KR101968873B1

KR101968873B1 - 세포 침투 효과가 우수한 보툴리늄 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물

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Publication number: KR101968873B1
Application number: KR1020180113722A
Authority: KR
Inventors: 최영권; 한창규; 정현식; 장관영; 조현영; 소우섭; 이문행; 김성수; 호환기
Original assignee: 아이큐어 주식회사; 주식회사 아이파마
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2019-04-29
Also published as: WO2020060128A1

Abstract

본 발명은 보툴리늄 독소의 효과 및 세포 침투를 향상시키기 위해서, 단백질 전달체, 보툴리늄 독소 경쇄 및 중쇄의 전좌(translocation) 영역이 융합된 재조합 단백질, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 상기 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 침투 효과가 우수한 보툴리늄 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising peptide derived from Botulinum toxin having improved cell penetrating ability}

본 발명은 우수한 피부투과성 및 세포투과성을 나타내고 보툴리늄 독소의 활성이 향상된 신규한 피부투과성 융합단백질, 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄, 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역(translocation domain)을 포함하는 보툴리늄 독소 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

보툴리늄 독소는 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는 신경독소 단백질이며, 신경세포의 신경전달물질인 아세트콜린 및 카테콜아민의 분비를 억제하는 것으로 보고 되고 있다. 보툴리늄 독소는 A, B, C, D, E, F, G 및 H 타입의 8종류가 있으며, A 및 B 타입이 상업적으로 이용된다.

신경전달물질의 분비를 위해서 신경전달물질을 담지하는 소포체(vesicle)의 표면에 존재하는 시냅토브레빈(synaptobrevin, Vesicle-associate membrane protein, VAMP), 시냅스 전 혈장막(pre-synaptic plasma membrane)에 존재하는 SNAP-25(synaptosomal associated protein 25), 및 신택신(Syntaxin) 3개의 단백질이 스네어(SNARE) 복합체를 형성하고, Ca²⁺의 자극에 의해 세포 외로 분비된다.

보툴리늄 독소의 서브타입들은 스네어(SNARE) 복합체를 형성하는 VAMP-2, SNAP-25 및 Syntaxin의 특정 위치를 절단하여 스네어(SNARE) 복합체의 형성을 방해하여 신경전달물질의 분비를 억제한다(Schiavo et al. Nature 359, 832-835, 1992).

보툴리늄 독소 단백질의 크기는 약 150 kDa이며, N-말단(n-terminal)의 경쇄(light chain)는 Zn²⁺ 금속 단백질 분해 효소(metalloprotease)로서 50 kDa이며, 중쇄는 100 kDa 이며, 두 개의 단백질은 다이설파이드(disulfide) 결합으로 연결되어 있다. 또한 중쇄는 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)과 C-말단의 수용체 결합 영역(receptor-binding domain)으로 구성되어 있다.

보툴리늄 독소는 신경독 단백질로 인간의 반수 치사량은 정맥주사나 근육 주사시 1.3 ∼ 2.1 ng/kg, 흡입할 경우 10 ∼ 13 ng/kg 로 독성이 매우 높은 물질이나, 적정한 양으로 조절시 신경장애, 근육 질환, 다한증, 사각턱 등을 치료하는 약물로 사용될 수 있고, 주름, 종아리 근육 축소 등 미용 용도로 가장 많이 사용되고 있다. 국내에 시판 중인 보툴리늄 독소는 보톡스(엘러간), 보톨렉스, 메디톡신, 디스포트 및 BTXA 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

이러한 보툴리늄 독소는 근육 주사를 통해 체내에 투여되는 의약품으로 사용되었으며, 최근에 피부로 직접 전달하는 화장품으로 사용하기 위해 여러가지 연구 및 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

그러나, 보툴리늄 독소는 경쇄와 중쇄를 합쳐 150 kDa으로 매우 큰 분자이기 때문에 피부를 투과하기 어렵고, 신경세포 내로의 전달은 보툴리늄 독소의 중쇄가 수용체에 결합하여 내포 작용(endocytosis)을 통해 가능하다. 최근에는 효소 활성을 갖는 경쇄만을 이용하여 단백질 전달체와 융합 단백질을 제조하여 피부 투과 및 세포내 전달을 유도하고 있다.

