KR101101147B1 - rpoB gene fragments and method for the diagnosis and identification of Nocardia genus - Google Patents
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Abstract
본 발명은 rpoB 유전자 분절 및 이를 이용한 노카디아 속의 동정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a rpoB gene segment and a method for identifying genus Nocadia using the same.
이를 통해 노카디아 속 균종이 가지는 생장속도가 느리고 다양한 균종이 존재한다는 문제점과 16s rDNA 동정이 갖는 문제점을 해결하여, 간편하고, 경제적이고 정확성이 높은 동정방법을 제공한다는 장점이 있다.This has the advantage of providing a simple, economical and accurate identification method by solving the problems of slow growth rate and various species exist in the species of Nocadia and the problem of 16s rDNA identification.
Description
본 발명은 rpoB 유전자 분절 및 이를 이용한 노카디아 속의 동정방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신속하고 정확하게 노카디아 속 균종을 동정하는 방법 및 이를 위한 rpoB 유전자 분절에 관한 것이다.The present invention relates to a rpoB gene segment and a method of identifying the genus Noccadia using the same, and more particularly, to a method for quickly and accurately identifying the genus of the genus Noccadia and rpoB gene segment for the same.
노카디아는 1888년 소의 질병으로부터 분리되었으며 이듬해에 Nocardia farcinica 로 명명되었으며, 사람에서 최초의 보고는 뇌로부터 분리된 호기성의 사상균에 의한 결절성 감염 사례로부터 N.asteroides로 분류되어 졌다(Corti ME and Villafane-Fioti MF. Nocardiosis: a review. Int J Infect Dis. 2003; 7: 243-50., Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501.,Burgert, S. J. 1999. Nocardiosis: a clinical review. Infect. Dis. Clin. Pract. 8:27-32). 이는 면역 활성이 저하되었을 때 발병하는 경향이 많았으며(Corti ME and Villafane-Fioti MF. Nocardiosis: a review. Int J Infect Dis. 2003; 7: 243-50), 주로 기도를 통하여 흡입되어 폐렴, 폐농양, 농흉 등의 폐병변을 일으키 고 심할 경우에는 뇌농양이나 신농양 등의 전신성 nocardiosis로 나타난다 (Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501). Nocardia was isolated from bovine disease in 1888 and named Nocardia farcinica the following year, and the first report in humans was classified as N.asteroides from cases of nodular infection caused by aerobic filamentous fungi isolated from the brain (Corti ME and Villafane-). Fioti MF.Nocardiosis: a review.Int J Infect Dis. 2003; 7: 243-50., Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience.J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501., Burgert , SJ 1999. Nocardiosis: a clinical review.Infect.Dis.Clin.Pr. 8: 27-32). It was more likely to develop when the immune activity was lowered (Corti ME and Villafane-Fioti MF.Nocardiosis: a review.Int J Infect Dis. 2003; 7: 243-50). Pulmonary lesions such as abscesses and empyemas are severe, and in severe cases, systemic nocardiosis, such as brain abscesses and renal abscesses (Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501).
특히 인간에 병원성을 가지는 N. asteroides , N. farcinica 및 N. nova등을 'N. asteroides complex라 하며 이들의 분류는 이전부터 매우 중요하게 인식되어져 왔다(Steingrube VA, Brown BA, Gibson JL, Wilson RW, Brown J, BlacklockIn particular , N. asteroides , N. farcinica and N. nova , which are pathogenic to humans, are referred to as ' N. asteroides complex' and their classification has been recognized very important (Steingrube VA, Brown BA, Gibson JL, Wilson RW). , Brown J, Blacklock
Z, et al. DNA amplification and restriction endonuclease analysis for differentiation of 12 species and taxa of Nocardia, including recognition of four new taxa within the Nocardia asteroides complex. J Clin Microbiol 1995; 33: 3096-101.)Z, et al. DNA amplification and restriction endonuclease analysis for differentiation of 12 species and taxa of Nocardia , including recognition of four new taxa within the Nocardia asteroides complex. J Clin Microbiol 1995; 33: 3096-101.)
현재 사용되고 있는 미생물학적 및 생화학적 분석에 의하면 많은 종류의 노카디아 종을 비교적 정확하게 분석할 수 있다. 그러나 이와 같은 동정법은 균이 군집(colony)을 형성해야만 미생물학적 분류가 가능하고, 다양한 종류의 생화학적 검사를 시행할 수 있으므로 결과를 얻기까지 장기간의 시간 (2-14일)이 요구된다 (Burgert, S. J. 1999. Nocardiosis: a clinical review. Infect. Dis. Clin. Pract. 8:27~32.). 또한, 생화학적 검사결과가 미미한 차이에 불과한 경우 이를 어떻게 판독하느냐에 따라 동정 결과가 달라질 수 있으므로 숙달된 전문가에 의해서만 결과를 얻을 수 있으며 대부분의 임상실험실에서는 동정이 불가능한 형편이다. 미생물학적 분류와 생화학적 검사법을 기초로 한 동정법 외에 현재 선진국을 중심으로 개발되거나 사용되고 있는 노카디아 동정법은 세포벽 성분인 meso-diaminopimelic acid을 고성능 액체 크로마도그래피(HPLC)를 이용하는 방법과 가스크로마토그래피를 사용한 지방산 분석도 검사의 특이성이 높아 매우 유용한 방법으로 생각되나 분석에 필요한 시료를 얻기 위해 균을 배양해야 하므로 균의 성장에 필요한 시간이 소요되어 검사시간을 단축할 수 없다는 단점이 남아 있으며, 고가의 장비를 필요로 하므로 선진국을 중심으로 한 표준실험실(reference laboratory) 에서만 검사가 가능하다는 단점이 있다(Butler WR, Kilburn JO, Kubica GP. High-performance liquid chromatography analysis of mycolic acids as an aid in laboratory identification of Rhodococcus and Nocardia species. J Clin Microbiol 1987; 25: 2126-31). Microbiological and biochemical analyzes currently in use allow the analysis of many species of noccadia relatively accurately. However, this identification method requires microorganisms to be classified only when colonies form colonies, and various types of biochemical tests can be performed, requiring a long time (2-14 days) to obtain a result ( Burgert, SJ 1999.Nocardiosis: a clinical review.Infect.Dis.Clin.Pr. 8: 27--32. In addition, if the biochemical test results are only slight differences, the identification results may vary depending on how to read the biochemical test results, and the results can only be obtained by a trained expert, which is impossible to identify in most clinical laboratories. In addition to the identification method based on microbiological classification and biochemical tests, the Nokadia identification method currently being developed or used mainly in developed countries is based on the method using high performance liquid chromatography (HPLC) and meso-diaminopimelic acid, a cell wall component. Fatty acid analysis using graphography is also considered to be a very useful method due to the high specificity of the test. However, it is necessary to cultivate the bacteria to obtain the samples required for analysis. It requires expensive equipment and can only be tested in reference laboratories in developed countries (Butler WR, Kilburn JO, Kubica GP.High-performance liquid chromatography analysis of mycolic acids as an aid in laboratory) identification of Rhodococcus and Nocardia species. J Clin Microbiol 1987; 25: 2126-31).
한편, 진화과정 중 그 염기서열의 보존성이 높아 같은 종(種) 간에만 유전자의 변이도가 발견되는 유전자를 탐침으로 이용하는 분자생물학적 균동정법도 개발되고 있다(Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical and laboratory experience. J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501.). 이들 방법은 PCR을 사용하면 적은 수의 균으로부터 표적 유전자를 증폭할 수 있다는 장점과 증폭된 유전자의 분석을 단시간 내에 마칠 수 있는 장점이 있다. 이런 분자생물학적 방법을 이용하여 다양한 미생물을 동정하는 방법에 관한 연구 개발이 활발하게 진행되고 있다(Brown, J. M., and M. M. McNeil. 2003. Nocardia, Rhodococcus, Gordonia,Actinomadura, Streptomyces, and other aerobic actinomycetes, p. 502~531. InP., R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken(ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology,Washington, D.C). On the other hand, molecular bioequivalence methods are also being developed that use genes whose probe sequences are highly conserved in evolution and whose gene variability is found only among the same species (Saubolle MA and Sussland D, Nocardiosis: review of clinical). and laboratory experience.J Clin Microbiol 2003; 41: 4497-501.). These methods have advantages in that PCR can be used to amplify target genes from a small number of bacteria, and the analysis of amplified genes can be completed in a short time. Research and development on the identification of various microorganisms using these molecular biological methods is actively progressing (Brown, JM, and MM McNeil. 2003. Nocardia , Rhodococcus , Gordonia , Actinomadura , Streptomyces , and other aerobic actinomycetes, p . 502 ~ 531. In P., R. Murray, EJ Baron, MA Pfaller, FC Tenover, and RH Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, DC).
