CN111763620A - 一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置及方法；装置包括纳秒脉冲发生器和纳米电极。方法是通过纳米颗粒局部放大细胞周围的电场强度，从而增强脉冲电场诱导的细胞电穿孔效应，步骤为：1)确定目标细胞的类型，获取目标细胞的靶向配体；2)将表面具有目标细胞靶向配体方纳米电极与目标细胞接触或将纳米电极延伸入目标细胞；3)预设脉冲参数；4)高压直流电源对储能电容充电；5)充电结束后，FPGA模块基于预设的脉冲参数控制MOSFET开关组的通断，进而控制纳米电极输出的脉冲参数；6)纳米电极利用脉冲对目标细胞进行穿孔。本发明能够在较低的脉冲电场强度作用下实现更高效的细胞电穿孔。
Description
技术领域
本发明涉及细胞电穿孔领域，具体是一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置及方法。
背景技术
脉冲电场诱导细胞电穿孔作为一种新型的生物技术，已经被广泛的应用于生物工程领域。在脉冲电场的作用下，细胞膜上产生亲水微孔，使得药物、DNA等分子能够更高效的进入细胞内部，明显提高了药物、DNA等物质的利用率。除此之外，微孔的产生破坏了原本细胞膜的完整性，可能诱导细胞发生坏死或凋亡，这使得电穿孔技术在肿瘤治疗领域同样有着重要应用前景。但是，传统电穿孔方法虽然能够诱导细胞发生穿孔，但是存在效率低、电气安全性差等问题，这在一定程度上限制了电穿孔技术的应用和推广。因此，提出一种更高效、安全的新型电穿孔方法是解决目前技术瓶颈的必然需求。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，即增强了传统电穿孔方法的穿孔效率，并降低了实现穿孔所需的电场强度大小。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，包括纳秒脉冲发生器和纳米电极；
所述纳秒脉冲发生器向目标细胞和纳米电极发送激励脉冲；
所述纳秒脉冲发生器包括高压直流电源、储能电容、FPGA模块和MOSFET开关组；
所述高压直流电源对储能电容充电；
所述储能电容通过MOSFET开关组向纳米电极发送激励脉冲；
所述FPGA模块控制MOSFET开关组的通断，进而控制激励脉冲的持续时间和个数。
所述纳米电极能够实现对目标细胞的靶向；
当纳米电极接收到激励脉冲后，对激励脉冲电场强度进行增强，并向目标细胞发送增强后的激励脉冲信号，增强目标细胞电穿孔效应；所述脉冲为方波脉冲。
所述纳米电极为若干高导电纳米粒子；每个高导电纳米粒子表面具有目标细胞的靶向配体。
所述高导电纳米粒子为金纳米棒。
一种使用靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置的方法，包括以下步骤：
1)确定目标细胞的类型，并获取目标细胞的靶向配体；
2)建立靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置；
3)将表面具有目标细胞靶向配体方纳米电极与目标细胞接触或将纳米电极延伸入目标细胞；
4)预设脉冲参数；
5)高压直流电源对储能电容充电；
6)充电结束后，FPGA模块基于预设的脉冲参数控制MOSFET开关组的通断以实现脉冲的输出；
7)发生器输出的脉冲流经纳米电极，实现脉冲增强；增强后的脉冲通过纳米电极中每个高导电纳米粒子的尖端释放，实现对目标细胞的穿孔。
所述高导电纳米粒子尖端电场强度Etip如下所示：
式中，Etip、E0分别为高导电纳米粒子尖端电场强度和外加均匀电场强度；L、D分别为高导电纳米粒子的长度和外径；α为常数。
值得说明的是，高导电纳米粒子的加入能够降低细胞周围环境的电阻率，从而提高了细胞所承受的脉冲电压大小，改善了脉冲电压的利用率。而具有一定长径比的导电纳米粒子能够在其尖端附近造成电场的畸变，因此，如果将高导电纳米粒子进行靶向配体的修饰，来实现对目标细胞的特异性结合，就能够有效增强细胞膜附近的电场强度，从而进一步增强细胞的电穿孔效应。
本发明首先需要针对目标细胞选择特定的靶向配体，然后对高导电纳米粒子表面进行靶向配体的修饰，使得修饰后的纳米粒子具有靶向识别目标细胞的功能。当纳米粒子与细胞发生结合之后，再施加相应参数的脉冲电场来诱导细胞发生电穿孔。
