KR101962669B1 - Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi - Google Patents
Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi Download PDFInfo
- Publication number
- KR101962669B1 KR101962669B1 KR1020160071326A KR20160071326A KR101962669B1 KR 101962669 B1 KR101962669 B1 KR 101962669B1 KR 1020160071326 A KR1020160071326 A KR 1020160071326A KR 20160071326 A KR20160071326 A KR 20160071326A KR 101962669 B1 KR101962669 B1 KR 101962669B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- fusarium
- primer
- complex
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 인실리코 AFLP방법을 통한 푸자리움 푸지쿠로이의 프라이머 선별 방법으로, 푸자리움 푸지쿠로이의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 벼 재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;를 포함한다.The present invention relates to a method for screening a primer of a fujarium fujicullo by means of a silylic acid AFLP method, comprising the steps of: dividing a whole genome sequence of a fujarium fujicullo by contig; Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing homologous sequences of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of rice plant propagation bacteria through BLAST in NCBI and Broadinstitute; And designing a primer based on the base sequence capable of specific detection through the BLAST process.
Description
본 발명은 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 선별방법 및 프라이머 세트에 관한 것으로, 구체적으로 인실리코 AFLP방법에 의한 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 검출용 프라이머 선별방법, 이를 통하여 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. The present invention relates to a primer selection method and a primer set for a fuzilium fujiklo species complex, and more particularly, to a primer selection method for detecting a fuzarium fujiklo species complex by a silico pigment AFLP method, And a primer set for detecting one or more complexes of fuzzy primer species selected from two sets of primers set to 1 to 4.
종래 프라이머 설계 방법은 이미 기능을 알고 있는 유전자를 선별하여 기능적 차이에 중점을 두고 프라이머를 설계하는 방식을 택하고 있다. 이러한 방법은 해당 기능을 가지고 있는 생물과 가지지 않는 생물의 유전적 차이를 기반으로 한다. 그러나, 유전자의 발현레벨과 종의 특성에 따라 같은 종임에도 불구하고 유전적 차이를 보일 수 있어 프라이머 설계에 있어 제한되는 부분이 발생된다. In the conventional primer designing method, a method of designing a primer by focusing on functional differences by selecting a gene that already knows a function is adopted. This method is based on genetic differences between organisms with and without corresponding functions. However, depending on the level of expression of the gene and the characteristics of the species, genetic differences may be seen despite the same species, resulting in a limited portion of the primer design.
기능이 알려져 있지 않은 유전자는 프라이머 설계에 사용하지 못하므로, 프라이머 설계는 특정 기능을 가진 유전자 서열정보에 의존적인 면이 있다. 각각의 생물에 대하여 모든 유전자의 기능이 밝혀져 있지 않으므로, 기존의 프라이머 설계방법을 사용하기 위해서는 유전자의 기능을 밝히는 과정이 선행되어야 할 것이지만, 각 생물의 유전자 고유 기능을 모두 밝히는 작업은 사실상 불가능한 것으로 볼 수 있으므로 프라이머를 개발하기 위하여 사용할 수 있는 정보는 제한적일 수 있다. Because genes whose function is not known can not be used for primer design, primer design is dependent on gene sequence information with specific functions. Since the functions of all genes are not known for each organism, it is necessary to precede the process of revealing the functions of genes in order to use the existing primer designing method. However, it is practically impossible to identify all the gene specific functions of each organism The information available to develop the primer may be limited.
같은 기능을 하는 유전자라도 염기서열에 차이가 있고 같은 종내에서도 염기서열의 차이를 보이기 때문에 프라이머의 정확성 확인을 위하여 반복실험이 필요할 수 있다. 뿐만 아니라 프라이머를 개발하기 위한 일련의 과정으로 DNA를 추출하여 PCR방법을 통한 전기영동 확인법이 반복적으로 실시됨에 따라 시간, 노력 및 비용이 크게 소요될 수 있다. Repeated experiments may be necessary to confirm the accuracy of the primers, because even the same functioning genes have different nucleotide sequences and show different nucleotide sequences within the same species. In addition, since DNA is extracted as a series of steps for developing primers and the electrophoresis confirmation method using the PCR method is repeatedly performed, time, effort, and cost can be considerably increased.
AFLP(amplified fragment length polymorphism)기술은 genomic DNA를 제한효소를 이용하여 여러 개의 단편 염기서열로 절단하고 그 끝을 어댑터(adapter)로 표지한 후 어댑터의 표지에 반응하는 프라이머를 사용하여 생성되는 DNA절편의 증폭을 비교하여 생성되는 증폭산물의 다형성을 알아보는 방법으로서, RAPD(random amplified polymorphic DNA)방법에 비해 고감도의 PCR 산물을 얻을 수 있는 방법으로 잘 알려져 있다. 이 방법은 유전자 증폭산물 길이의 다형성을 이용하여 주로 유전적 계통발생학에서 유전적 변이를 검출하는데 사용되고 있는데, 범죄수사나 친자감별 등 작은 유전적 차이를 찾아내기 위하여 사용되는 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 기존의 AFLP방법을 수행하기 위해서는 전문적인 기술과 장기간의 시간이 소요될 뿐만 아니라 실험이 실패할 가능성이 있다.The amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique is a technique in which genomic DNA is cut into several fragmentary sequences using restriction enzymes, the ends are labeled with an adapter, and DNA fragments generated using a primer reactive to the label of the adapter Is a method for detecting the polymorphism of the amplification products generated by comparing the amplification products of the RAPD (random amplified polymorphic DNA) method. This method is mainly used to detect genetic variation in genetic phylogenetics by using the polymorphism of gene amplification product length and can be used as a method to detect small genetic differences such as crime investigation or paternity discrimination. However, in order to perform the conventional AFLP method, it takes long time and requires specialized technology, and the experiment may fail.