단백질 전달체(PTD, Protein Transduction Domain)는 세포 투과 펩타이드(CPP, Cell Permeable Peptide) 또는 막-이동 시퀀스(MTS, Membrane Translocating Sequence)로 불리는 10 ∼ 16 개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드이다. 단백질 전달체는 특별한 수용체의 도움없이 자기 자신 또는 자신과 결합하는 물질들과 함께 혈장 막(plasma membrane)을 통과하여 세포 내에 축적된다. 이들은 DNA, RNA, 헤파린(heparin) 및 시알산(sialic acid)과 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질, 펩타이드, 안티센스(anti-sense) 서열, 플라스미드, 마이크로비즈(microbeads), 리포좀(liposomes) 등을 자유롭게 이동시킬 수 있다.

최초로 단백질 형질도입(protein transduction) 현상이 발견된 단백질은 HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1)의 Tat 단백질이다. Tat 단백질은 86 개의 아미노산으로 이루어진 HIV-1의 전사조절인자(transacting transcription factor)로서, HIV-1의 전사를 활성화(activation)시킬 뿐만이 아니라 만성적으로 감염된 세포 내에서 바이러스 복제 유도에도 영향을 미친다. 또한 휴지기 상태에 있는 감염 세포의 재활성화를 유도한다고 알려져 있다.

그 외에 HSV-1(Herpes Simplex Virus type 1)의 envelope protein과 캡시드(capsid) 사이에 존재하는 외피 단백질(tegument protein)인 VP22, 및 초파리의 발달과정 및 신경 형성에 관여하는 전사인자(transcription factor)로서 호메오단백질(homeoprotein)의 일종인 안테나페디아 단백질(antennapedia protein)과 같은 다양한 종의 단백질 형질도입(protein transduction)을 유도하는 서열들이 보고되었다.

인간의 단백질 전달체는 Hox-A5와 같은 호메오단백질에서 발견되었고, 세포내 유입을 유도하는데 매우 중요한 역할을 한다. 그 외에도 최근에는 합성을 통해 세포 막을 통과하는 성질을 갖는 단백질 전달체가 개발되고 있다.

단백질 전달체에 의한 세포내 전달은 내포 작용(endocytosis)과 같은 기존의 단백질 전달과는 전혀 다른 메커니즘으로 작용한다. 염기성 아미노산인 아르기닌을 많이 포함하는 양전하 단백질 전달체의 경우에는 대음세포작용(macropinocytosis)으로 세포 내로 전달되며, 소수성 단백질 전달체의 경우에는 인지질과 결합하여 뒤집힌 미셀(inverted micelle)을 형성하여 세포 내로 전달되는 것으로 알려져 있다.

최근 단백질 전달체와 보툴리늄 독소의 경쇄로 이루어진 융합단백질을 화장품으로 사용하려는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 융합단백질을 피부에 적용할 경우 우수한 피부투과 및 세포투과성을 갖는지에 대한 문제 뿐만 아니라, 세포 내에서 우수한 보툴리늄 독소의 효과를 나타내는지 여부에 대해서도 충분한 검증이 이루어지지 않고 있다.

본 발명자는 피부에 직접 적용할 경우에도 세포 내에서 보툴리늄 독소의 활성을 향상시키기 위하여, 보툴리늄 독소의 중쇄 중 세포질에서 타겟 단백질의 전좌(translocation)에 중요한 역할을 하는 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)을 보툴리늄 독소의 경쇄에 융합하여, 본 발명을 완성하였다.

또한, 본 발명자는 상기 융합단백질의 피부 투과성 및 세포투과성을 향상시키기 위하여, 상기 융합단백질에 가장 적합한 단백질 전달체를 확인하여 융합하였다.

즉, 본 발명은 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄, 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 N-말단의 전좌 영역(translocation domain)을 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 보툴리늄 독소 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 경피를 통한 전달이 가능하고, 보툴리늄 독소의 우수한 활성을 나타내며, 피부 자극을 나타내지 않는 보툴리늄 독소 융합단백질을 유효성분으로 포함하고, 상기 융합단백질의 세포 침투를 향상시키는 경피흡수촉진제를 추가로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 보툴리늄 독소 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 피부 주름의 개선 또는 예방 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 단백질 전달체들 중에서 양이온 전달체와 소수성 단백질 전달체를 포함한 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체를 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드의 운반체로 이용한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체와 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공한다.

구체적으로 상기 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

구체적으로 상기 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드는 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

구체적으로 상기 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드의 순으로 이루어진 융합단백질에 있어서, 상기 단백질 전달체와 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드 사이 및/또는 상기 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드 사이에 링커를 포함할 수 있다.