이중, 16S rRNA 유전자를 이용한 미생물 균종 동정법이 가장 보편적이나 16S rRNA 유전자의 경우 염기서열 보존성이 매우 높아 노카디아와 노카디아가 포함된 항산균(acid fast bacilli) 계통의 미생물인 마이코박테리아속, 로도코코스속, 고도나(godona)속과 츠카무렐라(Tsukamurella) 속 등을 구별할 수 있는 변별력이 떨어진다는 단점이 있다(Collins, C. H., M. D. Yates, and A. H. C. Uttley. 1988. Presumptive identification of nocardias in a clinical laboratory. J. Appl. Bacteriol. 65:55 59.). Among them, microbial species identification method using 16S rRNA gene is the most common, but 16S rRNA gene has very high nucleotide sequence retention and therefore, Mycobacteria genus, Rhodo, which are microorganisms of acid fast bacilli strains containing nocadia and nocadia. There is a drawback to being indistinguishable from Cocos, godona and Tsukamurella (Collins, CH, MD Yates, and AHC Uttley. 1988. Presumptive identification of nocardias in a clinical laboratory.J. Appl. Bacteriol. 65:55 59.).
따라서 16S rRNA 보다 노카디아 균종간을 정확하게 구별해낼 수 있는 유전자 부위에 대한 탐색과 한번에 동정을 마칠 수 있는 검사법이 필요한 것으로 생각되었으며 이와 같은 요구에 따라 더 나은 다른 유전자 부위에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Wilson RW, Steingrube VA, Brown BA, Wallace RJ Jr. Clinical application of PCR-restriction enzyme pattern analysis for rapid identification of aerobic actinomycete isolates. J Clin Microbiol 1998; 36: 148-52). 이중 최근에 발표된 rpoB 유전자 부위는 16S rRNA 보다 더 잘 마이코박테리아 균종간을 구분할 수 있는 유전자 부위인 것으로 보고된 바 있다. 이 유전자 부위를 PCR을 이용하여 증폭하고 이 PCR 산물의 염기를 분석하게 되면 정확한 균 동정이 가능한 것으로 생각되나, PCR 산물의 직접염기분석(direct sequence analysis)은 일반적인 임상실험실에서는 수행되기 어려운 고도의 분자생물학적 장비와 기술을 요구하는 방법으로 임상실험실에서 일상적으로 사용하기 어렵다는 단 점이 있어 실용화되기는 어려울 것으로 생각된다. Therefore, it is necessary to search for gene sites that can accurately distinguish between the species of Noccacia than 16S rRNA, and to test them to identify them at a time. (Wilson RW, Steingrube VA, Brown BA, Wallace RJ Jr. Clinical application of PCR-restriction enzyme pattern analysis for rapid identification of aerobic actinomycete isolates. J Clin Microbiol 1998; 36: 148-52). Recently, the recently announced rpoB gene region has been reported to be a genetic region capable of distinguishing between mycobacterial species better than 16S rRNA. The amplification of this gene region using PCR and analysis of the base of the PCR product seemed to make accurate identification of the bacterium. However, direct sequence analysis of the PCR product is highly difficult to perform in general clinical laboratories. It is difficult to be put into practical use because it is difficult to use in clinical laboratories as a method that requires biological equipment and technology.
그러므로, PCR 산물의 염기를 분석하는 번거로움 대신 PCR 산물을 여러 가지 제한효소로 절단하여 절단물의 크기와 숫자의 차이점을 비교함으로써 증폭된 유전자의 유전적 다형성(polymorphism)을 구별하고, 이를 이용하여 마이코박테리아 균종을 구분해 내는 방법인 PCR-제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism; "RFLP")법도 개발된 바 있다(Lee H, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ. Speciesidentification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene. J Clin Microbiol 38:2966-2971, 2000). 이 방법은 PCR 산물의 염기분석 방법에 비해 훨씬 간단하지만 유전자의 다형성이 노카디아종을 구분해 낼 수 있을 정도로 다양해야 하는 한편, 각 종에 속하는 균주간에는 잘 보존되어 있어야 하는 양면성을 갖고 있어야 한다. 이와 같은 목적에 부합하는 유전자 부위로 노카디아 종 구분을 위해 연구된 바 있는 유전자로 16S rRNA 유전자와 Hsp65 유전자가 연구되어 발표된 바 있다. Therefore, instead of the hassle of analyzing the base of a PCR product, the PCR product is digested with various restriction enzymes, and the genetic polymorphism of the amplified gene is distinguished by comparing the difference in the size and number of the cleavage. PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), a method of identifying bacterial species, has also been developed (Lee H, Park HJ, Cho SN, Bai GH, Kim SJ.Speciesidentification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene.J Clin Microbiol 38: 2966-2971, 2000). This method is much simpler than the PCR product sequencing method, but the polymorphism of the gene should be diverse enough to distinguish between the species, while the two-sided strains must be well preserved. As a gene site that meets these objectives, 16S rRNA gene and Hsp 65 gene have been studied.
PCR-RFLP는 PCR 산물의 염기서열 분석법에 비하여 훨씬 간편하여 실험적 기술면으로 볼 때는 임상실험실에서 이용할 수 있는 가능성이 가장 크다고 볼 수 있다. 그러나 최근까지 개발된 방법은 두 개 이상의 제한 효소를 사용해야만 정확한 균의 동정이 가능할 뿐 아니라, 유전자 절편의 크기의 차이가 매우 미미하여 유전자 절편의 분석을 위한 컴퓨터와 고가의 소프트웨어를 장만하거나 숙달된 인력이 필요하다는 애로사항이 존재하고 있다. 이는 현재까지 PCR-RFLP에 사용되고 있는 표적유전자의 다형성이 각 종을 구분해 내기에 적당치 않은 문제가 있었다. PCR-RFLP is much simpler than the sequencing method of PCR products, and it can be considered that it is most likely to be used in clinical laboratories in terms of experimental technology. However, the method developed until recently is not only accurate identification of bacteria by using two or more restriction enzymes, but also the difference in the size of the gene fragments is very small. There is a problem that this is necessary. This has been a problem that the polymorphism of the target gene used in PCR-RFLP so far is not suitable to distinguish each species.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하고자 하는 과제는 16s RNA를 분석하지 않고서도 손쉽게 노카디아 속 균종을 판별할 수 있는 RNA 폴리머라제 β-서브유닛 코딩유전자(RNA polymerase β-subunit coding gene; rpoB) 분절을 제공하는 것이다.The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, the first problem to be solved of the present invention is RNA polymerase β-subunit coding gene (which can easily determine the species of genus Nocadia without analyzing 16s RNA ( RNA polymerase β-subunit coding gene ( rpo B) to provide a segment.
본 발명의 두번째 해결하고자 하는 과제는 노카디아 속 균종에서 rpoB 유전자 분절을 동정하기에 적합한 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.The second problem to be solved of the present invention is to provide a primer pair suitable for identifying rpo B gene segments in the genus of the genus Nocadia.
본 발명의 세번째 해결하고자 하는 과제는 노카디아 속 균종을 신속하고 정확하게 판별하기에 적합한 판별방법을 제공하는 것이다.The third problem to be solved of the present invention is to provide a suitable method for discriminating quickly and accurately the genus Nocadia species.