셀 수 없이 많은 균이 존재하는 곰팡이균 환경의 특수성을 고려하면, 전문적인 기술과 장기간의 시간이 소요될 뿐만 아니라 실험이 실패할 가능성이 있는 기존의 AFLP방법은 특정 곰팡이균의 검출을 위한 프라이머 설계에 사용하기에 적합하지 않다.Considering the peculiarity of the fungus environment in which numerous bacteria exist, the conventional AFLP method, which may require not only professional technique and long time but also fail the experiment, is a primer design for detecting a specific fungus Not suitable for use.
인실리코(In silico) AFLP(amplified fragment length polymorphism)는 이러한 AFLP의 단점을 보완하기 위하여 분석하고자 하는 생물의 전체 게놈 시퀀스 (Whole Genome Sequence)를 이용하여 컴퓨터 프로그램으로 결과를 예측하여 실시하는 방법을 말한다. 그러나, 인실리코 AFLP는 AFLP과정을 수행하기 이전에 결과를 미리 예상해보는 단계에 사용되는데 그칠 뿐이며 범죄수사나 친자감별 등 작은 유전적 차이를 발견하기 위하여 AFLP 방법 자체를 대체하여 사용되기 곤란하다. 인실리코 AFLP는 정확성 보다는 속도에 중점을 두는 방식으로 컴퓨터의 분석에 의한 신속한 결과 제시를 위한 방법에 해당하기 때문이다.In silico amplified fragment length polymorphism (AFLP) is a method of predicting and executing the results using a computer program using the entire genome sequence of the organism to be analyzed in order to overcome the shortcomings of AFLP . However, insylco AFLP is only used to predict the outcome before AFLP process, and it is difficult to substitute AFLP method itself for detecting genetic differences such as crime investigation or paternity discrimination. In Silico AFLP is a method for presenting rapid results by computer analysis in a way that focuses on speed rather than accuracy.
한편, 자낭곰팡이의 하나인 푸자리움 푸지쿠로이(F.fujiguroi)는 화기감염을 통하여 종자에서부터 출수기에 거쳐 지베렐린을 과도하게 생성하도록 하여 벼를 웃자라게 만들고 이삭이 여물지 못하게 하는 등 벼에 치명적인 손상을 가하여 벼농사에 지속적인 경제적 손실을 야기해왔다. 키다리병은 1960년대에 일부 농 가에서 많이 발생한 보고가 있으나, prochloraz 등 종자소독제 사용으로 그동안 크게 문제시 되지 않았다(Park 등, 2003). 그러나 최근에는 벼 출수기의 기온상승, 친환경 벼 재배 확대, 기계 이앙에 따른 상자 육묘 등의 원인으로 키다리병 발생이 증가하고 있다 (Han, 2007; Kim 등 2008; Myung 등, 2005;). 특히 벼 키다리병은 2011년도에 들어 증가하기 시작하여 해마다 발병률이 증가하고 있는 추세이며, 이로 인한 경제적손실 또한 비례하여 증가하는 실정이다. 벼 키다리병 방제는 기본적으로 종자 소독 약제를 이용하여 벼 종자를 소독하는 것인데, benomyl, prochloraz 등의 종자소독 약제에 대한 저항성균 발생이 보고되고 있다(Lee 등 2010; Shin 등, 2008; Yamashita 등, 1995). 그럼에도 불구하고 병 발생에 따른 피해를 감소하기 위해서는 종자소독의 효과를 검정하고 키다리병 발생을 신속하게 진단하기 위한 푸자리움 푸지쿠로이 균주를 빠르게 확인할 수 있는 방법이 필요하다. 특히, 병원균을 PCR(polymerase chain reaction) 단계에서 분리할 수 있는 푸자리움 푸지쿠로이 균주의 선택적 마커 개발이 시급하다.On the other hand, F.fujiguroi , one of the fungus fungus, causes excessive production of gibberellin from seed to head through the fire infection, making the rice laughing, Have caused continuous economic loss to rice farming. However, the use of seed disinfectants such as prochloraz has not been a problem for many years (Park et al., 2003). In recent years, however, the incidence of Kidari disease has been increasing due to the rise in temperature of rice paddy fields, the growth of eco-friendly rice cultivars, and box planting due to mechanical transfer (Han, 2007; In particular, rice seedling disease started to increase in 2011, and the incidence rate is increasing year by year, and the economic loss is increasing proportionally. In this study, we investigated the effect of seed sterilizing agents on seedling disinfection by using the seed sterilization agent (Kim et al., 2010; Shin et al., 2008; Yamashita et al. 1995). Nevertheless, in order to reduce the damage caused by the disease, it is necessary to test the effect of seed disinfection and to quickly identify the strain of Fusarium pujiculoi for the rapid diagnosis of Kidder disease. In particular, it is urgent to develop selective markers for the P. fuziculi strain capable of isolating pathogens at the PCR (polymerase chain reaction) stage.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 인실리코 AFLP방법에 의한 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 선별방법 및 상기 방법에 따라 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다. In order to solve the above technical problems, there is provided a method for screening a primer for a fusarium fujiculosus complex complex by the silylcoccal AFLP method and a method for screening a primer using a primer set selected from two sets of primer sets selected from SEQ ID NOS: It is an object of the present invention to provide a primer set for the above-mentioned fuzarium fujiklo species complex.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The objects of the present invention are not limited to those mentioned above, and other objects not mentioned may be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 양상에 따른 인실리코 AFLP방법을 통한 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 선별 방법은, 푸자리움 푸지쿠로이의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 벼 재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;를 포함한다. In order to solve the above problems, a primer selection method for classifying a fusarium fujiklo species complex by a silico carbonyl complex method according to an aspect of the present invention comprises a step of introducing a whole genome sequence of fusarium fujicullo Dividing by contig; Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing homologous sequences of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of rice plant propagation bacteria through BLAST in NCBI and Broadinstitute; And designing a primer based on the base sequence capable of specific detection through the BLAST process.