구체적으로 상기 링커는 (G)_N으로 표시되고, 이때 N이 1 내지 20의 정수이고, G는 글라이신인 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 링커는 GGGGG일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.

상기 단백질 전달체의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 내지 20 중 어느 하나의 염기 서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 보툴리늄 독소의 경쇄 펩타이드 및 보툴리늄 독소의 중쇄의 전좌 영역 펩타이드를 포함하는 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 "경피흡수촉진제"는 유화제 중에서 피부투과에 영향을 주는 성분들로 통상적으로 경피패취제에 사용되는 성분이다. 본 발명에서는 융합단백질의 피부투과 및 세포침투를 증대시키는 역할을 하는 것으로, 레시틴(Lecithin), 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 글리세롤 모노올리에이트(Glycerol Monooleate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol Monolaurate), 프로필렌 글리콜 모노라우레이트(Propylene Glycol Monolaurate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노올리에이트(Sorbitan Monooleate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 경피흡수촉진제는 바람직하게 레시틴, 라우릴 피롤리돈, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트 또는 소르비탄 모노스테아레이트일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 레시틴일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 융합단백질, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드(Medium Chain Glyceride)를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 융합단백질, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드는 화장료 조성물에서 미셀(micelle)을 형성할 수 있다. 미셀(micelle)이란 계면활성제가 일정농도 이상일 때 집합체로 형성된 미립구 형태를 갖는다. 본 발명에서는 유효성분과 계면활성제만으로 미셀을 형성하기 어려워, 중쇄 글리세라이드와 같은 오일 성분을 추가하여 미셀이 형성되도록 하는 것이 바람직하다.

통상적으로 경피흡수촉진제는 각질의 인지질층에 유동성을 부여하여 비교적 작은 분자량(500Da이하)의 화합물들을 투과시키도록 도와주지만, 본 발명의 융합단백질의 분자량이 100kDa 이상으로 매우 크기 때문에 각질의 유동화만으로는 융합단백질의 피부투과 및 세포침투가 어려워 미셀을 형성함으로써, 미셀 형태로 세포내 이입(endocytosis)되어 피부투과 및 세포침투가 증대될 수 있다.

본 발명의 중쇄 글리세라이드는 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 경피흡수촉진제로 작용하는 레시틴은 조성물 총 중량에 대하여 0.5 중량% 이상에서 피부투과도가 급격히 상승하고, 이는 미셀을 형성하는 임계농도(CMC; Critical Micelle Concentration)에 해당한다.

또한, 본 발명의 조성물은 융합단백질을 안정화시키는 당알코올을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 당알코올은 만니톨, 에리스리톨, 자일리톨, 소르비톨 등일 수 있으며, 바람직하게는 만니톨일 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 주름의 개선 또는 예방을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "피부투과성"이란, 피부를 투과하여 피부 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 의미하며, 본 발명의 융합단백질과 이를 포함하는 조성물은 통상의 보툴리늄 독소와 비교하여 현저히 우수한 피부투과성을 나타낸다.

본 발명에서 "융합단백질"이란, 상기 피부투과성 펩타이드(단백질 전달체)가 다른 단백질 또는 펩타이드에 결합되도록 인위적으로 합성된 단백질이다. 본 발명에 따른 융합단백질의 구성을 도 1에 나타내었다.

본 발명의 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

본 발명에서 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되고, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내어야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 본 발명의 피부투과성 펩타이드(단백질 전달체)와 보툴리늄 독소의 경쇄 및 중쇄의 N-말단을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 피부투과성 펩타이드와 보툴리늄 독소의 경쇄 및 중쇄의 N-말단을 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 "H6Ub 단백질"은 히스티딘 단백질 6개(H6)가 유비퀴틴(Ubiquitin) 단백질에 결합된 단백질이다. 유비퀴틴은 목적단백질의 발현을 도와주는 발현유도체로 알려져 있는 단백질이다. 유비퀴틴은 정제공정 중 유비퀴틴 특이 프로테아제(Ubiquitin Specific Protease, USP)에 의하여 절단되어 제거된다.

