KR101962636B1 - Method and primer set for selecting cylindrocarpon destructans - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인실리코 AFLP방법을 통한 실린드로카폰 데스트럭탄스의 프라이머 선별 방법으로, 실린드로카폰 데스트럭탄스의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 인삼재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;를 포함한다.The present invention relates to a primer selection method for a Cylindrocone Desktor tansu through a silico carbon atom transfer chromatography (AFLP) method, comprising the steps of: dividing a whole genome sequence of a Cylindrocone desatto tans into contigs; Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing the homology of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of ginseng cultivars through BLAST in NCBI and Broadinstitute; And designing a primer based on the base sequence capable of specific detection through the BLAST process.
Description
본 발명은 실린드로카폰 데스트럭탄스균을 선별하기 위한 프라이머 선별방법 및 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 인실리코 AFLP방법에 의한 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 선별방법, 이를 통하여 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. The present invention relates to a primer selection method and a primer set for screening a Cylindrocodystrophotus tansum, and more particularly, to a primer selection method for detecting a Cylindrical carpet desorption tans by a phosphorylated AFLP method, 1 > to 4 < [chi] >.
종래 프라이머 설계 방법은 이미 기능을 알고 있는 유전자를 선별하여 기능적 차이에 중점을 두고 프라이머를 설계하는 방식을 택하고 있다. 이러한 방법은 해당 기능을 가지고 있는 생물과 가지지 않는 생물의 유전적 차이를 기반으로 한다. 그러나, 유전자의 발현레벨과 종의 특성에 따라 같은 종임에도 불구하고 유전적 차이를 보일 수 있어 프라이머 설계에 있어 제한되는 부분이 발생된다. In the conventional primer designing method, a method of designing a primer by focusing on functional differences by selecting a gene that already knows a function is adopted. This method is based on genetic differences between organisms with and without corresponding functions. However, depending on the level of expression of the gene and the characteristics of the species, genetic differences may be seen despite the same species, resulting in a limited portion of the primer design.
기능이 알려져 있지 않은 유전자는 프라이머 설계에 사용하지 못하므로, 프라이머 설계는 특정 기능을 가진 유전자 서열정보에 의존적인 면이 있다. 각각의 생물에 대하여 모든 유전자의 기능이 밝혀져 있지 않으므로, 기존의 프라이머 설계방법을 사용하기 위해서는 유전자의 기능을 밝히는 과정이 선행되어야 할 것이지만, 각 생물의 유전자 고유 기능을 모두 밝히는 작업은 사실상 불가능한 것으로 볼 수 있으므로 프라이머를 개발하기 위하여 사용할 수 있는 정보는 제한적일 수 있다. Because genes whose function is not known can not be used for primer design, primer design is dependent on gene sequence information with specific functions. Since the functions of all genes are not known for each organism, it is necessary to precede the process of revealing the functions of genes in order to use the existing primer designing method. However, it is practically impossible to identify all the gene specific functions of each organism The information available to develop the primer may be limited.
같은 기능을 하는 유전자라도 염기서열에 차이가 있고 같은 종내에서도 염기서열의 차이를 보이기 때문에 프라이머의 정확성 확인을 위하여 반복실험이 필요할 수 있다. 뿐만 아니라 프라이머를 개발하기 위한 일련의 과정으로 DNA를 추출하여 PCR방법을 통한 전기영동 확인법이 반복적으로 실시됨에 따라 시간, 노력 및 비용이 크게 소요될 수 있다. Repeated experiments may be necessary to confirm the accuracy of the primers, because even the same functioning genes have different nucleotide sequences and show different nucleotide sequences within the same species. In addition, since DNA is extracted as a series of steps for developing primers and the electrophoresis confirmation method using the PCR method is repeatedly performed, time, effort, and cost can be considerably increased.