한편, 상기 벼 재배지 서식균은 벼 병징부위에 존재하는 병원균일 수 있다. On the other hand, the rice cultivated bacterium can be a hospital uniform in the rice disease site.
한편, 상기 벼 재배지 서식균은 푸자리움 푸지쿠로이, 푸자리움 버티실리오이데스, 푸자리움 솔라니 및 푸자리움 옥시스포룸 중 어느 하나를 포함할 수 있다. On the other hand, the rice plant cultivar may include any one of fujarium fujiculoi, fujarium vermiculiides, fusarium solanis, and fusarium oxysporum.
한편, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 푸자리움 푸지쿠로이의 전체 게놈 시퀀스(Whole Genome Sequence)를 콘티그(contig)별로 나누는 단계; 인실리코 AFLP 프로그램에 업로드 가능하도록 상기 콘티그를 5MB 이하로 편집하는 단계; 상기 인실리코 AFLP 프로그램에 상기 편집된 콘티그를 업로드하는 단계; 상기 프로그램을 이용하여 증폭산물의 크기가 300 ~ 800bp로 예상되는 염기서열을 선별하는 단계; NCBI 및 Broadinstitute에서 BLAST를 통하여 벼 재배지 서식균으로 이루어진 실험군의 전체 게놈 시퀀스에 대해 상기 선별된 염기서열의 상동성을 비교하는 단계; 상기 BLAST과정을 통하여 특이적 검출이 가능한 염기서열을 토대로 프라이머를 디자인하는 단계;에 의하여 선별된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로서, Meanwhile, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for identifying a fungus, comprising the steps of: dividing a whole genome sequence of fusarium pujiculos by contig; Editing the contig to less than 5 MB so as to be uploadable to the Incilico AFLP program; Uploading the edited contig to the In silico AFLP program; Selecting a base sequence having an amplification product size of 300 to 800 bp using the program; Comparing homologous sequences of the selected nucleotide sequences to the entire genome sequence of an experimental group consisting of rice plant propagation bacteria through BLAST in NCBI and Broadinstitute; Designing a primer based on a base sequence that can be specifically detected through the BLAST process, and selecting as an oligonucleotide primer set selected by:
서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 제공될 수 있다. One or more oligonucleotides selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1 and oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2 A set of oligonucleotide primers comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of SEQ ID NOs.
