KR101958236B1

KR101958236B1 - Pharmaceutical composition for prevention or treatment of obesity comprising licarin a or pharmaceutically acceptable salts thereof as an effective component

Info

Publication number: KR101958236B1
Application number: KR1020170101654A
Authority: KR
Inventors: 김용식; 칸 모함마드 임란; 윤다현
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-10
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2019-03-14
Also published as: KR20190017201A

Abstract

본 발명은 리카린 A(licarin A, LA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가와 같은 표현형을 나타내는 지방세포의 갈색화(browning)에 의한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells) 또는 백색 지방 세포(white adipocyte)의 갈색 지방 세포(brown adipocyte) 또는 베이지 지방 세포(beige adipocyte)로의 분화를 유도시킬 수 있는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 갈색화를 통하여 백색 지방 세포를 갈색 또는 베이지 지방 세포로 효과적으로 분화시킴으로써 이를 비만과 같은 대사성 질환의 치료를 위한 의약품 등의 용도로 적용될 수 있으므로, 제약 산업 등에 매우 유용한 발명이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity containing as an active ingredient licarin A (LA) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and more particularly to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, Mesenchymal stem cells (MSCs) by browning of adipocytes showing phenotypes such as the production of multilocular lipid droplets, the increase of intracellular mitochondrial content and the number of copies, and the increase of expression of UCP1 (uncoupling protein 1) the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity which can induce differentiation of brown adipocytes or beige adipocytes of white adipocytes into stem cells or white adipocytes. The lyticin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention can be applied to a medicine for the treatment of metabolic diseases such as obesity by effectively differentiating white adipocytes into brown or beige adipocytes through browning , And the pharmaceutical industry.

Description

리카린 Ａ 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OBESITY COMPRISING LICARIN A OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, which comprises licalin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. [0002] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity,

본 발명은 리카린 A(licarin A, LA) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets, LDs) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가와 같은 표현형을 나타내는 지방세포의 갈색화(browning)에 의한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs) 또는 백색 지방 세포(white adipocyte)의 갈색 지방 세포(brown adipocyte) 또는 베이지 지방 세포(beige adipocyte)로의 분화를 유도시킬 수 있는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity containing as an active ingredient licarin A (LA) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and more particularly to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, The mesenchymal stem cells (SCCs) by the browning of adipocytes showing phenotypes such as the production of multilocular lipid droplets (LDs), the increase of intracellular mitochondrial content and the number of copies, and the increase of expression of UCP1 (uncoupling protein 1) a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity which can induce differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes of mesenchymal stem cells (MSCs) or white adipocytes (white adipocytes) .

비만 및 비만 관련 대사 건강 합병증은 이제 공공 보건 부문에서 중요한 문제가 되고 있다. 비만은 분명히 당뇨병, 죽상 동맥 경화증, 고혈압, 관상 동맥 질환 및 암을 비롯한 많은 심각하고 치명적인 상태 (혹은 질병)의 위험성을 증가시키기 때문에, 사망 위험성의 증가와 관련이 있다^[1-4]. 전 세계적으로 현재 약 7억 명 정도의 성인들이 비만을 가지고 있으며, 비만 유병률은 2030년까지 급증할 것으로 예상된다^[5,6]. 이처럼 비만의 유병률이 빠르게 증가하는 것의 원인은 지난 세기 동안 운동이 레크리에이션이고, 고 열량 음식을 많이 섭취하고, 신체 활동이 없는 라이프 스타일로 변화한 결과 때문인 것으로 보인다. 라이프 스타일의 이러한 변화들은 과도한 에너지를 배출하지 못하고, 장기간 지방으로 체내에 저장하고, 비만을 유발한다.Obesity and obesity-related metabolic health complications are now an important issue in the public health sector. Obesity is clearly associated with an increased risk of death because it increases the risk of many serious and fatal conditions (or diseases), including diabetes, atherosclerosis, hypertension, coronary artery disease and cancer ^[1-4] . Globally, approximately 700 million adults now have obesity, and the prevalence of obesity is expected to surge by 2030 ^[5,6] . The rapid increase in the prevalence of obesity is attributed to the fact that during the past century, exercise has become a recreation, a high-calorie diet, and a lifestyle without physical activity. These changes in lifestyle do not release excess energy, store it in the body for a long time, and cause obesity.

포유류는 대조적인 역할을 하는 지방 조직의 두 가지 특정 유형을 가지고 있다. 이 두 가지 지방 조직은 백색 지방 조직(white adipose tissues, WAT) 및 갈색 지방 조직(brown adipose tissues, BAT)이다. 인간에서 갈색 지방 세포를 확인하는 획기적인 연구는 ¹⁸F-표지 포도당 유사체인 프루오로디옥시글루코오스(fluorodeoxyglucose) 및 양전자 방출 단층 촬영-컴퓨터 단층 촬영(Positron emission tomography-computed tomography, PET-CT)을 사용하여 이루어졌다^[7]. 큰 단일 소포 지질 액적(large unilocular lipid droplets) 및 백색 지방 세포를 포함하는 말초 핵을 가지는 것으로 특징되는 백색 지방 조직은 다양한 아디포카인(adipokines)을 분비하고, 대사 반응을 조절하는 활성 내분비 기관이다^[8]. 갈색 지방 조직 및 백색 지방 조직은 형태학적으로나 기능적으로 서로 다르다. 비록 서로 각각의 지방 세포로 분화할 수 있지만, 분화의 기원은 뚜렷하게 다르다^[9,10]. 열을 생성하는 능력을 갖는 세포를 포함하는 다소포 지질 액적을 가진 백색 지방 조직에 UCP1이 존재하는 것을 베이지 지방 세포라고 부른다. 베이지 지방 세포는 UCP-1 발현, 열 생성 및 더 많은 수의 미토콘드리아를 가지는 것과 같은 갈색 지방 세포와 같은 특성을 가질 뿐만 아니라, 섬유아세포 성장인자 21(FGF21), CD137, T-박스 전사 인자(TBX1), 막 횡단 단백질 26(TMEM26) 및 시트크롬 c 산화 효소 서브 유닛 II(Cox2)와 같은 여러 베이지 지방 세포의 특이 마커들을 발현하는 특징을 가진다^[11]. 갈색 및 베이지 지방은 전신의 에너지 소비 조절에 기여할 수 있다^[11]. 백색 지방 세포에서 갈색 및 베이지 지방 세포들로의 분화를 촉진하는 것은 백색 지방 세포의 부작용을 완화하고, 대사 장애를 개선하는 데 도움이 될 수 있다고 생각된다.Mammals have two specific types of adipose tissue that play a role in contrast. These two adipose tissues are white adipose tissues (WAT) and brown adipose tissues (BAT). A groundbreaking study to identify brown adipose cells in humans has been performed using fluorodeoxyglucose and Positron emission tomography-computed tomography (PET-CT), a ¹⁸ F-labeled glucose analogue ^[7] . White adipose tissue, characterized by having large unilocular lipid droplets and peripheral nuclei containing white adipocytes, is an active endocrine organ that secretes various adipokines and regulates the metabolic response ^{[ 8]} . Brown adipose tissue and white adipose tissue are morphologically and functionally different. Although they can differentiate into different adipocytes, the origin of differentiation is distinctly different ^[9,10] . The presence of UCP1 in white adipose tissue with more lipid droplets containing cells with the ability to generate heat is called beige fat cells. Beige adipocytes have the same characteristics as brown adipocytes such as having UCP-1 expression, heat production and a greater number of mitochondria, as well as fibroblast growth factor 21 (FGF21), CD137, T-box transcription factor ), Transmembrane protein 26 (TMEM26) and sheet chromium c oxidase subunit II (Cox2) ^[11] . Brown and beige fats can contribute to the regulation of energy consumption of the whole body ^[11] . It is believed that promoting the differentiation of white adipocytes into brown and beige adipocytes may help alleviate side effects of white adipocytes and improve metabolic disturbances.

외부 자극에 의한 교감 자극은 β3-AR 활성화를 유도하고, PKA(protein kinase A)의 활성화를 유도하는 cAMP 생성을 증가시킨다^[12]. PKA의 활성화는 지방 분해(lipolysis)에 중요한 영향을 미치고, 결과적으로 열 생성을 위한 기질 처리를 촉진한다. 또한, 이 PKA 활성화는 갈색 지방 세포 분화, 미토콘드리아 생성 및 지방 조직에서 증가된 UCP1 발현을 포함한다^[12]. 최근 연구에서 본 발명의 발명자들은 한랭 노출과 β3-아드레날린 수용체의 약리학적 활성화가 백색 지방 조직에서 베이지 지방 세포들을 출현시키는 핵심 요인이라는 것을 인지할 수 있었다^[11]. 최근 보고는 글루카곤 유사 펩타이드-1인 리라글루타이드(liraglutide)가 구아닐릴 고리화 효소(sGC) 및 단백질 인산화 효소 G 매개 경로를 통해 비만을 억제하고, 갈색 지방-유사 표현형을 유도한다는 것을 증명하였다^[13]. 시아니딘-3-글루코사이드 처리로 인하여 전 지방 세포에서 cAMP의 양을 증가시킴으로써 PKA를 활성화 시키면, 3T3-L1 지방 세포에서 베이지 표현형의 형성이 유도된다고 보고 되었다^[14]. 또한, 약물 및 식이제가 백색 지방에서 갈색 및 베이지 지방으로의 전환에 기여할 수 있다고 보고된 바 있다^[15]. 또한, 과학자들은 운동, 노르에피네프린, 장기간 한랭 노출, 홍채 및 PPAR-γ 작용제와 같은 외부 자극이 베이지 지방 세포의 형성을 유도할 수 있음을 입증하였다^[16]. 백색 지방에서 갈색 지방으로의 전환을 위한 신호 전달 경로는 식이제 및 약물의 작용에 대한 이해를 바탕으로 만들어졌다^[15,16].The stimulus stimulated by external stimuli induces β3-AR activation and increases cAMP production, which induces activation of PKA (protein kinase A) ^[12] . Activation of PKA has an important effect on lipolysis and, as a result, promotes substrate processing for heat production. In addition, this PKA activation involves brown adipocyte differentiation, mitochondrial production and increased UCP1 expression in adipose tissue ^[12] . In a recent study, the inventors of the present invention have been able to recognize that cold exposure and pharmacological activation of the? 3-adrenergic receptor are key factors for the appearance of beige adipose cells in white adipose tissue ^[11] . Recent reports have demonstrated that glucagon-like peptide-1 liraglutide inhibits obesity through a guanylate cyclase (sGC) and protein kinase G mediated pathway, leading to a brown fat-like phenotype ^[13] . It has been reported that activating PKA by increasing the amount of cAMP in preadipocytes leads to the formation of beige phenotype in 3T3-L1 adipocytes due to cyanidin-3-glucoside treatment ^[14] . It has also been reported that drugs and dietary supplements can contribute to the conversion of white fats to brown and beige fats ^[15] . In addition, scientists have demonstrated that external stimuli such as exercise, norepinephrine, prolonged cold exposure, iris and PPAR-γ agonists can induce the formation of beige adipocytes ^[16] . Signal transduction pathways for the conversion of white fat to brown fat are based on understanding of the actions of dietary drugs and drugs ^[15,16] .