本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明能够在更短的时间内达到发生电穿孔所需的跨膜电压阈值，减少了电穿孔形成的时间，延长了脉冲作用期间穿孔发展的时间，进而引起了更强的细胞电穿孔效应。靶向修饰后的金纳米棒能够更加高效的发挥其“避雷针效应”以及高电导率的特性，提高了细胞膜所受的电场强度大小，降低了细胞膜充电时间常数，从而有效的增强了细胞电穿孔效应。高导电纳米粒子能够在其尖端附近增强电场强度强，有效地提高细胞膜附近的电场强度，从而提高了细胞的电穿孔效应。
附图说明
图1为靶向高导电纳米粒子联合脉冲电场增强细胞电穿孔效应的示意图；
图2为nsPEFs处理细胞的实验平台装置示意图；
图3为BTX电击杯；
图4为BTX电击杯底座；
图5为纳秒脉冲发生器结构示意图；
图6(a)为对照组金纳米棒与A375细胞的暗场成像结果；
图6(b)为GNR-PEG组金纳米棒与A375细胞的暗场成像结果；
图6(c)为GNR-PEG-FA组金纳米棒与A375细胞的暗场成像结果；
图7为不同电场强度对PI阳性细胞比例的影响；
图8为不同脉冲宽度对PI阳性细胞比例的影响；
图9为不同脉冲个数对PI阳性细胞比例的影响；
图10为五层细胞介电模型示意图；
图11为金纳米棒与球型单细胞的仿真几何模型；
图12为单个脉冲方波波形图；
图13为周期性脉冲方波波形图(改变脉冲个数时)；
图14为nsPEFs单独作用组细胞膜附近空间电场强度分布图；
图15为GNR-PEG组细胞膜附近空间电场强度分布图；
图16为GNR-PEG-FA组细胞膜附近空间电场强度分布图；
图17为细胞外膜所受电场强度大小分布图；
图18为外膜孔密度分布图；
图19为内膜孔密度分布图；
图20为外膜孔半径分布图；
图21为内膜孔半径分布图；
图中：电击杯1、细胞悬浮液2。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1：
参见图1至图2，一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，包括纳秒脉冲发生器和纳米电极；
所述纳秒脉冲发生器和纳米电极信号线连接；
所述纳秒脉冲发生器向纳米电极和目标细胞发送激励脉冲；
脉冲发生器向细胞和纳米电极的混合物释放脉冲。纳米电极由于经过了靶向修饰，所以会附着在细胞膜附近，根据下式(1)的原理，纳米电极会放大其周围的电场强度，因此细胞所受的电场也得到了增强，所以提高了细胞的电穿孔效应。
所述纳秒脉冲发生器包括高压直流电源、储能电容、FPGA模块和MOSFET开关组；
所述高压直流电源对储能电容充电；
所述储能电容通过MOSFET开关组向纳米电极发送激励脉冲；
所述FPGA模块控制MOSFET开关组的通断，进而控制激励脉冲的持续时间和个数。
所述纳米电极与目标细胞相接触或延伸入目标细胞；
当纳米电极接收到激励脉冲后，对激励脉冲电场强度进行增强，并向目标细胞发送增强后的激励脉冲信号，增强目标细胞电穿孔效应；纳米电极作为辅助起到了放大目标细胞电穿孔效应的作用。
当细胞周围的纳米电极接收到激励脉冲后，会放大接收到的脉冲电场强度，然后向目标细胞发送增强后的脉冲，
所述脉冲为方波脉冲。所述脉冲的脉冲宽度范围为1ns至1ms，电场强度范围为100V/cm至100kV/cm，脉冲频率不限。
所述纳米电极为若干高导电纳米粒子；每个高导电纳米粒子表面具有目标细胞的靶向配体。
所述高导电纳米粒子为金纳米棒。
所述目标细胞接收到激励脉冲和增强后的激励脉冲信号后，发生穿孔。
实施例2：
一种使用靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置的方法，包括以下步骤：
1)确定目标细胞的类型，并获取目标细胞的靶向配体；
2)建立靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置；
3)将表面具有目标细胞靶向配体方纳米电极与目标细胞接触或将纳米电极延伸入目标细胞；
4)预设脉冲参数；
5)高压直流电源对储能电容充电；
6)充电结束后，FPGA模块基于预设的脉冲参数控制MOSFET开关组的通断以实现脉冲的输出；