상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 실시예에 의하면, 인실리코 AFLP방법에 의한 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 선별방법 및 상기 방법에 의하여 선별된 서열번호 1 내지 4로 표시된 2개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 프라이머 세트가 제공될 수 있다. According to an embodiment of the present invention for solving the above technical problems, there is provided a method for screening a primer for fuzarium fujiklo species complex according to the insylco-AFLP method and a method for screening two primers selected from SEQ ID NOs: 1 to 4 A set of primers for one or more of the fuarium fujiklo species complexes selected from the pair of primer sets may be provided.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The effects of the present invention are not limited to those mentioned above, and other effects not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
도 1은 본 발명의 서열번호 1과 서열번호 2를 프라이머로 사용하여 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체를 대상으로 중합효소연쇄반응 분석을 한 뒤 생성되는 733bp 크기를 가지는 증폭산물의 생성여부를 전기영동을 통해 비교한 사진이다 (M: 100bp 마커, 1-8, 28-30: 푸자리움 푸지쿠로이; 9-19: 푸자리움 버티실리오이데스; 20-27, 31,32: 푸자리움 프롤리페라툼; 33,34: 푸자리움 옥시스포룸; 35-36: 푸자리움 솔라니)
도 2는 본 발명의 서열번호 3과 서열번호 4를 프라이머로 사용하여 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체를 대상으로 중합효소연쇄반응 분석을 한 뒤 생성되는 311bp 크기를 가지는 증폭산물의 생성여부를 전기영동을 통해 비교한 사진이다 (M: 100bp 마커, 1-8, 28-30: 푸자리움 푸지쿠로이; 9-19: 푸자리움 버티실리오이데스; 20-27, 31,32: 푸자리움 프롤리페라툼; 33,34: 푸자리움 옥시스포룸; 35-36: 푸자리움 솔라니)FIG. 1 is a graph showing the results of a PCR reaction using a primer set of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the present invention and showing whether a 733 bp amplification product was produced by electrophoresis (M: 100 bp marker, 1-8, 28-30: Fusarium fujiculosi; 9-19: Fusarium bactisiliosides; 20-27, 31,32: Fusarium fulleriferase Tum; 33,34: Fusarium oxysporum; 35-36: Fusarium solani)
FIG. 2 is a graph showing the results of a PCR reaction using a primer of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 of the present invention and showing whether the amplification product having a size of 311 bp was produced by electrophoresis (M: 100 bp marker, 1-8, 28-30: Fusarium fujiculosi; 9-19: Fusarium bactisiliosides; 20-27, 31,32: Fusarium fulleriferase Tum; 33,34: Fusarium oxysporum; 35-36: Fusarium solani)
본 발명의 목적 및 효과, 그리고 그것들을 달성하기 위한 기술적 구성들은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기증을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The above and other objects, features and advantages of the present invention will be more apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings, in which: FIG. In the following description of the present invention, a detailed description of known functions and configurations incorporated herein will be omitted when it may make the subject matter of the present invention rather unclear. Hereinafter, the terms are defined in consideration of donation in the present invention, which may vary depending on the intention of the user, the intention or the custom of the operator.
그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. However, the present invention is not limited to the embodiments described below, but may be embodied in various forms. These embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art to which the present invention pertains. Only. Therefore, the definition should be based on the contents throughout this specification.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 또는 "구비"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when an element is referred to as being "comprising" or "comprising" an element, it is understood that the element may include other elements, not the exclusion of any other element .
본 발명의 실시예에 따른 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the above object, according to an embodiment of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1, Wherein the oligonucleotide primer set comprises at least one oligonucleotide selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of at least 15 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레?티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다. Also provided is an oligonucleotide comprising one or more oligonucleotides selected from the group consisting of oligonucleotides consisting of fragments of at least 15 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 3 and fragments of 15 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: Oligonucleotide primer set comprising at least one oligonucleotide selected from the group consisting of nucleotides.
본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트에서, 상기 프라이머의 올리고뉴클레오티드는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드로 구성될 수 있고 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. In the primer set according to an embodiment of the present invention, the oligonucleotide of the primer may be composed of 15 or more consecutive nucleotides, more preferably 16 or more, 17 or more, 18 or more, An oligonucleotide consisting of fragments of 19 or more and 20 or more consecutive nucleotides.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.In addition, the oligonucleotide may preferably be an oligonucleotide consisting of fragments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, or 20 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The oligonucleotide is also preferably an oligonucleotide comprising at least 16, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22 consecutive nucleotide fragments in the sequence of SEQ ID NO: 3 Lt; / RTI >
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The oligonucleotide is also preferably an oligonucleotide comprising at least 16, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22 consecutive nucleotide fragments in the sequence of SEQ ID NO: 4 Lt; / RTI >
본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다. An oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention comprises a set of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 and a set of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 One or more oligonucleotide primer sets.
본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체 구분을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이고 더욱 바람직하게는 2개의 프라이머 세트를 동시에 이용할 수 있으나 이에 제한하지 않는다. An oligonucleotide primer set according to an embodiment of the present invention comprises an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOS: 1 and 2, an oligonucleotide primer set of the oligonucleotide primer set of SEQ ID NOS: 3 and 4, And more preferably two sets of primers can be used simultaneously, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트는 푸자리움 푸지쿠로이 균을 선별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 마커를 개발하기 위해, 먼저 인실리코 AFLP 방법을 이용하여 무작위로 푸자리움 푸지쿠로이의 염기서열을 지정하고 이를 벼 재배지역에 서식하는 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체의 염기서열과 비교하여 탐색하고, 지베렐린 형성에 관여하는 GGS2 유전자 염기서열을 비교하여 탐색하였다. 최종적으로 이러한 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하고, 이를 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체로부터 분리 분석함으로써 푸자리움 푸지쿠로이 구별 분자표지인 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 선발하였다.The primer set according to one embodiment of the present invention is used as a marker for selecting Fusarium pujiculos. In order to develop the markers, the nucleotide sequence of fuzilium fuziculoi was randomly designated using the silylcool AFLP method, and the sequence was compared with the nucleotide sequence of the pucharum fujicuro species complex in the rice growing area , And GGS2 gene sequences involved in the formation of gibberellin. Finally, a primer set was designed using these base sequences, and a primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4, which is a distinguishable marker of fusarium puficula, was selected by separating and analyzing the primer from the fusarium pujiculos species complex.