C3H10T1/2 중간엽 줄기세포는 지방 세포 생성에 대해서 잘 확립된 세포 형성 모델이다. 이 세포는 지방 세포 분화를 이루고, 덱사메타손, 인슐린, 포스포디에스테라아제 억제제인 메틸-이소부틸-크산틴(MDI)을 포함하는 6일 이상의 호르몬 자극 후, 성숙한 백색 지방 세포가 된다^[17]. C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells are well established cell formation models for adipocyte production. These cells form adipocyte differentiation and become mature white adipose cells after more than 6 days of hormone stimulation, including dexamethasone, insulin, and phosphodiesterase inhibitor methyl-isobutyl-xanthine (MDI) ^[17] .

리카린 A는 식물의 2차 대사 산물인 네오리그난(neolignan)이다^[18]. 리카린 A는 멕시코 약초인 아리스토로키아 탈리스카나(Aristolochia taliscana)로부터 추출할 수 있는 천연 화합물이다^[19]. 또한, 리카린 A는 화학적으로 합성될 수도 있다^[18]. 몇몇 연구에 따르면, 리카린 A는 체외에서 레이시마니아 메이저(Leishmania major) 전편모충(promastigotes)의 증식 억제^[20], 글루타메이트 유도 독성에 대한 보호^[21], 즉각적인 과민 반응의 치료^[22]와 같은 유익한 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Lycarine A is a neolignan, a secondary metabolite of the plant ^[18] . Lycarine A is a Mexican herb, Aristolochia taliscana ), which is a natural compound ^[19] . In addition, lycarin A may be chemically synthesized ^[18] . Several studies have shown that lycarin A is an in vitro inhibitor of proliferation of Leishmania major promastigotes ^[20] , protection against glutamate-induced toxicity ^[21] , treatment of immediate hypersensitivity ^[22] It is known to have beneficial effects.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 영양 과다와 좌식 문화에 따른 비만을 포함한 대사성 질환에 대한 현대인의 위험성을 해소하기 위한 방안으로서 식이 요법과 운동 요법과는 별도로 질병의 적극적인 치료의 개념으로서 효과적으로 사용될 수 있는 비만의 예방 또는 치료 용도의 신규한 약학적 조성물 등을 제공하고자 하는 것이다.A problem to be solved by the present invention is to solve the risk of modern people in metabolic diseases including obesity according to nutritional excess and sedentary culture, which can be effectively used as a concept of active treatment of diseases separately from diet and exercise therapy And a novel pharmaceutical composition for preventing or treating obesity.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising licalin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.The present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating obesity comprising licalin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 슬리밍용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for slimming comprising licalin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

상기 화장료 조성물은 로션, 화장수, 크림, 에센스, 폼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것이 바람직하다.The cosmetic composition is preferably a formulation selected from the group consisting of lotion, lotion, cream, essence, foam and pack.

또한, 본 발명은 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포 또는 백색 지방 세포의 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포로의 분화 유도용 시약 조성물을 제공한다.The present invention also provides a reagent composition for inducing the differentiation of mesenchymal stem cells or white adipocytes into brown adipocytes or beige adipocytes comprising lycarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 분화 유도된 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포는 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1 유전자의 발현량 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 것이 바람직하다.Preferably, the differentiation-induced brown adipose cell or beige adipocyte cell has a phenotype selected from the group consisting of increased oxygen consumption, more or less lipid droplet production, increased intracellular mitochondrial content and copy number, and increased expression level of UCP1 gene .

상기 분화 유도는 PKA 신호 경로의 활성화에 의한 것이 바람직하다.The differentiation induction is preferably by activation of the PKA signal pathway.

또한, 본 발명은 분리된 중간엽 줄기세포 또는 분리된 백색 지방 세포에 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for inducing differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes, which comprises treating isolated mesenchymal stem cells or isolated white adipocytes with lycarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof .

본 발명에 따른 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 갈색화를 통하여 백색 지방 세포를 갈색 또는 베이지 지방 세포로 효과적으로 분화시킴으로써 이를 비만과 같은 대사성 질환의 치료를 위한 의약품 등의 용도로 적용될 수 있으므로, 제약 산업 등에 매우 유용한 발명이다.The lyticin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention can be applied to a medicine for the treatment of metabolic diseases such as obesity by effectively differentiating white adipocytes into brown or beige adipocytes through browning , And the pharmaceutical industry.

도 1은 리카린 A가 트리글리세라이드 축적을 감소시키고, 다소포 지질 액적을 형성시킴을 보여주는 것이고,
도 2는 리카린 A가 백색 지방 마커를 억제함과 동시에 갈색 및 베이지 지방 세포의 유전자 발현을 유도시킴을 보여주고,
도 3은 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포, BAT 및 iWAT 세포에서 갈색 지방 특이 마커들의 발현을 증가시킴을 보여주고,
도 4는 리카린 A가 미토콘드리아 생성을 촉진시킴을 보여주고,
도 5는 리카린 A의 처리에 의한 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서의 갈색 지방세포-유사 형태를 보여주고,
도 6은 리카린 A가 Hsl(hormone sensitive lipase)의 다소포 지질 액적으로의 이동을 유도시켜, 지방 분해를 촉진시킴을 보여주고,
도 7은 PKA의 활성화는 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포의 갈색-유사 지방 세포로의 리카린 A 매개 리모델링을 위하여 필요함을 보여준다. Figure 1 shows that lycarin A reduces triglyceride accumulation and more or less forms lipid droplets,
Figure 2 shows that lycarin A inhibits white fat markers and induces gene expression in brown and beige adipocytes,
Figure 3 shows the expression of brown fat specific markers in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells, BAT and iWAT cells,
Figure 4 shows that lycarin A promotes mitochondrial production,
Figure 5 shows brown adipocyte-like morphology in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells by treatment with lycarin A,
FIG. 6 shows that lycarin A induces the migration of Hsl (hormone sensitive lipase) to a more lipid droplet, promoting lipolysis,
Figure 7 shows that activation of PKA is required for remineralin A mediated remodeling of C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells into brown-like adipocytes.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

상기 종래 기술에서 설명된 바와 같이, 지금까지 비만에 관하여 C3H10T1/2 MSC 및 백색 지방 세포에서 LA의 갈색화 효과는 보고되지 않았다. 여기서, 본 발명의 발명자들은 LA가 MDI 호르몬 자극에 의하여 C3H10T1/2 MSC로부터 유래된 백색 지방의 갈색화에 효과가 있음을 보고하고자 한다. 이를 위하여, 마우스의 C3H10T1/2 MSC, iWAT 및 BAT 세포를 사용하였다. 또한, LA의 갈색화 효과를 로시글리타존(rosiglitazone)의 갈색화 효과와 비교하였다. 본 발명의 발명자들은 LA가 C3H10T1/2 MSC에서 PKA의 활성화를 통해 WAT 특이적 마커의 발현을 억제하는 반면에, BAT 관련 마커, 베이지 세포 특이적 마커 및 미토콘드리아 생성 관련 마커들의 발현량을 효율적으로 증가시킨다는 것을 입증하였다.As described in the above prior art, the browning effect of LA in C3H10T1 / 2 MSC and white adipocytes has not been reported so far with respect to obesity. Here, the inventors of the present invention report that LA is effective for browning of white fat derived from C3H10T1 / 2 MSC by MDI hormone stimulation. For this purpose, mouse C3H10T1 / 2 MSC, iWAT and BAT cells were used. In addition, the browning effect of LA was compared with the browning effect of rosiglitazone. The inventors of the present invention have found that LA inhibits expression of WAT-specific markers through activation of PKA in C3H10T1 / 2 MSC, while efficiently increasing the expression level of BAT-related markers, beige cell-specific markers and mitochondrial production-related markers .

따라서, 본 발명은 리카린 A 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising licalin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 "비만"이라는 용어는 개체의 지방의 양이 정상 범위를 초과하는 임상적 증상을 의미한다. 또한, 상기 비만에는 비만과 관련된 각종 대사 이상에 의한 대사증후군을 포함하는 개념이다.The term " obesity " refers to a clinical condition in which the amount of fat in an individual exceeds a normal range. In addition, the above-mentioned obesity includes a metabolic syndrome due to various metabolic abnormalities related to obesity.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition containing the active ingredient of the present invention may be formulated into tablets, capsules, suspensions, emulsions, oral preparations such as syrups and aerosols, injections of sterilized injection solutions And may be administered by various routes including oral administration or intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration, and the like.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.Such pharmaceutical compositions may further comprise carriers, excipients or diluents, and examples of suitable carriers, excipients or diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, But are not limited to, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, And the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.In a preferred embodiment, the solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, for example starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like are mixed and formulated. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Examples of the oral liquid preparation include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, Perfumes, preservatives, and the like.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.As a preferable specific example, the preparation for parenteral administration includes sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-drying agents, suppositories, and the like. Examples of the non-aqueous solvent and suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The active ingredient of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.As a preferable example, the effective amount of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient, and generally 1 to 5,000 mg, preferably 100 to 3,000 mg per kg of body weight per day Or every other day or one to three times a day. However, the dosage may not be limited in any way because it may be increased or decreased depending on route of administration, severity of disease, sex, weight, age, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject through various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.In the present invention, " administration " means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is either oral or non-oral May be administered orally. The composition of the present invention may also be administered using any device capable of delivering an effective ingredient to a target cell.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.In the present invention, the term " object " includes, but is not limited to, human, monkey, cow, horse, sheep, pig, chicken, turkey, quail, cat, dog, mouse, rat, rabbit or guinea pig , Preferably a mammal, more preferably a human.

본 발명의 건강 기능 식품은 비만과 관련된 각종 증상의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.The health functional food of the present invention can be variously used for foods and beverages effective for preventing or improving various symptoms related to obesity. Examples of foods containing the active ingredient of the present invention include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complex, health supplement foods and the like, and they can be used in the form of powder, granule, tablet, capsule or beverage .

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.The active ingredient of the present invention may generally be added in an amount of 0.01 to 15% by weight of the total food, and the health beverage composition may be added in a proportion of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, based on 100 ml.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The health functional food of the present invention may contain, as an additional ingredient, a food-acceptable food-aid additive such as natural carbohydrates and various flavors, in addition to containing the above-mentioned compound as an essential ingredient in the indicated ratio.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. Examples of the natural carbohydrate include sugar sugars such as glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.Examples of the flavoring agents include natural flavoring agents such as tautatin, rebaudioside A and stiglycerin such as glycyrrhizin, and synthetic flavoring agents such as saccharin and aspartame. The ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the health functional food of the present invention. In addition to the above, the health functional food of the present invention may contain various kinds of nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavy stabilizers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, Thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the health functional food of the present invention may contain flesh for producing natural fruit juice, fruit juice drink, vegetable drink and the like. These components may be used independently or in combination. The ratio of such additives is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the active ingredient of the present invention.