본 발명의 "링커"는 융합 단백질 내에서 도메인과 도메인 사이에 물리 화학적 거리를 두거나, 혹은 연결을 위하여 사용되는 펩타이드이다. 본 발명의 융합 단백질은 피부투과성 펩타이드와 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드 사이 및/또는 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리늄 독소 중쇄의 N-말단 펩타이드 사이에 링커를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합단백질, 및 이를 포함하는 조성물은 피부투과성 및 세포투과성을 향상시키고, 보툴리늄 독소의 활성을 개선한 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명에 따른 융합단백질의 도메인 구성을 나타낸다.
도 2는 융합단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 pATP 벡터를 제한 효소로 처리한 결과를 나타낸다.
도 3은 E. coli 균주에서 융합단백질을 발현시킨 결과를 나타낸다.
도 4는 보툴리늄 독소 융합단백질의 펩타이드를 정제한 결과를 나타낸다.
도 5는 융합단백질에 따른 세포내 보툴리늄 독소의 전달 실험결과를 나타낸다.
도 6은 피부 투과성 분석에 사용되는 프란츠 확산 셀(Franz Diffusion Cell)의 모식도이다.
도 7은 융합단백질에 따른 피부 투과 분석 실험결과를 나타낸다.
도 8은 복합근 활동전위 시험에서 좌골신경을 2 Hz 로 50회 자극하여 기록된 복합근 활동전위의 평균을 나타낸다.
도 9는 융합단백질 주사 후 시간에 따른 복합근 활동전위 측정결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 내지 3]

융합 단백질의 발현 및 정제

(1) 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC); (2) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG) 및 보툴리늄 독소의 경쇄(LC)의 순으로 이루어진 아미노산 (S+LC 융합단백질); 및 (3) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG), LC, 링커(GGGGG) 및 보툴리튬 독소의 중쇄의 전좌 영역의 순으로 이루어진 아미노산(S+LC+HC 융합단백질)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하였다(도 1).

합성된 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터인 pAPT에 삽입하여, 3 종의 융합단백질에 대한 발현 벡터를 제조하였다. 발현을 유도하기 위한 융합파트너로 H6Ub 단백질을 사용하였다.

상기 융합단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질전환시킨 BL21(DE3) starpLysS E. coli 균주 (Invitrogen, NY, USA) 를 카나마이신 (50 mg/L)을 포함하는 37℃의 LB (Luria-Bertani) 배지에서 600 nm 에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 융합단백질의 발현결과를 도 2에 나타내었다.

0.1M 의 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 로 단백질 발현을 유도하고 세포를 16시간 동안 추가적으로 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집하고 라이시스 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 100 mM NaCl, 5mM 이미다졸, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, pH 8.0)에 재 현탁시키고, 초음파로 분쇄하였다. 그 다음 13,000 rpm, 4℃ 에서 15분간 원심분리하고, 상층액을 SDS-PAGE 를 통해 융합단백질의 발현율과 수용성 정도를 확인하였다. 제한효소 처리결과를 도 3에 나타내었다.

융합단백질의 정제는 상층액을 IMAC 6FF (GE Healthcare Life Sciences) 및 Q FF (GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 정제한 후, Sephadex G-25 (GE Healthcare Life Science)를 이용하여 안정화 완충액으로 완충액을 교체하였다.

융합 단백질의 정제는 상층액을 HisPrep FF(GE Healthcare Life Sciences) 및 HighTrep Desalting(GE Healthcare Life Science)을 이용하여 정제하였다. 정제된 융합단백질을 도 4에 나타내었다.

상기 (1) 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC); (2) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG) 및 보툴리늄 독소의 경쇄(LC)의 순으로 이루어진 아미노산 (S+LC 융합단백질); 및 (3) 서열번호 2로 표시되는 단백질 전달체, 링커(GGGGG), LC, 링커(GGGGG) 및 보툴리튬 독소의 중쇄의 전좌 영역의 순으로 이루어진 아미노산(S+LC+HC 융합단백질)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 합성된 폴리펩타이드를 실시예 1 내지 3으로 하였다.

[제조예 1 내지 12]

보툴리늄 유래 융합단백질을 포함하는 조성물

실시예 3의 융합단백질과 경피흡수촉진제를 포함하는 조성물을 하기의 방법으로 제조하였다.

세테아릴알코올 및 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 혼합한 용액과 글리세린, 만니톨, 아르기닌, 페녹시에탄올 및 정제수를 혼합한 용액을 70℃에서 각각 용해한 후, 혼합하여 호모믹서에서 3000rpm으로 5분 동안 유화하였다. 이후, 융합단백질 및 카르복시폴리머 용액을 첨가하여 5분간 혼합하여 제조예 1을 제조하였다

또한, 세테아릴알코올, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 및 레시틴을 혼합한 용액과 글리세린, 만니톨, 아르기닌, 페녹시에탄올 및 정제수를 혼합한 용액을 70℃에서 각각 용해한 후, 혼합하여 호모믹서에서 3000rpm으로 5분 동안 유화하였다. 이후, 융합단백질 및 카르복시폴리머 용액을 첨가하여 5분간 혼합하여 제조예 2를 제조하였다.

