immobilized on GST beads and used to precipitate the expressed mutant BoNT/B-Hc. in bacteria. Binding of BoNT/B-Hc to GST-tagged Syt II was detected by immunoblot analysis, detecting the HA tag fused to BoNT/BH ^c . As shown in Figure 6B, E1191M/C/V/Q resulted in significant levels of binding to h-Syt II, which was consistent with the finding that these four mutations also displayed the strongest p-galactosidase activity ( Figure 6A). Taken together, these results indicated that E1191M/C/V/Q are four primary mutations that acquire the ability to bind h-Syt II robustly.

Las mutaciones combinacionales en HCB mejoraron adicionalmente su unión a h-Syt IICombinational mutations in HCB further enhanced its binding to h-Syt II

A continuación se exploró si la unión de NTBo/B-Hc E1191M/C/V/Q a h-Syt II se podía mejorar adicionalmente mediante la inclusión de una mutación secundaria en un sitio diferente. Los sitios 1183, 1199 y 1178 fueron enfocados como candidatos para los sitios de mutación secundaria, ya que estos eran los únicos tres sitios que también dieron como resultado colonias de color azul (Figura 5). Utilizando E1191M como mutaciones primarias, se generaron mutaciones dobles combinando E1191M con todos los otros 10 cambios de restos identificados en el escrutinio mediante BACTH en los sitios 1183, 1199 y 1178 como se indica en la Figura 5B. Estas 10 mutaciones dobles se analizaron para determinar su capacidad para unirse a h-Syt II en ensayos de precipitación como se indica en la Figura 7A. T res de ellos, E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y y E1191M/W1178Q, dieron como resultado una unión significativa a h-Syt II (Figura 7A). Estos resultados sugirieron que la inclusión de S1199W/Y y W1178Q como sitio de mutación secundaria mejoraba adicionalmente la unión de NTBo/B-Hc E1191M/C/V/Q a h-Syt II. En conjunto, estos datos indicaron que hay cuatro opciones de mutación primaria en el sitio E1191 (M/C/V/Q) y tres opciones de sitios de mutación secundaria (S1199W/Y y W1178Q) (Figura 7B), y que una combinación de una mutación primaria con una mutación secundaria puede mejorar adicionalmente la unión a h-Syt II.We next explored whether the binding of BoNT/B-Hc E1191M/C/V/Q to h-Syt II could be further enhanced by inclusion of a secondary mutation at a different site. Sites 1183, 1199 and 1178 were targeted as candidates for secondary mutation sites, as these were the only three sites that also resulted in blue colonies (Figure 5). Using E1191M as primary mutations, double mutations were generated by combining E1191M with all 10 other residue changes identified on BACTH screening at sites 1183, 1199 and 1178 as indicated in Figure 5B. These 10 double mutations were tested for their ability to bind h-Syt II in knock-down assays as indicated in Figure 7A. Three of them, E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y and E1191M/W1178Q, resulted in significant binding to h-Syt II (FIG. 7A). These results suggested that the inclusion of S1199W/Y and W1178Q as a secondary mutation site further enhanced the binding of BoNT/B-Hc E1191M/C/V/Q to h-Syt II. Taken together, these data indicated that there are four choices of primary mutation at the E1191 site (M/C/V/Q) and three choices of secondary mutation sites (S1199W/Y and W1178Q) (Figure 7B), and that a combination of a primary mutation with a secondary mutation can further enhance binding to h-Syt II.

La combinación de E1191M con Y1183C/P redujo realmente la unión a h-Syt II (Figura 7A). La interfase de unión a Syt II de NTBo/B se compone de dos bolsas hidrófobas como se informó anteriormente. E1191 e Y1183 se encuentran en la misma bolsa, mientras que S1199 y W1178 se encuentran en otra. Debido a que E1191 está espacialmente cerca de Y1183, puede producirse un conflicto estructural potencial al mutar ambos, lo que puede explicar por qué las mutaciones dobles en estas dos posiciones redujeron la unión a h-Syt II.The combination of E1191M with Y1183C/P actually reduced h-Syt II binding (FIG. 7A). The Syt II-binding interface of BoNT/B is composed of two hydrophobic pockets as previously reported. E1191 and Y1183 are in the same bag, while S1199 and W1178 are in another bag. Because E1191 is spatially close to Y1183, a potential structural conflict may occur when mutating both, which may explain why double mutations at these two positions reduced h-Syt II binding.

Se prosiguió la determinación y comparación de las afinidades de unión entre NTBo/B-Hc mutado y h-Syt II cuantitativamente, con el objetivo de seleccionar las mutaciones dobles con la mejor afinidad de unión. La afinidad de unión (K^d) se determinó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa bien establecido (Figura 8A). Brevemente, las proteínas Syt etiquetadas con GST se inmovilizaron en una sonda. La sonda se expuso primero a NTBo/B-Hc purificada a diferentes concentraciones (fase de asociación, Figura 8A), seguido de etapas de lavado (fase de disociación, Figura 8A). La unión de NTBo/B-Hc a Syt etiquetada con GST aumenta el peso/tamaño molecular total en la sonda, lo que da como resultado un cambio en la reflexión de la luz en la sonda que se puede detectar y analizar. Los parámetros de unión tales como la constante de asociación (Kon), constante de disociación (Koff) y afinidad de unión aparente (KD) se pueden calcular a partir de la curva de asociación y disociación detectada como se indica en la Figura 8A.Determination and comparison of the binding affinities between mutated BoNT/B-Hc and h-Syt II were continued quantitatively, with the aim of selecting the double mutations with the best binding affinity. Binding affinity (K ^d ) was determined using a well-established biolayer interferometry assay (Figure 8A). Briefly, GST-tagged Syt proteins were immobilized on a probe. The probe was first exposed to purified BoNT/B-Hc at different concentrations (association phase, Figure 8A), followed by washing steps (dissociation phase, Figure 8A). Binding of BoNT/B-Hc to GST-tagged Syt increases the total molecular weight/size in the probe, resulting in a change in light reflection in the probe that can be detected and analyzed. Binding parameters such as association constant (Kon), dissociation constant (Koff) and apparent binding affinity (KD) can be calculated from the detected association and dissociation curve as indicated in Figure 8A.