상술한 과제를 첫번째 과제를 해결하기 위하여. 서열번호 1 내지 17로 표시되는 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 유전자 분절을 제공한다.In order to solve the first problem described above. It provides a gene segment comprising any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1 to 17.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 서열번호 1 내지 17로 표시되는 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되며, 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자의 302번째 아미노산 코돈의 902번째 염기에서부터 420번째 아미노산 코돈의 1261번째 염기 사이의 361bp 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, it is selected from the group consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 17, and 1261 of the 420th amino acid codon from the 902 base of the 302th amino acid codon of the rpo B gene of the genus Nocadia It is possible to provide a polynucleotide comprising a 361bp base sequence between the first base.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여, 노카디아 속의 균종(species)들로부터 rpoB 유전자의 일부분을 선택적으로 증폭시키기 위한 프라이머로 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.In order to solve the second object of the present invention, there is provided an oligonucleotide that can be used as a primer for selectively amplifying a portion of the rpo B gene from species of genus Nocadia.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 노카디아 속의 균종의 rpoB 유전자 일부분을 선택적으로 증폭시키기 위한 서열번호 18 ~ 19의 염기서열 중 어느 하나 이상으로 표시되는 프라이머를 제공하며, 서열번호 18 및 19의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 포함하는 노카디아 속의 균종을 선택적으로 증폭시켜 판별하기 위한 진단키트가 제공될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, there is provided a primer represented by any one or more of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 to 19 for selectively amplifying a portion of the genus rpo B gene of the genus Nocadia, A diagnostic kit may be provided for selectively amplifying and discriminating a species of genus Nocadia including a primer pair having a nucleotide sequence.
본 발명의 세번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 프라이머를 이용하여 노카디아 속의 균종의 rpoB 유전자 분절(361bp)를 PCR 증폭시킨 다음, 그 DNA 단편내에 존재하는 특정 제한효소 인식부위를 이용한 RFLP 분석을 통해 노카디아 속의 균종을 탐지 및 동정하는 방법을 제공한다.In order to solve the third object of the present invention, in which the present invention the rpo B gene fragments of the in the furnace Arcadia species (361bp) PCR amplified using the primers of the following, RFLP analysis using a specific restriction enzyme recognition site present in the DNA fragment It provides a method for detecting and identifying species in the genus Nocadia.
본 발명의 일 실시예에 의하면, (1) 노카디아 속의 균종 rpoB 유전자의 일부분을 증폭시켜 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분절을 제조하는 단계; (2) 상기 증폭된 유전자 분절의 염기 서열을 분석하는 단계; 및 (3) 상기 분석된 분절의 염기 서열을 서열번호 1 ~ 17의 염기서열과 대비하는 단계를 포함할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, (1) amplifying a portion of the genus rpo B gene of the genus Nocadia to prepare a rpo B gene segment of the genus Nocadia; (2) analyzing the nucleotide sequence of the amplified gene segment; And (3) comparing the nucleotide sequence of the analyzed segment with the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1 to 17.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (1) 단계에서 서열번호 18 ~ 19의 염기서열 중 어느 하나 이상으로 표시되는 프라이머를 사용하여 rpoB 유전자의 일부분을 증폭시킬 수 있다.According to another embodiment of the present invention, a part of the rpo B gene may be amplified using a primer represented by any one or more of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 to 19 in step (1).
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (1) 서열번호 1 내지 17로 표시된 염기서열 중 어느 하나를 갖는 유전자 분절을 제한효소로 절단하여 얻어진 단편들의 길이 다형성(length polymorphism) 패턴을 얻는 단계; (2) 동정하고자 하는 미생물로부터 DNA를 분리하는 단계; (3) 서열번호 18 ~ 19에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 상기 단계 (2)의 DNA로부터 rpoB 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 DNA를 상기 단계 (1)과 동일한 제한효소로 절단하는 단계; (5) 상기 단계 (4)에서 얻어진 제한효소 절단 단편들의 길이 다형성(length polymorphism) 패턴을 얻는 단계: 및 (6) 상기 단계 (5)에서 얻어진 패턴과 상기 단계 (1)에서 얻어진 패턴을 비교하는 단계를 포함하는 노카디아(Nocardia) 속 균주의 동정방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, (1) obtaining a length polymorphism pattern of fragments obtained by cutting a gene segment having any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 1 to 17 with a restriction enzyme; (2) separating DNA from the microorganism to be identified; (3) PCR amplifying the rpo B gene fragment from the DNA of step (2) using a primer having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 18 to 19; (4) cleaving the amplified DNA with the same restriction enzyme as in step (1); (5) obtaining a length polymorphism pattern of restriction enzyme cleavage fragments obtained in step (4): and (6) comparing the pattern obtained in step (5) with the pattern obtained in step (1). It provides a method for identifying strains of the genus Nocardia comprising a step.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 제한효소는 Msp I, Hae III 로부터 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the restriction enzyme is Msp I, Hae At least one selected from the group consisting of III.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (1)과 단계 (5)의 길이 다형성 패턴은 전기영동에 의해 얻을 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the length polymorphism pattern of steps (1) and (5) can be obtained by electrophoresis.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분절을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분절에 제한 효소를 가하는 단계를 포함하는 노카디아 속 균종 판별 방법을 제공한다.According to another embodiment of the present invention, amplifying a rpo B gene segment of the genus Nocadia genus; And adding a restriction enzyme to the rpoB gene segment of the amplified nocturnia genus.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 제한효소는 Msp I, Hae III로부터 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, the restriction enzyme is Msp I, Hae At least one selected from the group consisting of III.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 서열번호 18 및 19의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 사용하여 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분절을 증폭시킬 수 있다.According to another embodiment of the present invention, a primer pair having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19 may be used to amplify the rpo B gene segment of the genus Nocadia.
본 발명은 노카디아 속 균주 특이적 PCR 프라이머 및 노카디아 속 균주의 동 정에 이용될 수 있는 rpoB 유전자 의 361bp 분절을 나타내는 폴리뉴클레오타이드, 및 이들을 이용한 노카디아 속 균주를 동정하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for identifying a polynucleotide, and the exposure Arcadia spp using the same showing a 361bp segment of the rpo B gene, which can be used in the same forward in the furnace Arcadia in strain-specific PCR primers and no Arcadia sp.
이를 통해 인체감염이 문제가 되는 노카디아 속 균주에 있어서, 생장속도가 느리고 다양한 균종이 존재하는 단점, 그리고 물질위주 동정 및 16s rRNA 동정이 갖는 문제점을 해결하여, 간편하고, 경제적이고 정확성이 높은 동정방법을 제공한다는 장점이 있다.This is a simple, economical, high-accuracy identification method for solving the shortcomings of slow growth and various strains, and the problems of substance-based identification and 16s rRNA identification in the strains of the genus of the genus of human infection. It has the advantage of providing a method.
본 발명은 노카디아 속 균주의 rpoB 유전자에 특이적인 프라이머, 노카디아 속 균주 rpoB 분절 및 rpoB 분절의 서열정보를 이용한 노카디아 속 균주의 효과적인 탐지 또는 동정방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for effectively detecting or identifying a strain of the genus Nocdia using sequence information of the primers specific to the rpo B gene of the genus of the genus Nocdia, the rpo B segment of the genus Nocdia strain and the rpo B segment.
노카디아 속 균주의 동정 및 분류방법상의 문제점을 감안하여, 본 발명자들은 모든 노카디아 속 균주의 PCR 증폭에 사용되는 프라이머 쌍을 제공하고, 이를 이용하여 노카디아 속 균주 표준균주 17종을 대상으로 새로운 대체 표적 유전자인 rpoB의 유전자 분절 (361bp)의 염기서열을 분석하여 데이터베이스를 구축하였다. 또한, 목적 균주의 rpoB 분절을 증폭하여, 상기 데이터베이스와 비교 분석함으로써 새로운 노카디아 속 균주 탐지 또는 동정방법을 개발하게 되었다. 이를 위하여 본 발명에서는, 서열 1 내지 17의 어느 하나로 표시되는, 노카디아속 균종의 rpoB 유전자 단편으로서 서열번호 1 ~ 17로 표시되는 유전자 단편을 제공한다. 또한, 본 발명에 따라, 서열 18 내지 19 중 어느 하나로 표시되는 노카디아속 균종의 동정을 위한 PCR용 프라이머 서열이 제공된다.In view of the problems of the identification and classification methods of the strains of the genus of the genus, the present inventors provide primer pairs used for PCR amplification of all the genus of the genus, and using this to target 17 strains of the standard strain of the genus of the genus of the genus the nucleotide sequence of the target gene replacement of the gene segment of the rpo B (361bp) were analyzed to build a database. In addition, by amplifying the rpo B segment of the target strain, and compared with the database, a new method of detecting or identifying a genus of Nocadia was developed. To this end, in the present invention, the genus of the genus Nocadia, represented by any one of SEQ ID NOS: As the rpo B gene fragment, a gene fragment represented by SEQ ID NOs: 1 to 17 is provided. In addition, according to the present invention, there is provided a primer sequence for PCR for the identification of the genus Nocadia species represented by any one of SEQ ID NO: 18 to 19.