AFLP(amplified fragment length polymorphism)기술은 genomic DNA를 제한효소를 이용하여 여러 개의 단편 염기서열로 절단하고 그 끝을 어댑터(adapter)로 표지한 후 어댑터의 표지에 반응하는 프라이머를 사용하여 생성되는 DNA절편의 증폭을 비교하여 생성되는 증폭산물의 다형성을 알아보는 방법으로서, RAPD(random amplified polymorphic DNA)방법에 비해 고감도의 PCR 산물을 얻을 수 있는 방법으로 잘 알려져 있다. 이 방법은 유전자 증폭산물 길이의 다형성을 이용하여 주로 유전적 계통발생학에서 유전적 변이를 검출하는데 사용되고 있는데, 범죄수사나 친자감별 등 작은 유전적 차이를 찾아내기 위하여 사용되는 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 기존의 AFLP방법을 수행하기 위해서는 전문적인 기술과 장기간의 시간이 소요될 뿐만 아니라 실험이 실패할 가능성이 있다.The amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique is a technique in which genomic DNA is cut into several fragmentary sequences using restriction enzymes, the ends are labeled with an adapter, and DNA fragments generated using a primer reactive to the label of the adapter Is a method for detecting the polymorphism of the amplification products generated by comparing the amplification products of the RAPD (random amplified polymorphic DNA) method. This method is mainly used to detect genetic variation in genetic phylogenetics by using the polymorphism of gene amplification product length and can be used as a method to detect small genetic differences such as crime investigation or paternity discrimination. However, in order to perform the conventional AFLP method, it takes long time and requires specialized technology, and the experiment may fail.
셀 수 없이 많은 균이 존재하는 토양환경의 특수성을 고려하면, 전문적인 기술과 장기간의 시간이 소요될 뿐만 아니라 실험이 실패할 가능성이 있는 기존의 AFLP방법은 토양병원균의 검출을 위한 프라이머 설계에 사용하기에 적합하지 않다.Considering the peculiarities of the soil environment in which countless bacteria are present, the existing AFLP method, which not only requires expertise and takes a long time but also fails the experiment, is used for primer design for soil pathogen detection .
인실리코(In silico) AFLP(amplified fragment length polymorphism)는 이러한 AFLP의 단점을 보완하기 위하여 분석하고자 하는 생물의 전체 게놈 시퀀스 (Whole Genome Sequence)를 이용하여 컴퓨터 프로그램으로 결과를 예측하여 실시하는 방법을 말한다. 그러나, 인실리코 AFLP는 AFLP과정을 수행하기 이전에 결과를 미리 예상해보는 단계에 사용되는데 그칠 뿐이며 범죄수사나 친자감별 등 작은 유전적 차이를 발견하기 위하여 AFLP 방법 자체를 대체하여 사용되기 곤란하다. 인실리코 AFLP는 정확성 보다는 속도에 중점을 두는 방식으로 컴퓨터의 분석에 의한 신속한 결과 제시를 위한 방법에 해당하기 때문이다.In silico amplified fragment length polymorphism (AFLP) is a method of predicting and executing the results using a computer program using the entire genome sequence of the organism to be analyzed in order to overcome the shortcomings of AFLP . However, insylco AFLP is only used to predict the outcome before AFLP process, and it is difficult to substitute AFLP method itself for detecting genetic differences such as crime investigation or paternity discrimination. In Silico AFLP is a method for presenting rapid results by computer analysis in a way that focuses on speed rather than accuracy.
한편, 인삼은 농가의 대표적 고소득 약용작물로서 농가의 주요 수입원이 되고 있다. 인삼의 재배기간은 대략 4~6년의 장시간이 소요된다. 인삼 재배 시 가장 문제되는 점은 역시 뿌리에 발생하는 썩음병이다. 오랜 시간 재배되는 특성으로 인하여, 한번 피해가 발생하게 되면 농가에 큰 피해를 입힐 수 있으므로 문제가 심각하다. On the other hand, ginseng is a representative high-income medicinal crop of farm households and is becoming a major source of income for farm households. The cultivation period of ginseng is about 4-6 years long. The most problematic aspect of ginseng cultivation is the rotting disease in the root. Due to the characteristics of being cultivated for a long time, once the damage occurs, the problem is serious because it can cause great damage to the farmhouse.