제조예 1 및 2의 성분 및 함량은 하기 표 1과 같다.

제조예	1 (중량%)	2 (중량%)
융합단백질 (실시예3)	0.1	0.1
레시틴	-	0.5
세테아릴 알코올 (Cetearyl Alcohol)	1.0	1.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	3.0	3.0
만니톨	1.0	1.0
카르복시폴리머 (카보머)	0.2	0.2
아르기닌	0.2	0.2
페녹시에탄올	적량	적량
정제수	잔량	잔량
합계	100	100

또한, 제조예 2의 경피흡수촉진제인 레시틴(Lecithin) 대신, 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 글리세롤 모노올리에이트(Glycerol Monooleate), 글리세롤 모노라우레이트(Glycerol Monolaurate), 프로필렌 글리콜 모노라우레이트(Propylene Glycol Monolaurate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monostearate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate), 소르비탄 모노올리에이트(Sorbitan Monooleate), 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate), 소르비탄 모노라우레이트(Sorbitan Monolaurate)를 첨가하여, 제조예 3-12를 제조하였다.

[시험예 1]

융합단백질의 세포내 전달 효과

세포내 보툴리늄 독소의 효과를 분석하기 위해, 상기 실시예 1 내지 3의 폴리펩타이드에 대하여 각각 형광물질인 FITC(Sigma, Fluorescein-5-isothiocyanate, 27072-45-3)를 레이블링하여 FACs(FACSCalibur, Becton Dickinson)으로 분석하였다. PC 12 세포(Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721)에 반응시간은 1시간으로 동일하게 반응시켰다.

상기 실험결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2 및 3은 높은 세포내 전달효과를 나타내었으며, 실시예 3이 실시예 2 보다 더 우수한 세포내 전달 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

[시험예 2]

프란츠 확산 셀(Franz Diffusion cell)을 이용한 피부 투과 효과

피부투과도의 분석을 위해 가장 많이 사용되고 있는 프란츠 확산 셀(Franz Diffusing Cell)을 이용하여 Flux를 분석하였다(도 6).

시험에 사용되는 피부로는 기니피그(Hartley Guinea Pig)를 사용하였다. 항온수조를 이용하여 32℃를 유지하고, receptor의 medium은 PBS이고, 600 rpm 으로 하였다. 10시간 동안 2시간 간격으로 샘플링(sampling)을 진행하여 피부투과속도(Flux)를 계산하였다.

실시예 1 및 3의 폴리펩타이드에 Cy5 Fast conjugation kit(ab188288)를 이용하여 Cy-5를 접합하여 사용하였고, Waters 2475 Fluorescence Detector(excitation 630nm, emission 660nm)를 이용하여 분석하였다.

단백질 전달체에 따른 프란츠 확산 셀(Franz Diffusion Cell)에서의 피부 투과 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 3의 피부투과를 분석한 결과, 실시예 3의 융합단백질의 피부투과성이 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄만 있는 경우보다 초기에 2-3배 이상 현저히 우수한 것을 확인하였다.

[시험예 3]

카테콜아민 분비억제능 분석

카테콜아민은 교감신경자극전달물질로 부신수질-교감신경계 기능을 고찰하는 중요한 지표이다. 보툴리늄 독소는 신경세포의 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육을 마비시키기 때문에, 신경전달물질 분비 억제 기능을 확인하고자 카테콜아민 한 종류인 도파민 및 노르에피네프린 분비 억제 효과를 분석하였다.

PC 12 세포(Pheochromocytoma, ATCC CRL-1721)를 2 mM L-글루타민, 1.5 g/L 중탄산나트륨 및 10% FBS를 넣은 F-12K 배지(Gibco) 15 ml에서 배양하였다. 2일 동안 세포 배양 플라스크인 T75(Nunc)에서 세포 밀도가 625,000 세포/㎠ 이 되도록 배양하였다.

이후 배양한 세포를 원심분리하여 상등액을 제거하고 동일 부피의 F-12K 배지와 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 각각 첨가하여 하루 동안 배양하였다. 이를 10uM 농도의 Ca²⁺으로 자극하여 분비되는 도파민 및 노르에피네프린의 양을 액체크로마토그래피-질량분석법(LC/Mass)을 통해 분석하였다.