7)发生器输出的脉冲流经纳米电极，实现脉冲增强；增强后的脉冲通过纳米电极中每个高导电纳米粒子的尖端释放，实现对目标细胞的穿孔。纳米电极增强了细胞周围的脉冲电场强度，并对目标细胞进行穿孔。
所述高导电纳米粒子尖端电场强度Etip如下所示：
式中，Etip、E0分别为高导电纳米粒子尖端电场强度和外加均匀电场强度；L、D分别为高导电纳米粒子的长度和外径；α为常数。
实施例3：
一种应用靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置的实验，包括以下步骤：
1)细胞培养
人源A375黑色素瘤细胞株获自第三军医大学基础医学研究部，是一种常见的恶性程度较高的人源肿瘤细胞，通常发病于皮肤表面，易于观察和处理，为后续靶向金纳米棒联合纳秒脉冲电场的在体实验研究提供方便。
1.1)细胞复苏
将-80℃冰箱或液氮中保存的A375细胞取出，放置于37℃水浴锅中轻轻摇晃，直至细胞冻存液完全融化，然后迅速将其转入到提前装有高糖改良杜氏伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)的离心管中吹打均匀，接着在800转/分钟的转速下离心，去掉上清液并重悬细胞，最后加入到含有5mL新鲜DMEM培养基的T25培养瓶中，并于孵箱中培养(5％CO2，37℃)。细胞培养所用的DMEM培养基均添加有10％胎牛血清(Gibco,USA)和1％的青霉素-链霉素(Gibco,USA)
1.2)细胞传代
待A375细胞铁壁生长汇合至80％以上，吸出培养瓶中的培养基，并加入1mL磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)轻轻洗涤两遍。在洗涤完成后吸出培养基中的PBS，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶(25200056,Gibco)并放置于孵箱中消化1分钟，随后加入1mL培养基终止消化。将消化下来的细胞移至离心管并离心(800转/分钟)，去上清，最后将细胞平均分配到2-3个T25培养瓶中继续孵育。
1.3)细胞悬液的制备
待细胞生长汇合至80％时，对细胞进行消化并离心(同细胞传代步骤)，加入一定量的DMEM培养基，然后通过血球计数板进行计数，最后将细胞浓度确定在1×106个/mL，放置于离心管中等待进行脉冲处理。
1.4)细胞冻存
将二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)和胎牛血清以9：1的体积比进行混合，从而配置成冻存液。待细胞生长汇合至80％以上，对细胞进行消化并离心，去除上清液，然后加入提前配置好的冻存液，装入冻存盒中并于-80℃冰箱中保存过夜，最后取出冻存管，移入液氮容器中保存。
2)实验平台的搭建
本实施例所搭建的实验平台装置示意图如图2所示，将提前准备好的A375细胞悬液装入电击杯1(平板电极，间距2mm，BTX)当中，再将实验室自制的纳秒脉冲发生器的输出端连接到电击杯两端。与此同时，将高压探头(PPE5KV,Teledyne Lecroy)接在电击杯两端，然后将放电回路中的导线穿过皮尔森线圈(2877,Pearson Electronics)，最后通过示波器来采集电击杯两端的电压波形和电流波形图。电击杯1和电击杯底座如图3和图4所示。
本实施例所用的脉冲发生器装置结构示意图如图5所示，通过电脑PC端进行编程，将程序烧入现场可编程逻辑门阵列(Field-Programmable Gate Array,FPGA)模块(AX301,ALINX)中，FPGA的信号输出通过光纤传输到MOSFET开关(IXRFD630,IXYS)来控制MOSFET的开通和关断，从而实现对输出脉冲参数的控制。纳秒脉冲发生器主体则采用的是传统的RC充放电的电路结构，即通过高压直流电源(DW-P302-35F5D,东文高压电源公司)对电容(R75QR41004000J,KEMET)进行充电，然后通过FPGA的输出信号来控制MOSFET开关的动作，从而控制脉冲电压在负载两端的持续时间以及作用个数。
3)GNR-PEG-FA靶向结合A375细胞的效果
3.1)暗场成像方法