구체적으로 본 발명은 노카디아 속 균주를 탐지 또는 동정하기 위한 노카디아 속 균주의 rpoB 분절을 나타내는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 노카디아 속 균주를 분류 동정하는데 있어서의 16S rRNA를 대체할 수 있는 대체 분자로서 본 발명에서는 RNA 폴리머라제 β-서브유닛 코딩유전자를 코딩하는 361bp의 rpoB 유전자 분절을 사용하였다. 보다 바람직하게는 rpoB 유전자의 302번째 아미노산 코돈의 902번째 염기에서부터 420번째 아미노산 코돈의 1261번째 염기 사이의 361bp 염기서열을 갖는 rpoB 유전자 분절을 사용하였다. In particular, the present invention relates to polynucleotides representing rpo B segments of the genus of the genus Nocadia for detecting or identifying genus strains, or fragments thereof. As an alternative molecule which can replace the 16S rRNA according to the furnace Identification Arcadia in strain in the present invention was used for rpo B gene fragments of 361bp encoding the RNA polymerase β- subunit encoding gene. More preferably used a 361bp rpo B gene fragments having the nucleotide sequence between the 1261st base of the 420th amino acid codon from the 902nd base in the 302 amino acid codon of the rpo B gene.
어떤 유전자가 세균의 계통적 관계를 잘 반영하는 시계분자가 되기 위해서는 일정한 요건을 만족해야 한다. 첫째로, 표적 유전자가 모든 세균에서 기능적으로 필수적이고 보존되어야 한다. 대표적인 시계 분자인 16S rRNA은 단백질 합성에 필수적인 역할을 담당하기 때문에 모든 세균이 이 유전자를 보유하고 있고, 또한 각 세균사이의 유전자 변이가 진화상의 시간 관계를 잘 나타낸다. 본 발명에서 표적으로 사용한 rpoB 유전자도 세균의 전사에 관여하는 필수 효소이기 때문에 이러한 조건을 충족시킨다. 둘째로, 표적 유전자의 유전자 변이가 진화를 반영하는 시간적 요소에 의해서만 일어나야 한다. 즉 균종간 선택압 (selection pressure)에 의한 lateral transfer에 의한 염기서열 변이가 일어나지 않는다. 본 연구에 표적으로 사용하고 있는 rpoB 유전자는 균 종간의 염기서열 변이가 일어나지 않는다. 셋째로, 표적유전자는 균의 계통적 관계를 나타내기에 적절한 속간 다양성 (interspecies variation)과 같은 속내의 균종 사이의 보존성 (intraspecies conservation)을 보여야 한다. In order for a gene to be a clock molecule that reflects the systematic relationship of a bacterium, certain requirements must be met. First, target genes must be functionally necessary and conserved in all bacteria. Since 16S rRNA, a representative clock molecule, plays an essential role in protein synthesis, every bacterium has this gene, and the genetic variation between each bacterium shows an evolutionary time relationship. The rpo B gene used as a target in the present invention also satisfies this condition because it is an essential enzyme involved in bacterial transcription. Second, the genetic variation of the target gene should only be caused by temporal factors that reflect evolution. In other words, the nucleotide sequence does not occur by lateral transfer due to selection pressure between species. The rpo B gene, which is used as a target of this study, does not cause sequence variation between species. Third, the target gene should show the conservation of the species within the genus, such as interspecies variation, which is appropriate for showing the phylogenetic relationship.
기존의 시계분자로 널리 사용되던 16s rRNA 와 비교하여 본 발명의 rpoB 361bp 분절은 다음과 같은 장점이 있다.Compared to the 16s rRNA rpo B 361bp segment of the present invention the release of widely used as a conventional watch molecule has the following advantages.
(i) 16S rRNA을 표적으로 하여 비교염기서열 분석 방법에 의하여 정확한 균 동정을 하기 위해서는 거의 1.5 kbp 정도의 전체 유전자를 분석해야 한다. 그러나, rpoB 유전자는 단지 361bp의 염기서열 분석만으로도 정확한 균 동정이 가능하다.(i) In order to accurately identify the target by 16S rRNA by comparative sequencing method, the whole gene of about 1.5 kbp should be analyzed. However, rpo B gene is only possible to correct only bacteria identified sequencing of 361bp.
(ii) 16S rRNA 를 이용한 노카디아 속 균주 동정방법에 있어서 가장 큰 단점은 어떤 종에서는 16s rRNA 가 다수 사본으로 존재하고, 또한 이들 각 사본의 염기서열이 서로 다르기 때문에, 16s rRNA 의 직접 염기서열 분석방법으로 할 수 없다는 것이다. 즉, 클로닝 작업 후에 여러 클론의 염기서열 분석을 해야 한다. 따라서 직접 염기서열 분석 방법에 비해 노동력과 시간, 비용이 수배가 더 소모된다. 또한, rpoB는 16S rRNA 보다 구분력(differentiation power)이 높으며, 이는 종단위의 결정에 있어서 16S rRNA의 균종 보존성(intraspecies conservation)이 매우 높아지므로 각 균종의 구분력이 낮아 rpoB유전자보다는 종단위 결정에 적합하지 않다.(ii) The biggest drawback in the identification of strains of the genus Nocdia using 16S rRNA is the direct sequencing of 16s rRNA, because in some species 16s rRNA is present in multiple copies, and the nucleotide sequence of each copy is different. You can't do it this way. That is, after cloning, sequencing of multiple clones should be performed. Therefore, labor, time, and cost are several times higher than direct sequencing methods. In addition, rpo B has a higher discrimination power than 16S rRNA, which is highly distinctive in conservation of 16S rRNA, and thus has low discrimination ability for each species. Not suitable for
(ⅲ) 16S rRNA는 염기서열 데이터베이스가 1980년 중반부터 수행되어 왔고, 노카디아 속 균주 전체의 염기서열은 아직 분석되지 않았지만, 산발적으로 여러 다른 연구자에 의해 수행되어 왔다. 이런 염기서열은 분석방법이 기술적으로 완전하지 못할 때 이루어진 것이 많다. 따라서, 얻어진 16s rRNA데이터베이스는 문제가 많다. 그러나, 본 발명의 노카디아 속 균주의 rpoB 염기서열은 Genbank 상에서 전부 새롭기 때문에, 독자적인 노카디아 속 균주 분류용 데이터베이스를 구축할 수 있다.(Iii) The 16S rRNA has been performed by the base sequence database since the mid-1980s and sporadicly performed by several different researchers, although the base sequence of the entire genus of the genus Nocadia has not yet been analyzed. These sequences are often made when the method is not technically complete. Therefore, the obtained 16s rRNA database is problematic. However, since the rpo B sequences of the genus of the genus of the present invention are all new on the Genbank, a database for classifying the genus of the genus of the genus of the genus Arcica can be constructed.