Utilizando este ensayo, todas las combinaciones de cuatro mutaciones primarias (E1191M/C/Q/V) se caracterizaron sistemáticamente con tres mutaciones secundarias (S1199W/Y, W1178Q). Además, también se generó y analizó una mutación triple, E1191M/S1199W/W1178Q. La unión de WT NTBo/B-Hc a Syt II de ratón (m-Syt II) se midió como un control positivo, que mostró una K^dde unión en 0,13 |uM (Figura 8B). Como era de esperar, la unión de WT NTBo/B-HC a h-Syt II era demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una KD estimada por encima del límite de detección (> 20 |uM). Una sola mutación primaria E1191M produjo una K^dunión en 6,7 |uM, una mejora significativa con respecto a WT NTBo/B-Hc. Las mutaciones dobles que combinaron un sitio de mutación primaria con sitios de mutación secundaria mejoraron adicionalmente la afinidad de unión hasta 0,59 |uM (E1191V/S1199Y). Como era de esperar, la mayoría de las mutaciones dobles mejoraron la afinidad de unión a h-Syt II, con una K^dentre 0,59 |uM y 4,3 |uM. E1191Q/W1178Q fue el único que no se unió a h-Syt II. Se desconoce el motivo, pero es posible que esta mutación doble haya inducido cambios conformacionales inesperados de la proteína. La mutación triple E1191M/S1199W/W1178Q mostró casi la misma afinidad de unión que la mutación doble E1191M/S1199W, lo que sugiere que la adición del tercer sitio de mutación puede no mejorar adicionalmente la afinidad de unión. En conjunto, estos datos confirmaron que todas las mutaciones dobles entre E1191M/C/Q/V y S1199W/Y, W1178Q, con la excepción de E11191Q/W1178Q, dieron como resultado una NTBo/B-Hc muíante que podía unirse a h-Syt II de forma robusta.Using this assay, all combinations of four primary mutations (E1191M/C/Q/V) were systematically characterized with three secondary mutations (S1199W/Y, W1178Q). In addition, a triple mutation, E1191M/S1199W/W1178Q, was also generated and tested. Binding of WT BoNT/B-Hc to mouse Syt II (m-Syt II) was measured as a positive control, which showed a K ^d of binding at 0.13 uM (FIG. 8B). As expected, the binding of WT BoNT/B-HC to h-Syt II was too weak to be reliably determined, with an estimated KD above the detection limit (>20 µM). A single primary E1191M mutation produced a binding K ^d at 6.7 µM, a significant improvement over WT BoNT/B-Hc. Double mutations that combined a primary mutation site with secondary mutation sites further improved binding affinity to 0.59 µM (E1191V/S1199Y). As expected, most of the double mutations enhanced h-Syt II binding affinity, with a K ^d between 0.59 µM and 4.3 µM. E1191Q/W1178Q was the only one that did not bind to h-Syt II. The reason is unknown, but it is possible that this double mutation induced unexpected conformational changes in the protein. The triple mutation E1191M/S1199W/W1178Q showed almost the same binding affinity as the double mutation E1191M/S1199W, suggesting that the addition of the third mutation site may not further improve binding affinity. Taken together, these data confirmed that all double mutations between E1191M/C/Q/V and S1199W/Y, W1178Q, with the exception of E11191Q/W1178Q, resulted in a mutant BoNT/B-Hc that could bind h-Syt II robustly.

Los mutantes de HCB mostraron una mejor unión a h-Syt IHCB mutants showed better binding to h-Syt I

Además de Syt II, Syt I también funciona como receptor para NTBo/B. Para lograr la unión más alta posible a las neuronas humanas, los mutantes de NTBo/B modificados no deberían afectar a la unión a Syt I humana. Idealmente, pueden incluso aumentar la unión a Syt I. De hecho, se encontró que E1191M mejoraba significativamente la unión de NTBo/BHc a h-Syt I, ya que se pudo detectar una unión robusta sin la presencia de los gangliósidos del correceptor de lípidos (Figura 9A). La afinidad de unión entre las mutaciones dobles seleccionadas y h-Syt I se midió utilizando un ensayo de interferometría de biocapa. Como se muestra en la Figura 9B, C, las mutaciones dobles E1191M/S1199Y (B-Hc MY) y E1191V/S1199Y (B-Hc VY) muestran una K^da 2,9 pM y 5,82 pM, respectivamente, mientras que la unión de WT NTBo/B-HC a h-Syt I era demasiado débil para ser determinada de manera confiable, con una estimación de K^dpor encima del límite de detección (> 20 pM).In addition to Syt II, Syt I also functions as a receptor for BoNT/B. To achieve the highest possible binding to human neurons, the modified BoNT/B mutants should not affect binding to human Syt I. Ideally, they may even increase binding to Syt I. Indeed, E1191M was found to significantly enhance the binding of BoNT/BHc to h-Syt I, as robust binding could be detected without the presence of the lipid coreceptor gangliosides. (FIG. 9A). The binding affinity between the selected double mutations and h-Syt I was measured using a biofilm interferometry assay. As shown in Figure 9B,C, the double mutations E1191M/S1199Y (B-Hc MY) and E1191V/S1199Y (B-Hc VY) show a K ^d at 2.9 pM and 5.82 pM, respectively, while that the binding of WT BoNT/B-HC to h-Syt I was too weak to be determined reliably, with an estimate of K ^d above the limit of detection (>20 pM).

H^cB^myse une a h-Syt II sobre las superficies neuronalesH ^c B ^my binds to h-Syt II on neuronal surfaces

A continuación los autores de la presente invención examinaron si el mutante H^cB^mipodía unirse a h-Syt II en superficies neuronales fisiológicamente relevantes. con este fin, los autores de la presente invención utilizaron neuronas corticales de rata cultivadas como modelo neuronal, que expresa Syt I pero no Syt II (Dong et al., The Journal of cell biology 179(7): 1511-1522 (2007)). Por lo tanto, la modificación para reducir la expresión de Syt I generó neuronas sin receptores endógenos. La expresión de h-Syt II de longitud completa en estas neuronas Syt I KD creó neuronas "humanizadas" con solo h-Syt Il como receptor de toxina, como describieron anteriormente los autores de la presente invención (Peng et al., J cell Sci. 125: 3233-42(2012)). como se esperaba, WT HcB se unió fuertemente a las neuronas de rata y la unión se abolió después de la modificación para reducir la expresión de Syt I endógena. La expresión de mSyt II de longitud completa, pero no la de h-Syt II ni la de m-Syt II que contenía la mutación F54L, restauró la unión de WT HcB (Figura 10A). Por el contrario, H^cB^mymostró una unión robusta a las neuronas que expresaban m-Syt II, h-Syt II o m-Syt II (F54L), lo que demuestra que H^cB^mylogra la capacidad mejorada de unirse a h-Syt II sobre superficies neuronales (Figura 10B).We next examined whether the H ^c B ^mi mutant could bind h-Syt II on physiologically relevant neuronal surfaces. For this purpose, the present inventors used cultured rat cortical neurons as a neuronal model, which expresses Syt I but not Syt II (Dong et al., The Journal of cell biology 179(7): 1511-1522 (2007) ). Therefore, modification to reduce Syt I expression generated neurons without endogenous receptors. Expression of full-length h-Syt II in these Syt I KD neurons created "humanized" neurons with only h-Syt Il as the toxin receptor, as previously described by the present inventors (Peng et al., J cell Sci 125: 3233-42(2012)). As expected, WT HcB bound strongly to rat neurons and binding was abolished after modification to reduce endogenous Syt I expression. Expression of full-length mSyt II, but not h-Syt II or m-Syt II containing the F54L mutation, restored WT HcB binding (FIG. 10A). In contrast, H ^c B ^my showed robust binding to neurons expressing m-Syt II, h-Syt II, or m-Syt II (F54L), demonstrating that H ^c B ^my achieves the enhanced ability to bind to h-Syt II on neuronal surfaces (FIG. 10B).

El mutante NTBo/B mostró una mayor eficacia para bloquear la neurotransmisión en neuronas humanizadas Para abordar la cuestión clave de si la mejor unión a h-Syt II se traduce en una mejor eficacia a niveles funcionales en neuronas, los autores de la presente invención produjeron WT NTBo/B de longitud completa y la toxina mutante que contenía mutaciones puntuales E1191M/S1199Y (NTBo/B^my) recombinantemente en E. coli. Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de toxinas WT o NTB^o/B^my. La escisión de VAMP2 se examinó mediante análisis de inmunotransferencia. como se muestra en la Figura 11A, se escindió más VAMP2 en las neuronas expuestas a NTBo/BMY en comparación con las neuronas expuestas a WT NTBo/B a cada concentración de toxina sometida a prueba, lo que indica que NTBo/BMY se dirigía a las neuronas e ingresaba de manera más eficiente que la toxina WT.The BoNT/B mutant showed enhanced efficacy in blocking neurotransmission in humanized neurons. To address the key question of whether enhanced binding to h-Syt II translates into enhanced efficacy at functional levels in neurons, we produced WT full-length BoNT/B and mutant toxin containing E1191M/S1199Y point mutations (BoNT/B ^my ) recombinantly in E. coli. Humanized neurons were exposed to a gradient of WT or NTB ^or /B ^my toxins. VAMP2 cleavage was examined by immunoblot analysis. as shown in Figure 11A, more VAMP2 was cleaved in BoNT/BMY-exposed neurons compared to WT BoNT/B-exposed neurons at each toxin concentration tested, indicating that BoNT/BMY targeted neurons and entered more efficiently than the WT toxin.