首先用0.25％胰蛋白酶将A375细胞从培养瓶上消化下来，重新将细胞铺板于提前放有24mm盖玻片的6孔板上，加入3mL培养基继续于孵箱中孵育24小时。24小时之后，吸出6孔板中的培养基，用PBS轻轻冲洗细胞以去除杂质及死细胞，然后将细胞分为三组：GNR-PEG-FA组(加入靶向修饰的金纳米棒)、GNR-PEG组(加入未靶向修饰的金纳米棒)和对照组(不加入金纳米棒)，其中GNR-PEG-FA和GNR-PEG的浓度均为0.1mg/mL(该浓度是步骤3.5所确定的安全浓度)。将三组细胞放入孵箱中继续孵育15分钟，然后用PBS轻轻冲洗三遍以去除未与细胞结合的金纳米棒，最后用多聚甲醛固定，甘油包被，并用另一个盖玻片进行密封，最后将准备好的样品于配有暗场聚光镜(U-DCW，1.2-1.4)的BX51暗场显微镜(Olympus,Japan)下进行观察。来自金纳米棒和细胞的散射光通过100X物镜到达DP72单芯片彩色电耦合器件相机(Olympus,Japan)，然后通过相机获得了暗场图像，从而实现对金纳米棒的位置观察。
3.2)暗场成像结果
GNR-PEG-FA组和GNR-PEG组的暗场成像结果如图6(a)、图6(b)、图6(c)所示，其中本实施例所用的金纳米棒在暗场成像下呈黄色。对比三组暗场成像的结果可以发现，靶向修饰后的GNR-PEG-FA对A375细胞具有更强的结合作用，且大量的分布在细胞膜周围。除此之外，细胞内部也存在一部分金纳米棒，这是由于细胞膜表面叶酸受体介导的内吞作用所导致的。GNR-PEG组由于缺乏靶向配体，因此只能通过静电吸附作用或胞吞作用来与细胞发生结合，结合效率低且不稳定。因此，通过暗场成像结果直观的证明了GNR-PEG-FA能够更高效的结合A375细胞，为后续脉冲电场实验研究的开展奠定了基础。
4)纳秒脉冲电场处理方案
本步骤悬浮细胞实验所采用的脉冲参数如表2.1所示，由于脉冲频率的变化对细胞的影响机制较为复杂，且频率的变化在本质上影响的主要是脉冲个数，因此本实验固定脉冲频率为1Hz，然后针对电场强度(E)、脉冲宽度(τ)和脉冲个数(N)三个变量分别设置有5个不同水平的参数值，这些参数值的确定是通过前期预实验的摸索得到的，分别对细胞产生由弱到强的影响。本实施例首先对参数设置了一个中间值，即E为5kV/cm，τ为300ns，N为100个。当改变E时，τ固定为300ns，N为100个；当改变τ时，E固定为5kV/cm，N为100个。当改变N时，则E固定为5kV/cm，τ为300ns。
表1纳秒脉冲电场实验参数表
Table 2.1Experimental parameters of nsPEFs
通过步骤2的方法得到细胞悬浮液1，然后将细胞悬浮液分为三组：GNR-PEG-FA组，GNR-PEG组和nsPEFs单独作用组，其中GNR-PEG-FA组和GNR-PEG组中金纳米棒的浓度均为安全浓度，且均有各自对应的不加脉冲电场处理的对照组。脉冲电场处理前，将约80μL的细胞悬浮液加入到2mm的BTX电击杯中，等待约15分钟后将电击杯***到电击杯底座中，然后施加特定参数的脉冲电场进行处理。脉冲电场处理结束后，将电击杯中的细胞悬浮液吸出，然后离心、去上清并重悬，再以1×105个/mL的细胞浓度铺板于96孔板中，在孵箱继续孵育8小时后，加入cck-8试剂，再孵育1.5小时后通过酶标仪进行吸光度的检测。
5)PI染色法检测细胞膜通透性
5.1)PI试剂染色方法
本步骤实验中使用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶对细胞进行消化。在脉冲电场处理过后，将细胞重新接种于6孔板中，于孵箱中继续孵育3小时。3小时过后用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶将细胞从6孔板中消化下来，离心3遍以去除细胞溶液中的培养基，加入PBS缓冲液并最终定容为200μL。在黑暗环境下加入200μL的PBS和碘化丙啶(PI)的混合溶液(20：1)并继续孵育10分钟，最后在避光条件下通过流式细胞仪(ACCURI-C6-T100,BD)进行检测。