본 발명에 따라 노카디아 속 균주의 rpoB 유전자의 361bp 분절에서의 염기서열 차이를 이용하여 목적 균주을 동정할 수 있다. 예컨대, 이들 염기서열의 차이를 이용한 분자 생물학적인 방법은 모두 본 발명에 적용하여 표준균주의 361bp 분절과 목적균주의 rpoB유전자 서열을 비교함으로써 노카디아 속 균주를 탐지 또는 동정할 수 있다. 예컨대, rpoB 염기서열분석을 하거나, 노카디아 속 균주의 361bp 분절 또는 이의 단편을 프로브로 사용한 혼성화 방법을 적용하여 동정하는 방법, 또는 상기 노카디아 속 균주의 rpoB 유전자 또는 이의 단편을 포함하는 프로브를 마이크로어레이에 부착하여 시료 균주의 rpoB 유전자 증폭산물을 반응시켜 분석할 수도 있다. 이를 위해 본 발명에서는 서열번호 18 ~ 19로 표시되는 프라이머 쌍을 제공한다. 상기 프라이머 쌍은 본 발명의 노카디아 속 균주의 rpoB 유전자 또는 이의 단편을 특이적으로 증폭시키는데 대단히 유용하다. 한편, 본 발명의 노카디아 속 균주 중 일부(Nocardia otitidiscaviarum )는 361bp가 아닌 355bp에서 염기서열의 차이가 존재하며 이는 마이코박테리아속, 츠카뮬레라속의 균주와 마찬가지로 일부 균종의 경우 6개의 뉴클레오티드가 결실되었기 때문으로 예상된다.Using the nucleotide sequence differences in the furnace Arcadia in rpo B 361bp segment of the gene of the strains according to the invention can be identified gyunjueul purpose. For example, the molecular biological method using difference between these base sequences can all be detected or identified in the furnace Arcadia strain by comparing the rpo B gene sequence of the 361bp segment of the strains applied to the present invention and the objective strain. For example, rpo B sequencing, hybridization method using a 361bp segment or fragment thereof of the genus of the genus as a probe, or a method comprising the probe or the rpo B gene or fragments thereof of the genus genus of the genus May be attached to a microarray and analyzed by reacting the rpo B gene amplification product of the sample strain. To this end, the present invention provides a primer pair represented by SEQ ID NOs: 18 to 19. The primer pairs are very useful for specifically amplifying the rpo B gene or fragments thereof of the genus Nocadia strain of the present invention. On the other hand, some of the genus strains of the present invention ( Nocardia otitidiscaviarum ) has a nucleotide sequence difference at 355 bp instead of 361 bp due to the deletion of 6 nucleotides in some species, as in the strains of the genus Mycobacteria and Tsukamulera.
본 발명의 또 다른 목적은, 분석대상의 노카디아 속의 rpoB 유전자 일부분을 상기의 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 이렇게 증폭된 노카디아 속의 rpoB DNA 분절내에 존재하는 특정 제한 효소 인식부위에 특정 제한효소를 가하는 단계; 상기의 특정 제한 효소에 의하여 상기 분절의 절단 여부를 확인하는 단계를 포함하 는 균종 판별 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다. 이 경우 바람직하게는 상기 노카디아 속의 rpoB 유전자 일부분은 서열번호 1 ~ 17로 표시되는 유전자 서열일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 노카디아 속에 속하는 균종이면 모두 본 발명의 원리가 적용될 수 있다.Another object of the present invention, amplifying a portion of the rpo B gene in the genus of the subject of analysis using the primers; Adding a specific restriction enzyme to a specific restriction enzyme recognition site present in the rpo B DNA segment of the genus thus amplified; It can be achieved by providing a bacterial species discrimination method comprising the step of identifying whether the segment is cleaved by the specific restriction enzyme. In this case, preferably, a part of the rpo B gene of the genus Nocadia may be a gene sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 17, but is not limited thereto, and the principles of the present invention may be applied to any species belonging to the genus Nocadia.
이러한 균종 판정 방법에 있어서도, 판정 대상 노카디아 속의 rpoB 유전자 일부분을 서열번호 제18 및 제19의 정방향 및 역방향의 프라이머를 혼합하여 사용하여 분절을 증폭하며, 이렇게 증폭된 분절에 각 균종에 따라 특정되는 제한효소를 가하여 그 제한 효소에 의하여 절단되는 부위가 존재하는지 여부를 판별하여 분석 대상 노카디아 속이 어떤 균종에 속하는지를 판단할 수 있으며 구체적인 균종의 종류는 하기 표 1의 17종이 예시되어 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한편, 상기 특정 제한효소는 바람직하게는 Msp I, Hae III 로부터 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 제한효소를 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.Also in this type of species determination method, a portion of the rpo B gene of the genus to be determined is amplified using a mixture of the forward and reverse primers of SEQ ID NOs: 18 and 19, and the amplified segments are identified according to each species. By determining whether there is a site cleaved by the restriction enzyme by adding a restriction enzyme, it is possible to determine which species belonging to the genus of the target ancadia, and the specific species of the species are shown in Table 1 below but not limited to 17. It doesn't work. On the other hand, the specific restriction enzyme may be preferably used at least one or more restriction enzyme selected from the group consisting of Msp I, Hae III, but is not limited thereto.
각 노카디아 균종들에 있어서, 제한 효소에 의한 절단 여부 및 부위가 상이하므로 증폭된 분절에 특정 제한 효소로 처리(RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism)하고, 그 처리된 혼합물을 전기영동으로 분리한 결과를 분석하여 절단된 분절의 크기 및 분리된 밴드의 수에 따라 노카디아 속의 균종을 판별할 수 있게 된다.In each Nocadia species, since the cleavage and site of restriction enzymes were different, the amplified fragments were treated with a specific restriction enzyme (RFLP-Restriction Fragment Length Polymorphism), and the treated mixture was subjected to electrophoresis. By analyzing the size of the cut segment and the number of separated bands it is possible to determine the species of genus Noccadia.
본 발명의 또 다른 목적은 노카디아속의 rpoB 유전자만을 선택적으로 증폭시키는 서열번호 제18 및 제19의 염기서열을 갖는 프라이머쌍을 제공하므로써 달성된다. 노카디아속의 rpoB 유전자만을 선택적으로 증폭시키는 서열번호 제18 및 제19 의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍은 서열 번호 제1 ~ 17의 노카디아 속 균종의 염기 서열로부터 이들의 특징적 염기서열을 확인하여, 노카디아 속의 rpoB 유전자의 일부 분절을 선택적으로 증폭시키는 프라이머 쌍을 제조하였다.Another object of the present invention is achieved by providing a primer pair having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19 that selectively amplify only rpo B gene of the genus Nocadia . Primer pairs having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19 that selectively amplify only the rpo B gene of the genus Noccadia are identified by their characteristic base sequences from the nucleotide sequences of the genus Noccacia of SEQ ID NOs: 1-17, Primer pairs were prepared to selectively amplify some segments of the rpo B gene of the genus Nocadia .
본 발명의 또 다른 목적은 서열 번호 18 및 19의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍을 포함하는, 노카디아 속 균종을 선택적으로 판별하기 위한 진단 시약을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a diagnostic reagent for selectively determining the genus of the genus Arcica, comprising a primer pair having the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 18 and 19.
가장 바람직하게는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, (1) 서열번호 1 내지 17로 표시된 염기서열 중 어느 하나를 갖는 유전자 분절을 제한효소로 절단하여 얻어진 단편들의 길이 다형성(length polymorphism) 패턴을 얻는 단계; (2) 동정하고자 하는 미생물로부터 DNA를 분리하는 단계; (3) 서열번호 18 ~ 19에 기재된 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 상기 단계 (2)의 DNA로부터 rpoB 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계; (4) 상기 증폭된 DNA를 상기 단계 (1)과 동일한 제한효소로 절단하는 단계; (5) 상기 단계 (4)에서 얻어진 제한효소 절단 단편들의 길이 다형성(length polymorphism) 패턴을 얻는 단계: 및 (6) 상기 단계 (5)에서 얻어진 패턴과 상기 단계 (1)에서 얻어진 패턴을 비교하는 단계를 포함하여 노카디아속 균주를 동정하고 이를 판별할 수 있다. Most preferably, according to another embodiment of the present invention, (1) a length polymorphism pattern of fragments obtained by cutting a gene segment having any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 17 with a restriction enzyme Obtaining; (2) separating DNA from the microorganism to be identified; (3) from the DNA of step (2) using a primer having a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 18-19 PCR amplifying the rpo B gene fragment; (4) cleaving the amplified DNA with the same restriction enzyme as in step (1); (5) obtaining a length polymorphism pattern of restriction enzyme cleavage fragments obtained in step (4): and (6) comparing the pattern obtained in step (5) with the pattern obtained in step (1). Including the step may identify and determine the genus Noccadia strains.
이 경우, 상기 제한효소는 Msp I, Hae III 로부터 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있다. 상기 단계 (1)과 단계 (5)의 길이 다형성 패턴은 전기영동에 의해 얻을 수 있다.In this case, the restriction enzyme is Msp I, Hae At least one selected from the group consisting of III. The length polymorphism pattern of steps (1) and (5) can be obtained by electrophoresis.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분 절을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 노카디아 속 균종의 rpoB 유전자 분절에 제한 효소를 가하는 단계를 포함하여 노카디아 속 균종을 판별하는 것도 가능하다. According to another embodiment of the present invention, amplifying the rpo B gene segment of the genus Nocadia genus; And adding a restriction enzyme to the rpo B gene segment of the amplified Nocdia genus species.