본 발명에서 푸자리움 푸지쿠로이(Fusarium fujikuroi IMI 58289 draft genome) 염기서열을 분석한 자료에서 4개의 프라이머를 제작하여 F. Proliferatum, F. certicillioides , F. solani, F. graminearum을 중합효소 연쇄반응 한 결과, 각각의 균들의 중합효소연쇄반응의 산물과 다른 결과가 형성되는 것을 확인한 바, 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체부터 푸자리움 푸지쿠로이 구별 프라이머로써 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 PCR 구별방법은 푸자리움 푸지쿠로이 구별 또는 푸자리움 푸지쿠로이 균의 선별용 분자마커로 유용하게 이용될 수 있다. In the present invention, four primers were prepared from the Fusarium fujikurio IMI 58289 draft genome sequence data, and four primers were prepared and PCR was performed using F. proliferatum, F. certicillioides , F. solani, and F. graminearum As a result, it was confirmed that a result different from the product of the polymerase chain reaction of each bacterium was formed. As a result, it was confirmed that the bacterium was effective as a primer for distinguishing fucaria fucicloide from fucaria fucicloide complex. Therefore, the PCR discrimination method using the primer according to the present invention can be usefully used as a molecular marker for the selection of fusarium pujiculos or fusarium pujiculos.
본 발명의 방법에 있어서, 푸자리움 푸지쿠로이 시료에서 유전자를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 유전자를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 유전자를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction)을 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, 중합효소연쇄반응이란 중합효소를 이용하여 표적 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 원하는 유전자를 증폭하는 방법이다. 이러한 중합효소연쇄반응 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용 할 수도 있다. In the method of the present invention, a step of isolating the gene from the fusarium fucicloide sample is included. A method known in the art can be used as a method of isolating the genomic gene from the sample. The target sequence may be amplified by performing amplification reaction using the separated genomic gene as a template and using one or more oligonucleotide primer sets according to one embodiment of the present invention as a primer. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), amplification through a ligase chain reaction, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, the polymerase chain reaction is a method of amplifying a desired gene from a pair of primers that specifically bind to a target gene using a polymerase. Such polymerase chain reaction methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있다. In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material may be a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 방사성 측정, 형과 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 겔 전기영동을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The method of the present invention comprises detecting said amplification product. The detection of the amplification product can be carried out through radioactive measurement, type and measurement or phosphorescence measurement, and more preferably, gel electrophoresis can be used, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 벼 재배지 서식균에 대해 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체로부터 푸자리움 푸지쿠로이균을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 유전자 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA polymerase, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. Also provided is a kit for selecting pseudomonas sp. From a fungus species complex of rice plant cultivars comprising at least one oligonucleotide primer set according to the present invention and a reagent for carrying out an amplification reaction do. In the kit of the present invention, the reagent for performing the gene amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffer, and the like.
이하, 본 발명의 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실험에 사용된 곰팡이 확보 및 배양Securing the fungi used in the experiment and culturing
Fusarium fujikuroi의 염기서열과 상동성이 높으면서 벼 재배지역에서 쉽게 분리되는 F. fujikuroi, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani, F. oxysporum 총 5가지 균주를 사용하였다. F. fujikuroi 9균주, F. proliferatum 10균주, F. verticillioides 11균주, F. solani 2균주, F. oxysporum 2균주 총 36균주 중 F. fujikuroi를 제외한 나머지 균은 순천향대학교(http://homepage.sch.ac.kr/)로부터 분양받아 사용하였고 F. fujikuroi 균은 농촌진흥청 국립농업과학원(http://www.naas.go.kr/)으로부터 분양 받아 사용하였다. F. fujikuroi , F. proliferatum , F. verticillioides , F. solani , and F. oxysporum , which are highly homologous with the nucleotide sequence of Fusarium fujikuroi and easily separated from rice growing area, were used. F. fujikuroi 9, F. proliferatum 10, F. verticillioides 11, F. solani 2, and
곰팡이 게놈 DNA 추출Fungal genomic DNA extraction
PDA배지에서 자란 균사를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 가로(1㎝) × 세로(1㎝) 크기로 절단한 다음 1.5㎖ tube에 넣고 400 ㎕ Extraction buffer(100 mM Tris-HCl(pH8.0), 10 mM EDTA(pH8.0), 1 M KCl)을 첨가한 후 homogenizer를 이용하여 균사를 갈아준다. Phenol:chloroform:isoamyl alcohol(25:24:1) 혼합용액 400 ㎕를 첨가하고 vortex를 이용하여 5분간 섞어준다. 혼합된 균사용액을 원심분리기를 통하여 10분간 12,000rpm으로 원심분리한 후 상층액을 추출하여 새로운 1.5 ㎖ tube에 넣고 300 ㎕ 2-propanol를 혼합한 뒤 inverting하여 3분간 상온에서 반응시킨다. 그다음 5분간 12,000rpm으로 원심분리 시킨 후 pellet을 제외한 상등액을 버리고 70% ethanol 300 ㎕을 첨가한 후 5분간 12,000rpm으로 세척한다. 세척이 끝난 70% EtOH를 버린 후 남은 1.5 ㎖ tube는 상온에서 15분간 건조시킨 후 TE buffer(10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA(pH 8.0)) 50 ㎕를 첨가하여 DNA를 녹인 후 4에서 보관하여 사용하였다.The hyphae grown on the PDA medium were cut into a size of 1 cm × 1 cm using a sterilized toothpick, and then placed in a 1.5 ml tube and washed with 400 μl of extraction buffer (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 1 M KCl), and then homogenize the mycelium using a homogenizer. Add 400 μl of Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) solution and mix for 5 minutes using vortex. Mixed mycelial solution is centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes through a centrifuge, and then the supernatant is extracted and placed in a new 1.5 ml tube. 300 μl of 2-propanol is added to the mixture, and the mixture is inverted for 3 minutes at room temperature. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 minutes, discard the supernatant except pellet, add 300 μl of 70% ethanol, and wash at 12,000 rpm for 5 minutes. After removing the washed 70% EtOH, the remaining 1.5 ml tube was dried at room temperature for 15 minutes, and then 50 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA And stored at 4 ° C.