PI是一种大分子的核酸染料，当细胞膜具有完整的形态时，PI无法透过细胞膜进入到细胞内部与细胞核结合。当细胞外膜受到脉冲电场的作用而发生穿孔时，PI分子能够通过膜上的微孔穿透细胞膜，从而进入到细胞内部，并与细胞核发生结合。因此，使用PI染色法能够准确反映细胞发生电穿孔后膜通透性的变化，并最终通过PI阳性细胞的比例来定性的表征电穿孔效应的强弱。
5.2)脉冲参数变化对PI阳性细胞比例的影响
图7至图9为不同脉冲参数作用下，PI阳性细胞百分比柱状图。如图7所示，对照组由于没有施加脉冲电场，且GNR-PEG和GNR-PEG-FA的浓度均为安全浓度，因此三组细胞的PI阳性比例很低且均无显著性差异(p>0.05)，说明此时并没有发生穿孔，细胞膜处于完整状态。
当改变电场强度时，nsPEFs单独作用的情况下PI阳性比例从2kV/cm的3.8％升高到了8kV/cm的52.7％，而GNR-PEG组的PI阳性比例则从4.1％升高到63.9％，相较于nsPEFs单独作用组而言具有一定程度的提高。GNR-PEG-FA组的PI阳性比例随着电场强度增加从4.2％升高到了74.5％，较GNR-PEG组和nsPEFs单独作用组而言具有更高的PI阳性比例。除此之外，从图中可以发现GNR-PEG组的增强效果不稳定，在电场强度为2kV/cm、4kV/cm和5kV/cm时，GNR-PEG组与nsPEFs单独作用组相比不具有显著性差异(p>0.05)，而GNR-PEG-FA组则在除开2kV/cm这一情况之外，均与nsPEFs单独作用组具有显著性差异(*p<0.05)，尤其当电场强度增大到5kV/cm以上时，差异更为显著(**p<0.01)。因此，当电场强度增加至一定程度，GNR-PEG-FA的加入能够有效的提高细胞的PI阳性比例，明显增强了细胞电穿孔效应。
当改变脉冲宽度时，nsPEFs单独作用组、GNR-PEG组和GNR-PEG-FA组的PI阳性比例分别从100ns时的4.1％、5.2％和4.9％升高到500ns时的51.5％、66.3％和77.9％。任一实验所用的脉冲宽度下GNR-PEG-FA组均显示出较GNR-PEG组更强的A375细胞杀伤效果，且均与nsPEFs单独作用具有显著性差异(*p<0.05)。
当改变脉冲个数时，nsPEFs单独作用组、GNR-PEG组和GNR-PEG-FA组分别从15个脉冲时的3.9％、4.1％和3.8％升高至260个脉冲时的60.8％、69.3％和79.9％。任一实验所用的脉冲个数下GNR-PEG-FA组均显示出较GNR-PEG组更强的A375细胞杀伤效果，且均与nsPEFs单独作用具有显著性差异(*p<0.05)。
因此，基于上述实验结果可以发现，在相同的脉冲参数下，GNR-PEG-FA组具有更高的PI阳性细胞比例，初步证明了GNR-PEG-FA的加入能够明显提高细胞电穿孔效应。
本实施例以叶酸修饰后的金纳米棒(GNR-PEG-FA)、纳秒脉冲电场(nsPEFs)和A375黑色素瘤细胞为实例，从实验和仿真两个方面开展研究，共同验证了这一方法的可行性。实验结果表明，GNR-PEG-FA组的PI阳性细胞比例最高达到了79.9％，较非靶向金纳米棒组(GNR-PEG)和nsPEFs单独作用组的69.3％和60.8％分别提高了15.3％和31.4％，有效地提高了传统nsPEFs的电穿孔效率，从实验的角度验证了该方法的可行性。除此之外，通过单细胞有限元仿真表明，与nsPEFs单独作用组相比，GNR-PEG-FA的加入使得细胞膜所受场强上升了33％，内膜和外膜孔密度分别提高了75.7％和100％，孔通量提高了20％，揭示了GNR-PEG-FA增强细胞电穿孔的电学机制，为该方法提供了理论依据。
实施例4：
一种应用靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置的仿真实验，包括以下步骤：
1)金纳米棒和单细胞仿真模型的建立
1.1)几何模型的建立
如下图10所示，单细胞模型采用的是常用的五层介电模型，该模型常被用来研究脉冲电场对细胞外膜、核膜的电穿孔效应，其中细胞半径Rm为10μm，细胞核半径Rn为5μm，外膜厚度rm为5nm，核膜厚度rn为40nm。后续实验结果的横坐标均以图中正下方的红色基点为起始点(顺时针方向)。