이하 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예의 내용으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to the following Examples.
<실시예) 1> 노카디아 균종(재료)<Example 1> Nocadia strains (material)
본 실험에 사용된 노카디아 속의 표준 균종은 하기 표 1에 표시하였다Standard strains of the genus Nocadia used in this experiment are shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17One
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Nocardia asiatica Nocardia asiatica
NocardiaNocardia
asteroidesasteroides
Nocardia brevicatena Nocardia brevicatena
Nocardia carnea Nocardia carnea
NocardiaNocardia
cyriacigeorgicacyriacigeorgica
NocardiaNocardia
eleganselegans
NocardiaNocardia
farcinicafarcinica
NocardiaNocardia
flavoroseaflavorosea
NocardiaNocardia
novanova
NocardiaNocardia
otitidiscaviarumotitidiscaviarum
NocardiaNocardia
salmonicidasalmonicida
NocardiaNocardia
seriolaeseriolae
NocardiaNocardia
uniformisuniformis
NocardiaNocardia
vacciniivaccinii
NocardiaNocardia
pseudosporangiferapseudosporangifera
NocardiaNocardia
violaceofuscaviolaceofusca
CIP 108374
ATCC 19247
ATCC 15333
ATCC 6847
CIP 48295
CIP 108553
ATCC 3318
CIP 104511
ATCC 33726
ATCC 14629
ATCC 27463
ATCC 43993
CIP 104824
ATCC 11092
CIP 104825
CIP 104780ATCC BAA-279
CIP 108374
ATCC 19247
ATCC 15333
ATCC 6847
CIP 48295
CIP 108553
ATCC 3318
CIP 104511
ATCC 33726
ATCC 14629
ATCC 27463
ATCC 43993
CIP 104824
ATCC 11092
CIP 104825
CIP 104780
<실시예 2> DNA 분리 및 PCR 증폭Example 2 DNA Separation and PCR Amplification
표 1에 나타낸 균종들을 배양하고, 이 중 배양된 균주 1의 백금이 정도를 0.4 ml의 ddH2O가 들어있는 1.5 ml 들이 튜브에 넣고 약 10분동안 끓이거나 혹은 15분간 멸균하였다. 이어서 필요에 따라 원심분리를 하였다.The bacterial species shown in Table 1 were cultured, and the platinum of the
PCR 반응의 조성은 KCl 50mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8.3), MgCl2 1.5 mM, 젤라틴 0.001% (w/v), dNTP 각각 200 μM, Taq 1.25U, 프라이머 10 pmole이다. PCR 반응은 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1 사이클, 변성 온도 94에서 30초, 어닐링 온도 58℃에서 40초, 연장(elongation) 온도 72℃에서 1분인 사이클을 35번, 그리고 마지막으로 최종 연장 온도 72℃에서 10분간 수행하였으며, PCR 증폭에 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다. The composition of the PCR reaction is
MOTTrpo-5': 5'-TCAAGGAGAAGCGCTACGA-3' (서열번호 18)MOTTrpo-5 ': 5'-TCAAGGAGAAGCGCTACGA-3' (SEQ ID NO: 18)
MOTTrpo-3': 5'-GGATGTTGATCAGGGTCTGC-3' (서열번호 19)MOTTrpo-3 ': 5'-GGATGTTGATCAGGGTCTGC-3' (SEQ ID NO: 19)
PCR이 끝난 후 5 정도의 시료를 취하여 2% 아가로스 겔 전기영동을 행함으로써 PCR이 성공했는지의 여부와 산물의 크기 (361 bp)를 확인하였다.After completion of the PCR, a sample of about 5 samples was taken and subjected to 2% agarose gel electrophoresis to determine whether the PCR was successful and the size of the product (361 bp).
<실시예 3> PCR-RFLP 수행Example 3 PCR-RFLP
PCR 결과를 확인하여 원하는 크기의 산물이 합성되었음이 확인되면 이중 500 ng 정도의 DNA에 해당하는 17.5 의 시료를 취하여 총 20 의 반응부피로 5 U의 MspI 제한효소와 2 의 10X 완충액을 사용하여 PCR 산물을 절단하였다. 37에서 1시간 이상 반응시킨 후 5 의 5X DNA 로딩 완충액을 섞은 뒤 4% 메타포르 아가로스 겔 전기영동(metaphor agarose gel electrophoresis)으로 절단된 PCR 산물을 분석하였다. 이때 DNA 사이즈 마커로는 PRA size marker (M&D, KOREA, WONJU)를 사용하였다.After checking the PCR result and confirming that the product of the desired size was synthesized, 17.5 samples corresponding to 500 ng of DNA were collected and 5 U Msp I restriction enzyme and 2 10X buffer using a total of 20 reaction volumes. PCR products were cleaved. After reacting for more than 1 hour at 37, the 5X DNA loading buffer was mixed and analyzed by PCR product cleaved by 4% metaphor agarose gel electrophoresis. PRA size markers (M & D, KOREA, WONJU) were used as DNA size markers.
4. PCR 산물의 클로닝 및 염기서열 분석4. Cloning and Sequencing PCR Products
각 노카디아의 ATCC 표준주를 이용하여 PCR을 수행하고 이 PCR 산물을 이용하여 염기서열 분석을 완료하고 서열분석이 완료된 염기서열을 균종별로 서열번호 1 ~ 17에 나타내었다.PCR was performed using the ATCC standard strain of each Noccadia, and the sequencing was completed using the PCR product, and the sequencing was shown in SEQ ID Nos.
결과result
1. 노카디아 표준균주를 이용한 rpoB 유전자의 PCR-RFLP 분석1. rpoB using Nocadia standard strain PCR-RFLP Analysis of Genes
본 발명자가 보유하고 있는 노카디아 표준균주 (ATCC 및 CIP에서 분양 받음) 중 17여종의 노카디아 (Nocardia)균주로 부터 게놈 DNA를 분리하고 서열번호 18및 19으로 나타낸 노카디아rpoB 프라이머 쌍을 이용하여 rpoB 유전자 부위의 PCR을 수행하였다. PCR 결과 만들어진 산물들을 2% 아가로스겔 전기영동으로 확인해 본 결과, 예상한 바대로 361 bp의 크기를 갖는 rpoB 유전자 부위의 효율적인 증폭이 일어났음을 볼 수 있었다 (도 2). 효과적으로 증폭된 각 균주의 PCR 산물을 제한효소 MspI(도 3)과 HaeIII(도 4)로 각각 처리한 뒤, 4% 메타포르 아가로스 전기영동을 이용하여 DNA 절편을 분석한 결과, 각 PCR 산물의 특이성에 따라 각기 다른 크기와 숫자의 DNA 절편이 나타남을 볼 수 있었다.The genomic DNA was isolated from 17 Nocardia strains among the Nocdia standard strains (available from ATCC and CIP) possessed by the present inventors, and the Nocadia rpoB primer pairs represented by SEQ ID NOs: 18 and 19 were used. rpoB PCR of the gene region was performed. As a result of confirming the products produced by the PCR by 2% agarose gel electrophoresis, it could be seen that the efficient amplification of the rpo B gene region having a size of 361 bp as expected (Fig. 2). PCR products of each strain that were effectively amplified were combined with restriction enzyme Msp I (FIG. 3). After treatment with Hae III (FIG. 4), DNA fragments were analyzed using 4% metaphor agarose electrophoresis. As a result, DNA fragments of different sizes and numbers appeared according to the specificity of each PCR product. there was.