상기 "슬리밍"은 신체의 전체 또는 특정 부위의 체적이 감소되는 현상을 의미하며, 예를 들어, 신체의 전체 또는 특정 부위의 지방의 제거 또는 감소일 수 있다. The term " slimming " means a phenomenon in which the volume of the whole or a specific part of the body is reduced, for example, the elimination or reduction of fat in the whole or a specific part of the body.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 슬리밍 효과를 기대할 수 있다.The active ingredient of the cosmetic composition of the present invention may be contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 1 to 10% by weight based on the total weight of the composition. Appropriate formulation stability can be ensured within such a content range, and a desired slimming effect can be expected.

본 발명의 상기 조성물은 본 발명의 유효성분 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 항노화, 보습, 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.The composition of the present invention may further contain, in addition to the effective ingredient of the present invention, a known natural extract or other ingredients for the antioxidative, anti-aging, moisturizing and skin regeneration promoting effects within the range not inhibiting the active activity of the present invention .

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.In addition, the composition may also contain components commonly added to cosmetic compositions, such as fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, A cosmetic or dermatological composition such as a perfume, a perfume, a surfactant, water, an ionic or nonionic type emulsifier, a filler, a sequestering and chelating agent, a preservative, a vitamin, a barrier, a wetting agent, an essential oil, a dye, a pigment, a hydrophilic or lipophilic active agent May be formulated into a particular formulation, including adjuvants or carriers commonly used in the field of dermatology.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 로션, 화장수, 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 폼, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다. The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be formulated into various forms such as solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, Containing cleansing, oil and spray, but are not limited thereto. More specifically, the present invention relates to a lotion, a lotion, a flexible lotion, a nutritional lotion, a cream, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a powder foundation, an emulsion foundation, a wax foundation, a cleansing cream, a foam, a cleansing foam, , Spray, powder, fact, lip gloss, lipstick, shadow, shampoo and rinse.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component. In particular, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, Propane / butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.

상기 분화 유도는 PKA 신호 경로의 활성화에 의한 것일 수 있다.The differentiation induction may be due to activation of the PKA signaling pathway.

상기 분화 유도용 시약 조성물은, 예를 들어, 연구용 시약 조성물로서 적용될 수 있다. 통상 실험실 조건하에서 본 발명의 분화 유도용 시약 조성물을 세포 또는 실험 동물에 투여할 수 있으며, 구체적인 투여 방법과 안전 규칙 등은 실험자의 각 실험실의 내부 준수 규정에 따라 수행되는 것이 바람직하다. The reagent composition for inducing differentiation can be applied, for example, as a reagent composition for research. The reagent composition for inducing differentiation of the present invention can be administered to a cell or an experimental animal under normal laboratory conditions. It is preferable that the specific administration method and safety rules are performed according to the internal regulations of each laboratory of the experimenter.

상기 중간엽 줄기세포 또는 백색 지방 세포는 개체로부터 자연적 또는 인위적 방법으로 분리된 것을 대상으로 한다. 개체로부터 분리된 상기 세포들은 적절한 배양 조건하에서 수일 내지 수주 동안 배양될 수 있으며, 경우에 따라서 동결보관될 수도 있다. The mesenchymal stem cells or white adipocytes are those which have been isolated from an individual by natural or artificial means. The cells isolated from the individual can be cultured for several days to several weeks under appropriate culture conditions, and may be stored in a freezer as the case may be.

분리된 상기 세포들에 본 발명의 유효성분을 투여하는 방법은 통상의 기술자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 본 명세서의 하기 실시예에 기재된 바를 따를 수 있을 것이다. Methods for administering the active ingredient of the present invention to the isolated cells are obvious to those of ordinary skill in the art, and preferably those described in the following Examples of the present invention may be followed.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. The following examples illustrate one preferred embodiment of the present invention, and it is apparent that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by the matters described in the following examples.

[[ 실시예Example ]]

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

1.1. 화학물질, 시약 및 항체1.1. Chemicals, reagents and antibodies

리카린 A(순도(HPLC): 최소 97%)는 카르보신스 주식회사(콤프톤, 버크셔, 영국)로부터 구입하였다. 고 포도당 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 및 태아 소 혈청(FBS) 은 아트라스 바이오지컬스로부터 구입하였다. 페니실린-스트렙토마이신 용액은 하이크론 네보라토리스 주식회사(사우스 로간, 뉴욕, 미국)로부터 구입하였다. 인슐린, 덱사메타손, IBMX, 이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT), 로지그리타존(Rosi), 오일 레드 오일 다이(ORO), DAPI 및 4% 포름알데히드는 시그마-알드리츠(세인트루이스, 미주리, 미국)에서 구입하였다. Sirt1, 인산화된 HSL(세린 563 및 660), HSL, ATGL, 페릴리핀, 인산화된 PKA 기질에 대한 항체는 셀 시그널링 테크노로지(단버스, 메사츄세츠, 미국)에서 구입하였다. PPAR-γ에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지 주식회사에서 구입하였다. Ucp1, Pgc-1α, Prdm16 및 β-액틴에 대한 항체는 엡캡(캠브리지, 메사츄세츠, 미국)에서 구입하였다. 보디피 493/503은 라이프 테크노로지 주식회사(카르스바드, 캘리포니아, 미국)에서 구입하였고, BCA 단백질 정량 키트는 써모 사이언티픽(Rockford, IL, USA)에서, 단백질 로딩 용액은 바이오 라드 레보라토리 주식회사(허큐레스, 캘리포니아, 미국)에서 각각 구입하였다. 미토 엑스프레스 엑스트라 산소 소비 분석 키트는 룩셀 바이오 사이언스 주식회사(인케라, 리틀 아일랜드, 콜크, 아일랜드)에서 구입하였다. Licarin A (purity (HPLC): at least 97%) was purchased from Carbosin Corporation (Compton, Berkshire, UK). High glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and fetal bovine serum (FBS) were purchased from Atlas Biosciences. The penicillin-streptomycin solution was purchased from Hycronne Borothrice, Inc. (South Logan, New York, USA). Insulin, dexamethasone, IBMX, isobutyl-1-methylsantaine (IBMX), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Rosi), Oil Red Oil Die (ORO), DAPI and 4% formaldehyde were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA). Antibodies to Sirt1, phosphorylated HSL (serine 563 and 660), HSL, ATGL, perilipine, phosphorylated PKA substrate were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, Mass., USA). Antibodies to PPAR-y were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. Antibodies to Ucp1, Pgc-l [alpha], Prdm16 and [beta] -actin were purchased from Epcap (Cambridge, Mass., USA). The protein loading solution was purchased from BioRad Laboratories, Inc. (Rockford, IL, USA), and the protein loading solution was purchased from Biorad Laboratories, Inc. Hercules, Calif., USA). The Mito-Xpress Extra Oxygen Consumption Analysis Kit was purchased from Luxel Bioscience, Inc. (Inker, Little Island, Cork, Ireland).

1.2. 세포 배양, 분화 및 약물 처리1.2. Cell culture, differentiation and drug treatment

C3H10T1/2 MSCs(한국 세포주 은행, KCLB-10226), iWAT(연세대학교 이윤희의 친절한 기증) 및 BAT 세포(NIH 선임 연구원인 게 카이의 친절한 기증)를 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 넣어준 DMEM 그루타맥스의 배지를 이용하여 배양하였다. 이때, 37℃의 5% CO₂ 배양기를 이용하였다. 세포를 지속적으로 배양할 목적으로 70~80%의 밀도로 세포가 배양되었을 때 계대배양하였다. C3H10T1/2 MSC를 지방 세포 계통으로 유도하기 위해, 세포를 접종한 다음 날에 세포가 전체 용기의 50~60% 밀도로 배양되었을 때(-3일로 지정), 10nM 인간 재조합 BMP7(R&D 시스템, 미네아폴리스, 미네소타, 미국)을 모든 처리군에 처리하였다. 분화를 위해, C3H10T1/2가 100%의 밀도로 배양(2일 이후에, 100% 밀도로 배양된 것을 0일로 지정), iWAT 및 BAT 세포들을 10μg/mL 인슐린, 1μM 덱사메타손, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(MDI)을 함유한 10% FBS의 DMEM에서 배양하였다. 그리고, 이후에는 DMEM, 10% FBS, 및 10μg/mL 인슐린을 포함한 성숙 배지에서 배양하였다. 세포 배양 배지는 격일로 교체하였다. LA를 DMSO(시그마-알드리츠, 세인트 루이스, 미주리, 미국)에 완전히 용해 시켰고, 저장 용액을 이후 사용을 위해서 -20℃에서 보관하였다. 처리군을 MDI, MDI+로시글리타존(양성 대조군), MDI+LA 처리군으로 나누었다. 2일 이후에, 4일까지 성숙 배지에 약물을 혼합하여 다시 처리하였다. 4일 이후에는 성숙 배지만을 사용하였다.(FIB) and 1% penicillin (Bacillus thuringiensis) supplemented with C3H10T1 / 2 MSCs (KCLB-10226), iWAT (friendly donation by Yoon Hee Lee of Yonsei University) and BAT cells - streptomycin in DMEM Grutamax medium. At this time, a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C was used. When the cells were cultured at a density of 70-80% for the purpose of continuously culturing the cells, they were subcultured. To induce C3H10T1 / 2 MSCs into the adipocytic lineage, 10 nM human recombinant BMP7 (R & D system, Minneapolis, MN) was used when cells were incubated at 50-60% , Minnesota, USA) were all treated. For differentiation, C3H10T1 / 2 cells were cultured at a density of 100% (designated as 0 days after 2 days, 100% density was designated as 0 days), iWAT and BAT cells were treated with 10 ug / mL insulin, 1 袖 M dexamethasone, 0.5 mM 3- Butyl-1-methylxanthine (MDI) in DMEM supplemented with 10% FBS. Then, the cells were cultured in a mature medium containing DMEM, 10% FBS, and 10 μg / mL insulin. Cell culture medium was replaced every other day. LA was completely dissolved in DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) and the stock solution was stored at -20 C for later use. The treatment groups were divided into MDI, MDI + rosiglitazone (positive control) and MDI + LA treatment groups. After 2 days, the drug was mixed and reprocessed in the maturation medium until 4 days. After 4 days, mature bacillus was used.