In silicoIn silico AFLP를 AFLP 이용한 Used 프라이머primer 제작 making
In silico AFLP를 수행하기 위하여 http://insilico.ehu.es/AFLP/에서 제공되는 프로그램을 사용하였으며 곰팡이 염기서열 분석환경에 적합하도록 F. fujikuroi WGS를 contig에 따라 4,5Mb 이하로 편집한 데이터를 업로드 하여 분석을 실시하였다. In silico AFLP에 사용된 제한효소는 BamH, EcoR, Mbo, Nde 를 사용하였으며 In silico AFLP를 이용하여 가상의 결과를 도출하고 이 중 증폭되는 산물의 크기가 300 bp 이상 800 bp 이하의 크기를 가지는 염기서열을 따로 선별하였다. 선별된 염기서열들은 NCBI Genbank database(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 통하여 상동성이 있는 염기서열을 검색하고 F. fujikuroi 이외의 비교대상 곰팡이에서 증폭이 될 가능성이 있는 염기서열들을 1차적으로 배제 시켰다. 선별된 염기서열들은 제한효소 사이트를 포함하는 크기 15 ~ 25 bp의 프라이머를 지정하고 DNA의 풀림 온도를 50 ~ 63이 되도록 프라이머를 디자인하였다. In silico AFLP was performed using the program provided by http://insilico.ehu.es/AFLP/ and the F. fujikuroi WGS was edited to less than 4,5 Mb according to the contig to be suitable for fungal sequencing analysis environment Were uploaded and analyzed. In Silico AFLP, BamH, EcoR, Mbo, and Nde were used as restriction enzymes. In silico AFLP, the resultant product was amplified to a size of 300 bp to 800 bp Sequences were screened separately. The selected nucleotide sequences were searched in the NCBI Genbank database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) for homologous base sequences through BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) and F. fujikuroi Primers that could be amplified in other fungi were excluded primarily. The selected primers were designed so that a primer of 15-25 bp in size containing a restriction enzyme site was designated and a annealing temperature of the DNA was 50-63.
종 특이 Species specific 프라이머를Primer 이용한 중합효소 연쇄반응 확인 Confirmation of the use of polymerase chain reaction
In silico AFLP를 통해 디자인된 프라이머들은 MACROGEN사를 통하여 합성하고 최적의 중합효소 연쇄반응 온도를 맞추고 중합효소 연쇄반응을 실시하였다(O’Donnell, 1998). 중합효소 연쇄반응은 DNA 1㎕, forward primer 1 ㎕, reverse primer 1 ㎕와 Ex taq(Takara) 0.25 ㎕, 10X Ex Taq Buffer(Takara) 5 ㎕, dNTP Mixture(Takara) 4 ㎕ 를 사용하여 총 부피 50 ㎕로 맞춘 후 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 증폭산물 생성의 결과는 0.8% agarose gel에 75V, 45분동안 전기영동하여 확인하였다.Primers designed with In silico AFLP were synthesized by MACROGEN and optimized polymerase chain reaction temperature and polymerase chain reaction (O'Donnell, 1998). PCR was performed using 1 μl of DNA, 1 μl of forward primer, 1 μl of reverse primer, 0.2 μl of Ex Taq (Takara), 5 μl of 10X Ex Taq Buffer (Takara) and 4 μl of dNTP Mixture (Takara) And then polymerase chain reaction was performed. The result of amplification product generation was confirmed by electrophoresis for 45 minutes at 75V on 0.8% agarose gel.