2. 서울아산병원에서 분리된 임상분리 노카디아균주를 이용한 rpoB 유전자의 PCR- RFLP 분석2. rpoB using clinical isolate Nocdia strain isolated from Asan Medical Center PCR-RFLP Analysis of Genes
위의 실험에서 얻은 PCR-RFLP 양상이 ATCC에 속하는 표준 균주에만 존재하는 것이 아니라 임상에서 분리된 임상분리된 동일한 종에 속하는 노카디아균주에서도 지속적으로 발견되는 특성인지의 여부, 및 같은 종에 속한 임상분리균주 간에 잘 보존되어 있는 종특이적 양상인지의 여부를 확인하기 위하여, 임상분리된 균주를 대상으로 rpoB 유전자 부위의 PCR-RFLP 분석을 수행하였다. 임상분리균주는 서울아산병원의 균 동정팀에 의하여 미생물, 생화학적 검사 결과를 기초로 동정된 바 있는 임상분리 균주 중, 임상적 의의나 분리빈도 면에서 의미가 있다고 생각되는 10가지 종에 속하는 109개의 균주를 택하여 실시하였다. 위에서 기술된 바 대로 PCR을 수행하고 그 PCR 산물을 확인한 뒤, MspI과 HaeIII 제한효소를 사용하여 DNA를 절단하고 4% 메타포르 아가로스 전기영동을 행하여 결과를 분석하였다 (도 5 내지 도 7).Whether the PCR-RFLP pattern obtained in the above experiment is not only present in the standard strain belonging to the ATCC but is also a characteristic consistently found in nocdia strains belonging to the same clinically isolated species. To determine whether species-specific patterns are well conserved among the isolates, rpoB was used in clinically isolated strains. PCR-RFLP analysis of the gene regions was performed. Clinical isolates belonged to 10 species of clinical isolates that were identified based on microbial and biochemical test results by the bacterial identification team of Asan Medical Center, which are considered to be meaningful in terms of clinical significance or isolation frequency. Three strains were selected and performed. PCR was performed as described above and the PCR product was identified, followed by Msp I and DNA was cut using Hae III restriction enzyme and 4% metaphor agarose electrophoresis was performed to analyze the results (FIGS. 5-7).
도 5는 Nocardia farcinica 임상균주의 DNA와 노카디아rpo 프라이머를 이용하여 rpoB 유전자 부위를 증폭하고 증폭된 PCR 산물 DNA를 MspI 제한효소로 절단하고 전기영동하여 얻은 결과이다. 도 5에서 알 수 있듯이, 모든 Nocardia farcinica 균주의 rpoB 유전자를 이용한 PCR-RFLP 결과는 동일하다. 따라서, 모든 Nocardia farcinica 균주의 rpoB 유전자 부위의 염기서열은 잘 보존되어 있으며 rpoB 유전자 부위의 염기서열을 이용하여 Nocardia farcinica 균주를 동정할 수 있음을 알 수 있다.5 is a result obtained by amplifying the rpo B gene region using DNA of the Nocardia farcinica clinical strain and the nocadia rpo primer and cutting the amplified PCR product DNA with Msp I restriction enzyme and electrophoresis. As can be seen in Figure 5, PCR-RFLP results using the rpo B gene of all Nocardia farcinica strains are the same. Therefore, it can be seen that the nucleotide sequence of the rpo B gene region of all Nocardia farcinica strains is well preserved and that the Nocardia farcinica strain can be identified using the nucleotide sequence of the rpo B gene region.
도 6과 도 7은 노카디아속 (Nacoarida genus)의 임상균주를 이용한 실험 결 과이며, 노카디아속 (Nacoarida genus) 표준균주를 이용한 결과와 같은 결과가 얻어졌음을 알 수 있다. 즉, 모든 노카디아속 간의 rpoB 유전자 부위를 이용한 PCR-RFLP 결과는 동일하며, 이는 모든 노카디아속 균주에 존재하는 rpoB 유전자 부위의 염기서열은 잘 보존되어 있으며 rpoB 유전자 부위의 염기서열이 노카디아속의 균동정에 사용될 수 있는 가능성을 시사한다고 볼 수 있다.6 and 7 are experimental results using clinical strains of the genus Nacoarida genus, it can be seen that the same results as obtained using the standard strains of the genus Nacoarida genus. In other words, PCR-RFLP results using the rpo B gene region between all the genus Nocdia are identical, which means The nucleotide sequence of the rpo B gene region in the strain is well preserved, suggesting the possibility that the nucleotide sequence of the rpo B gene region can be used for the identification of genus Nocadia.
위의 두 실험을 통해 MspI 제한효소 처리만으로도 대부분의 균종간의 차이를 볼 수 있었으므로 이후 임상균주를 이용한 실험은 MspI 제한효소만을 처리하였다.In the above two experiments, only Msp I restriction enzyme treatment showed the difference between most strains. Therefore, the experiments using clinical strains were treated only with Msp I restriction enzyme.
이외에도, 상기 표 1에 기재된 노카디아 속 균종들(Nocardia abscessus, Nocardia asiatica, Nocardia asteroides, Nocardia brevicatena, Nocardia carnea, Nocardia cyriacigeorgica Nocardia elegans, Nocardia farcinica, Nocardia flavorosea, Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia salmonicida, Nocardia seriolae, Nocardia uniformis, Nocardia vaccinii, Nocardia pseudosporangifera, Nocardia violaceofusca)을 포함하는 다양한 노카디아 임상균주를 이용한 실험을 수행하였으며, 그 결과 노카디아 임상균주의 rpoB 유전자 부위를 PCR-RFLP 분석함으로써 균의 동정에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.In addition, Nocadia genus species listed in Table 1 ( Nocardia abscessus, Nocardia asiatica, Nocardia asteroides, Nocardia brevicatena, Nocardia carnea, Nocardia cyriacigeorgica Nocardia elegans, Nocardia farcinica, Nocardia flavorosea, Nocardia nova, Nocardia Notiticardiavia , Nocardia uniformis, Nocardia vaccinii, Nocardia pseudosporangifera, Nocardia violaceofusca ), and experiments were carried out using a variety of clinical strains, as a result of PCR-RFLP analysis of the rpo B gene region of the clinical strains can be used for the identification of bacteria I could see that.
3. 노카디아 표준균주의 rpoB 유전자 절편의 염기서열 분석3. rpoB of the Nocadia standard strain Sequence analysis of gene segments
임상적 의의가 있는 것으로 생각되는 표 1 기재의 총 17 종 (N. 포함 균주)의 rpoB 유전자 부위를 PCR을 이용하여 증폭하고 염기를 분석하였다. 각 균주의 rpoB 유전자 부위는 PCR 산물 크기인 361 bp이며, 서열목록의 서열번호 1 내지 17에 나타낸 바와 같다.A total of 17 types of rpo B (Strains containing N. ) listed in Table 1 that are considered clinically significant. Gene regions were amplified using PCR and base analyzed. Rpo B of each strain The gene region is 361 bp, the size of the PCR product, as shown in SEQ ID NOs: 1 to 17 in the Sequence Listing.
4. PCR-RFLP 결과와 염기분석 결과를 기초로 한 노카디아 동정의 알고리즘4. Alkadia Identification Algorithm Based on PCR-RFLP and Base Analysis
다양한 노카디아 표준균주와 임상균주의 PCR-RFLP 분석을 통해 얻은 PCR-RFLP 프로필과 PCR 산물의 염기서열의 제한효소 부위 분석을 통해 얻은 데이터를 분석하여 PCR-RFLP를 이용한 노카디아균종을 위한 알고리즘을 작성하였다(도 8, 9).Analysis of PCR-RFLP profile obtained through PCR-RFLP analysis and various data of standard strains and clinical strains, and analysis of data obtained through restriction enzyme site analysis of nucleotide sequences of PCR products to prepare algorithms for nocadia strains using PCR-
도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 보존성이 매우 높은 유전자 부위와 다형성을 나타내는 부위가 잘 분리되어 있음을 알 수 있다. 따라서 다형성이 매우 높은 부위의 유전자를 서명 유전자(signature gene)로 사용하여 노카디아 동정에 사용할 수 있음을 알 수 있다.As can be seen in Figure 9, it can be seen that the region showing a highly conserved gene region and polymorphism is well separated. Therefore, it can be seen that a gene having a very high polymorphism can be used as a signature gene and used for identification of noccadia.
본 발명은 노카디아 속 균종을 빠른시간내에 정확하게 판별할 수 있어 그에 따른 맞춤형 진단 및 치료를 수행할 수 있으므로 의료산업 상 중요한 발명이다.The present invention is an important invention in the medical industry because it is possible to accurately determine the genus of the genus Nocdia in a short time to perform a customized diagnosis and treatment accordingly.
도 1은 노카디아속(Nocardia genus)에 속한 노카디아종들의 (Nocardia species)의 rpoB 유전자 지도이다.1 is a rpoB gene map of Nocardia species belonging to the genus Nocardia genus.