포장에서 인삼의 뿌리썩음병을 일으키는 곰팡이균은 다양하다. 그 중에서도 특히 문제가 되는 것은 실린드로카폰 데스트럭탄스이다. 실린드로카폰 데스트럭탄스 곰팡이는 인삼뿌리썩음병을 일으키는 주 병원균으로서 인삼 뿌리의 끝 또는 중간부분에서 적갈색이나 흑갈색 병반을 형성하여 세근의 손실과 부패를 야기하고 묘삼에서부터 6년생근까지 모든 년생에서 발생하여 인삼농가에 지속적인 경제적 손실을 야기해왔다. 뿐만 아니라 실린드로카폰 데스트럭탄스는 후막포자를 형성하여 불리한 조건의 토양에서도 장기간의 생존이 가능하므로, 답전 윤환의 재배법이나 또는 토양훈증제 처리에 의하더라도 근본적인 방제가 어렵다. 이러한 특징에 따라 인삼의 연작장해를 유발하여 인삼 재배지역을 지속적으로 축소시켜 왔다. 이러한 인삼뿌리썩음병은 특히 고년생의 인삼에서 크게 발생하며 마땅한 치료제가 없어 폐농까지 유발하는 실정이다. 따라서, 실린드로카폰 데스트럭탄스가 발병하기 이전에 실린드로카폰 데스트럭탄스 균의 존재를 미리 확인할 필요성이 크다. There are many fungi that cause root rot of ginseng in packaging. Of particular concern is the Cylindrocone Desert Trucks. Cylindrocone death truck tans fungus is the main pathogen causing ginseng root rot disease. It forms reddish brown or black brown lesion at the end or middle part of ginseng roots and causes loss of fine roots and decay. It occurs in every year from seedling to 6 years old. Has caused continuous economic loss to ginseng farmers. In addition, Cylindrocapone desatta tans form thick-spore spores, so long-term survival is possible even in unfavorable soil conditions. Therefore, it is difficult to control the soil even if it is cultivated or treated with soil fumigation. According to these characteristics, the ginseng cultivation area has been continuously reduced by inducing disorder of ginseng. These ginseng root rot diseases are especially caused in high - birth - rate ginsengs, and there are no proper therapeutic agents to cause lung diseases. Therefore, there is a great need to confirm the presence of the Cylindrocone Desatta tanskrit before the Cylindrone Phone Truck Tans develops.
인삼 재배를 위하여 경작지를 선택하는 과정에 있어서 실린드로카폰 데스트럭탄스 균이 인삼재배에 피해를 줄 수 있는지 여부를 사전에 검증하는 과정이 선행될 수 있다면, 실린드로카폰 데스트럭탄스 균에 의한 농가 피해를 감소할 수 있을 것이다. If the process of selecting the cropland for the cultivation of ginseng can be preceded by a process of proving whether the Cylindrocarbon Desert Tracts can damage the ginseng cultivation, The damage can be reduced.
뿌리썩음병은 다양한 곰팡이에 의하여 발병할 수 있으므로, 사후적 대처를 위하여도 실린드로카폰 데스트럭탄스에 의한 것인지 빠르게 확인할 수 있는 방법이 필요한 실정이다. 이에 따라 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위하여 실린드로카폰 데스트럭탄스의 집단 분석연구뿐만 아니라 저항성 연구의 기반으로 병원균을 PCR(polymerase chain reaction) 단계에서 분리할 수 있는 실린드로카폰 데스트럭탄스 균주의 선택적 마커 개발이 시급하다. Root rot disease can be caused by various fungi. Therefore, it is necessary to quickly identify whether the root rot disease is due to the Cylindrocone desorption tangent for the posterior coping. In order to control the root rot disease of ginseng, it is necessary to study not only the group analysis of Cylindrocone desatta tans, but also the selective marker of Cylindrocodontus tans strains which can isolate the pathogens at the PCR (polymerase chain reaction) Development is urgent.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 인실리코 AFLP방법에 의한 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 선별방법, 상기 방법에 따라 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다. In order to solve the above technical problems, there is provided a primer selection method for detecting a cancer cell death truck tans by a silylcool AFLP method, a method for screening one or more silanes selected from two sets of primer sets selected from SEQ ID NOS: It is another object of the present invention to provide a primer set for detecting a dead car tow truck tangle.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to those mentioned above, and other objects not mentioned may be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 양상에 따른 인실리코 AFLP방법을 통한 실린드로카폰 데스트럭탄스의 프라이머 선별 방법은, 실린드로카폰 데스트럭탄스의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 인삼재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;를 포함한다. In order to solve the above-described problems, a primer selection method for a Cylindrocone desktor tansi using a silylic acid AFLP method according to an aspect of the present invention is characterized in that a whole genome sequence of a Cylindrocodontus tansanto contig); Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing the homology of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of ginseng cultivars through BLAST in NCBI and Broadinstitute; And designing a primer based on the base sequence capable of specific detection through the BLAST process.
한편, 상기 인삼재배지 서식균은 인삼뿌리 병징부위에 존재하는 병원균일 수 있다. On the other hand, the ginseng cultivated bacterium can be a hospital uniform present in the ginseng root symptom area.
한편, 상기 인삼재배지 서식균은 푸자리움 솔라니, 라이족토니아 솔라니, 스클레로티니아 스클레오티니움 및 실린드로카폰 데스트럭탄스 중 어느 하나를 포함할 수 있다. Meanwhile, the ginseng cultivated bacterium may include any one of Fusarium solanii, Raionionia solani, Sclerotinia schleitinium, and Cylindrocarpane trucktans.