A continuación, los autores de la presente invención controlaron la liberación de neurotransmisores mediante el registro de corrientes postsinápticas inhibidoras en miniatura (mIPSc) utilizando un registro de pinzamiento zonal de células completas. La frecuencia de las mIPSc refleja la actividad de liberación de neurotransmisores en una población de neuronas. La entrada de NTBo/B en los terminales presinápticos bloquea la liberación de neurotransmisor, lo que reduce la frecuencia de las mIPSc (Figura 11B). Las neuronas humanizadas se expusieron a un gradiente de WT NTBo/B o NTBo/B^my. como se muestra en la Figura 11c, NTBo/B^mymostró una potencia muy mejorada, con una concentración inhibidora semimáxima (c I^sü) ~11 veces menor que la toxina WT: NTBo/B^mypuede lograr el mismo nivel de bloqueo en la liberación de neurotransmisores con concentraciones de toxina 11 veces más bajas en comparación con la toxina WT. Estos datos demostraron que la mejor unión a los receptores humanos dio como resultado una mayor eficacia de la toxina a niveles funcionales en las neuronas.We next monitored neurotransmitter release by recording miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSc) using whole-cell patch-clamp recording. The frequency of mIPSc reflects the activity of neurotransmitter release in a population of neurons. Entry of BoNT/B into presynaptic terminals blocks neurotransmitter release, reducing the frequency of mIPSc (FIG. 11B). Humanized neurons were exposed to a gradient of WT BoNT/B or BoNT/B ^my . as shown in Figure 11c, BoNT/ ^Bmy showed greatly enhanced potency, with a half-maximal inhibitory concentration (c I ^sü ) ~11-fold lower than WT toxin: BoNT/ ^Bmy can achieve the same level of blockade in the neurotransmitter release with 11-fold lower toxin concentrations compared to WT toxin. These data demonstrated that better binding to human receptors resulted in greater toxin efficacy at functional levels in neurons.

El método BAcTH se utilizó para escrutar todas las posibles mutaciones individuales en los 19 restos clave en NTBo/B-Hc que forman el bolsillo de unión para Syt II. Se identificaron cuatro posiciones que se pueden mutar para aumentar la afinidad de unión a h-Syt II, con el sitio E1191 como sitio primario y S1199, W1178 e Y1183 como sitios de mutación secundaria. Se crearon y sometieron a prueba mutaciones dobles que combinaban los sitios de mutación primaria y secundaria, y se demostró que la combinación de E1191M/c/V/Q con S1199Y/W o W1178Q produce mutaciones dobles con fuerte afinidad de unión a h-Syt II y h-Syt IThe BAcTH method was used to screen for all possible single mutations in the 19 key residues in BoNT/B-Hc that form the binding pocket for Syt II. Four positions that can be mutated to increase h-Syt II binding affinity were identified, with site E1191 as the primary site and S1199, W1178 and Y1183 as secondary mutation sites. Double mutations combining primary and secondary mutation sites were created and tested, and it was shown that the combination of E1191M/c/V/Q with S1199Y/W or W1178Q produces double mutations with strong binding affinity for h-Syt II and h-Syt I

DiscusiónDiscussion

combinando el diseño racional basado en la estructura co-cristalina disponible del complejo NTBo/B-Syt II con el método BAcTH que satura todas las posibles mutaciones puntuales individuales en cada uno de los restos diana seleccionados, se identificó una serie de mutaciones puntuales en NTBo/B que se puede unir a h-Syt II. Estas mutaciones puntuales se examinaron más a fondo en combinaciones, revelando mutantes dobles que lograron una unión de alta afinidad a h-Syt II. Es importante destacar que la NTBo/B de longitud completa que contiene la mutación diseñada mostró una potencia ~11 veces mayor que la WT NTBo/B en las neuronas humanizadas, lo que demuestra que la mejor unión a los receptores de toxinas se traduce en una mayor potencia a niveles funcionales en las neuronas.Combining rational design based on the available co-crystal structure of the BoNT/B-Syt II complex with the BAcTH method that saturates all possible single point mutations at each of the selected target residues, a series of point mutations in BoNT were identified. /B that can bind to h-Syt II. These point mutations were further examined in combinations, revealing double mutants that achieved high-affinity binding to h-Syt II. Importantly, full-length BoNT/B containing the engineered mutation exhibited ~11-fold greater potency than WT BoNT/B in humanized neurons, demonstrating that enhanced binding to toxin receptors translates into enhanced toxin receptor binding. increased potency at functional levels in neurons.

Materiales y métodosMaterials and methods

Materiales y construcciones. Los siguientes anticuerpos se adquirieron de los proveedores indicados: Sinapsina I (Clon 46.1, Synaptic Systems), VAMP2 (Clon 69.1, Synaptic Systems), HA (16B12, Covance) y p-tubulina III (ab18207, Abcam). Los gangliósidos cerebrales mixtos bovinos se adquirieron de Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) y se reconstituyeron en solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 20 mM, NaCl 150 mM) como se describió previamente (Peng et al., PLoS pathogens 7(3):e1002008 (2011)). Se optimizaron los codones del ADNc que codificaba H^cB (resto 857-1291, Genbank: ACA46990.1) para la expresión en E. coli y se sintetizó por Genscript Inc. (New Brunswick, NJ). Los siguientes ADNc fueron generosamente proporcionados por los grupos indicados: Syt I de rata (T.C. Sudhof, Palo Alto, CA), Syt II de ratón (M. Fukuda, Ibaraki, Japón), Syt I humana (R.B. Sutton, Lubbock, TX). El ADN que codificaba HcB se subclonó en el vector pET28a, con una etiqueta His6 (SEQ ID NO: 13) y una etiqueta HA (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)) fusionadas a su extremo N-terminal. Las mutaciones en H^cB se generaron mediante PCR usando el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio (Agilent Technologies, CA). Los fragmentos Syt I/II etiquetados con GST y el mutante Syt II F54L se describieron previamente (Dong M et al. The Journal of cell biology 162(7): 1293-1303 (2003); Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42 (2012); Dong M et al. Science 312 (5773):592-596 (2006)).Materials and constructions. The following antibodies were purchased from the indicated vendors: Synapsin I (Clon 46.1, Synaptic Systems), VAMP2 (Clon 69.1, Synaptic Systems), HA (16B12, Covance), and p-tubulin III (ab18207, Abcam). Bovine mixed cerebral gangliosides were purchased from Matreya LLC (Pleasant Gap, PA) and reconstituted in Tris-buffered saline (TBS: 20 mM Tris, 150 mM NaCl) as previously described (Peng et al., PLoS pathogens 7( 3):e1002008 (2011)). The cDNA encoding H ^c B (residue 857-1291, Genbank: ACA46990.1) was codon optimized for expression in E. coli and synthesized by Genscript Inc. (New Brunswick, NJ). The following cDNAs were generously provided by the groups indicated: rat Syt I (TC Sudhof, Palo Alto, CA), mouse Syt II (M. Fukuda, Ibaraki, Japan), human Syt I (RB Sutton, Lubbock, TX) . The DNA encoding HcB was subcloned into the pET28a vector, with a His6 tag (SEQ ID NO: 13) and a HA tag (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 12)) fused to its N-terminus. Mutations in H ^c B were generated by PCR using the Site Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, CA). GST-tagged Syt I/II fragments and the F54L Syt II mutant were previously described (Dong M et al. The Journal of cell biology 162(7): 1293-1303 (2003); Peng et al., J Cell Sci. 125:3233-42 (2012);Dong M et al.Science 312(5773):592-596 (2006)).