실시예 1 내지 3의 융합단백질은 10^-5 M 및 10^-6 M의 농도로 처리하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄는 양성 대조군과 비교하여 신경전달물질 분비량에 차이가 없었고, 카테콜아민의 분비의 억제 효과가 없는 것을 확인하였다.

실시예 2 및 3의 융합단백질은 신경전달물질의 분비를 억제하는 효과를 나타내었으며, 실시예 3은 실시예 2 보다 더 우수한 억제 효과를 나타내었다.

[시험예 4]

복합근 활동전위 시험

보툴리늄 독소는 신경세포의 신경전달물질의 분비를 억제함으로써 근육을 마비시키기 때문에 보툴리늄 독소의 성능을 확인하기 위해서는 신경을 전기자극하여 해당 근육의 복합근 활동전위(compound muscle action potentials, CMAP)를 기록하여 평가하는 것이 일반적인 성능 평가시험이다.

상기 실시예 1 내지 3의 융합단백질에 대한 복합근활동전위를 다음과 같이 분석하였다.

랫트(rat)를 마취한 후, 복와위(업드린 자세)로 두고 뒷다리의 고관절, 슬관절, 발목관절이 90°가 되게 구부려 고정하고, 전경골근에 BOTOX Cosmetics (onabotulinum toxin A, Allergan), 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 주사하였다.

BOTOX Cosmetics의 주사방법은 제조사가 제시하는 100 unit을 2.5 mL의 0.9% 생리식염수에 녹여 5uL를 1회 주사하는 방법을 사용하였다. 또한, 실시예 1 내지 3의 융합단백질을 각 100 ng/5uL의 농도로 1회 주사하여 비교하였다.

0.2 Unit의 BOTOX Cosmetics을 주사한 경우, 3주 경과까지 완벽하게 근육이 마비되었며, 이를 비교예로 하였다.

좌골신경(sciatic nerve)을 전기 자극하여 전경골근에서 복합근 활동전위의 진폭을 측정하였다. 좌골신경을 2 Hz 로 50회 자극하여 기록된 복합근 활동전위의 평균을 도 8에 나타내었다.

최대 진폭을 야기하는 자극크기의 150% 내외의 자극을 2 Hz, 20 Hz 로 50 회 반복 자극하여 반복 복합근 활동전위를 유발하였고, 주사 후 각각 1주, 2주, 3주, 4주에 복합근 활동전위의 진폭을 측정한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 보툴리늄 독소의 경쇄 (LC)의 경우, 세포 내로의 전달이 전혀 이루어지지 않아 근육 마비의 효과가 나타나지 않았다. 반면, 실시예 2 및 3의 융합단백질의 경우 각각 근육 마비효과가 점차 증가하였으며, 실시예 3의 융합단백질은 실시예 2의 융합단백질보다 더 우수한 근육마비 효과를 나타내었으며, 1주에는 비교예와 거의 동일한 근육마비 효과를 나타내었다.

[시험예 5]

피부자극실험

실시예 3의 융합단백질에 대해 피부 자극시험을 실시하였다.

실험동물은 뉴질랜드 백색 계통의 토끼 수컷 3마리를 이용하였다. 시험물질 적용 24시간 전에 전기 제모기를 이용하여 토끼의 배부 피부에 상처가 나지 않도록 제모된 건강한 피부를 만들었다. 제모된 피부는 좌우로 나누어 좌를 적용구획, 우를 대조구획으로 하였다.

적용방법으로는 2.5 cm X 2.5 cm 의 적용구획 피부 위에 0.5ml(1mg/ml의 농도)의 시험물질을 적용한 후, 거즈를 덮어 시험물질과 피부가 잘 접촉할 수 있도록 하였다. 대조구획에는 거즈만 덮어 주었다. 거즈 위에는 시험물질의 증발을 막기 위해 침투성이 없고 자극성이 낮은 테이프를 감아 주었다.

시험물질의 적용은 1회 적용하여 24시간 경과 후 제거하고, 시험물질이 잔류하지 않도록 생리식염수로 가볍게 씻어내었다. 시험물질 적용 후, 24시간, 48시간, 72시간째에 도포 국소 부위의 홍반, 부종, 출혈, 가피 형성 등의 변화를 육안적으로 관찰하였다. 하기 표 3 및 표 4에 피부반응 평가 기준을 나타내었다.