1.3. 세포 생존율(1.3. Cell survival rate MTTMTT 분석) analysis)

MTT 분석을 통해서 우리는 세포 생존율을 확인한다. C3H10T1/2 MSC를 다음날에 80~90%의 밀도로 배양되도록 세포를 접종하였고, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 LA 농도를 각각 5, 10 및 20μM로 처리하였다. 분화된 상태에서의 세포 생존율을 확인하기 위하여, 세포를 분화 및 성숙 배지에서 5, 10 및 20μM 농도의 LA를 용해시킨 후 6일까지 배양하였다. 배양이 끝나면, 5μg/mL MTT 용액 20μL를 넣고, 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하여 포르마잔 결정을 형성시켰다. 그런 다음, 포르마잔 결정을 150μL DMSO에 용해시키고, 빅터 X3 다중 라벨 판독기(펄킨 엘머, 왈탐, 메사츄세츠, 미국)를 사용하여 590nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.Through MTT analysis, we confirm cell viability. Cells were inoculated with C3H10T1 / 2 MSCs at 80-90% density for the next day and treated with LA, 5, 10 and 20 μM for 24, 48 and 72 hours, respectively. To confirm the cell viability in the differentiated state, cells were lysed at different concentrations and at 5, 10 and 20 μM concentrations in mature medium and cultured for up to 6 days. After incubation, 20 μL of 5 μg / mL MTT solution was added and the cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours to form formazan crystals. The formazan crystals were then dissolved in 150 μL DMSO and the absorbance was measured at a wavelength of 590 nm using a Victor X3 multi-label reader (Pulcin Elmer, Walton, Mass., USA).

1.4. 오일 1.4. oil 레드Red O 염색 O dyeing

오일 레드 O(ORO)는 중성 트리글리세라이드(중성 지방) 및 지질을 염색한다. ORO 염색은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다^[41]. 간략히 설명하면 다음과 같다. C3H10T1/2 MSC를 6개의 웰 플레이트에 접종, 성장 및 분화시켰다. 분화 8일 후에, 세포를 1X PBS로 세척하고, 10% 포르말린을 이용하여 1시간 동안 세포를 고정시킨 후, 0.3% 여과된 오일 레드 O 용액으로 20분 동안 염색하였다. 염색된 세포들을 증류수로 4회 세척하고, Axiovert-25 현미경(칼 자이스, 자나, 독일)을 사용하여 표현형 변화를 확인하였다. ORO의 양을 정량하기 위하여, 염색된 세포들을 100% 이소프로판올에서 용출시키고, 흡광도를 빅터 X3을 사용하여 파장 520nm에서 판독하였다.Oil Red O (ORO) stains neutral triglycerides (triglycerides) and lipids. ORO staining was performed as previously described ^[41] . A brief explanation is as follows. C3H10T1 / 2 MSCs were inoculated, grown and differentiated into 6 well plates. After 8 days of differentiation, the cells were washed with 1X PBS, fixed with 10% formalin for 1 hour, and stained with 0.3% filtered Oil Red O solution for 20 minutes. The stained cells were washed 4 times with distilled water and phenotypic changes were confirmed using an Axiovert-25 microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany). To quantify the amount of ORO, stained cells were eluted from 100% isopropanol and absorbance was read at 520 nm using a Victor X3.

1.5. 1.5. 보디피Body fat (( BodipyBodipy ) 493/503 지질 염색) 493/503 Lipid Dyeing

C3H10T1/2 MSCs를 35mm 공초점 접시에서 유리 커버슬립(coverslip) 상에 접종하였고, 10일 동안 분화시켰다. 10일 후, 세포를 냉 메탄올로 고정시켰다. 보디피 녹색 염색을 1X PBS(1μM 농도까지)로 희석하고, 고정된 세포를 상온에서 15분 동안 이 용액에서 염색시켰다. 그 후, 3차례 1X PBS 용액으로 세척하고, 1μg/ml DAPI 용액에서 1분 동안 상온에서 세포를 염색하였다. 그 후, 다시 1X PBS로 3회 세척하였다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 염료 여기 및 방출 파장을 이용하여, 공초점 현미경(올림푸스; 동경, 일본)을 사용하여 이미지를 얻었고, FV 10i-ASW 3.0 뷰어 소프트웨어(올림푸스; 동경, 일본)를 사용하여 분석하였다.C3H10T1 / 2 MSCs were inoculated on glass coverslips in 35 mm confocal dishes and differentiated for 10 days. After 10 days, the cells were fixed with cold methanol. The body pigment green stain was diluted with 1X PBS (to a concentration of 1 [mu] M) and the fixed cells were stained in this solution for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the cells were washed three times with 1X PBS solution, and the cells were stained at room temperature for 1 minute in 1 μg / ml DAPI solution. Then, it was washed three times with 1X PBS again. Images were acquired using a Alexa Fluor 488 dye excitation and emission wavelength using a confocal microscope (Olympus; Tokyo, Japan) and analyzed using the FV 10i-ASW 3.0 viewer software (Olympus; Tokyo, Japan) Respectively.

1.6. 정량 1.6. dose 역전사Reverse transcription 중합 효소 연쇄 반응 분석( Polymerase chain reaction analysis ( qRTqRT -- PCRPCR ))

정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)은 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다^[41]. 간단히 말하면 다음과 같다. C3H10T1/2 세포를 "세포 배양, 분화 및 처리" 섹션에 설명된 대로 세포를 접종하고, 배양하고, 처리한 다음, RNA 추출 키트(카이아젠, 바렌시아, 캘리포니아, 미국)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 맥심 RT 프리 믹스 키트(인트론 바이오 테크노로지, 서울, 한국)를 이용하여 전체 RNA(1μg)를 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 통하여 cDNA를 합성하고, 반응은 베리티 96-웰 유전자 증폭기(어플라이드 바이오 시스템, 싱가포르)에서 수행하였다. 정량 실시간 PCR은 iQ™ 사이브로(SYBR) 그린 슈퍼믹스 키트(바이오 라드, 싱가포르)를 사용하여, CFX96™ 역전사 중합 반응 검출 시스템(바이오 라드, 싱가포르)에서 수행되었다. 본 실시예에서 사용된 프라이머들의 염기 서열은 표 1에 열거되어있다. 표적 유전자 발현은 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소(Gapdh)의 발현을 이용하여 정상화하였다.Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was performed as previously described ^[41] . Simply put: C3H10T1 / 2 cells were inoculated, cultured and treated as described in the section " Cell Culture, Differentiation and Treatment ", and then cultured using RNA extraction kit (Chiagen, The total RNA was extracted. CDNA was synthesized by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) on total RNA (1 μg) using a Maxim RT pre-mix kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea), and the reaction was performed using a Verity 96-well gene amplifier Biosystems, Singapore). Quantitative real time PCR was performed on a CFX96 (TM) reverse transcription polymerisation detection system (BioRad, Singapore) using the iQ ™ SYBR Green Super Mix Kit (BioRad, Singapore). The nucleotide sequences of the primers used in this Example are listed in Table 1. Target gene expression was normalized using the expression of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Gapdh).

[표 1] [Table 1] 프라이머primer 서열 리스트 Sequence List

1.7. 미토콘드리아 DNA 함량 분석1.7. Analysis of mitochondrial DNA content

미토콘드리아 생성은 핵 DNA(nDNA) 함량에 대한 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 함량의 비율에 의해 결정되었으며, nDNA가 일정하다고 가정하고, 설명된 대로^[42], 실시간 qPCR로 정량화하였다. 각각의 DNA 추출에 대해, 핵 유전자 리보솜 단백질 large p0 및 미토콘드리아 유전자 시토크롬 C 산화 효소 서브 유니트 I(CoxI)을 실시간 qPCR에 의해 개별적으로 정량화하였다. 데이터는 핵 유전자 p0 DNA에 대해서 정상화하였다(ΔΔCT 분석).Mitochondrial production was determined by the ratio of mitochondrial DNA (mtDNA) content to nuclear DNA (nDNA) content and quantified as real-time qPCR, as described, assuming nDNA was constant ^[42] . For each DNA extraction, the nuclear gene ribosomal protein large p0 and the mitochondrial gene cytochrome C oxidase subunit I (CoxI) were individually quantified by real-time qPCR. The data were normalized to the nuclear gene p0 DNA (ΔΔCT analysis).

1.8. 1.8. 웨스턴Western 블롯Blot 분석을 위한 전 세포 추출물 준비 Preparation of whole cell extract for analysis

전 세포 추출물 준비 및 웨스턴 블롯(WB) 분석은 앞에서 설명한 바와 같이 수행되었다^[41]. 변형된 내용은 다음과 같다. 인산화된 단백질의 WB 분석을 위하여, 탈지유 대신에, 1% BSA을 사용하여 멤브레인을 블로킹하였고, 포스파타제 억제제(시그마- 알드리츠, 세인트 루이스, 미주리, 미국)를 RIPA 용해 완충 용액 칵테일에 첨가하였다.Whole-cell extract preparation and western blot (WB) assays were performed as previously described ^[41] . The modified contents are as follows. For WB analysis of phosphorylated proteins, membranes were blocked using 1% BSA instead of skim milk and phosphatase inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) were added to the RIPA lysis buffer cocktail.

1.9. 산소 소비량 분석1.9. Oxygen consumption analysis

계대 배양 수가 낮은 C3H10T1/2 세포들을 96-웰 플레이트에 접종하였다. 이 때의 세포 밀도는 200μl 배양 배지에 약 40,000~60,000 세포였다. 37℃의 CO₂ 배양기에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 미토 엑스프레스 엑스트라 산소 소비 분석 키트(룩스셀 바이오 사이언스 주식회사, 인케라, 리틀 아일랜드, 코르크, 아일랜드)를 사용하였다. 이때 제조업체의 프로토콜에 따라 산소 소비 분석을 수행하였다. 양성 대조군-포도당 산화 효소(Gox) 및 음성 대조군-안티 마이신 A(AA, 복합체 III 억제제)를 사용하였으며, 시그마-알드리츠(세인트 루이스, 미주리, 미국)에서 구입하였다. 판독은 각각 380nm 및 650nm 여기 및 방출 파장에서 빅터 X3 다중 라벨 판독기(펄킨 엘머, 왈탐, 메사츄세츠, 미국)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 대조군(MDI)의 퍼센트로 표시되었다.C3H10T1 / 2 cells with low subculture numbers were inoculated into 96-well plates. The cell density at this time was about 40,000 to 60,000 cells in a 200 μl culture medium. And cultured overnight in a CO ₂ incubator at 37 ° C. The following day, the Mito-Xpress Extra Oxygen Consumption Assay Kit (Luxcell Bioscience Inc., Inker, Little Island, Cork, Ireland) was used. At this time, oxygen consumption analysis was performed according to the manufacturer's protocol. Positive controls - glucose oxidase (Gox) and negative control - antimycin A (AA, complex III inhibitor) were used and were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Reading was performed using a Victor X3 multi-label reader (Pulcin Elmer, Waltham, Mass., USA) at 380 and 650 nm excitation and emission wavelengths, respectively. Data were expressed as percent of control (MDI).

1.10. 글리세롤 배출 분석1.10. Glycerol emission analysis

지방 분해의 양을 결정하기 위하여, 완전히 분화된 C3H10T1/2 세포에서의 글리세롤 배출 분석은 다른 곳에서 기술된 바와 같이 수행되었다^[41].To determine the amount of fat degradation, glycerol emission analysis in fully differentiated C3H10T1 / 2 cells was performed as described elsewhere ^[41] .