BACTH (ensayo de dos híbridos de adenilato ciclasa bacteriana): El ensayo BACTH se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Euromedex). Se seleccionaron dos plásmidos compatibles, pUT18C y pKT25 para el escrutinio. El dominio luminal H-Syt II (restos 1-80) se clonó en pKT25 para generar pKT25-h-Syt II. Se clonó HCB en pUT18C para producir T18-HCB. Se crearon bibliotecas de mutantes de HCB con cebadores que contenían tripletes de nucleótidos aleatorios (NNN) en las posiciones designadas. Cada biblioteca se transformó conjuntamente con el plásmido pKT25-h-Syt II en la cepa indicadora de E. coli BTH101 por electroporación y se escrutó en placas de agar LB que contenían 100 pg/ml de Ampicilina, 50 pg/ml de Kanamicina, IPTG 0,5 mM y 40 pg/ml de X-Gal. Las placas se incubaron a 30°C durante 64 horas. Los plásmidos se extrajeron de las colonias de color azul y se secuenciaron. El número total de colonias determinó la posibilidad de cubrir los 20 aminoácidos en el sitio de mutación seleccionado. Esto se calculó mediante la ecuación de Clark-Carbon: P = 1-(1-f)N, donde f refleja el número de restos posibles (f = 1/20 aquí ya que hay 20 aminoácidos diferentes), y N es el número total de colonias. Con un número mínimo de 380 colonias en los ensayos, la probabilidad de cubrir los 20 aminoácidos en cada posición es >99,8%.BACTH (bacterial adenylate cyclase two-hybrid assay): The BACTH assay was performed according to the manufacturer's instructions (Euromedex). Two compatible plasmids, pUT18C and pKT25, were selected for screening. The luminal H-Syt II domain (residues 1-80) was cloned into pKT25 to generate pKT25-h-Syt II. HCB was cloned into pUT18C to produce T18-HCB. Libraries of HCB mutants were created with primers containing random nucleotide triplets (NNN) at designated positions. Each library was co-transformed with plasmid pKT25-h-Syt II into the E. coli indicator strain BTH101 by electroporation and screened on LB agar plates containing 100 pg/ml Ampicillin, 50 pg/ml Kanamycin, IPTG 0.5 mM and 40 pg/ml X-Gal. Plates were incubated at 30°C for 64 hours. Plasmids were extracted from blue colonies and sequenced. The total number of colonies determined the possibility of covering all 20 amino acids at the selected mutation site. This was calculated using the Clark-Carbon equation: P = 1-(1-f)N, where f reflects the number of possible residues (f = 1/20 here since there are 20 different amino acids), and N is the number total colonies. With a minimum number of 380 colonies in the assays, the probability of covering all 20 amino acids at each position is >99.8%.

Ensayo de B-galactosidasa: Se inocularon células de E. coli BTH101 con proteínas de interés expresadas en medio LB líquido que contenía ampicilina, kanamicina e IPTG (0,5 mM). El cultivo se hizo crecer durante la noche a 37°C para alcanzar la fase estacionaria. La DO600 del cultivo desarrollado durante la noche se registró antes de la recolección. Se centrifugó un mililitro del cultivo desarrollado durante la noche, y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con PBS y se suspendieron en un volumen igual de tampón Z (Na2HPO460 mM, Na2HPO440 mM, KCl 10 mM, MgSO41 mM y ditiotreitol [DTT] 20 mM). Se diluyeron cien microlitros de células bacterianas resuspendidas en 1 ml de tampón Z (factor de dilución [FD] = 10). Posteriormente, se añadieron 100 ml de cloroformo y 50 ml de SDS al 0,1% y se mezclaron bien para permeabilizar las células. A continuación se transfirieron 250 microlitros de la mezcla a un nuevo tubo de Microcentrífuga y se llevaron a 28°C, se añadieron 50 ml de o-nitrofenil-p-galactósido precalentado (4 mg/ml en tampón Z) y la mezcla se incubó a 28°C hasta que se desarrolló un color amarillo. La reacción se detuvo mediante la adición de 200 ml de Na2CO3 1 M. Se registraron la A420 y el período de tiempo preciso de la reacción en minutos (T). La actividad p-galactosidasa se definió como (1000 x A420 x FD)/(T x DO600) en unidades Miller.β-galactosidase assay: E. coli BTH101 cells were inoculated with expressed proteins of interest in liquid LB medium containing ampicillin, kanamycin and IPTG (0.5 mM). The culture was grown overnight at 37°C to reach stationary phase. The OD600 of the overnight culture was recorded prior to harvest. One milliliter of the overnight culture was centrifuged, and the cell pellets were washed twice with PBS and suspended in an equal volume of buffer Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM Na2HPO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, and 20 mM dithiothreitol [DTT]. mM). One hundred microliters of resuspended bacterial cells were diluted in 1 ml of buffer Z (dilution factor [DF] = 10). Subsequently, 100 ml of chloroform and 50 ml of 0.1% SDS were added and mixed well to permeabilize the cells. 250 microliters of the mixture were then transferred to a new Microcentrifuge tube and brought to 28°C, 50 ml of preheated o-nitrophenyl-p-galactoside (4 mg/ml in buffer Z) were added and the mixture was incubated. at 28°C until a yellow color developed. The reaction was stopped by the addition of 200 ml of 1M Na2CO3. The A420 and the precise time period of the reaction in minutes (T) were recorded. p-galactosidase activity was defined as (1000 x A420 x FD)/(T x OD600) in Miller units.

Expresión y purificación de proteínas: Se expresaron WT y mutantes de NTBo/B-Hc como proteínas recombinantes etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) en E. coli. Los fragmentos y mutantes de Syt I/II se expresaron como proteínas recombinantes etiquetadas con GST en E. coli. Tanto proteínas de fusión con GST como las de fusión con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) se purificaron como se describió previamente9, con la temperatura de inducción a 20°C durante la noche con IPTG 0,25 mM.Protein expression and purification: WT and BoNT/B-Hc mutants were expressed as His6-tagged recombinant proteins ("His6" disclosed as SEQ ID NO: 13) in E. coli. Syt I/II fragments and mutants were expressed as GST-tagged recombinant proteins in E. coli. Both GST fusion and His6 fusion proteins ("His6" disclosed as SEQ ID NO: 13) were purified as previously described9, with the induction temperature at 20°C overnight with 0.25 mM IPTG.