도 2는 노카디아속에 속한 노카디아 각 균종 표준균주의 rpoB 유전자 부위(361bp)의 PCR 증폭사진이다. 도 2에서 각 레인은 다음의 균주를 표시한다( M; PCR 사이즈 마커, N; negative control 1; Nocardia flavorosea, 2; Nocardia pseudosporangifera, 3; Nocardia cyriacigeorgica, 4; Nocardia uniformis, 5; Nocardia vaccinii, 6; Nocardia violaceofusca, 7; Nocardia elegans, 8; Nocardia brevicatena, 9; Nocardia carnea, 10; Nocardia farcinica, 11; Nocardia otitidiscaviarum, 12; Nocardia salmonicida, 13; Nocardia seriolae).Figure 2 is a photograph of a PCR amplified no no Arcadia of each species type strain rpo B gene region (361bp) belonging to the genus Arcadia. In FIG. 2 each lane represents the following strains: M; PCR size marker, N;
도 3은 노카디아종(Nocardia species) 표준균주의 PCR-RFLP (Msp I 분해) 산물의 전기영동사진이다. 도 3에서 레인 M 및 1-13은 도 3에서와 동일한 의미를 갖는다.Figure 3 is an electrophoresis picture of the PCR-RFLP ( Msp I digestion) product of Nocardia species standard strain. Lanes M and 1-13 in FIG. 3 have the same meaning as in FIG. 3.
도 4는 노카디아종(Nocardia species) 표준균주의 PCR-RFLP (Hae III 분해) 산물의 전기영동사진이다. 도 4에서 레인 M 및 1-13은 도 3에서와 동일한 의미를 갖는다.Figure 4 is an electrophoresis picture of the PCR-RFLP ( Hae III digestion) product of the Nocardia species standard strain. Lanes M and 1-13 in FIG. 4 have the same meanings as in FIG. 3.
도 5는 서울아산병원에서 분리된 노카디아종 임상균주의 PCR-RFLP (Msp I 분해) 산물의 전기영동사진이다. 도 5에서 각 레인은 다음의 균주를 표시한다 ( M; PCR 사이즈 마커, 1; Nocardia asiatica, 2; Nocardia farcinica, 3; Nocardia farcinica, 4; Nocardia farcinica, 5; Nocardia farcinica, 6; Nocardia farcinica, 7; Nocardia farcinica , 8; Nocardia farcinica , 9; Nocardia otitidiscaviaum).Figure 5 is an electrophoresis picture of the PCR-RFLP ( Msp I digestion) product of nocadia species isolated from Asan Medical Center. In Figure 5 each lane represents the following strains (M; PCR size marker, 1; Nocardia asiatica, 2; Nocardia farcinica, 3; Nocardia farcinica, 4; Nocardia farcinica, 5; Nocardia farcinica, 6; Nocardia farcinica, 7 ; Nocardia farcinica , 8; Nocardia farcinica , 9; Nocardia otitidiscaviaum ).
도 6은 서울아산병원에서 분리된 노카디아종 임상균주의 PCR-RFLP (Msp I 분해) 산물의 전기영동사진이다. 도 6에서 각 레인은 다음의 균주를 표시한다( M; PCR 사이즈 마커, 1; Nocardia farcinica, 2; Tsukamurella pseudospumae, 3; Nocardia elegans, 4; Nocardia otitidiscaviaum, 5; Nocardia elegans, 6; Nocardia farcinica).6 is a nocadia species isolated from Seoul Asan Hospital Electrophoresis of the PCR-RFLP ( Msp I digestion) product of the clinical strain. Each lane in Figure 6 represents the following strains (M; PCR size marker, 1; Nocardia farcinica, 2; Tsukamurella pseudospumae, 3; Nocardia elegans, 4; Nocardia otitidiscaviaum, 5; Nocardia elegans, 6; Nocardia farcinica ).
도 7은 서울아산병원에서 분리된 노카디아종 임상균주의 PCR-RFLP (Msp I 분해) 산물의 전기영동사진이다. 도 7에서 각 레인은 다음의 균주를 표시한다 ( M; PCR 사이즈 마커, 1; Nocardia aisatica, 2; Nocardia farcinica, 3; Nocardia cyriacigeorgica, 4; Rhodococcus corynebacterioides, 5; Nocardia elegans, 6; Nocardia brasiliensis , 7; Nocardia farcinica , 8; Nocardia elegans).Figure 7 is an electrophoresis picture of the PCR-RFLP (Msp I digestion) product of nocadia species isolated from Seoul Asan Hospital. Each lane in Figure 7 represents the following strains (M; PCR size marker, 1; Nocardia aisatica, 2; Nocardia farcinica, 3; Nocardia cyriacigeorgica, 4; Rhodococcus corynebacterioides, 5; Nocardia elegans, 6; Nocardia brasiliensis , 7 ; Nocardia farcinica , 8; Nocardia elegans ).
도 8는 노카디아종의 rpoB 유전자 부위의 염기서열을 배열하여 비교한 결과이다.Figure 8 is the result of comparing the nucleotide sequence of the rpoB gene region of nocadia species.
도 9는 노카디아종의 구분을 위한 알고리즘 표이다.9 is a table of algorithms for the classification of nocadia species.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> rpoB gene fragments and method for dignosis and identificatin of Nocardia genus <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 361 <212> DNA <213> Nocardia abscessus <400> 1 ttcaaggaga agcgctacga cctggcgcgc gtcggccggt acaagatcaa caagaagctc 60 ggcatccacg tgggcgagca ggtcgtcggt tcggtgctga cgaaggaaga catcgtcaac 120 accatcgagt acctggtgcg cctgcactcg ggcgacagga ccatgacggc ccccggtggc 180 gtcgaggtcc cggtggaagt ggacgacatc gaccacttcg gcaaccgtcg cctgcgcacc 240 gtgggcgagc tgatccagaa ccagatccgg gtcggtctgt cgcgcatgga gcgcgtggtc 300 cgggagcgga tgacgactca ggacgtcgag gcgatcacgc cgcagaccct gatcaacatc 360 c 361 <210> 2 <211> 361 <212> DNA <213> Nocadia asiatica <400> 2 ttcaaggaga agcgctacga cctggcgcgc gtgggtcgct acaagatcaa caagaagctg 60 ggcatccacc tgggcgagca ggtcgtcggt tcggtgctga cgaaggaaga catcgtcaac 120 accatcgagt acctggtgcg cctgcactcc ggcgacaaga ccatgaccgc ccccggcggg 180 gtcgaggtgc cggtggaagt ggacgacatc gaccacttcg gcaaccgtcg 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gatcaacatc 360 c 361 <210> 15 <211> 361 <212> DNA <213> Nocardia vaccinii <400> 15 ttcaaggaga agcgctacga tctggcccgc gtcggccgct acaaggtcaa caagaagctc 60 ggcctgaacc tgggcgagcc ggtcatcggc tcgacgctcg ctcgtgagga catcgtcgcc 120 acgatcgagt acctggtccg gctgcaccag ggcgacaagc tgatgaccgc tcccggcggc 180 accgaggtcg tcgtcgaggt ggacgatatc gatcacttcg gcaaccgtcg tctgcgcacc 240 gtcggcgagc tgatccagaa ccagatccgc gtcggcctct cgcgtatgga gcgtgtcgtg 300 cgcgagcgca tgaccactca ggacgtcgag gcgatcaccc cgcagaccct gatcaacatc 360 c 361 <210> 16 <211> 361 <212> DNA <213> Nocardia pseudosporangifera <400> 16 ttcaaggaga agcgctacga cctggctcgc gtcggccgct acaaggtcaa caagaagctg 60 ggcgtcaacg ccggcgagcc gatcaccggt tcgacgctga cccgcgagga catcgtcgcc 120 accatcgagt acctggtgcg tctgcaccag ggcgacaact cgatgaccgt gcccggcggc 180 gtcgaggtcc ccgtcgacgt cgacgatatc gaccacttcg gcaaccgtcg cctgcgtacc 240 gtcggcgagc tgatccagaa ccagctgcgc gtcggcctct cgcgtatgga gcgggtcgtg 300 cgtgagcgca tgaccaccca ggacgtcgag gccatcaccc cgcagaccct gatcaacatc 360 c 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