한편, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 실린드로카폰 데스트럭탄스의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 인삼재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;에 의하여 선별된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로서, Meanwhile, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for identifying a cancer cell, comprising the steps of: dividing a whole genome sequence of a Cylindrical carpet desorption tank by contig; Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing the homology of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of ginseng cultivars through BLAST in NCBI and Broadinstitute; Designing a primer based on a base sequence that can be specifically detected through the BLAST process, and selecting as an oligonucleotide primer set selected by:
서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 제공될 수 있다. One or more oligonucleotides selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1 and oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2 A set of oligonucleotide primers comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NOs.
상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 실시예에 의하면, 인실리코 AFLP방법에 의한 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 선별방법 및 상기 방법에 의하여 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 실린드로카폰 데스트럭탄스 검출용 프라이머 세트가 제공될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, there is provided a primer selection method for detecting a carcass decontamination tangle by a Silicone AFLP method, and a method of selecting two pairs of primers selected from SEQ ID NOS: 1 to 4 A primer set for detecting at least one selected from among a primer set can be provided.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The effects of the present invention are not limited to those mentioned above, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명의 서열번호 1과 서열번호 2를 프라이머로 사용하여 인삼 배양지 서식균을 대상으로 중합효소연쇄반응 분석을 한 뒤 생성되는 605bp 크기를 가지는 증폭산물의 생성여부를 전기영동을 통해 비교한 사진이다 (M: 100bp 마커, C.D: 실린드로카폰 데스트럭탄스, F.S: 푸자리움 솔라니, S.S: 스클레로티니아 스클레로티오룸, R.S: 라이족토니아 솔라니)
도 2는 본 발명의 서열번호 3과 서열번호 4를 프라이머로 사용하여 인삼 배양지 서식균을 대상으로 중합효소연쇄반응 분석을 한 뒤 생성되는 455bp 크기를 가지는 증폭산물의 생성여부를 전기영동을 통해 비교한 사진이다 (M: 100bp 마커, C.D: 실린드로카폰 데스트럭탄스, F.S: 푸자리움 솔라니, S.S: 스클레로티니아 스클레로티오룸, R.S: 라이족토니아 솔라니)FIG. 1 is a graph showing the results of PCR amplification using a primer set forth in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the present invention to determine whether a 605 bp amplification product was produced by electrophoresis One photograph (M: 100bp marker, CD: Cylindrocone Desert Trucks, FS: Fusarium Solani, SS: Sclerotinia Sclerotio Room, RS: Raiotonia Solani)
FIG. 2 shows the results of PCR amplification of the ginseng culture bacterium using SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 of the present invention as a primer to determine whether a 455 bp amplification product was produced by electrophoresis One photograph (M: 100bp marker, CD: Cylindrocone Desert Trucks, FS: Fusarium Solani, SS: Sclerotinia Sclerotio Room, RS: Raiotonia Solani)
본 발명의 목적 및 효과, 그리고 그것들을 달성하기 위한 기술적 구성들은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기증을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The above and other objects, features and advantages of the present invention will be more apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings, in which: FIG. In the following description of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. Hereinafter, the terms are defined in consideration of donation in the present invention, which may vary depending on the intention of the user, the intention or the custom of the operator.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. However, the present invention is not limited to the embodiments described below, but may be embodied in various forms. These embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art to which the present invention pertains. Only. Therefore, the definition should be based on the contents throughout this specification.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 또는 "구비"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when an element is referred to as being "comprising" or "comprising" an element, it is understood that the element may include other elements, not the exclusion of any other element .
본 발명의 실시예에 따른 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the above object, according to an embodiment of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1, Wherein the oligonucleotide primer set comprises at least one oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of at least 15 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레?티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다. Also provided is an oligonucleotide comprising one or more oligonucleotides selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of at least 15 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 3 and fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: Oligonucleotide primer set comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of nucleotides.