Ensayos de precipitación de GST: Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos de precipitación. La primera serie se utilizó para escrutar la unión de la NTBo/B-Hc mutante a Syt II de ratón (m-Syt II) etiquetada con GST y una Syt II de ratón mutante (F54L) que imita la secuencia Syt II humana (designada como h-Syt II). Brevemente, se centrifugaron 6 ml de E. coli que expresaba NTBo/B H^c, se resuspendieron en 800 pl de TBS, se sometieron a sonicación y a continuación, se incubaron con Triton X-100 al 2% durante 1 hora a 4°C. Después, las muestras se centrifugaron a velocidad máxima durante 15 min en una microcentrífuga a 4°C. Los sobrenadantes se recogieron y se utilizaron para ensayos de precipitación incubando con 10 pg de proteínas Syt inmovilizadas sobre cuentas de glutatión-Sefarosa (GE bioscience, Piscataway, NJ) a 4°C durante 1 hora. Las muestras se lavaron tres veces en tampón de lavado (TBS con Triton X-100 al 0,5%) y se analizaron mediante inmunotransferencia de NTBo/B-Hc utilizando el anticuerpo anti-HA. Para mutantes con mejor unión a h-Syt II, se llevaron a cabo ensayos de precipitación adicionales purificando estos mutantes de NTBo/B-Hc como proteínas etiquetadas con His6 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 13) como se describió anteriormente9. A continuación, se llevaron a cabo ensayos de precipitación utilizando fragmentos de Syt inmovilizados en 100 pl de tampón TBS más Triton X-100 al 0,5%, con o sin gangliósidos (60 pg/ml), durante 1 hora a 4°C. Las cuentas se lavaron tres veces utilizando tampón TBS más Triton X-100 al 0,5%. El diez por ciento de los materiales unidos se sometió a SDS-PAGE seguido del análisis de inmunotransferencia.GST precipitation tests: Two types of precipitation tests were carried out. The first run was used to screen for binding of the GST-tagged BoNT/B-Hc mutant to mouse Syt II (m-Syt II) and a mutant mouse Syt II (F54L) that mimics the human Syt II sequence (designated as h-Syt II). Briefly, 6 ml of E. coli expressing BoNT/BH ^c were centrifuged, resuspended in 800 μl TBS, sonicated, and then incubated with 2% Triton X-100 for 1 hour at 4°C. Samples were then centrifuged at maximum speed for 15 min in a microcentrifuge at 4°C. Supernatants were collected and used for precipitation assays by incubating with 10 pg Syt proteins immobilized on glutathione-Sepharose beads (GE bioscience, Piscataway, NJ) at 4°C for 1 hour. Samples were washed three times in wash buffer (TBS with 0.5% Triton X-100) and analyzed by immunoblotting for BoNT/B-Hc using anti-HA antibody. For mutants with better binding to h-Syt II, additional precipitation assays were performed by purifying these BoNT/B-Hc mutants as His6-tagged proteins ("His6" disclosed as SEQ ID NO: 13) as described previously9. Next, precipitation assays were carried out using Syt fragments immobilized in 100 μl of TBS buffer plus 0.5% Triton X-100, with or without gangliosides (60 pg/ml), for 1 hour at 4°C. . Beads were washed three times using TBS plus Triton buffer. X-100 at 0.5%. Ten percent of the bound materials were subjected to SDS-PAGE followed by immunoblot analysis.

Ensayo de interferometría de biocapa. Las afinidades de unión entre las variantes H^cB y Syt I/Syt II se midieron mediante ensayo BLI con el sistema Blitz (ForteBio). Brevemente, Syt I o Syt II etiquetadas con GST (20 pg/ml) se inmovilizaron sobre biosensores Anti-GST Dip and Read™ (ForteBio) y se equilibraron con tampón PBS. A continuación, los biosensores se expusieron a concentraciones seriadas de H^cB, seguido de lavado con PBS. Las afinidades de unión (K^d) se calcularon utilizando el soporte lógico del sistema Blitz siguiendo las instrucciones del fabricante (ForteBio).Biolayer interferometry assay. Binding affinities between H ^c B and Syt I/Syt II variants were measured by BLI assay with the Blitz system (ForteBio). Briefly, GST-tagged Syt I or Syt II (20 pg/ml) were immobilized on Anti-GST Dip and Read™ biosensors (ForteBio) and equilibrated with PBS buffer. Next, the biosensors were exposed to serial concentrations of H ^c B, followed by washing with PBS. Binding affinities (K ^d ) were calculated using the Blitz system software following the manufacturer's instructions (ForteBio).

Cultivo de neuronas, lentivirus y ensayo de entrada/unión de toxinas. Se prepararon neuronas corticales de rata a partir de embriones E18-19 como se describió anteriormente (Peng et al. PLoS Pathogens 7(3):e1002008 (2011)). Las construcciones para la expresión de Syt I KD, mSyt II y h-Syt II en neuronas se describieron previamente (Peng et al., J Cell Sci. 125: 3233-42 (2012)). Se añadieron lentivirus a cultivos de neuronas en DIV5 (días in vitro), y se llevaron a cabo experimentos de unión/entrada de toxinas en DIV12-14. Las toxinas se diluyeron en tampón con alto contenido de K+ (NaCl 87 mM, KCl 56 mM, KH2PO41,5 mM, Na2HPÜ48 mM, MgCl20,5 mM, y CaCl 1 mM) y se precalentaron a 37°C. Las neuronas se expusieron a los tampones que contenían las toxinas anteriores durante 5 minutos a 37°C seguido de lavado con PBS. Estas neuronas se sometieron a análisis de inmunotinción o se incubaron en medio libre de toxinas durante 24 horas adicionales, seguido de análisis de inmunotinción.Neuron culture, lentivirus and toxin entry/binding assay. Rat cortical neurons were prepared from E18-19 embryos as previously described (Peng et al. PLoS Pathogens 7(3):e1002008 (2011)). Constructs for expression of Syt I KD, mSyt II, and h-Syt II in neurons were previously described (Peng et al., J Cell Sci. 125:3233-42 (2012)). Lentiviruses were added to cultures of neurons at DIV5 (days in vitro), and toxin binding/entry experiments were performed at DIV12-14. Toxins were diluted in high K+ buffer (87 mM NaCl, 56 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HP04, 20.5 mM MgCl, and 1 mM CaCl) and prewarmed at 37°C. Neurons were exposed to the buffers containing the above toxins for 5 minutes at 37°C followed by washing with PBS. These neurons were subjected to immunostaining analysis or incubated in toxin-free medium for an additional 24 hours, followed by immunostaining analysis.

Registro de mIPSC. Se realizaron registros de pinzamiento zonal de células completas a partir de neuronas corticales cultivadas en DIV 14-18 (DIV 14-18). La solución de la pipeta contenía (en mM): CsCl 135, HEPES 10, EGTA 1, Na-GTP 1, Mg-ATP 4 y QX-314 10 (pH 7,4, ajustado con CsOH). La resistencia de las pipetas llenas de solución intracelular varió entre 4 y 5 Mü. Después de la formación de la configuración de células completas y el equilibrio de la solución de pipeta intracelular, la resistencia en serie se ajustó a 10 Mü. Las corrientes sinápticas se controlaron con un amplificador EPC-10/2 (HEKA) a un potencial de retención de -70 mV. La solución del baño contenía (en mM): NaCl 140, KCl 5, CaCl 2, MgCl2 1, HEPES 10, glucosa 10 (pH 7,4, ajustado con NaOH). Las corrientes postsinápticas inhibidoras espontáneas (sIPSC) y las corrientes postsinápticas inhibidoras evocadas (eIPSC) se inhibieron farmacológicamente mediante la adición de bloqueadores del receptor de AMPA y NMDA CNQX y APV a la solución de baño extracelular. Se controlaron las corrientes postsinápticas inhibidoras en miniatura espontáneas (mIPSC) en presencia de tetrodotoxina (TTX) para bloquear los potenciales de acción. Los datos se analizaron utilizando Clampfit 10 (Molecular Devices), el soporte lógico Origin8 (Mocrocal Inc.), el soporte lógico MiniAnalysis (Synaptosoft) e Igor (Wavemetrics). El análisis estadístico se realizó con la prueba t de Student (* P <0,01). Todos los datos mostrados son medias ± E.T.M.Registry of mIPSC. Whole cell patch-clamp recordings were made from cortical neurons cultured at DIV 14-18 (DIV 14-18). The pipette solution contained (in mM): CsCl 135, HEPES 10, EGTA 1, Na-GTP 1, Mg-ATP 4 and QX-314 10 (pH 7.4, adjusted with CsOH). The resistance of the pipettes filled with intracellular solution varied between 4 and 5 Mü. After formation of the whole cell configuration and equilibration of the intracellular pipette solution, the series resistance was set to 10 Mü. Synaptic currents were monitored with an EPC-10/2 amplifier (HEKA) at a holding potential of -70 mV. The bath solution contained (in mM): NaCl 140, KCl 5, CaCl 2, MgCl2 1, HEPES 10, glucose 10 (pH 7.4, adjusted with NaOH). Spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSCs) and evoked inhibitory postsynaptic currents (eIPSCs) were inhibited pharmacologically by adding AMPA and NMDA receptor blockers CNQX and APV to the extracellular bath solution. Miniature spontaneous inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) were controlled in the presence of tetrodotoxin (TTX) to block action potentials. Data were analyzed using Clampfit 10 (Molecular Devices), Origin8 software (Mocrocal Inc.), MiniAnalysis software (Synaptosoft), and Igor (Wavemetrics). Statistical analysis was performed with Student's t-test (*P < 0.01). All data shown are means ± S.E.M.