1.11. 이미지 정량화1.11. Image quantification

이미지J 소프트웨어는 http://rsb.info.nih.gov/ij에서 다운로드하였다. 웨스턴 블롯 및 면역 형광(IF)을 사용하였다. 면역 형광법을 이용하여 염색된 이미지는 이미지J를 사용하여 정량화하였다. 이전에 설명한 것처럼, 면역 형광법을 사용하여 염색된 이미지를 정량화하였다^[43]. 간단히 말해서, 면역 형광법을 사용하여 염색된 이미지를 가중치 8 비트 회색 스케일로 전환하였다. 이미지의 흰색과 검은색을 서로 반대로 전환하였고, 이미지J를 사용하여 정량화하였다.Image J software was downloaded from http://rsb.info.nih.gov/ij. Western blot and immunofluorescence (IF) were used. Images stained using immunofluorescence were quantified using image J. As previously described, immunofluorescence was used to quantify stained images ^[43] . Briefly, immunofluorescence was used to convert the stained image to a weighted 8-bit gray scale. The white and black colors of the image were reversed and quantified using the image J.

1.12. 통계 분석1.12. Statistical analysis

이 실험의 모든 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현되었다. 달리 명시하지 않는 한, MDI 처리된 시료 군을 사용하여, 대조군에 비해 변화가 어느 정도 이루어졌는지를 확인하였다. 대조군과 다른 처리군들 간의 유의한 차이는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)를 사용하여 계산하였다. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의 하다고 간주하였다.All data for this experiment were expressed as mean ± SD (SD) of three or more independent experiments. Unless otherwise specified, the MDI-treated sample groups were used to determine the extent of changes compared to the control group. Significant differences between the control and other treatment groups were calculated using the Student's t-test. * P? 0.05, ** P? 0.01, *** P? 0.001. A P value of less than 0.05 was considered statistically significant.

2. 결과2. Results

2.1. LA는 2.1. LA 트리글리세라이드(중성 지방)의Of triglycerides (triglycerides) 축적을 줄이고, 더 작은 지질 Less accumulation, smaller geology 액적(LDs)을The droplets (LDs) 형성한다. .

C3H10T1/2 MSC에서 지방 세포 생성이 이루어지고, 이것은 다음과 같은 결과에 의해서 입증된다. 전 지방 세포와 MDI 처리군을 비교했을 때 TG 축적이 40% 증가하였고(도 1의 C), ORO 염색에 의한 TG 축적 증가를 육안으로 관찰하였다(도 1의 F). 도 1의 F에 나타난 바와 같이, MDI 처리가 없는 실험군은 MDI 처리군에서의 현저한 TG 축적과 달리 TG 축적이 나타나지 않았다. TG 축적 5% 감소(n=3)에 의해 입증된 바와 같이, LA는 C3H10T1/2 MSC에서 중성 지방(TG) 축적을 감소시킨다(도 1의 C). 우리는 TG의 감소가 지질 저장의 억제로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 현미경 관찰을 통하여, 우리는 대조군(MDI)에 비해 LA 처리된 세포에서 더 작은 LD를 관찰하였다(도 1의 F). 세포의 거의 모든 부분을 커버하는 단일의 소포이고, 크기가 큰 LD가 MDI 처리된 그룹에서 관찰되었다(도 1의 F의 흰색 화살표). 그리고, 이것은 WAT의 큰 특징이다. 반면에, 세포 내에 크기가 작은 여러 개의 LD는 로시글리타존 및 LA를 처리한 그룹들에서 관찰되었다. 이것은 BAT의 독특한 특징이다^[23]. 이 발견을 통하여 우리는 갈색 및 베이지 관련 지방 생성 마커들에 대한 LA의 효과를 분석하게 되었다. 우선, 우리는 20μM LA가 전 지방 세포와 성숙한 지방 세포들에 대한 독성을 가지는지 아닌지를 확인하려고 하였다. C3H10T1/2 세포를 이용한 MTT 분석 결과에 의하면, LA는 이러한 조건들에서 세포 독성이 없었고, 우리는 약간의 세포 증식이 증가된 것을 관찰하였다(도 1의 C 및 D).Fatty cell production is achieved in the C3H10T1 / 2 MSC, which is evidenced by the following results. TG accumulation increased by 40% when compared to pre-adipocytes and MDI-treated group (Fig. 1C), and TG accumulation increase by ORO staining was visually observed (Fig. 1F). As shown in Fig. 1F, in the experimental group without MDI treatment, TG accumulation was not observed unlike the remarkable accumulation of TG in MDI-treated group. As demonstrated by the 5% reduction in TG accumulation (n = 3), LA decreases triglyceride (TG) accumulation in the C3H10T1 / 2 MSC (FIG. We hypothesized that the decrease in TG could be due to inhibition of lipid storage. Through microscopic observation, we observed smaller LDs in LA treated cells compared to the control (MDI) (Fig. 1F). A single vesicle covering almost all parts of the cells, large LDs were observed in the MDI-treated group (white arrows in Fig. 1 F). And this is a big feature of WAT. On the other hand, several small LDs in the cells were observed in groups treated with rosiglitazone and LA. This is a unique feature of BAT ^[23] . Through this discovery we have analyzed the effect of LA on brown and beige related fat production markers. First, we tried to determine whether 20 μM LA had toxicity to all adipocytes and mature adipocytes. MTT analysis using C3H10T1 / 2 cells showed that LA was not cytotoxic under these conditions, and we observed a slight increase in cell proliferation (FIGS. 1C and D).

2.2. LA는 갈색 및 베이지 지방 세포들의 유전자 발현을 유도하고, 백색 지방 2.2. LA induces gene expression of brown and beige adipocytes, and white fat 마커들의Markers 발현을 억제한다. Lt; / RTI >

PPAR-γ 작용 물질인 로시글리타존(Rosiglitazone)을 양성 대조군으로 사용하였고, 이것은 백색 지방 세포들을 갈색 및 베이지 지방 세포들로의 전환을 보여 주었다^[24]. 우리는 LA 및 로시글리타존이 유사하게 갈색 및 베이지 지방 세포 특이적 유전자들의 발현을 증가시키고, 백색 지방 세포 특이적 유전자의 발현을 억제함을 관찰하였다(도 2의 A, B 및 C). 흥미롭게도, LA는 Rosi와 MDI(n=3)를 사용했을 때와 비교하여, 베이지 특이적 유전자들인 Tbx1 및 Cox2 발현을 거의 4배 더 높게 유도하는 반면, Tmem26 발현은 감소시켰으나, CD137 및 Fgf21 발현은 유의하게 증가하지 않았다(도 2의 B). C3H10T1/2 세포에서 LA를 처리하면, 갈색 지방 특이적 유전자들의 발현은 다음과 같이 증가한다^[25]; Cidea, 1.6배(Rosi, 1.9배) 및 Dio2, 1.4배(Rosi, 1.6배). 반면에 갈색 및 베이지 마커들은 다음과 같이 증가하였다; Pgc- 1α, 4배(Rosi, 7배, n=3); Ucp1, 3.4배(Rosi, 1.4배); Prdm16, 2.5배(Rosi, 1.4배)(도 2의 A). 우리는 LA 처리를 했을 때, MDI는 C3H10T1/2 MSC 분화를 촉진하여 갈색 및 베이지 지방 세포로 분화되고, 백색 지방 생성이 감소할 것이라고 가정하였다. 우리는 백색 지방 조직에서 높게 발현되는 "포만 호르몬" 렙틴(Leptin)의 발현이^[26] 0.25배 감소하였고(Rosi, 0.7배, n=3), 아미노산 수송체이고, 갈색 지방 세포에서는 거의 발현하지 않는 백색 지방 세포 특이적 세포 표면 단백질인, Asc-1^[27]의 발현은 0.5배(Rosi 0.7배)로 억제되었다. Serpina3k 및 Psat1 mRNA 양도 감소하였다(각각 0.65배 및 0.94배)(도 2의 C). 한편, aP2(2배); Ppar-γ, 4.8배(Rosi, 6.4 배) 및 Resistin1 mRNA 양은 증가하였다(도 2의 C). 우리는 aP2 및 Ppar-γ가 공통적인 지방 생성 마커이며, 지방 생성 C3H10T1/2 MSCs에 필수적이며^[28], 또한 aP2 발현이 백색 지방보다 갈색 지방에서 더 높다는 것을 알고 있다(Biogps.org). 우리는 또한 갈색 지방 생성 결정의 초기 조절 인자인 Bmp7 유전자^[29]의 발현 증가(2.3배) 및 Bmp4 발현 감소를 관찰하였다. 그리고, Bmp5 발현은 변화하는 동안에 갈색 지방 세포에서 백색 지방 세포로 변화하는 것을 보여주었다^[30](도 2의 D).Rosiglitazone, a PPAR-γ agonist, was used as a positive control, indicating the conversion of white adipocytes into brown and beige adipocytes ^[24] . We observed that LA and rosiglitazone similarly increased the expression of brown and beige adipocyte specific genes and inhibited the expression of white adipocyte specific genes (FIGS. 2A, B, and C). Interestingly, LA induced nearly four-fold higher expression of Tbx1 and Cox2, the beige-specific genes, compared with Rosi and MDI (n = 3), while decreased Tmem26 expression, while CD137 and Fgf21 expression Did not significantly increase (Fig. 2B). When treated with LA in C3H10T1 / 2 cells, the expression of brown fat-specific genes increases as follows ^[25] ; Cidea, 1.6 times (Rosi, 1.9 times) and Dio2, 1.4 times (Rosi, 1.6 times). On the other hand, the brown and beige markers increased as follows; Pgc- 1 alpha, 4-fold (Rosi, 7-fold, n = 3); Ucp1, 3.4 fold (Rosi, 1.4 fold); Prdm16, 2.5 times (Rosi, 1.4 times) (Fig. 2A). We hypothesized that when treated with LA, MDI would promote C3H10T1 / 2 MSC differentiation to differentiate into brown and beige adipocytes and decrease white fat production. We observed a 0.25-fold decrease in expression of the highly expressed "satiety hormone" Leptin ^[26] in white adipose tissue (Rosi, 0.7-fold, n = 3), an amino acid transporter and almost absent in brown adipocytes The expression of Asc-1 ^[27] , a white adipocyte-specific cell surface protein, was inhibited 0.5-fold (Rosi 0.7-fold). Serpina3k and Psat1 mRNA levels were also decreased (0.65-fold and 0.94-fold, respectively) (Fig. 2C). On the other hand, aP2 (2-fold); Ppar-y, 4.8-fold (Rosi, 6.4-fold) and Resistin 1 mRNA levels were increased (FIG. We know that aP2 and Ppar-γ are common lipogenesis markers and are essential for fat-producing C3H10T1 / 2 MSCs ^[28] , and also that aP2 expression is higher in brown fat than in white fat (Biogps.org). We also observed increased expression (2.3-fold) and decreased Bmp4 expression of the Bmp7 gene ^[29] , an early regulator of brown fat production crystals. And, Bmp5 expression changed from brown adipocytes to white adipocytes during the change ^[30] (Fig. 2D).