홍반과 가피의 형성 반응	정도
홍반이 전혀 없음	0
아주 가벼운 홍반(육안으로 겨우 식별할 정도)	1
분명한 홍반	2
약간 심한 홍반	3
심한 홍반(홍당무 색의 발적)과 가벼운 정도의 가피 형성(심부손상)	4

부종 형성 반응	정도
부종이 전혀 없음	0
아주 가벼운 부종(육안으로 겨우 식별할 정도)	1
가벼운 부종(뚜렷하게 부어 올라서 변연부가 분명히 구별될 경우)	2
약간 심한 부종(약 1mm 정도 부어 올랐을 경우)	3
심한 부종(1 mm 이상 부어 오르고 노출부위 밖까지 확장된 상태)	4

피부 반응을 채점한 것을 이용하여 24 시간, 72 시간 때의 홍반 평점과 부종 평점을 더해서 평균치를 산출하였고 이 수치로 피부 자극성을 평가하였다. 피부 자극성의 비교에는 1차 피부자극 지수 값을 이용하였다. 1차 피부 자극 지수(PII, Primary Irritation Index)는 개체별 피부 반응 채점결과의 평균 합을 4로 나눈 값이다. 하기 표 5에 1차 피부 자극 지수에 따른 자극성 정도를 나타내었다.

1차 피부 자극 지수	구분
0.0 - 0.5	비자극성
0.6 - 2.0	약한 자극성
2.1 - 5.0	중등도 자극성
5.1 - 8.0	강한 자극성

실시예 3의 융합단백질의 적용에 따라, 24 시간째 가벼운 홍반이 토끼 3마리 모두에서 관찰되었고, 48 시간 및 72 시간째는 토끼 1마리 만이 가벼운 홍반이 관찰되었다. 이를 통해, 실시예 3의 융합단백질은 일차피부자극지수(PII) 값이 0.25인 비자극성 물질이라는 것을 확인하였다.

[시험예 6]

피부 주름 개선 효과

실시예 3의 융합단백질을 함유한 화장품 조성물의 피부주름 개선 정도를 알아보기 위해 30세 이상의 건강한 여성 15명에 대하여 임상효능 평가를 실시하였다.

제품 사용에 따른 주름개선 효과를 피부화상분석기(Visiometer)를 이용하여 분석하였다. 이를 위하여 0주, 4주, 8주 경과시 지정된 눈가 부위의 모사판을 제작하였다. 상기 모사판은 항온 항습(22±2℃, 40%∼60% 습도) 조건에서 실리콘 재질을 이용하여 제작되었다.

상기 모사판은 피부화상분석기(Skin-Visiometer SV 600, Courage & Khazaha, Gemany)의 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

상기 모사판의 분석은 분광법으로 수행하였다. 구체적으로 인공 광원에서 방출된 빛이 실리콘 재질을 투과하면서 생기는 빛의 세기를 람베르트-베르의 법칙(Lambert & Beer's law)으로 분석하였으며, 피부주름 개선 정도를 측정하였다.

상기 피부화상분석기에 의한 측정 변수는 R2로 표시되며, 이는 최대 거칠기(Maximum Roughness)를 나타낸다. 상기 변수의 값이 작아질수록 피부주름이 개선되어 주름의 깊이가 낮아짐을 의미한다. 본 발명에 따른 화장품 조성물의 피부주름 개선 평가시험에서의 피부주름 개선율(%)을 하기 표 6에 표시하였다.

주름개선 효과

	개선율(%)	p-value
4주 후	5.67	0.11248
8주 후	9.28	0.00097

상기 실험결과를 통하여 본 발명에 따른 실시예 3의 융합단백질을 함유한 화장품은 우수한 주름개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

[시험예 7]

보툴리늄 유래 융합단백질을 포함하는 조성물의 피부투과 시험

제조예 1 내지 12의 조성물에 대하여, 피부투과의 정도를 측정하기 위하여 시험예 2와 같은 방법으로 피부투과 시험을 수행하였으며, 여기서는 10시간 동안의 누적 피부투과량을 측정하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 경피흡수촉진제를 첨가한 제조예 2-12가 경피흡수촉진제를 첨가하지 않은 제조예 1 보다 2-3배 정도 더 우수한 피부 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 레시틴을 포함하는 제조예 2가 가장 우수한 피부 투과성을 나타내었고, 라우릴 피롤리돈을 포함하는 제조예 3, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 제조예 8, 및 소르비탄 모노스테아레이트를 포함하는 제조예 11이 15㎍/cm²이상의 우수한 피부 투과성을 나타내는 것을 확인하였다.