ConclusiónConclution

Los resultados presentados anteriormente indican nuevos métodos y composiciones para mejorar la unión de NTBo/B a sus receptores humanos, y proporcionan una forma de crear nuevas generaciones de NTBo terapéuticas, utilizando el dominio de unión al receptor modificado creado en la presente invención, con una mejor eficacia y especificidad para neuronas humanas diana que las WT NTBo actualmente utilizadas.The results presented above indicate new methods and compositions to improve the binding of BoNT/B to its human receptors, and provide a way to create new generations of therapeutic BoNT, using the modified receptor binding domain created in the present invention, with a better efficacy and specificity for targeting human neurons than the currently used WT BoNT.

Estos esfuerzos muestran que la modificación de la secuencia de proteínas de NTBo/B-Hc puede crear nuevas versiones que pueden unir Syt II humana con alta afinidad. La modificación de la secuencia de proteínas de NTBo/B-H^cse puede realizar mediante mutagénesis dirigida (mutagénesis dirigida al sitio) o mutagénesis aleatoria de cada resto de aminoácido dentro de la región conocida por unirse a Syt I/II. Estas regiones de unión a Syt están bien definidas por estudios estructurales de cocristales previos2526. Por ejemplo, se compone de los restos 1078-1291 en la secuencia de NTBo/B1 (número de acceso de GenBank: P10844). Aunque estos estudios se realizaron utilizando la secuencia de NTBo/B1, todos los subtipos de NTBo/B se pueden utilizar como molde para recrear las mismas mutaciones o mutaciones similares como se describe aquí. Aunque la posición exacta de los restos seleccionados puede no ser idéntica en diferentes subtipos de NTBo/B, los restos análogos en los diferentes subtipos de NTBo/B se pueden identificarse fácilmente (p. ej., mediante alineación de secuencia cuando no están exactamente en la misma posición).These efforts show that modification of the BoNT/B-Hc protein sequence can create new versions that can bind human Syt II with high affinity. Modification of the BoNT/BH ^c protein sequence can be accomplished by site-directed mutagenesis (site-directed mutagenesis) or random mutagenesis of each amino acid residue within the region known to bind Syt I/II. These Syt-binding regions are well defined by structural studies of previous cocrystals2526. For example, it is composed of residues 1078-1291 in the BoNT/B1 sequence (GenBank accession number: P10844). Although these studies were performed using the BoNT/B1 sequence, all BoNT/B subtypes can be used as a template to recreate the same or similar mutations as described here. Although the exact position of selected residues may not be identical in different BoNT/B subtypes, analogous residues in different BoNT/B subtypes can be readily identified (eg, by sequence alignment when they are not exactly in alignment). the same position).

Se estudiaron específicamente todos los restos en la interfase de unión a Syt II de NTBo/B según la estructura del complejo NTBo/B-Syt II informada (ID de PDB: 2NM1), incluidos K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178, Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245 e Y1256, como se enumera en la Figura 3B.All residues at the BoNT/B Syt II-binding interface were specifically studied based on the reported BoNT/B-Syt II complex structure (PDB ID: 2NM1), including K1113, D1115, S1116, P1117, V1118, W1178 , Y1181, Y1183, E1191, K1192, F1194, A1196, P1197, S1199, S1201, E1203, F1204, E1245, and Y1256, as listed in Figure 3B.

La mutagénesis es una técnica de laboratorio común para crear productos proteicos modificados mediante ingeniería genética. Se encuentran disponibles varios métodos para introducir mutaciones, incluida la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis aleatoria, la mutagénesis combinatoria y la mutagénesis por inserción. Se aplicaron mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis aleatoria para introducir mutaciones en la secuencia de NTBo/B-HC. La mutagénesis aleatoria es una herramienta poderosa para crear bibliotecas mutantes para su escrutinio. Mediante el uso de cebadores de PCR con nucleótidos dopados, se creó una reserva de mutantes que contenía sustituciones de los 19 aminoácidos restantes en las posiciones enumeradas en la Figura 3B. A continuación, se realizó el escrutinio utilizando el sistema BACTH como se ilustra en la Figura 4. Mutagenesis is a common laboratory technique for creating genetically engineered protein products. Various methods for introducing mutations are available, including site-directed mutagenesis, random mutagenesis, combinatorial mutagenesis, and insertional mutagenesis. Site-directed mutagenesis and random mutagenesis were applied to introduce mutations into the BoNT/B-HC sequence. Random mutagenesis is a powerful tool for creating mutant libraries for screening. Using nucleotide-doped PCR primers, a pool of mutants was created containing substitutions of the remaining 19 amino acids at the positions listed in Figure 3B. Screening was then performed using the BACTH system as illustrated in Figure 4.

Se identificó que los restos en las posiciones 1191, 1178, 1183 y 1199 eran importantes para que las mutaciones por sustitución generaran mutantes de NTB^o/B-H^ccon mejor unión a Syt II humana. Las sustituciones específicas fueron E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183C/P, S1199Y/W/E/H, W1178Y/Q/A/S (Figura 5A, B).Residues at positions 1191, 1178, 1183 and 1199 were identified as important for substitution mutations to generate NTB ^or /BH ^c mutants with better binding to human Syt II. Specific substitutions were E1191M/C/V/Q/L/Y, Y1183C/P, S1199Y/W/E/H, W1178Y/Q/A/S (Figure 5A, B).

Ensayos cuantitativos adicionales revelaron que cambiar el resto E1991 a M/C/V/Q dio como resultado la unión más fuerte a h-Syt II, según lo medido por la actividad p-galactosidasa (Figura 6A) y ensayos de precipitación (Figura 6B). Por lo tanto, se identificó E1191 como el sitio principal para introducir mutaciones que mejoran la unión a h-Syt II, y las mutaciones por sustitución de E1191/M/C/V/Q se identificaron como mutaciones primarias.Additional quantitative assays revealed that changing the E1991 moiety to M/C/V/Q resulted in the strongest binding to h-Syt II, as measured by p-galactosidase activity (Figure 6A) and precipitation assays (Figure 6B). ). Therefore, E1191 was identified as the major site for introducing mutations that enhance binding to h-Syt II, and substitution mutations of E1191/M/C/V/Q were identified as primary mutations.

Se utilizó E1191M como la mutación primaria para explorar si la adición de una mutación secundaria puede mejorar adicionalmente la unión a h-Syt II (Figura 7A). Debido a que las mutaciones por sustitución Y1183C/P, S1199Y/W/E/H y W1178Y/Q/A/S dieron como resultado colonias de color "azul claro" en el escrutinio con BACTH (Figura 5B), estos sitios se seleccionaron como el sitio de mutación secundaria potencial. Se generaron y probaron mutaciones dobles que combinaban E1191M con estas posibles mutaciones secundarias. Se encontró que tres mutaciones, S1199W, S1199Y y W1178Q mejoraban la unión a h-Syt II, cuando se combinaban con la mutación primaria en E1191M en ensayos de precipitación (Figura 7A, B). Estas tres mutaciones por sustitución se seleccionaron como mutaciones secundarias.E1191M was used as the primary mutation to explore whether the addition of a secondary mutation can further enhance h-Syt II binding (FIG. 7A). Because the Y1183C/P, S1199Y/W/E/H, and W1178Y/Q/A/S substitution mutations resulted in "light blue" colonies on BACTH screening (Figure 5B), these sites were selected as the potential secondary mutation site. Double mutations combining E1191M with these potential secondary mutations were generated and tested. Three mutations, S1199W, S1199Y, and W1178Q, were found to enhance binding to h-Syt II, when combined with the primary mutation at E1191M in precipitation assays (Figure 7A, B). These three substitution mutations were selected as secondary mutations.