2.3. LA는 2.3. LA C3H10T1C3H10T1 /2 /2 MSCMSC , BAT 및 , BAT and iWATiWAT 세포에서 갈색 지방 특이적 Brown-fat-specific in cells 마커의Marker 발현을 증가시킨다. Increases expression.

분명히, WAT에서 갈색 및 베이지 지방 형성을 조절하는 전사 조절 인자들은 페록시솜 증식체 활성화 수용체 감마(PPAR-γ), 페록시솜 증식체 활성화 수용체 감마 공활성 인자 1-알파(PGC-1α), PR 도메인 포함 16(PRDM16)이었다^[11,31]. 우리는 LA 용량이 C3H10T1/2 MSC에서 Ucp1 및 Pgc-1α 단백질 발현 및 Ucp1 유전자 발현을 증가시켰다는 것을 발견하였고, 이것은 LA가 백색 지방을 갈색화시킬 가능성이 있음을 보여주었다(도 3의 A 및 B). 우리는 또한 LA의 효과가 20μM에서 가장 높다는 것을 발견하였다. 갈색 지방 마커들인 Ucp1(6.5배, p < 0.05, n=3), Prdm16(2.1배), Ppar-γ(2.8배) 및 Pgc-1α(4.9배, p < 0.01)의 단백질 발현량이 C3H10T1/2 MSC에서의 대조군보다 높았다. 이것은 Pparg, Pgc-1α 및 Prdm16 에 의한 Ucp1 발현 유도의 전사 조절을 보여준다(도 3의 C). 또한, LA 처리는 iWAT 및 BAT 세포에서 이러한 마커들의 단백질 발현을 유의하게 유도하였다(도 3의 D 및 E). 주목할 점은, iWAT 및 BAT 세포들에서 LA를 처리할 경우, Ppar-γ 발현이 로시글리타존(Rosiglitazone)보다 높다는 것이다(도 3의 D 및 E).Clearly, transcriptional regulators that regulate brown and beige adipose formation in WAT include peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR-gamma), peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1 alpha) Including PR domain 16 (PRDM16) ^[11,31] . We have found that LA capacity increased Ucp1 and Pgc-1α protein expression and Ucp1 gene expression at C3H10T1 / 2 MSC, indicating that LA has the potential to brown white fat (FIGS. 3A and B) . We also found that the effect of LA was the highest at 20 μM. The protein expression levels of brown fat markers Ucp1 (6.5-fold, p <0.05, n = 3), Prdm16 (2.1-fold), Ppar-γ (2.8-fold) and Pgc- Was higher than the control group in MSC. This shows transcriptional regulation of Ucp1 expression induction by Pparg, Pgc-l [alpha] and Prdm16 (Fig. 3C). In addition, LA treatment significantly induced protein expression of these markers in iWAT and BAT cells (D and E in Fig. 3). Notably, when LA is treated in iWAT and BAT cells, the expression of Ppar-y is higher than that of rosiglitazone (D and E in Fig. 3).

2.4. LA는 미토콘드리아 생성을 촉진한다.2.4. LA promotes mitochondrial production.

PGC-1α 발현 유도와 함께 PPAR-γ 자극이 미토콘드리아 생성을 촉진할 수 있다고 보고되었다^[16]. 따라서, 우리는 LA에 의한 PPAR-γ 자극이 지방 세포에서 유사한 효과를 촉진할 수 있는지 여부를 조사하였다. 첫째, LA가 미토콘드리아 질량에 영향을 미치는지 아닌지를 평가하기 위하여, 우리는 미토크랙커로 염색하여 미토콘드리아 질량을 측정하여 질량이 증가하였는지를 평가하였다. 우리는 LA가 미토콘드리아 질량을 1.9배(n=3) 증가시키고, 미토콘드리아 내막 단백질 Ucp1 발현을 2.9배 증가시켰다는 것을 확인하였다. 이것은 양성 대조군(로시글리타존)의 정적인 효과와 비슷하다는 것을 확인하였다(도 4의 A 및 B). 그런 다음, 우리는 미토콘드리아 세포 함량 및 항상성에 대한 마커로 인식되는 Cox7a, Cox8b, Nrf1, Tfam, Opa1 및 Drp1의 발현 양에 대한 약물의 효과를 연구하였다^[16]. 도 4의 C에서 보여 주듯이, LA는 Cox7a, Cox8b(5배, n=3), Nrf1, Tfam, Opa1(10배) 발현을 유의하게 증가시켰고, Drp1 발현을 감소시켰다(n=3). 다음으로, 우리는 미토콘드리아 세포 함량의 다른 지표인 mtDNA 발현량을 측정하였다^[16]. 도 4의 D에서 보여 주듯이, 대조군 세포와 비교하여 mtDNA, Cox1의 양이 유의하게 증가하였다(+1.6배, p < 0.05; n=3; 도 4의 D). 마지막으로, 우리는 또 다른 미토콘드리아 생합성 마커인 Sirt1을 측정하고, 도 4의 E에서 보여 주듯이, LA 처리는 C3H10T1/2 세포, iWAT 및 BAT 세포에서 Sirt1 단백질 발현을 증가시켰다.PPAR-γ stimulation with PGC-1α induction has been reported to promote mitochondrial production ^[16] . Thus, we examined whether PPAR-gamma stimulation by LA could promote similar effects in adipocytes. First, to assess whether LA affects mitochondrial mass, we measured mitochondrial mass by staining with mitochrone to assess whether the mass increased. We confirmed that LA increased mitochondrial mass by 1.9-fold (n = 3) and increased mitochondrial endothelial protein Ucp1 expression by 2.9-fold. It was confirmed that this was similar to the static effect of the positive control (rosiglitazone) (FIGS. 4A and B). We then studied the effects of drugs on the expression levels of Cox7a, Cox8b, Nrf1, Tfam, Opa1 and Drp1, which are recognized as markers for mitochondrial cell content and homeostasis ^[16] . As shown in FIG. 4C, LA significantly increased Cox7a, Cox8b (5-fold, n = 3), Nrf1, Tfam, Opa1 (10-fold) expression and decreased Drp1 expression (n = 3). Next, we measured mtDNA expression, another indicator of mitochondrial cell content ^[16] . As shown in FIG. 4D, the amount of mtDNA and Cox1 was significantly increased (+1.6 times, p <0.05; n = 3; D of FIG. Finally, we measured another mitochondrial biosynthetic marker, Sirt1, and LA treatment increased Sirt1 protein expression in C3H10T1 / 2 cells, iWAT and BAT cells, as shown in Figure 4E.

2.5. 2.5. C3H10T1C3H10T1 /2 세포에 LA를 처리하면 갈색 지방 세포와 유사한 형태를 보여 준다./ 2 cells treated with LA show a similar pattern to brown adipose cells.

C3H10T1/2 세포에 MDI를 처리하면 백색 지방 생성이 진행된다. 이것은 말초 핵을 가진 세포의 거의 모든 영역에 작은 액적의 단일 지질이 존재한다는 것을 입증한다(도 5의 A). 반면에 LA를 처리하면 로시글리타존 처리하는 것과 같이 중심 핵 주위에 여러 작은 LD의 갈색 지방 세포-유사 특징을 나타냈다(도 1의 F 및 도 5의 A). 지방 분해가 발생하면, 더 큰 LD가 분해되어 여러 개의 작은 LD를 생성한다. 또한, 더 많은 양의 미토콘드리아는 더 높은 산화 능력의 메커니즘을 작동할 수 있게 한다. 우리 연구에서, LA를 처리하는 것은 대조군(MDI 군), 양성 대조군 포도당 산화 효소(Gox)가 OC를 60% 증가시켰을 때와 비교하여, 120분 동안 평균 산소 소비량을 13% 증가시켰다. 반면에, 음성 대조군인 안티마이신 A(Antimycin A)(AA, 복합체 III 억제제)는 OC를 13% 낮추었다(도 5의 B).When C3H10T1 / 2 cells are treated with MDI, white fat production proceeds. This demonstrates the presence of small lipid monoliths in almost all regions of cells with peripheral nuclei (Fig. 5A). On the other hand, treatment of LA showed brown fat-like features of several small LDs around the central nucleus as treated with rosiglitazone (F in Figure 1 and A in Figure 5). When fat decomposition occurs, the larger LD is decomposed to produce several small LDs. In addition, larger amounts of mitochondria enable the mechanism of higher oxidative capacity to operate. In our study, treatment of LA increased mean oxygen consumption by 13% over 120 min compared to a 60% increase in OC compared to control (MDI group), positive control glucose oxidase (Gox). On the other hand, the negative control Antimycin A (AA, complex III inhibitor) lowered OC by 13% (FIG. 5B).

2.6. LA 처리는 2.6. LA processing Hsl을Hsl LD의 표면으로 옮기고, 지방 분해를 촉진한다. Transfer to the surface of the LD and promote lipolysis.

다음으로 우리는 LA 처리가 호르몬에 민감한 지방 분해 효소(Hsl), Angptl4 및 Atgl 유전자 발현(도 6의 A)뿐만 아니라, Atgl 단백질 발현(도 7의 D)을 증가시킨다는 것을 확인하였으며, 이러한 발현의 증가는 지방 세포들에서 지방 분해 증가를 나타낸다. 유전자 발현 증가 결과는 글리세롤의 배출 증가에 의해 입증되었다(도 6의 B). 반대로, LA 처리에 의해 페릴리핀(perilipin) 유전자 및 단백질 발현이 증가하였고(도 6의 A 및 도 7의 D), 지방 분해가 시작되기 위해서는 페릴리핀이 필요하다는 보고가 있었다^[32]. 또한, 우리는 LA 처리가 Hsl을 LD로 전이시킨다는 것을 발견하였다(도 6의 C). 도 6의 C의 Hsl 및 페릴리핀 면역 염색 이미지에서 볼 수 있듯이, MDI 처리 후 Hsl 효소는 세포질에 있으며, 큰 LD 주변에는 존재하지 않았다. 그러나, LA 및 로지글리타존 처리 후, Hsl 효소는 지방 분해를 나타내는 작은 LD의 표면으로 미세하게 전위된다.Next, we found that LA treatment increased Atgl protein expression (D in FIG. 7) as well as hormone-sensitive lipase (Hsl), Angptl4 and Atgl gene expression (FIG. 6A) Increased lipolysis shows increased lipolysis in adipocytes. Increased gene expression was evidenced by an increase in glycerol emissions (Fig. 6B). Conversely, there was a report that perilipin gene and protein expression was increased by LA treatment (Fig. 6A and Fig. 7D), and that perlipine was required to initiate lipolysis ^[32] . We also found that LA treatment transfers Hsl to LD (Fig. 6C). As shown in the Hsl and perillipine immunohistochemical images of Figure 6C, the Hsl enzyme after MDI treatment was in the cytoplasm and was not present around large LDs. However, after treatment with LA and rosiglitazone, the Hsl enzyme is minutely displaced to the surface of a small LD that exhibits lipolysis.