[시험예 8]

보툴리늄 유래 융합단백질 및 레시틴을 포함하는 조성물의 피부투과 시험

보툴리늄 독소 및 레시틴을 포함하는 조성물에 있어서, 레시틴의 함량에 따른 피부투과성을 확인하는 시험을 수행하기 위하여 제조예 2와 동일한 방법으로 제조예 13 내지 15를 제조하였다.

시험예 7의 방법과 동일한 방법으로 피부투과성 시험을 수행하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 레시틴의 함량이 0.1 및 0.3 중량%인 경우 피부 투과량이 8.2 및 9.7㎍/cm²로 유사하였으나, 레시틴의 함량이 0.5 중량%인 경우 20.3 ㎍/cm²로 급격하게 증가하는 것을 확인하였다.

경피흡수촉진제는 각질의 인지질층에 유동성을 부여하여 비교적 작은 분자량(500Da이하)의 화합물들을 투과시키도록 도와주는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 융합단백질의 경우에 분자량이 100kDa 이상으로 상당히 크기 때문에 각질의 유동화만으로는 융합단백질의 피부투과가 어렵다.

본 실험을 통하여 관찰한 결과, 경피흡수촉진제 및 중쇄 글리세라이드(Medium Chain Glyceride)의 한 종류인 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)가 융합단백질과 함께 미셀(micelle)을 형성하여, 미셀 형태로 세포내 이입(endocytosis)되어 피부투과가 증대되는 것을 확인하였다.

경피흡수촉진제인 레시틴의 함량이 0.5 중량% 이상에서 피부투과도가 급격히 상승하는 실험결과로부터, 상기 함량이 미셀을 형성하는 임계농도(CMC; Critical Micelle Concentration)인 것을 알 수 있다.

<110> Iphama CO.,LTD. ICURE Pharmaceutical Inc. <120> Cosmetic composition comprising peptide derived from Botulinum toxin having improved cell penetrating ability <130> P170021 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> penetratin <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT <400> 2 Arg Lys Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP22 <400> 3 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 4 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> kFGF <400> 5 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyarginine(R9) <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MPG <400> 7 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YTA2 <400> 8 Tyr Thr Ala Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YTA4 <400> 9 Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys Gly Pro Leu 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pVEC <400> 10 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain <400> 11 aggcagatca agatctggtt ccagaacagg aggatgaagt ggaagaag 48 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide of protein transduction domain 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Ser Ile Val 290 295 300 Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys 305 310 315 320 Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu 325 330 335 Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp 340 345 350 Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn 355 360 365 Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr 370 375 380 Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn 385 390 395 400 Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu 405 410 415 Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg 420 425 430 Gly Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys 435 440 445 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The translocation domain peptide of the Botulinum toxin heavy chain <400> 22 Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser 1 5 10 15 Leu Lys Asp

Claims

보툴리늄 독소 융합단백질 및 경피흡수촉진제를 포함하고,
상기 보툴리늄 독소 융합단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 전달체, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드, 및 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌(translocation) 영역 펩타이드로 이루어지고,
상기 융합단백질은 단백질 전달체, 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드, 및 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드의 순으로 융합되며,
상기 경피흡수촉진제는 레시틴(Lecithin), 라우릴 피롤리돈(Lauryl Pyrrolidone), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate) 및 소르비탄 모노스테아레이트(Sorbitan Monostearate)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 단백질 전달체와 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드 사이, 및 보툴리늄 독소 경쇄 펩타이드와 보툴리늄 독소 중쇄의 전좌 영역 펩타이드 사이 중 어느 하나 이상에 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 링커가 (G)_N으로 표시되며, 이때 N이 1 내지 20의 정수이고, G가 글라이신인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 링커가 GGGGG인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 경피흡수촉진제가 레시틴인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서, 상기 레시틴이 전체 조성물 중량에 대하여 0.5 중량% 이상으로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제7항에 있어서, 중쇄 글리세라이드(Medium Chain Glyceride)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제9항에 있어서, 상기 중쇄 글리세라이드가 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제10항에 있어서, 융합단백질, 레시틴 및 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드(Caprylic/Capric Triglyceride)이 미셀(micelle)을 형성하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 융합단백질을 안정화시키는 당알코올을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제12항에 있어서, 상기 당알코올은 만니톨인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름의 개선 또는 예방을 위한 화장료 조성물.