Se llevaron a cabo ensayos cuantitativos adicionales para determinar la afinidad de unión entre mutantes de NTBo/B-Hc y h-Syt II, utilizando un ensayo de interferometría de biocapa como se describe en la Figura 8A. Las mutaciones dobles, una de las mutaciones primarias (M1191M/C/Q/V) y la otra de las mutaciones secundarias (S1199W/Y, W1178Q), se midieron para determinar sus afinidades de unión a h-Syt II (Figura 8B). Los resultados mostraron que las siguientes mutaciones dobles: E1191M/C/Q/V combinada con S1199W/Y y E1191M/C/V combinada con W1178Q tienen afinidades de unión significativamente mejoradas para h-Syt II (Figura 8B). Por tanto, estas once combinaciones dobles se identificaron como mutaciones en NTBo/B-HC que mejoran al máximo la unión a h-Syt II.Additional quantitative assays were carried out to determine the binding affinity between BoNT/B-Hc mutants and h-Syt II, using a biofilm interferometry assay as described in Figure 8A. Double mutations, one of the primary mutations (M1191M/C/Q/V) and the other of the secondary mutations (S1199W/Y, W1178Q), were measured for their h-Syt II binding affinities (Figure 8B). . The results showed that the following double mutations: E1191M/C/Q/V combined with S1199W/Y and E1191M/C/V combined with W1178Q have significantly enhanced binding affinities for h-Syt II (FIG. 8B). Therefore, these eleven double combinations were identified as mutations in BoNT/B-HC that maximally enhance h-Syt II binding.

Se encontró que los mutantes de NTBo/B-HC modificados mediante ingeniería genética no solo mejoraban la unión a Syt II humana, sino también a Syt I humana. Se utilizaron E1191M/S1199Y y E1191V/S1199Y para mostrar que estos mutantes presentaban capacidades de unión a Syt I humana significativamente mejoradas, así como en comparación con WT NTBo/B-HC (Figura 9).The genetically engineered BoNT/B-HC mutants were found to not only enhance binding to human Syt II, but also to human Syt I. E1191M/S1199Y and E1191V/S1199Y were used to show that these mutants had significantly enhanced human Syt I binding abilities as compared to WT NTBo/B-HC (FIG. 9).

Los mutantes de NTBo/B-HC modificados pueden contener sustituciones de aminoácidos en uno o en una combinación de los restos de aminoácido E1191, Y1183, W1178 y S1199, tales como E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y y E1191V/W1178Q.Modified BoNT/B-HC mutants may contain amino acid substitutions at one or a combination of amino acid residues E1191, Y1183, W1178, and S1199, such as E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W , E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y, and E1191V/W1178Q.

También se probaron las mutaciones triples seleccionadas mediante la combinación de mutaciones en los sitios E1191/S1199/W1178 y se encontró que tenían una afinidad de unión similar a la de la doble mutación en los sitios E1191/S1199. Por ejemplo, E1191M/S1199W/W1178Q tiene una afinidad de unión similar a E1191M/S1199W (Figura 8B). Por lo tanto, las mutaciones triples exhibieron la mejor afinidad de unión de las mutaciones dobles, aunque no parecieron ofrecer una ventaja significativa sobre las mutaciones dobles con respecto al aumento de la afinidad de unión.Triple mutations selected by combining mutations at the E1191/S1199/W1178 sites were also tested and found to have similar binding affinity as the double mutation at the E1191/S1199 sites. For example, E1191M/S1199W/W1178Q has a similar binding affinity as E1191M/S1199W (FIG. 8B). Thus, triple mutations exhibited the best binding affinity of double mutations, although they did not appear to offer a significant advantage over double mutations with respect to increased binding affinity.

Estos resultados indican que los polipéptidos que contienen NTBo/B-Hc con secuencia de aminoácidos modificada relacionada con la secuencia de WT NTBo/B-HC, en donde la NTBo/B-HC modificada tiene una capacidad mejorada para unirse a Syt I y II humanas en comparación con WT NTBo/B-HC y se puede preparar y utilizar terapéuticamente. Los polipéptidos pueden estar, por ejemplo, en forma de mutantes de NTBo/B de longitud completa, mutantes de NTBo/B truncados o proteínas recombinadas que contienen las mismas sustituciones de aminoácidos dentro del dominio de unión al receptor (NTBo/B-HC), como se describió anteriormente, y también, subtipos de NTBo/B con sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes. Además, el subtipo de NTBo/B se puede modificar para unirse a h-Syt II reemplazando los restos dentro de su dominio de unión al receptor que son diferentes de NTBo/B1.These results indicate that BoNT/B-HC containing polypeptides with modified amino acid sequence related to the sequence of WT BoNT/B-HC, where the modified BoNT/B-HC has an enhanced ability to bind Syt I and II compared to WT BoNT/B-HC and can be prepared and used therapeutically. The polypeptides may be, for example, in the form of full-length BoNT/B mutants, truncated BoNT/B mutants, or recombinant proteins containing the same amino acid substitutions within the receptor-binding domain (BoNT/B-HC). , as described above, and also, BoNT/B subtypes with amino acid substitutions at corresponding positions. In addition, the BoNT/B subtype can be modified to bind h-Syt II by replacing residues within its receptor binding domain that are different from BoNT/B1.

Los mutantes de NTBo/B de longitud completa abarcados contienen sustituciones de aminoácidos en uno o en una combinación (p. ej., 2 o 3) de los restos de aminoácidos E1191, Y1183, W1178 y S1199 tal como E1191M/S1199W, E1191M/S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y y E1191V/W1178Q. Las mutaciones se pueden realizar de la misma manera que se describe anteriormente para NTBo/B-HC, utilizando cualquiera de los subtipos de NTBo/B como molde. Estas toxinas NTBo/B mutadas obtienen una mejor unión tanto a Syt II humana como a Syt I humana, por lo tanto, alcanzarán una mayor eficacia y especificidad para las neuronas humanas diana que WT NTBo/B. Referencias para la sección de ejemplos Covered full-length BoNT/B mutants contain amino acid substitutions at one or a combination (eg, 2 or 3) of amino acid residues E1191, Y1183, W1178, and S1199 such as E1191M/S1199W, E1191M/ S1199Y, E1191M/W1178Q, E1191C/S1199W, E1191C/S1199Y, E1191C/W1178Q, E1191Q/S1199W, E1191Q/S1199Y, E1191V/S1199W, E1191V/S1199Y and E1191V/W. Mutations can be made in the same manner as described above for BoNT/B-HC, using any of the BoNT/B subtypes as template. These mutated BoNT/B toxins obtain better binding to both human Syt II and human Syt I, therefore, they will achieve higher efficacy and specificity for targeting human neurons than WT BoNT/B. References for the examples section

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1. en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo que consiste en E1191C y E1191Y, en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido muestra mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de una o más mutaciones por sustitución.1. A polypeptide comprising a modified receptor binding domain from Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ), comprising one or more substitution mutations corresponding to substitutions in serotype B, strain 1. wherein one of the substitution mutations is selected from the group consisting of E1191C and E1191Y, wherein the modified receptor binding domain has 95% or greater amino acid sequence identity with a reference wild-type receptor binding domain of SEQ ID NO: 5, and wherein the polypeptide exhibits better binding to human Syt II compared to an identical molecule lacking one or more substitution mutations.