由于在实验当中无法准确评估金纳米棒的实际位置，因此在几何模型的建立中，GNR-PEG-FA组与细胞发生紧密的结合，紧贴在细胞膜周围，而GNR-PEG则散乱的分布在细胞膜外侧，以此来定性的区分靶向金纳米棒和非靶向金纳米棒与细胞不同的位置关系。除此之外，金纳米棒与细胞、仿真空间的尺寸差距过大，因此为了保证仿真的准确性，提高仿真设备的利用率，只对图11中细胞模型的左侧圆圈区域附近添加了金纳米棒，且后续的仿真分析区域也是位于细胞的左半侧。
仿真几何模型如图12和图13所示，中间是球型单细胞模型，左右两侧为平板电极，电极间距为0.2mm(实验中BTX电击杯间距为2mm)，这是为了防止空间尺寸和仿真目标尺寸差距过大。如下图11中三个子图所示分别为nsPEFs单独作用、GNR-PEG和GNR-PEG-FA三种情况下的几何模型。首先通过Matlab的蒙特卡洛算法以及“random”函数来定义一根随机角度的金纳米棒，其尺寸调整为长度60nm，外径15nm，均与实验所用金纳米棒的尺寸保持一致。重复上述方法生成多根金纳米棒的几何模型，然后通过Comsol软件中的Boolean运算，将多根金纳米棒与Comsol软件中的单细胞模型联合，从而实现了金纳米棒和单细胞模型的建模。由于叶酸分子的尺寸远小于金纳米棒，因此在仿真模型中将GNR-PEG-FA紧紧贴近细胞膜，而GNR-PEG组则随机的分布在细胞膜外侧。
1.2)数学模型的建立
当细胞膜处于完整形态的情况下时，由于其外膜具有选择透过性，因此能够阻止许多大分子物质进入到细胞内部，起到了屏蔽与保护的作用。当一定强度的脉冲电场施加到细胞上时，细胞膜两端的电压(跨膜电压)由于电荷的聚集而快速上升。当跨膜电压上升到一定阈值时，会导致细胞膜发生穿孔，细胞膜的完整性被破坏，从而可能引起细胞死亡。根据电流守恒定律，当细胞处于电场当中时，细胞上任意一点的电位可以由下式(1)表示：
其中，ε0和εr分别为真空介电常数和细胞上某处的相对介电常数，σ为细胞上某处的电导率。因此，跨膜电位的大小则可以通过计算细胞膜外部和细胞外膜内部的电位之差来得到。
为了研究GNR-PEG-FA联合nsPEFs对细胞电穿孔效应的影响，本实施例采用经典的动态电穿孔模型来进行仿真，该模型能够动态的反映在脉冲电场作用期间细胞内外膜相关的电穿孔指标的变化，能够从时间上动态的体现孔密度、孔半径等相关参数的变化，更加准确的反映细胞电穿孔的发展过程，对电穿孔的机理研究具有重要意义。
孔半径能够反映出脉冲电场作用后的穿孔大小，而孔密度则可以体现出单位面积内孔数量的多少。因此孔半径越大，孔密度越高，则意味着脉冲电场对细胞膜完整性的破坏程度也就越高。
因此，为了直观的研究GNR-PEG-FA联合nsPEFs对细胞电穿孔效应的影响，本步骤主要针对孔密度以及孔半径两个电穿孔指标进行分析和讨论。
首先是孔密度，在一定强度的脉冲电场作用下，细胞膜上会产生亲水孔，从而导致了细胞膜电导率的上升，基于此理论，相关学者提出了孔密度的方程，如下式(3.2)所示：
其中N为孔密度，UEP为跨膜电压阈值，q为穿孔形成系数，N0为未发生电穿孔前的孔密度大小，α为常数。
在确定了孔密度的数学方程后，需要确定孔径的发展规律。目前得到了广泛认可的理论是认为孔半径的发展是随着孔能量的变化而变化的，而孔能量往往与膜表面的受力息息相关。当没有脉冲电场作用时，细胞膜表面的受力在整体上处于一种平衡状态，而一定强度的脉冲电场会打破这种平衡，导致了亲水孔的产生和发展，基于此理论，相关学者得到了孔径随时间变化的方程，如下式(3)所示：
其中rj为孔半径，D为孔径的发展系数，k为玻尔兹曼常数，δeff表示膜的有效张力系数，Vm为跨膜电压大小，Fmax为跨膜电压达到发生穿孔阈值时的电场力大小。
根据相关文献，其它具体相关的仿真参数值如下表2所示。
表2仿真模型中的具体参数值
Table 3.1Model parameters of simulation
续表2：
1.3)仿真脉冲波形及参数的设置
当电场强度为5kV/cm，脉冲宽度为300ns，脉冲个数为100个时，PI阳性细胞比例的水平均处于整个参数范围下的中间位置。且该脉冲参数作用下，GNR-PEG-FA组较nsPEFs单独作用组、GNR-PEG组均具有显著性差异(*p<0.05)，十分具有代表性。因此，本步骤选用该参数来仿真场强分布、孔密度以及孔半径，既能够避免参数水平过高或过低带来的特殊性，又能够很好的对比GNR-PEG-FA、GNR-PEG组和nsPEFs单独作用组之间不同的电穿孔效应。