2.7. 2.7. C3H10T1C3H10T1 /2 세포들이 LA에 의해서 갈색 유사 지방 세포들로 전환되는 리모델링을 위해서는 PKA의 활성화가 필요하다./ 2 < / RTI > cells are transformed into brown-like adipocytes by LA, activation of PKA is required.

메커니즘에 대한 연구에서, 우리는 LA 처리가 베타 아드레날린 수용체 3(Adrb3) 및 아데니릴 사이클라제 유전자(Adcy3, Adcy6 및 Adcy8; 도 7의 A)의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 다음으로 우리는 LA가 PKA 신호 전달을 활성화시켜 PKA 기질의 인산화를 유도한다는 것을 발견하였다(도 7의 B). 지방 세포들의 대사적 갈변을 일으키는 분자 메커니즘을 해독하기 위하여, 우리는 PKA 억제제인 H89로 처리하여 PKA의 활성을 억제하였다(도 7의 B). 도 7의 C에서 보여 주듯이, H89에 의한 PKA 활성의 저해는 PKA 신호 전달의 하위 단계에 위치한 백색 지방 전사 인자들인 Pgc-1a 및 Ucp1 의 갈색화를 억제하였다. 그리고, MDI 및 LA와 비교하여 더 넓은 범위의 유전자들이 조절되었다. H89의 처리는 PKA에 의한 인산화되는 표적 부위인 세린-563 및 세린-660에 LA에 의한 Hsl의 인산화를 특이적으로 억제하였다(도 7의 C). 대조적으로, Hsl, Atgl 및 페릴리핀과 같은 H89의 일부 비특이적 단백질의 예상치 못한 저해가 관찰되었다(도 7의 C). 다음으로 우리는 PKA-cat 유전자 발현 억제를 적용하여 H89의 비특이적 억제를 배제하기로 결정하였다. PKA-cat 유전자 발현 억제는 지방 세포의 갈변에 대한 PKA의 역할을 더욱 강화시킬 수 있다.In a study of the mechanism, we found that LA treatment increased gene expression of beta adrenergic receptor 3 (Adrb3) and adenylyl cyclase genes (Adcy3, Adcy6 and Adcy8; Next, we found that LA activated PKA signaling leading to PKA substrate phosphorylation (Fig. 7B). To detoxify the molecular mechanism causing metabolic browning of adipocytes, we treated PKA inhibitor H89 to inhibit the activity of PKA (Fig. 7B). As shown in Figure 7C, inhibition of PKA activity by H89 inhibited the browning of white fat transcription factors Pgc-1a and Ucp1, which are located in the lower stages of PKA signal transduction. And, a broader range of genes was regulated compared to MDI and LA. Treatment of H89 specifically inhibited the phosphorylation of Hsl by LA in serine-563 and serine-660, which are target sites phosphorylated by PKA (Fig. 7C). In contrast, unexpected inhibition of some nonspecific proteins of H89, such as Hsl, Atgl, and perilipine, was observed (Figure 7C). Next, we decided to exclude the nonspecific inhibition of H89 by inhibiting PKA-cat gene expression. Inhibition of PKA-cat gene expression may further enhance the role of PKA in the browning of adipocytes.

3. 논의 및 결론3. Discussion and Conclusion

지방 세포의 갈색화와 이와 관련된 대사 효과의 출현은 대사 질환을 치료하기 위한 천연 화합물의 탐색에 대한 상당한 관심을 불러 일으켰다. 여기에서 우리는 C3H10T1/2 MSC에서 갈색-유사 열 발생 프로그램을 유도하는 작은 분자를 입증 하였다. 우리는 Ucp1의 유력한 유도제를 확인한 후 쥐의 세포주에서 지질 액적 형태를 재구성하였다. 우리는 천연 화합물 LA가 지방 세포에서 PKA 신호 전달 경로를 표적으로하고, C3H10T1/2 MSC 및 iWAT 에 갈색화 유사 대사 특성을 생각하게 하는 뚜렷한 효과가 있음을 발견하였다. 우리의 웨스턴 블랏 분석 및 qRT-PCR 데이터는 C3H10T1/2 MSC(용량 의존적 방식), BAT 및 iWAT 세포에서 Ucp1의 발현이 증가됨을 확인하였다. 이 증가는 또한 Ucp1 항체를 이용한 면역 염색 분석에 의해 확인되었다. BAT 분화의 주요 조절 인자는 Prdm16을 코딩하는 유전자이다. 그리고, 이 유전자의 발현은 근원(myogenic) 및 백색 지방 전구체로부터 갈색 지방 세포로의 분화를 유도할 수 있다^[33,34]. 이는 Prdm16 및 그 파트너 Pgc-1a의 발현 증가 및 Ucp1 발현의 후속 증가와 함께 발생한다. The emergence of adipocyte browning and associated metabolic effects has generated considerable interest in the search for natural compounds for the treatment of metabolic disorders. Here we demonstrate a small molecule that induces a brown-like heat-generating program in the C3H10T1 / 2 MSC. After confirming the potent inducer of Ucp1, we reconstructed the lipid droplet form in the mouse cell line. We have found that the natural compound LA has a distinct effect of targeting the PKA signaling pathway in adipocytes and allowing the C3H10T1 / 2 MSC and iWAT to reflect the brownish phenotypic character. Our Western blot analysis and qRT-PCR data confirmed increased expression of Ucp1 in C3H10T1 / 2 MSC (dose dependent manner), BAT and iWAT cells. This increase was also confirmed by immunostaining assay using Ucp1 antibody. The primary regulator of BAT differentiation is the gene encoding Prdm16. And, the expression of this gene can induce differentiation from myogenic and white lipid precursors into brown adipocytes ^[33,34] . This occurs with increased expression of Prdm16 and its partner Pgc-1a and subsequent increase of Ucp1 expression.

LA에 의한 미토콘드리아 생합성은 여러 수준에서 확인되었다. LA 처리는 미토콘드리아 생합성 관련 유전자 및 단백질의 발현을 촉진시켰다. 미토콘드리아 생합성은 주로 Ugp1 발현 조절에 역할을 하는 Pgc-1a에 의해 조절된다^[35]. Sirt1은 기능적으로 Pgc-1a와 상호 작용하고, 미토콘드리아 생합성을 촉진한다^[36]. Pgc-1a 및 Sirt1의 발현이 증가한다는 결과는 이전 연구들의 결과와 관련이 있다. LA가 미토콘드리아 생합성뿐만 아니라 Ucp1 전사 인자 및 Ucp1 발현을 증가시키고, 지방 세포를 함유하는 더 작은 LD를 유도하여 더 높은 산소 소비를 유도한다는 가설은 합리적이다. LA 처리군에서, 지방 분해 및 Ucp1 발현의 증가는 UCP1이 매개된 결합 해제를 통한 양성자 농도가 감소되는 것을 나타내며, 이는 발생되는 열의 양을 결정하는 추가적인 생체 내 실험이 필요하다. LA가 C3H10T1/2, BAT 및 iWAT에서 미토콘드리아 질량 및 UCP1 발현을 증가시켰기 때문에, LA에 의해 증가된 산소 소비는 현재의 방법으로 적극적으로 측정하기 어려운 세포들의 갈변에 어느 정도의 역할을 가질 수 있다.Mitochondrial biosynthesis by LA was observed at several levels. LA treatment promoted the expression of mitochondrial biosynthesis related genes and proteins. Mitochondrial biosynthesis is regulated mainly by Pgc-1a, which plays a role in the regulation of Ugp1 expression ^[35] . Sirt1 functionally interacts with Pgc-1a and promotes mitochondrial biosynthesis ^[36] . The results of increased expression of Pgc-1a and Sirt1 are related to the results of previous studies. It is reasonable to assume that LA increases mitochondrial biosynthesis as well as Ucp1 transcription factor and Ucp1 expression and induces smaller LDs containing adipocytes, leading to higher oxygen consumption. In the LA treated group, increased lipolysis and increased expression of Ucp1 indicate decreased proton concentration through UCP1 mediated disassociation, which requires additional in vivo experiments to determine the amount of heat generated. Because LA increased mitochondrial mass and UCP1 expression in C3H10T1 / 2, BAT, and iWAT, increased oxygen consumption by LA can play a role in the browning of cells that are hard to measure positively in current ways.

지방 세포들에서 트리글리세라이드(중성 지방)의 가수 분해는 다른 기관에 연료를 공급하는 과정이며, 이 과정은 아드레날린 수용체 신호 전달(ARS)에 의해 제어된다. ARS는 또한 갈색 지방 세포 열 생성 및 에너지 소비를 촉진시키는 경로로 알려져 있다. PKA의 촉매 서브 유닛(PKA-Cat)은 그것의 표적 단백질인 지방 분해 효소 및 LD 단백질인 페리릴핀(perilipin)을 인산화시킨다^[37]. 우리는 LA 처리가 베타-아드레날린 수용체 3, 하위 단계에 위치한 아데니릴 사이클라제 유전자 및 활성화된 PKA 의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. PKA 억제제 H89에 의한 처리는 LA에 의한 PKA 활성화를 중단시킨다. 또한, 우리는 H89에 의한 PKA 인산화의 저해가 PKA 표적 부위인 HSL의 세린-563 및 세린-660에서의 인산화뿐만 아니라 갈변 및 지방 분해 관련 단백질 발현 양에 영향을 주는 LA의 효과를 막는다는 것을 확인하였다. H89 처리가 약간의 비특이적 억제를 나타냈기 때문에, 우리는 siRNA에 의한 PKA-cat-alpha의 발현을 제거함으로써 갈변에 PKA 신호 전달 경로가 관련되어 있다는 것을 확인하였다. PKA-cat-alpha의 발현을 제거하는 것은 HSL 인산화(PKA 표적 부위인 세린-563 및 세린-660 위치에서의 인산화)뿐만 아니라 갈색 지방 세포 특이적 마커 발현을 억제하였다. PKA 인산화, 후속 Hsl 인산화, 지방 분해 및 갈변 관련 단백질의 발현이 연관되어있는 것처럼 보이지만, 우리는 PKA 의 활성화가 이러한 모든 일들에서 중심적인 역할을 할 수 있다고 가정하였다.Hydrolysis of triglycerides in adipocytes is the process of feeding other organs and this process is controlled by adrenergic receptor signaling (ARS). ARS is also known to be a pathway that promotes brown fat cell heat generation and energy consumption. The catalytic subunit of PKA (PKA-Cat) phosphorylates its target protein, the lipolytic enzyme and the LD protein, perilipin ^[37] . We have found that LA treatment increases the expression of beta-adrenergic receptor 3, downstream of the adenylyl cyclase gene and activated PKA. Treatment with the PKA inhibitor H89 stops PKA activation by LA. We also found that inhibition of PKA phosphorylation by H89 blocks the effect of LA on phosphorylation of serine-563 and serine-660 of HSL, the PKA target site, as well as the amount of browning and lipolytic-related protein expression Respectively. Because H89 treatment exhibited some nonspecific inhibition, we confirmed that the PKA signaling pathway is involved in browning by removing the expression of PKA-cat-alpha by siRNA. Elimination of PKA-cat-alpha expression inhibited HSL phosphorylation (PKA target sites serine-563 and serine-660 phosphorylation) as well as brown adipocyte-specific marker expression. Although PKA phosphorylation, subsequent Hsl phosphorylation, lipolysis and expression of browning-related proteins appears to be involved, we assumed that activation of PKA could play a central role in all of these activities.