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트에서, 상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성될 수 있고 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In the primer set according to an embodiment of the present invention, the oligonucleotide of the primer may be composed of 15 or more consecutive nucleotides, more preferably 16 or more, 17 or more, 18 or more, An oligonucleotide consisting of fragments of 19 or more and 20 or more consecutive nucleotides.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.In addition, the oligonucleotide may preferably be an oligonucleotide consisting of fragments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, or 20 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The oligonucleotide is also preferably an oligonucleotide comprising at least 16, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22 consecutive nucleotide fragments in the sequence of SEQ ID NO: 3 Lt; / RTI >
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The oligonucleotide is also preferably an oligonucleotide comprising at least 16, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22 consecutive nucleotide fragments in the sequence of SEQ ID NO: 4 Lt; / RTI >
본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 실린드로카폰 데스트럭탄스를 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다. An oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention comprises a set of oligonucleotide primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 and a set of oligonucleotide primers of SEQ ID NOS: 3 and 4, One or more oligonucleotide primer sets.
본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 실린드로카폰 데스트럭탄스 균을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이고 더욱 바람직하게는 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용할 수 있으나 이에 제한하지 않는다. An oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention comprises an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2, an oligonucleotide for selecting a Cylindrocodystrophy containing a set of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 Primer set, and more preferably two sets of primers can be used simultaneously, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트는 실린드로카폰 데스트럭탄스 균을 선별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 마커를 개발하기 위해, 먼저 인실리코 AFLP 방법을 이용하여 무작위로 실린드로카폰 데스트럭탄스의 염기서열을 지정하고 이를 인삼 배양지에 서식하는 다른 곰팡이 균의 염기서열과 비교하여 탐색하였다. 최종적으로 이러한 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하고, 이를 인삼 배양지 서식균에서 분리 분석함으로써 실린드로카폰 데스트럭탄스 구별 분자표지인 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 선발하였다.The primer set according to one embodiment of the present invention is used as a marker for selecting the Cylindrocone desatta strains. In order to develop the markers, the nucleotide sequence of a randomly selected carcass decontamination tans was determined by using the silylcool AFLP method and compared with the nucleotide sequence of other fungi in the ginseng culture. Finally, a primer was designed using these nucleotide sequences, and the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4, which is a distinguishable marker of Cylindrocone desatta tansa, was selected by separating and analyzing the primers in the ginseng culture medium.
본 발명에서 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans) 염기서열을 분석한 자료에서 4개의 프라이머를 제작하여 S. sclerotiorum, F. solani, B. cinerea, R. solani를 중합효소 연쇄반응 한 결과, 각각의 균들의 중합효소연쇄반응의 산물과 다른 결과가 형성되는 것을 확인한 바, 실린드로카폰 데스트럭탄스 구별 프라이머로써 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 PCR 구별방법은 실린드로카폰 데스트럭탄스 구별 또는 실린드로카폰 데스트럭탄스 균의 선별용 분자마커로 유용하게 이용될 수 있다. In the present invention, four primers were prepared from the analysis of the base sequence of Cylindrocarpon destructans, and PCR was performed with S. sclerotiorum, F. solani, B. cinerea, and R. solani. And the results were different from those of the products of the polymerase chain reaction of the microorganisms of the present invention. Therefore, the PCR discrimination method using the primer according to the present invention can be usefully used as a molecular marker for the screening of the cellulosic dextrorotans or for the screening of the cellulolytic dextrotoxin.
본 발명의 방법에 있어서, 실린드로카폰 데스트럭탄스 시료에서 유전자를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 유전자를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 유전자를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction)을 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, 중합효소연쇄반응이란 중합효소를 이용하여 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 원하는 유전자를 증폭하는 방법이다. 이러한 중합효소연쇄반응 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용 할 수도 있다. In the method of the present invention, the step of isolating the gene from the sample of the Cylindrocone desktor tans includes the step of isolating the gene. A method known in the art can be used as a method of isolating the genomic gene from the sample. The target sequence may be amplified by performing amplification reaction using the separated genomic gene as a template and using one or more oligonucleotide primer sets according to one embodiment of the present invention as a primer. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), amplification through a ligase chain reaction, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, the polymerase chain reaction is a method of amplifying a desired gene from a pair of primers that specifically bind to a target gene using a polymerase. Such polymerase chain reaction methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있다. In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material may be a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 방사성 측정, 형과 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 겔 전기영동을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The method of the present invention comprises detecting said amplification product. The detection of the amplification product can be carried out through radioactive measurement, type and measurement or phosphorescence measurement, and more preferably, gel electrophoresis can be used, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 인삼 재배지 서식균에 대해 실린드로카폰 데스트럭탄스 균을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 유전자 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA polymerase, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. Also provided is a kit for screening a ginseng cultivated bacterium comprising a set of one or more oligonucleotide primers according to the present invention and a reagent for carrying out an amplification reaction. In the kit of the present invention, the reagent for performing the gene amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffer, and the like.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실험에 사용된 곰팡이 확보 및 배양Securing the fungi used in the experiment and culturing
C. destructans 특이 프라이머 개발을 위한 F. solani, R. solani, S. sclerotiorum은 국립농업유전자원센터(http://www.genebank.go.kr/)로부터 분양 받아 사용하였다. C. destructans 균주는 국내 인삼재배지에서 분리한 균을 농촌진흥청 국립원예특작과학원(http://www.nihhs.go.kr/;인삼특작부)으로부터 분양받아 사용하였다. 분양 받은 곰팡이의 배양은 potato sucrose agar(Water 1 l; potato 200 g, sucrose 20 g, agar 15 g)에 계대하여 25 배양기에서 3~5일간 배양하였다. F. solani , R. solani and S. sclerotiorum for the development of C. destructans specific primers were purchased from the National Center for Agricultural Genetic Resources (http://www.genebank.go.kr/). C. destructans isolates were isolated from Korean ginseng cultivation area and purchased from the National Institute of Horticultural Science ( http://www.nihhs.go.kr/ ). Cultures were cultivated in potato sucrose agar (Water 1 l; potato 200 g, sucrose 20 g, agar 15 g) for 3-5 days in 25 incubator.