如下图12所示，首先通过Comsol软件定义了一个脉冲宽度为300ns的方波脉冲，由于软件本身的限制，在该处定义的方波脉冲幅值默认只能为1。针对变化脉冲个数的情况，则需要在单个方波脉冲定义完成后，通过Comsol软件继续定义一个解析函数，在解析函数中将上述的单个方波脉冲函数转换为频率为1Hz的周期性方波脉冲函数U(t)，如下图13所示(为了更清晰的展示，图13只显示了10个方波脉冲)。随后，在电流模块中添加电势，将电势的所属域选择为图11中的平板电极，然后将电势大小设置为100倍的函数U(t)，单位为伏特(V)，从而完成了对电压幅值的调整。由于仿真中为了避免细胞和仿真空间过大的尺寸差异，因此电极的间距设置为0.2mm，所以当脉冲电压幅值为100V时，极板间的均匀电场强度为5kV/cm。
2)靶向金纳米棒增强细胞电穿孔效应的机理分析
2.1)靶向金纳米棒对细胞膜所受电场强度的影响
虽然金纳米棒在仿真中只在部分区域进行了添加，但是金纳米棒的加入对整体电导率的影响已经从实验参数的设置上进行了区分，因此电导率的影响实际上已经直接包含在了接下来的仿真当中，而场强的分布情况则与该区域是否存在金纳米棒有着重要关联，因此本步骤主要是针对电场强度大小进行仿真和分析。
电场仿真结果如下图14至图17所示，图14、15、16分别代表了nsPEFs单独作用组、GNR-PEG组和GNR-PEG-FA组三种情况的局部电场分布图，而图17为三种情况下细胞膜所受电场强度大小的曲线图。需要特别说明的是，图17是将细胞膜作为一个二维边，然后得到了细胞膜所受的场强大小，并不是与图14、15、16靠近细胞膜附近的场强对应，前三张图主要是为了展现出金纳米棒局部增强场强的效果图。
从仿真结果可以看出，金纳米棒尖端附近的场强得到了明显的提高，但是在远离金纳米棒的区域，则无法受到金纳米棒畸变电场的影响。该结果充分说明，只有当金纳米棒足够靠近细胞，才能够更有效的发挥出其增强电场的效果。通过计算可以得到该区域细胞膜所受电场强度的平均值，nsPEFs单独作用组约为5.78kV/cm，GNR-PEG组约为6.01kV/cm，GNR-PEG-FA组约为7.58kV/cm。GNR-PEG-FA的加入能够使得细胞膜所受场强较nsPEFs单独作用组上升了约33％，而没有与细胞靶向结合的GNR-PEG组，膜上电场强度大小仅仅提高了约4％。因此，通过电场仿真结果进一步验证了对金纳米棒进行靶向修饰的正确性和必要性。
2.2)靶向金纳米棒对细胞电穿孔特性的影响
上一步骤通过电场强度的仿真，验证了GNR-PEG-FA能够更有效的提高细胞膜所受的电场强度大小。为了进一步探究GNR-PEG-FA的加入对电穿孔特性的影响规律，本步骤将分别对孔密度和孔半径进行仿真，为后续孔通量与细胞实验的对比和分析奠定基础。
图18、19为细胞内外膜孔密度的仿真结果图。从图18中可以观察到GNR-PEG-FA组的外膜孔密度明显高于GNR-PEG组和nsPEFs单独作用组，其中GNR-PEG-FA组中的最大的孔密度达到了约13×1016m-2，高于GNR-PEG组8×1016m-2的和nsPEFs单独作用组的7.4×1016m-2，分别提高了60.4％和75.7％。除此之外，GNR-PEG-FA组的曲线的顶部出现了局部明显的震荡，这主要是受到了金纳米棒的影响。由公式2可知孔密度与场强大小所影响的电位差具有密切的关系，同时结合图17的电场仿真结果也可以发现，正是该区域场强的不均匀变化，从而导致了该区域孔密度的振荡。而GNR-PEG组由于离细胞具有一定的距离，因此其顶部的振荡很小，而nsPEFs单独作用组则几乎看不到振荡。
对比图19内膜孔密度结果图可以看到，GNR-PEG-FA组的内膜孔密度均明显高于其余两组，其中GNR-PEG-FA组的最大值达到了7.4×1017m-2，而GNR-PEG组和nsPEFs单独作用组分别只有4.7×1017m-2和3.7×1017m-2，分别提高了57.4％和100％。由此可见，由于金纳米棒具有高电导率和畸变电场的特性，在相同的脉冲参数下能够造成细胞内外膜产生更高的孔密度，明显提高了nsPEFs对细胞的电穿孔效应。
如下图20、21所示为细胞内外膜孔径的分布图。外膜孔半径结果表明GNR-PEG-FA在局部区域能够明显的造成孔半径的提高，且GNR-PEG-FA组造成的外膜孔半径整体来说均大于其余两组的仿真结果。