포유 동물에서 카테콜아민은 PKA를 활성화시켜 HSL를 인산화시키고, HSL 기능을 증대시켜서 지방 분해를 유도한다^[38]. 종양 괴사 인자(TNFα)는 지질 액적 보호 단백질인 페릴리핀의 기능에 영향을 주어 지방 분해를 유도한다^[38]. LA는 카테콜아민이 활성화시킨 PKA와 유사한 경로를 따른다.In mammals, catecholamines activate PKA to phosphorylate HSL and increase HSL function, leading to lipolysis ^[38] . Tumor necrosis factor (TNFα) influences the function of perilipine, a lipid droplet protective protein, leading to lipolysis ^[38] . LA follows a pathway similar to PKA activated by catecholamines.

백색에서 갈색 및 브라이트 (갈색과 흰색 사이) 지방 세포들로의 정확한 기원 및 분화에 대해선 논쟁의 여지가 있기 때문에^[39,40], 우리는 체외에서 갈색 지방과 유사한 세포들에 대하여 LA가 매개된 다른 가능한 기작을 배제할 수 없다. 이 문제를 해결하기 위해서는 더 많은 지방 세포들의 운명 결정 실험이 필요하다.Because there is controversy over the precise origin and differentiation of white to brown and bright (between brown and white) adipocytes ^[39,40] , we have shown that LA is mediated to cells similar to brown fat in vitro Other possible mechanisms can not be ruled out. To solve this problem, more fat cells need fate determination experiments.

결론적으로, 우리는 이 연구에서 LA가 C3H10T1/2 MSCs 세포뿐만 아니라 iWAT 및 BAT 세포에서도 갈색 지방 세포와 유사한 특성을 유도한다는 것을 성공적으로 보여주었다. LA가 매개시킨 갈색 지방 세포와 유사한 특성들은 UCP-1, Prdm16 및 PGC-1α 발현의 증가, 산소 소비량의 증가, 미토콘드리아 생합성, 다소포 LD의 형성 및 베이지 지방 세포 마커의 증진과 같이 여러 수준에서 나타났다. 또한, LA는 PKA 신호 전달 경로 및 후속 지방 분해 및 열 생성 프로그램을 활성화시킨다. 우리가 아는 한, 이것은 C3H10T1/2 MSC에서 갈색 및 베이지 지방 세포 표현형에 영향을 미치는 LA의 효과에 대한 첫 번째 보고이다. 우리는 LA가 비만 또는 비만 관련 대사 장애의 치료제 후보가 되기 위하여는 추가 조사가 필요하지만 가능성이 높은 후보 물질이라고 제안한다.In conclusion, we have successfully shown that LA induces properties similar to brown adipocytes in C3H10T1 / 2 MSCs cells as well as iWAT and BAT cells in this study. Similar properties of LA-mediated brown adipocytes were found at various levels, such as increased expression of UCP-1, Prdm16 and PGC-1α, increased oxygen consumption, mitochondrial biosynthesis, formation of multiple PO LDs, and enhanced beige adipocyte markers . In addition, LA activates the PKA signaling pathway and subsequent fat decomposition and heat generation programs. As far as we know, this is the first report on the effect of LA on C3H10T1 / 2 MSC on brown and beige adipocyte phenotypes. We suggest that LA is a highly likely candidate, although further investigation is needed to become a candidate for treatment of obesity or obesity-related metabolic disorders.

<110> SOON CHUN HYANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OBESITY COMPRISING LICARIN A OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT <130> YP170032 <160> 64 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 forward primer <400> 1 gggtggcact caagaaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 reverse primer <400> 2 agtgttccag gacacccttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp2 forward primer <400> 3 gggacccgct gtcttctagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp2 reverse primer <400> 4 tcaactcaaa ttcgctgagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp4 forward primer <400> 5 gacttcgagg cgacacttct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp4 reverse primer <400> 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Elov13 reverse primer <400> 22 ggacctgatg caaccctatg a 21 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fabp4 (aP2) forward primer <400> 23 gtgatgcctt tgtgggaaac ctggaag 27 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fabp4 (aP2) reverse primer <400> 24 tcataaactc ttgtggaagt cacgcc 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Gapdh forward primer <400> 25 gacatgccgc ctggagaaac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Gapdh reverse primer <400> 26 agcccaggat gccctttagt 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 forward primer <400> 27 gagcatgttt tcagacgact ttg 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 reverse primer <400> 28 ccgagggtct tcatgtttcc tt 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD137 forward primer <400> 29 cgtgcagaac tcctgtgata ac 22 <210> 30 <211> 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forward primer <400> 53 taccgccttg tcaagaaacc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 reverse primer <400> 54 agtggagcgc cagaatagaa 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin forward primer <400> 55 tgccagtgtg caaggataga ct 22 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin reverse primer <400> 56 cgctcacttc cccgacat 18 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k forward primer <400> 57 ggctgaaggc aaagtcagtg t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k reverse primer <400> 58 tggaatctgt cctgctgtcc t 21 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam forward primer <400> 59 gtccataggc accgtattgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam reverse primer <400> 60 cccatgctgg aaaaacactt 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 forward primer <400> 61 ggcattcaga ggcaaatcag ct 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 reverse primer <400> 62 cgcaagttca cagtcgttcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin forward primer <400> 63 cacacacgca gtcggtatcc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin reverse primer <400> 64 agcccaggaa tgaagtccaa 20 <110> SOON CHUN HYANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OBESITY COMPRISING LICARIN A OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT <130> YP170032 <160> 64 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 forward primer <400> 1 gggtggcact caagaaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 reverse primer <400> 2 agtgttccag gacacccttg 20 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reverse primer <400> 26 agcccaggat gccctttagt 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 forward primer <400> 27 gagcatgttt tcagacgact ttg 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 reverse primer <400> 28 ccgagggtct tcatgtttcc tt 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD137 forward primer <400> 29 cgtgcagaac tcctgtgata ac 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD137 reverse primer <400> 30 gtccacctat gctggagaag g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fgf21 forward primer <400> 31 agatcaggga ggatggaaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fgf21 reverse primer <400> 32 tcaaagtgag gcgatccata 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tbx1 forward primer <400> 33 ggcaggcaga cgaatgttc 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tbx1 reverse primer <400> 34 ttgtcatcta cgggcacaaa g 21 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tmem26 forward primer <400> 35 accctgtcat cccacagag 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tmem26 reverse primer <400> 36 tgtttggtgg agtcctaagg tc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Opa1 forward primer <400> 37 cagctggcag aagatctcaa g 21 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Opa1 reverse primer <400> 38 tatgagcagt ttgacaca 18 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse p0 forward primer <400> 39 gcactttcgc tttctggagg gtgt 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse p0 reverse primer <400> 40 tgacttggtt gctttggcgg gatt 24 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse P2rx5 forward primer <400> 41 ctgcagctca ccatcctgt 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse P2rx5 reverse primer <400> 42 cactctgcag ggaagtgtca 20 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pat2 forward primer <400> 43 gtgccaagaa gctgcagag 19 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pat2 reverse primer <400> 44 tgttgccttt gaccagatga 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pgc1a forward primer <400> 45 acagctttct gggtggatt 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pgc1a reverse primer <400> 46 tgaggaccgc tagcaagttt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara forward primer <400> 47 gcgtacggca atggctttat 20 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara reverse primer <400> 48 gaacggcttc aggttctt 18 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 49 tttgaaagaa gcggtgaacc ac 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pparg reverse primer <400> 50 accattgggt cagctcttgt g 21 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 51 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 reverse primer <400> 52 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 forward primer <400> 53 taccgccttg tcaagaaacc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 reverse primer <400> 54 agtggagcgc cagaatagaa 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin forward primer <400> 55 tgccagtgtg caaggataga ct 22 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin reverse primer <400> 56 cgctcacttc cccgacat 18 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k forward primer <400> 57 ggctgaaggc aaagtcagtg t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k reverse primer <400> 58 tggaatctgt cctgctgtcc t 21 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam forward primer <400> 59 gtccataggc accgtattgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam reverse primer <400> 60 cccatgctgg aaaaacactt 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 forward primer <400> 61 ggcattcaga ggcaaatcag ct 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 reverse primer <400> 62 cgcaagttca cagtcgttcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin forward primer <400> 63 cacacacgca gtcggtatcc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin reverse primer <400> 64 agcccaggaa tgaagtccaa 20

Claims

리카린 A(licarin A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising licarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

리카린 A(licarin A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.A health functional food for preventing or ameliorating obesity comprising licarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

리카린 A(licarin A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 슬리밍용 화장료 조성물.A cosmetic composition for slimming comprising licarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

제 3항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 로션, 화장수, 크림, 에센스, 폼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.The cosmetic composition according to claim 3, wherein the cosmetic composition is a formulation selected from the group consisting of lotion, lotion, cream, essence, foam and pack.

리카린 A(licarin A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포 또는 백색 지방 세포의 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포로의 분화 유도용 시약 조성물.A reagent composition for inducing differentiation of mesenchymal stem cells or white adipocytes into brown adipocytes or beige adipocytes comprising licarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

제 5항에 있어서, 상기 분화 유도된 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포는 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 분화 유도용 시약 조성물.6. The method according to claim 5, wherein the differentiation-induced brown adipocytes or beige adipocytes have increased oxygen consumption, more multilocular lipid droplets, increased intracellular mitochondrial content and copy number, and increased UCP1 (uncoupling protein 1) And a phenotype selected from the group consisting of an increase in the expression level of the expression vector.

제 5항에 있어서, 상기 분화 유도는 PKA(protein kinase A) 신호 경로의 활성화에 의한 것임을 특징으로 하는 분화 유도용 시약 조성물.6. The reagent composition according to claim 5, wherein the induction of differentiation is by activation of a PKA (protein kinase A) signal pathway.

분리된 중간엽 줄기세포 또는 분리된 백색 지방 세포에 리카린 A(licarin A) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 갈색 지방 세포 또는 베이지 지방 세포로의 분화 유도 방법. A method of inducing differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes comprising treating isolated mesenchymal stem cells or isolated white adipocytes with licarin A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.