곰팡이 게놈 DNA 추출Fungal genomic DNA extraction
PDA배지에서 자란 균사를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 가로(1㎝) × 세로(1㎝) 크기로 절단한 다음 1.5㎖ tube에 넣고 400 ㎕ Extraction buffer(100 mM Tris-HCl(pH8.0), 10 mM EDTA(pH8.0), 1 M KCl)을 첨가한 후 homogenizer를 이용하여 균사를 갈아준다. Phenol:chloroform:isoamyl alcohol(25:24:1) 혼합용액 400 ㎕를 첨가하고 vortex를 이용하여 5분간 섞어준다. 혼합된 균사용액을 원심분리기를 통하여 10분간 12,000rpm으로 원심분리한 후 상층액을 추출하여 새로운 1.5 ㎖ tube에 넣고 300 ㎕ 2-propanol를 혼합한 뒤 inverting하여 3분간 상온에서 반응시킨다. 그다음 5분간 12,000rpm으로 원심분리 시킨 후 pellet을 제외한 상등액을 버리고 70% ethanol 300 ㎕을 첨가한 후 5분간 12,000rpm으로 세척한다. 세척이 끝난 70% EtOH를 버린 후 남은 1.5 ㎖ tube는 상온에서 15분간 건조시킨 후 TE buffer(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA(pH 8.0)) 50 ㎕를 첨가하여 DNA를 녹인 후 4에서 보관하여 사용하였다.The hyphae grown on the PDA medium were cut into a size of 1 cm × 1 cm using a sterilized toothpick, and then placed in a 1.5 ml tube and washed with 400 μl of extraction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 1 M KCl), and then homogenize the mycelium using a homogenizer. Add 400 μl of Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) solution and mix for 5 minutes using vortex. Mixed mycelial solution is centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes through a centrifuge, and then the supernatant is extracted and placed in a new 1.5 ml tube. 300 μl of 2-propanol is added to the mixture, and the mixture is inverted for 3 minutes at room temperature. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 minutes, discard the supernatant except pellet, add 300 μl of 70% ethanol, and wash at 12,000 rpm for 5 minutes. After removing the washed 70% EtOH, the remaining 1.5 ml tube was dried at room temperature for 15 minutes, and then 50 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA And stored at 4 ° C.