同样类似的规律也出现在了图21的内膜孔半径实验结果，GNR-PEG-FA组的内膜孔半径要高于其余两组。因此，GNR-PEG-FA能够诱导细胞产生半径相对更大的孔，增强了细胞的电穿孔效应。
脉冲电场影响细胞发生电穿孔最重要的因素之一就是电场强度，因此首先对细胞膜承受的电场强度进行仿真与分析。由于金纳米棒具有独特的棒状结构，具有“避雷针效应”，因此会在其尖端产生的局部电场强度增强效应，如下式所示：
式中，Etip、E0分别为金纳米棒尖端电场强度和外加均匀电场强度；L、D分别为金纳米棒的长度和外径；α为常数。
事实上，除了场强的影响因素之外，金纳米棒的高电导率特性也对电穿孔效应的增强具有重要意义。由于膜可以等效成一个电容，其充电时间常数为：
其中rc为细胞直径；Cm为膜表面电容；S0为膜表面电导率；σi和σm分别为膜内部和膜外部的电导率。
由式(3.5)可知，细胞外部电导率的升高会降低细胞膜的充电时间常数，因此同一个脉冲参数的作用下，周围环境中含有金纳米棒的细胞则能够在更短的时间内达到发生电穿孔所需的跨膜电压阈值，减少了电穿孔形成的时间，延长了脉冲作用期间穿孔发展的时间，进而引起了更强的细胞电穿孔效应。
综上所述，靶向修饰后的金纳米棒能够更加高效的发挥其“避雷针效应”以及高电导率的特性，提高了细胞膜所受的电场强度大小，降低了细胞膜充电时间常数，从而有效的增强了细胞电穿孔效应。
Claims (6)
1.一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，其特征在于，包括纳秒脉冲发生器和所述纳米电极。
所述纳秒脉冲发生器和纳米电极信号线连接；
所述纳秒脉冲发生器向目标细胞和纳米电极发送激励脉冲；
所述纳米电极与目标细胞相接触或延伸入目标细胞；
当纳米电极接收到激励脉冲后，对激励脉冲电场强度进行增强，并向目标细胞发送增强后的激励脉冲信号，增强目标细胞电穿孔效应；
所述纳米电极为若干高导电纳米粒子；每个高导电纳米粒子表面具有目标细胞的靶向配体；
所述目标细胞接收到激励脉冲和增强后的激励脉冲信号后，发生穿孔。
2.根据权利要求1或2所述的一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，其特征在于：所述纳秒脉冲发生器包括高压直流电源、储能电容、FPGA模块和MOSFET开关组；
所述高压直流电源对储能电容充电；
所述储能电容通过MOSFET开关组向纳米电极发送激励脉冲；
所述FPGA模块控制MOSFET开关组的通断，进而控制激励脉冲的持续时间和个数。
3.根据权利要求1所述的一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，其特征在于：所述高导电纳米粒子为金纳米棒。
4.根据权利要求1所述的一种靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置，其特征在于：所述脉冲为方波脉冲。
5.一种使用权利要求1至4中任一项所述靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)确定目标细胞的类型，并获取目标细胞的靶向配体；
2)建立靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔装置；
3)将表面具有目标细胞靶向配体的纳米电极与目标细胞接触或将纳米电极延伸入目标细胞；
4)预设脉冲参数；
5)高压直流电源对储能电容充电；
6)充电结束后，FPGA模块基于预设的脉冲参数控制MOSFET开关组的通断以实现脉冲的输出；
7)发生器输出的脉冲流经纳米电极，实现脉冲增强；增强后的脉冲通过纳米电极中每个高导电纳米粒子的尖端释放，实现对目标细胞的穿孔。
6.根据权利要求5所述的一种使用靶向修饰的高导电纳米颗粒增强细胞电穿孔的方法，其特征在于：所述高导电纳米粒子尖端电场强度Etip如下所示：
式中，Etip、E0分别为高导电纳米粒子尖端电场强度和外加均匀电场强度；L、D分别为高导电纳米粒子的长度和外径；α为常数。
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