2. Un polipéptido de neurotoxina botulínica (NTBo) que comprende:2. A botulinum neurotoxin (BoNT) polypeptide comprising:

a) un dominio proteasa;a) a protease domain;

b) un sitio de escisión de proteasa;b) a protease cleavage site;

c) un dominio de translocación; yc) a translocation domain; and

d) un dominio de unión al receptor modificado de Botulinum clostridial serotipo B (B-H^c), que comprende una o más mutaciones por sustitución correspondientes a sustituciones en el serotipo B, cepa 1, en donde una de las mutaciones por sustitución se selecciona del grupo formado por E1191C y E1191Y,d) a modified receptor binding domain of Botulinum clostridial serotype B (BH ^c ), comprising one or more substitution mutations corresponding to substitutions in serotype B, strain 1, wherein one of the substitution mutations is selected from the group made up of E1191C and E1191Y,

en donde el dominio de unión al receptor modificado posee 95% o más de identidad de secuencia de aminoácidos con un dominio de unión al receptor de tipo salvaje de referencia de SEQ ID NO: 5, y en donde el polipéptido de NTBo muestra una mejor unión a Syt II humana en comparación con una molécula idéntica que carece de la una o más mutaciones por sustitución.wherein the modified receptor binding domain has 95% or greater amino acid sequence identity with a reference wild-type receptor binding domain of SEQ ID NO: 5, and wherein the BoNT polypeptide exhibits improved binding to human Syt II compared to an identical molecule lacking the one or more substitution mutations.

3. El polipéptido de NTBo de la reivindicación 2, en donde el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son del serotipo seleccionado del grupo que consiste en A, B, C, D, E, F, G y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde el dominio proteasa, el dominio de translocación y el sitio de escisión de proteasa son de serotipo B, cepa 1 o del serotipo A, cepa 1.3. The BoNT polypeptide of claim 2, wherein the protease domain, translocation domain and protease cleavage site are of serotype selected from the group consisting of A, B, C, D, E, F, G and combinations thereof, preferably wherein the protease domain, translocation domain and protease cleavage site are serotype B strain 1 or serotype A strain 1.

4. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio de unión al receptor modificado corresponde a los restos 1078-1291 de SEQ ID NO: 5 o los restos 859-1291 de SEQ ID NO: 5.4. The BoNT polypeptide or polypeptide according to any of claims 1-3, wherein the modified receptor binding domain corresponds to residues 1078-1291 of SEQ ID NO: 5 or residues 859-1291 of SEQ ID NO: 5.

5. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio de unión al receptor modificado comprende:5. The BoNT polypeptide or polypeptide according to any of claims 1 to 4, wherein the modified receptor binding domain comprises:

i) dos mutaciones por sustitución; oi) two substitution mutations; or

ii) dos mutaciones por sustitución correspondientes a:ii) two substitution mutations corresponding to:

E1191C y S1199W;E1191C and S1199W;

E1191CyS1199Y;oE1191CyS1199Y;or

E1191C y W1178Q.E1191C and W1178Q.

6. El polipéptido o polipéptido de NTBo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el dominio de unión al receptor modificado comprende tres mutaciones por sustitución.6. The BoNT polypeptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 4, wherein the modified receptor binding domain comprises three substitution mutations.

7. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 que es una molécula quimérica que comprende una primera porción que es el dominio de unión al receptor modificado conectado a una segunda porción.7. The BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-6 which is a chimeric molecule comprising a first portion which is the modified receptor binding domain connected to a second portion.

8. El polipéptido o polipéptido de NTBo de la reivindicación 7, en donde:8. The BoNT polypeptide or polypeptide of claim 7, wherein:

la primera porción y la segunda porción están conectadas covalentemente o no covalentemente; y la segunda porción se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un ácido nucleico, un polipéptido corto y una proteína, preferiblemente en donde la segunda porción es una molécula bioactiva, un fármaco polipéptido o no polipeptídico terapéutico.the first portion and the second portion are covalently or non-covalently connected; and the second portion is selected from the group consisting of a small molecule, a nucleic acid, a short polypeptide, and a protein, preferably wherein the second portion is a bioactive molecule, a therapeutic polypeptide or non-polypeptide drug.

9. Un ácido nucleico, preferiblemente un vector de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.9. A nucleic acid, preferably a nucleic acid vector, comprising a nucleotide sequence encoding the BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-8.

10. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9 o que expresa el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8. 10. A cell comprising the nucleic acid of claim 9 or expressing the BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-8.

11. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o el ácido nucleico de la reivindicación 9, opcionalmente en donde la composición farmacéutica comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.11. A pharmaceutical composition comprising the BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-8 or the nucleic acid of claim 9, optionally wherein the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.

12. Un método para producir un polipéptido o polipéptido de NTBo, comprendiendo el método las etapas de cultivar la célula de la reivindicación 10 en condiciones en donde se produce dicho polipéptido o polipéptido de NTBo.12. A method of producing a BoNT polypeptide or polypeptide, the method comprising the steps of culturing the cell of claim 10 under conditions wherein said BoNT polypeptide or polypeptide is produced.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente uno o más de las siguientes etapas:13. The method of claim 12, further comprising one or more of the following steps:

- recuperar el polipéptido o polipéptido de NTBo del cultivo,- recovering the BoNT polypeptide or polypeptide from the culture,

- purificar el polipéptido o polipéptido de NTBo,- purifying the BoNT polypeptide or polypeptide,

- activar el polipéptido o polipéptido de NTBo, y/o- activating the BoNT polypeptide or polypeptide, and/or

- formular el polipéptido o polipéptido de NTBo.- formulating the BoNT polypeptide or polypeptide.

14. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en medicina.14. The BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-8, or the pharmaceutical composition of claim 11, for use in medicine.

15. El polipéptido o polipéptido de NTBo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad neuronal no deseada, en donde la afección se selecciona del grupo que consiste en disfonía espasmódica, tortícolis espasmódica, distonía laríngea, disfonía oromandibular, distonía lingual, distonía cervical, distonía focal de la mano, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, trastorno del párpado, parálisis cerebral, espasticidad focal y otros trastornos de la voz, colitis espasmódica, vejiga neurogénica, anismo, espasticidad de las extremidades, tics, temblores, bruxismo, fisura anal, acalasia, disfagia y otros trastornos del tono muscular y otros trastornos caracterizados por movimientos involuntarios de grupos musculares, lagrimeo, hiperhidrosis, salivación excesiva, secreciones gastrointestinales excesivas, trastornos secretores, dolor por espasmos musculares, dolor de cabeza, migraña y afecciones dermatológicas. 15. The BoNT polypeptide or polypeptide of any of claims 1-8, or the pharmaceutical composition of claim 11, for use in treating a condition associated with unwanted neuronal activity, wherein the condition is selected from the group consisting of spasmodic dysphonia, spasmodic torticollis, laryngeal dystonia, oromandibular dysphonia, lingual dystonia, cervical dystonia, focal hand dystonia, blepharospasm, strabismus, hemifacial spasm, eyelid disorder, cerebral palsy, focal spasticity, and other voice disorders, spasmodic colitis, neurogenic bladder, anismus, spasticity of extremities, tics, tremors, bruxism, anal fissure, achalasia, dysphagia and other disorders of muscle tone and other disorders characterized by involuntary movements of muscle groups, lacrimation, hyperhidrosis, excessive salivation, secretions excessive gastrointestinal disorders, secretory disorders, pain due to muscle spasms, neck pain headache, migraine and dermatological conditions.