In silicoIn silico AFLP를 AFLP 이용한 Used 프라이머primer 제작 making
In silico AFLP를 수행하기 위하여 http://insilico.ehu.es/AFLP/에서 제공되는 프로그램을 사용하였으며 곰팡이 염기서열 분석환경에 적합하도록 C. destructans WGS를 contig에 따라 4,5Mb 이하로 편집한 데이터를 업로드 하여 분석을 실시하였다. In silico AFLP에 사용된 제한효소는 BamH, EcoR, Mbo, Nde 를 사용하였으며 In silico AFLP를 이용하여 가상의 결과를 도출하고 이 중 증폭되는 산물의 크기가 300 bp 이상 800 bp 이하의 크기를 가지는 염기서열을 따로 선별하였다. 선별된 염기서열들은 NCBI Genbank database(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 통하여 상동성이 있는 염기서열을 검색하고 C. destructans 이외의 비교대상 곰팡이에서 증폭이 될 가능성이 있는 염기서열들을 1차적으로 배제 시켰다. 선별된 염기서열들은 제한효소 사이트를 포함하는 크기 15 ~ 25 bp의 프라이머를 지정하고 DNA의 풀림 온도를 50 ~ 63이 되도록 프라이머를 디자인하였다. In silico AFLP was performed using the program provided at http://insilico.ehu.es/AFLP/ and the C. destructans WGS was edited to less than 4,5 Mb according to the contig to fit the fungal sequence analysis environment Were uploaded and analyzed. In Silico AFLP, BamH, EcoR, Mbo, and Nde were used as restriction enzymes. In silico AFLP, the resultant product was amplified to a size of 300 bp to 800 bp Sequences were screened separately. The selected nucleotide sequences are searched in NCBI Genbank database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) for homologous base sequences through BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) and C. destructans Primers that could be amplified in other fungi were excluded primarily. The selected primers were designed so that a primer of 15-25 bp in size containing a restriction enzyme site was designated and a annealing temperature of the DNA was 50-63.
종 특이 Species specific 프라이머를Primer 이용한 중합효소 연쇄반응 확인 Confirmation of the use of polymerase chain reaction
In silico AFLP를 통해 디자인된 프라이머들은 MACROGEN사를 통하여 합성하고 최적의 중합효소 연쇄반응 온도를 맞추고 중합효소 연쇄반응을 실시하였다(O’Donnell, 1998). 중합효소 연쇄반응은 DNA 1㎕, forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕와 Ex taq(Takara) 0.25 ㎕, 10X Ex Taq Buffer(Takara) 5 ㎕, dNTP Mixture(Takara) 4 ㎕ 를 사용하여 총 부피 50 ㎕로 맞춘 후 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 증폭산물 생성의 결과는 0.8% agarose gel에 75V, 45분동안 전기영동하여 확인하였다.Primers designed with In silico AFLP were synthesized by MACROGEN and optimized polymerase chain reaction temperature and polymerase chain reaction (O'Donnell, 1998). Polymerase chain reaction DNA 1㎕, forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕ and Ex taq (Takara) 0.25 ㎕, 10X Ex Taq Buffer (Takara) 5 ㎕, dNTP Mixture (Takara) total volume of 50 using a 4 ㎕ And then polymerase chain reaction was performed. The result of amplification product generation was confirmed by electrophoresis for 45 minutes at 75V on 0.8% agarose gel.
중합효소연쇄반응을Polymerase chain reaction 이용한 유전자 Gene used 증폭산물Amplification product 비교 compare
중합효소연쇄반응은 C1000 Thermal cycler(BIORAD, USA) 장비로 수행하였으며, 한 샘플당 Ex Taq(5 units/㎕)(TaKaRa, Japan) 0.25㎕, 10X Ex Taq buffer(TaKaRa, Japan) 5㎕, dNTP Mixture(TaKaRa, Japan) 4㎕를 첨가하였고, 프라이머 20pM 1㎕, gortks 100~500 ng에 멸균 증류수(sterilized distilled water)를 첨가하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 중합효소연쇄반응 온도는 94 2분 가열 후 92℃ 45초, 프라이머 최적온도 30초, 72 45초를 30번 반복한 후 72℃에서 2분 가열하여 4~12℃로 식힌 다음 증폭산물을 확인하였다 (표 2참조).The polymerase chain reaction was carried out using C1000 thermal cycler (BIORAD, USA). Each well contained 0.25 μl of Ex Taq (5 units / μl) (TaKaRa, Japan), 5 μl of 10X Ex Taq buffer (TaKaRa, Japan) Mixture (TaKaRa, Japan) was added, and 1 μl of primer 20 pM and 100-500 ng of gortks were added with sterilized distilled water to give a total volume of 50 μl. The PCR reaction temperature was 94 ° C for 2 min, followed by 92 ° C for 45 sec., Primer optimum temperature for 30 sec., And 72 sec. For 30 sec. After heating at 72 ° C for 2 min, the PCR product was cooled to 4 ~ 12 ° C. (See Table 2).
<실시예 1. 프라이머의 인삼 재배지 서식균에 대한 PCR 검사>≪ Example 1 > PCR test of primers for ginseng cultivated bacterium >
인삼 배양지 서식균주인 스클레오티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 푸자리움 솔라니(F. solani) 및 라이족토니아 솔라sl(R. solani) 곰팡이 균주의 중합효소연쇄반응 산물 증폭 결과는 도 1 및 도 2와 같다. The results of amplification of polymerase chain reaction products of Sclerotinia sclerotiorum, F. solani and R. solani fungus strains, which are ginseng culture host strains, 1 and 2.
서열번호 1번과 2번을 사용한 중합효소연쇄반응의 증폭 산물 결과에서 실린드로카폰 데스트럭탄스에서만 605bp 크기로 증폭 확인이 되었고 서열번호 3번과 4번을 사용한 중합효소연쇄반응의 증폭 산물 결과에서는 실린드로카폰 데스트럭탄스가 455bp 크기의 증폭산물을 생성하는 것을 확인할 수 있었다.Amplification products of the polymerase chain reaction using SEQ ID NOS: 1 and 2 were confirmed to amplify to 605 bp only in the Cylindrone dextrocanase, and amplification products of the polymerase chain reaction using SEQ ID NOS: 3 and 4 We could confirm that the Cylindrocone Desert Tans was generating a 455 bp amplification product.
denatureInitial
denature
extentionFinal
extention
3 min95 ° C /
3 min
45 sec94 ° C /
45 sec
30 sec58 ° C /
30 sec
45 sec72 ° C /
45 sec
5 min72 ° C /
5 min
3 min95 ° C /
3 min
45 sec94 ° C /
45 sec
30 sec57 ° C /
30 sec
45 sec72 ° C /
45 sec
5 min72 ° C /
5 min
본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It is not intended to limit the scope. It is to be understood by those skilled in the art that other modifications based on the technical idea of the present invention are possible in addition to the embodiments disclosed herein.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> METHOD AND PRIMER SET FOR SELECTING CYLINDROCARPON DESTRUCTANS <130> GP160019KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 gatcccctca gtggcccat 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 gaattcccca gctcggatac 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 gaattccgga tacaaagcgt tc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 gatcgacaag taccctgagc 20 <110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> METHOD AND PRIMER SET FOR SELECTING CYLINDROCARPON DESTRUCTANS <130> GP160019KR <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 gatcccctca gtggcccat 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 gaattcccca gctcggatac 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 gaattccgga tacaaagcgt tc 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 gatcgacaag taccctgagc 20
Claims (11)
An oligonucleotide primer set for the screening of Cylindrocodontus tontans comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide of SEQ ID NO:
A set of oligonucleotide primers for the selection of a Cylindrocodon tractant comprising an oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide of SEQ ID NO:
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제4항 또는 제5항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 유전자를 증폭하는 단계를 포함하는
실린드로카폰 데스트럭탄스의 선별을 위한 방법.
Isolating the genomic DNA from the sample of the Cylindrocone desaturation tans;
Amplifying the gene using the separated genomic DNA as a template and using the oligonucleotide primer set according to claim 4 or 5 as a primer
Method for selection of Cylindrocone Desert Truck Tans.
실린드로카폰 데스트럭탄스의 선별을 위한 방법.
7. The method of claim 6, further comprising detecting the amplification product
Method for selection of Cylindrocone Desert Truck Tans.
실린드로카폰 데스트럭탄스의 선별을 위한 방법.
8. The method of claim 7, wherein the detection of the amplification product is by fluorescent, phosphorescent or radioactive labeling
Method for selection of Cylindrocone Desert Truck Tans.
실린드로카폰 데스트럭탄스의 선별을 위한 방법.
8. The method of claim 7, wherein the detection of the amplification product is performed using gel electrophoresis, fluorescence measurement or phosphorescence measurement
Method for selection of Cylindrocone Desert Truck Tans.
실린드로카폰 데스트럭탄스를 구별하기 위한 키트.
Comprising a set of one or more oligonucleotide primers according to any one of claims 4 to 5 and a reagent for carrying out an amplification reaction
A kit for distinguishing Cylindrocone Death Truck Tans.
실린드로카폰 데스트럭탄스를 구별하기 위한 키트.11. The method according to claim 10, wherein the reagent for carrying out the amplification reaction comprises a DNA polymerase, dNTPs and a buffer
A kit for distinguishing Cylindrocone Death Truck Tans.
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| KR20210067781A (en) | 2019-11-29 | 2021-06-08 | 동아대학교 산학협력단 | Antibodies specific to Cylindrocarpon destructans and uses thereof |
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2016
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Patent Citations (2)
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| PLoS ONE, Vol.9, Issue 12, Article e114682, pp.1-18 (2014)* |
| 강윤희, 석사학위논문, 동아대학교 응용생명과학과 (2016.02.) |
Cited By (1)
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