중합효소연쇄반응을Polymerase chain reaction 이용한 유전자 Gene used 증폭산물Amplification product 비교 compare
중합효소연쇄반응은 C1000 Thermal cycler(BIORAD, USA) 장비로 수행하였으며, 한 샘플당 Ex Taq(5 units/㎕)(TaKaRa, Japan) 0.25㎕, 10X Ex Taq buffer(TaKaRa, Japan) 5㎕, dNTP Mixture(TaKaRa, Japan) 4㎕를 첨가하였고, 프라이머 20pM 1㎕, gortks 100~500 ng에 멸균 증류수(sterilized distilled water)를 첨가하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 중합효소연쇄반응 온도는 94 2분 가열 후 92℃ 45초, 프라이머 최적온도 30초, 72 45초를 30번 반복한 후 72℃에서 2분 가열하여 4~12℃로 식힌 다음 증폭산물을 확인하였다 (표 2참조).The polymerase chain reaction was carried out using C1000 thermal cycler (BIORAD, USA). Each well contained 0.25 μl of Ex Taq (5 units / μl) (TaKaRa, Japan), 5 μl of 10X Ex Taq buffer (TaKaRa, Japan) Mixture (TaKaRa, Japan) was added, and 1 μl of
<실시예 1. 프라이머의 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체에 대한 PCR 검사>≪ Example 1: PCR test for primer fumarate fucicloide complex >
푸자리움 속 균주인 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum) 및 푸자리움 옥시스포룸(F. oxysporum), 푸자리움 솔라니(F. solani), 푸자리움 푸지쿠로이 종복합체인 푸자리움 버티실리오이데스(F. verticillioides), 푸자리움 프롤리페라툼(F. proliferatum), 푸자리움 푸지쿠로이(F. fujikuroi) 곰팡이 균주의 중합효소연쇄반응 산물 증?i 결과는 도 1 및 도 2와 같다. Fusarium graminearum and F. oxysporum , F. solani, Fusarium fujiculosum species complex, Fusarium species, such as Fusarium graminearum, Fusarium graminearum, Fusarium graminearum and F. oxysporum , Fusarium solani, The results of the PCR for the products of F. verticillioides, F. proliferatum and F. fujikuroi fungi are shown in FIGS. 1 and 2.
서열번호 1번과 2번을 사용한 중합효소연쇄반응의 증폭 산물 결과에서 푸자리움 푸지쿠로이와 푸자리움 버티실리오이데스가 733bp 크기로 증폭된 것이 확인이 되었고 서열번호 3번과 4번을 사용한 중합효소연쇄반응의 증폭 산물 결과에서는 푸자리움 푸지쿠로이가 311bp 크기의 증폭산물을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 푸자리움 옥시스포럼과 푸자리움 버티실리오이데스는 증폭 산물의 형성이 다른 균주와 다른 크기의 산물을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. From the amplification products of the polymerase chain reaction using SEQ ID NOs: 1 and 2, it was confirmed that the amplified product of pucharium fujium and fusarium abortisyliodes was amplified to a size of 733 bp, and the polymerization using SEQ ID NOS: 3 and 4 The result of the amplification product of the enzyme chain reaction showed that the Fusarium fujiculoi produced a 311 bp amplification product. In addition, it was confirmed that the formation of the amplification product of fusarium oxysporum and pseudomonas bacterium occidentus produces products of different sizes from those of other strains.
denatureInitial
denature
extentionFinal
extention
3 min95 ° C /
3 min
45 sec94 ° C /
45 sec
30 sec55 ° C /
30 sec
45 sec72 ° C /
45
5 min72 ° C /
5 min
3 min95 ° C /
3 min
45 sec94 ° C /
45 sec
30 sec53 ° C /
30 sec
45 sec72 ° C /
45
5 min72 ° C /
5 min
본 명세서와 도면에는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.Although the present invention has been described with reference to preferred embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, It is not intended to limit the scope. It is to be understood by those skilled in the art that other modifications based on the technical idea of the present invention are possible in addition to the embodiments disclosed herein.
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation
<120> METHOD AND PRIMER SET FOR SELECTING FUSARIUM FUJIKUROI
<130> GP160020KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
gatcgtacga ggaatgttcg ga 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
ggatccgagc tcgtggtcaa taat 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
catatgcatg ccgaagtcc 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
gatcgattca agccaacg 18
<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation
<120> METHOD AND PRIMER SET FOR SELECTING FUSARIUM FUJIKUROI
<130> GP160020KR
<160> 4
<170> KoPatentin 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
Claims (11)
An oligonucleotide primer set for selection of a fusarium fujicuro species complex comprising an oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide of SEQ ID NO:
A set of oligonucleotide primers for selection of a fuarium fujiklo species complex comprising an oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide of SEQ ID NO:
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로하고, 제4항 또는 제5항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 유전자를 증폭하는 단계;를 포함하는
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체의 선별을 위한 방법.
Isolating the genomic DNA from the fusarium pujiculosoma complex; And
Amplifying the gene using the separated genomic DNA as a template and using the oligonucleotide primer set according to claim 4 or 5 as a primer
A method for screening a fujarium fujiculosin complex.
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체의 선별을 위한 방법.
7. The method of claim 6, further comprising detecting the amplification product
A method for screening a fujarium fujiculosin complex.
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체의 선별을 위한 방법.
8. The method of claim 7, wherein the detection of the amplification product is by fluorescent, phosphorescent or radioactive labeling
A method for screening a fujarium fujiculosin complex.
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체의 선별을 위한 방법.
8. The method of claim 7, wherein the detection of the amplification product is performed using gel electrophoresis, fluorescence measurement or phosphorescence measurement
A method for screening a fujarium fujiculosin complex.
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체를 구별하기 위한 키트.
Comprising a set of one or more oligonucleotide primers according to any one of claims 4 to 5 and a reagent for carrying out an amplification reaction
A kit for distinguishing a fusarium pujiculosin complex.
푸자리움 푸지쿠로이 종복합체를 구별하기 위한 키트.11. The method according to claim 10, wherein the reagent for carrying out the amplification reaction comprises a DNA polymerase, dNTPs and a buffer
A kit for distinguishing a fusarium pujiculosin complex.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160071326A KR101962669B1 (en) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160071326A KR101962669B1 (en) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170138891A KR20170138891A (en) | 2017-12-18 |
| KR101962669B1 true KR101962669B1 (en) | 2019-03-27 |
Family
ID=60922861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160071326A KR101962669B1 (en) | 2016-06-08 | 2016-06-08 | Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101962669B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111139251B (en) * | 2020-01-08 | 2022-02-11 | 华南农业大学 | Mitochondrion complete genome DNA of mulberry pseudoblight pathogenic bacteria and application thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010527598A (en) | 2007-05-23 | 2010-08-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | Polynucleotide marker |
| KR101509076B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-08 | 대한민국 | Composition comprising DNA marker for selecting rice variety containing bakanae disease-resistant BK1 gene and method of selecting rice variety resistant to bakanae disease using the DNA marker |
-
2016
- 2016-06-08 KR KR1020160071326A patent/KR101962669B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010527598A (en) | 2007-05-23 | 2010-08-19 | シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト | Polynucleotide marker |
| KR101509076B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-08 | 대한민국 | Composition comprising DNA marker for selecting rice variety containing bakanae disease-resistant BK1 gene and method of selecting rice variety resistant to bakanae disease using the DNA marker |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| De Vos et al., "Genome-Wide Macrosynteny among Fusarium Species in the Gibberella fujikuroi Complex Revealed by Amplified Fragment Length Polymorphisms", PLoS ONE, Vol.9, Issue 12, Article e114682, pp* |
| International Journal of Molecular Sciences (2012) 13:115-132 |
| Journal of Clinical Microbiology (2011) 49(5):1890-1898 |
| Journal of Plant Protection Research (2016) 56(2):143-148 |
| PLoS ONE (2014) 9(8):e104195 |
| The Plant Pathology Journal (2010) 26(4):409-416 |
| YUN et al., "Development of Species-specific Primer to Diagnose Gibberella fujikuroi Species Complex", 2015 KSPP Spring Meeting(한국식물병리학회 춘계학술발표회) 포스터 발표 (2015.04.23.-24.) (식물병 연구, 21권 2호, p.121 (2015* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20170138891A (en) | 2017-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Singh et al. | Use of multiplex terminal restriction fragment length polymorphism for rapid and simultaneous analysis of different components of the soil microbial community▿ | |
| Strayer-Scherer et al. | Recombinase polymerase amplification assay for field detection of tomato bacterial spot pathogens | |
| CN105112504B (en) | A kind of molecular marker identification method of the high nitrogen use efficiency gene of rice | |
| Chapman et al. | Using quantitative real time PCR melt curve analysis of partial CO1 sequence for rapid biotype differentiation of Bactericera cockerelli (Hemiptera: Triozidae) | |
| Busse et al. | Genomic and transcriptomic resources for marker development in Synchytrium endobioticum, an elusive but severe potato pathogen | |
| Lievens et al. | From extensive clone libraries to comprehensive DNA arrays for the efficient and simultaneous detection and identification of orchid mycorrhizal fungi | |
| KR101660951B1 (en) | Single nucleotide polymophism maker for selecting watermelon clutivar and uses thereof | |
| KR101650987B1 (en) | Universal primer set COS0566 for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same | |
| KR101962636B1 (en) | Method and primer set for selecting cylindrocarpon destructans | |
| KR101962669B1 (en) | Method and primer set for selecting fusarium fujikuroi | |
| KR101650986B1 (en) | Universal primer set for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same | |
| JP2010046038A (en) | Method for detecting pathogenic bacteria of major disease injury of strawberry, and primer for detection | |
| KR101166781B1 (en) | Specific primer for strain discrimination of Pleurotus spp. by analysis of mitochondria DNA polymorphism and uses thereof | |
| Osathanunkul et al. | Identification of Uvaria sp by barcoding coupled with high-resolution melting analysis (Bar-HRM) | |
| KR101695053B1 (en) | Universal primer set COS0264 for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same | |
| KR101695051B1 (en) | Universal primer set COS0842 for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same | |
| KR20100051981A (en) | Molecular marker linked to the major resistant gene to pepper anthracnose (colletotrichum acutatum) and its use | |
| Azizpour et al. | Assessment of genetic diversity of Iranian Ascochyta rabiei isolates using rep‐PCR markers | |
| Trang et al. | Analyzing sequence variation of the avirulence Avr-Pita1 gene of rice blast isolates, Magnaporthe oryzae in vietnam | |
| KR101636111B1 (en) | Universal primer set COS0084 for discrimination of Brassicaceae sp. and molecular marker comprising the same | |
| KR101608576B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for detecting Pseudoperonospora cubensis and method for detecting Pseudoperonospora cubensis using the same | |
| KR101288514B1 (en) | Microsatellite marker for identifying domestic species and foreign species of red mold pathogen and method for identifying domestic species and foreign species of red mold pathogen using the marker | |
| Kumar et al. | Diagnosis of Pulse Diseases and Biotechnological Approach for their Management | |
| KR101953823B1 (en) | Primer set for detection of Xanthomonas fragariae and diagnostic kit using the same | |
| CN107177691B (en) | SNP marker and its detection method for assisted Selection cotton excellent parent genetic background |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |