KR101921735B1 - Pharmaceutical composition for prevention or treatment of obesity comprising medicarpin or pharmaceutically acceptable salts thereof as an effective component - Google Patents

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김용식
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윤다현
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순천향대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition or the like for prevention or treatment of obesity containing medicarpin or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient. More specifically, the pharmaceutical composition or the like for prevention or treatment of obesity is capable of inducing the differentiation of white adipose cells into brown fat cells or beige fat cells by browning of fat cells exhibiting phenotypes such as an increase in oxygen consumption, generation of multilocular lipid droplets, increases in intracellular mitochondria content and copy number, and an increase in the expression ratio of uncoupling protein 1 (UCP1) genes. According to the present invention, the medicarpin or the pharmaceutically acceptable salts thereof is a very useful invention for a pharmaceutical industry or the like since the medicarpin or the pharmaceutically acceptable salts thereof can be applied to medicines or the like for treating a metabolic disease such as obesity by effectively differentiating the white adipose cells into the brown or beige fat cells through browning.

Description

메디카르핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OBESITY COMPRISING MEDICARPIN OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, which comprises, as an active ingredient, medicinal or a pharmaceutically acceptable salt thereof. [0002] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity,

본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가와 같은 표현형을 나타내는 지방세포의 갈색화(browning)에 의한 백색 지방세포의 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화를 유도시킬 수 있는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, which comprises Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, (brown lipid droplets) of white adipocytes by increasing the intracellular mitochondrial content and the number of copies, and increasing the expression level of UCP1 (uncoupling protein 1) A pharmaceutical composition for preventing or treating obesity that can induce differentiation into adipocytes, and the like.

제 2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 고혈당증, 이상지질혈증, 가속화된 심혈관 질환 및 암 위험의 증가로 인해 비만은 일반적인 건강 문제 중에서 6번째로 심각한 위험 요인이 되었다(1, 2). 과학 기술 발전으로 식료품 가격이 낮아지고, 좌식 생활 경향에 따른 체중 증가가 가속화되었다. 현재, 비만은 급속히 확산되고 있고, 공중 보건 및 외모 등의 문제와 동반되는 경각심을 불러 일으키는 경제적 현상이다(3). 좌식 생활 방식과 증가된 음식 섭취, 에너지 소비의 불균형 및 지방 조직으로 에너지의 저장은 백색 지방 저장소에 지방으로 에너지를 축적시킨다. 따라서, 증가된 식료품 소비 비용은 증가하는 비만 및 관련 대사성 합병증의 치료에 더 많은 비용 지불을 가속화하고 있다(4). Obesity is the sixth most common health problem due to increased risk of type 2 diabetes, insulin resistance, hyperglycemia, dyslipidemia, accelerated cardiovascular disease, and cancer risk (1, 2) . The development of science and technology has lowered the price of groceries and accelerated the weight increase due to the sedentary lifestyle trend. At present, obesity is rapidly spreading, and it is an economic phenomenon that raises awareness that is accompanied by problems such as public health and appearance (3) . The sedentary lifestyle and increased food intake, the imbalance of energy consumption, and the storage of energy into adipose tissue accumulate energy in fat in the white fat reservoir. Therefore, increased food consumption costs are accelerating the payment of more costs for the treatment of increasing obesity and related metabolic complications (4) .

백색 지방 조직(WAT, white adipose tissue)의 장기적인 에너지 저장은 비만으로 이어질 수 있다. 다른 한편으로, 에너지를 소비하는 갈색 지방세포 및 베이지 지방세포는 비만을 막을 수 있다. 갈색 지방 조직(BAT, brown adipose tissue)은 조직학적으로 WAT와 구별되며, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets, LDs)과 uncoupling protein 1(UCP1)을 운반하는 다수의 미토콘드리아를 포함한다. BAT는 중성지방 가수분해(triglyceride hydrolysis)에 의해 생성되는 지방산을 산화시켜 에너지를 소비하는 역동적인 역할을 한다(5). 최근 자료에 따르면, 두 가지 유형의 갈색 지방이 있다: MYF-5-양성 세포 계통으로부터 유래된 고전적인 갈색 지방 및 감기 또는 β-아드레날린성 자극에 노출된 후 MYF-5-음성 계통의 백색 지방에 나타나는 UCP1-양성 세포(6). UCP1은 연소 기계(combustion machinery)로서 열발생을 개시하고, 백색 지방에서의 추가 에너지 소비를 가역화시킬 수 있다. 따라서, 백색 지방을 갈색 또는 베이지 지방으로 변환하는 것은 연소 기계(즉, UCP1)를 건초 더미(즉, WAT)에 직접 놓는 것과 같다(7): 이 방법은 과도한 지방 축적을 감소시키고, 대사 장애를 완화시키는데 도움이 될 수 있다(4, 8).Long-term energy storage of white adipose tissue (WAT) can lead to obesity. On the other hand, brown fat cells and beef fat cells that consume energy can prevent obesity. Brown adipose tissue (BAT) is histologically distinct from WAT and contains multiple mitochondria carrying multilocular lipid droplets (LDs) and uncoupling protein 1 (UCP1). BAT plays a dynamic role in energy consumption by oxidizing fatty acids produced by triglyceride hydrolysis (5) . According to recent data, there are two types of brown fat: classic brown fat derived from the MYF-5-positive cell line and white fat of the MYF-5-negative system after exposure to cold or β-adrenergic stimuli UCP1-positive cells that appear (6) . UCP1 can initiate heat generation as a combustion machinery and can reverse the additional energy consumption in the white fat. Thus, the conversion of white fats to brown or beige fats is equivalent to placing the combustion machine (ie, UCP1) directly in a haystack (ie WAT) (7) : this method reduces excessive fat accumulation, (4, 8), which may be helpful in mitigation.

보고된 바에 따르면, peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha(PGC-1α), PR domain-containing 16(PRDM16), CCAAT-enhancer-binding protein alpha(C/EBPα) 및 peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARγ)를 포함하는 다수의 전사 조절인자뿐만 아니라, bone morphogenetic protein 7(BMP7), BMP4, irisin 및 fibroblast growth factor 21(FGF21)과 같은 다수의 분비된 중개자(mediators)는 갈색-유사 지방세포의 분화를 촉진시킬 수 있다(4, 9). 한편, 최근 연구 결과에 따르면, cyanidin-3-glucoside, curcumin, quercetin 및 resveratrol을 포함하는 phytochemicals가 WAT에서 지방세포의 갈색화(browning)를 촉진한다는 것을 밝혔다(10-13). phytochemicals에 의한 WAT의 갈색화는 열생성 유전자(thermogenic genes) 및 전사인자의 발현 증가 또는 관련된 조절 신호 경로의 활성화와 관련이 있다(14). 전신 에너지 센서와 조절자인 AMPK의 활성화는 상기 언급된 phytochemicals 및 WAT의 갈색화에 관한 모든 연구에서 보고되어 있다(10-13). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC-1α), PR domain-containing 16 (PRDM16), CCAAT-enhancer-binding protein alpha Many mediators, such as bone morphogenetic protein 7 (BMP7), BMP4, irisin and fibroblast growth factor 21 (FGF21), as well as a number of transcriptional regulators, including PPARgamma, (4, 9) . Recent studies have shown that phytochemicals, including cyanidin-3-glucoside, curcumin, quercetin and resveratrol, promote browning of adipocytes in WAT (10-13) . Brownening of WAT by phytochemicals is associated with increased expression of thermogenic genes and transcription factors or activation of related regulatory signaling pathways (14) . Activation of the AMPK, a systemic energy sensor and regulator, has been reported in all studies on the above mentioned phytochemicals and WAT browning (10-13) .

C3H10T1/2 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells)는 잘 확립된 지방 생성의 세포 모델이며, 지방세포 분화로 진행하고, 덱사메타손, 인슐린 및 포스포디에스테라제 억제제인 methyl-isobutyl-xanthine(MDI)을 포함하는 호르몬 자극의 적어도 6일 후에 성숙한 백색 지방세포로 된다(15).C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells are a well-established cellular model of lipogenesis, progressing to adipocyte differentiation and inducing dexamethasone, insulin and phosphodiesterase inhibitor methyl-isobutyl-xanthine (MDI) It becomes a mature white adipose cell after at least 6 days of hormonal stimulation involved (15) .

Figure 112017052352515-pat00001
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Figure 112017052352515-pat00003
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본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 영양 과다와 좌식 문화에 따른 비만을 포함한 대사성 질환에 대한 현대인의 위험성을 해소하기 위한 방안으로서 식이 요법과 운동 요법과는 별도로 질병의 적극적인 치료의 개념으로서 효과적으로 사용될 수 있는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 제공하고자 하는 것이다.A problem to be solved by the present invention is to solve the risk of modern people in metabolic diseases including obesity according to nutritional excess and sedentary culture, which can be effectively used as a concept of active treatment of diseases separately from diet and exercise therapy And a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.The present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating obesity comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 슬리밍용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for slimming comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

상기 화장료 조성물은 로션, 화장수, 크림, 에센스, 폼 및 팩으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것이 바람직하다.The cosmetic composition is preferably a formulation selected from the group consisting of lotion, lotion, cream, essence, foam and pack.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포의 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 시약 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a method of inducing the differentiation of mesenchymal stem cells, medullar stem cells, medicinal cells or white adipocytes into brown adipocytes or beige adipocytes, comprising medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Lt; / RTI >

상기 분화 유도된 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포는 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 것이 바람직하다.The differentiation-induced brown adipocytes or beige adipocytes are characterized by increased oxygen consumption, more multilocular lipid droplets generation, increased intracellular mitochondrial content and copy number, and increased expression of UCP1 (uncoupling protein 1) gene Lt; RTI ID = 0.0 > a < / RTI >

상기 분화 유도는 AMPK(5''-AMP-activated protein kinase) 신호 경로의 활성화에 의한 것일 수 있다.The differentiation induction may be due to activation of the AMPK (5 " -AMP-activated protein kinase) signal pathway.

또한, 본 발명은 분리된 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포에 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method of inducing differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes, which comprises treating the isolated mesenchymal stem cells, pre-adipocytes or white adipocytes with medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, ≪ / RTI >

본 발명에 따른 메디카르핀 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 갈색화(browning)을 통하여 백색 지방세포를 갈색 또는 베이지 지방세포로 효과적으로 분화시킴으로써 이를 비만과 같은 대사성 질환의 치료를 위한 의약 등에 적용될 수 있으므로, 제약 산업 등에 매우 유용한 발명이다.Medicarfine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention can be effectively applied to medicines for the treatment of metabolic diseases such as obesity by effectively differentiating white adipocytes into brown or beige adipocytes through browning , And the pharmaceutical industry.

도 1은 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서 항 비만 활성을 갖는 phytochemicals의 통상적인 스크리닝 과정을 보여준다. 도 1의 A는 스크리닝 흐름도로서, ORO(Oil Red O dye)의 정량과 총 RNA 추출은 6일간의 분화 후에 수행되었다. 도 1의 B는 선택된 15가지 phytochemicals의 영향 하에 Ucp1 유전자 발현을 나타내고, 데이터는 두 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현되었다. 삽입된 그림은 Med의 구조를 나타낸다. 도 1의 C 및 D는 C3H10T1/2 세포 유래의 전 지방 세포 및 성숙한 지방 세포의 생존 가능성을 MTT 분석에 의해 평가한 결과를 나타내고, 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 나타내었다. PA는 전 지방세포(preadipocyte)를 의미한다. 도 1의 E는 8일 째 완전히 분화된 C3H10T1/2 세포에서의 ORO-염색 이미지를 나타낸다. 눈금 막대는 50μm를 나타내고, 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 2는 Med가 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서 갈색 및 베이지 지방 유전자 발현을 촉진하지만, 백색 지방 유전자 발현은 촉진하지 않음을 보여주는 결과이다. qRT-PCR 분석은 하기 실시예에서 상세하게 설명한다. 도 2의 A는 BAT 및 베이지 지방 특이적 유전자의 유전자 발현 정도를 나타내고, 도 2의 B는 WAT 특정 마커의 유전자 발현을 나타내며, 도 2C는 일부 BMP 유전자의 유전자 발현 정도를 나타낸다. 데이터는 세 가지 개별 실험의 평균±표준 편차로 표시하였다. 상이한 처리군과 대조군(MDI) 간의 차이점의 중요성을 Student's t test로 평가하였다(*P≤0.05, **P≤0.01).
도 3은 Med가 미토콘드리아 생성을 촉진함을 보여준다. qRT-PCR 분석은 하기 실시예에서 상세하게 설명한다. 도 3의 A는 미토콘드리아 생성 특이적 마커의 유전자 발현 정도를 나타내고, 도 3의 B는 8일 동안 분화된 C3H10T1/2 세포의 DAPI(핵), Mitotracker(미토콘드리아) 및 Ucp1-면역 염색된 공 초점 이미지를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다. 도 3의 C에서 면역 염색된 이미지의 정량은 ImageJ 소프트웨어의 수단으로 수행되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균±SD로 표현되었다. 도 3의 D에서 상대적 미토콘드리아 DNA 함량은 p0 및 Cox1 유전자의 qRT-PCR 분석에 의해 결정되었다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험에서 nDNA p0과 mtDNA Cox1의 비율로 표현되었다. 도 3의 E에서 전체 단백질은 C3H10T1/2 및 BAT 세포 모두에서 6일째에 추출되었고, 항-SIRT1-항체를 사용하여 웨스턴 블랏(WB) 분석을 수행하였다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다. 웨스턴 블랏 이미지의 정량화는 ImageJ 소프트웨어에서 수행되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균±SD로 표현되었다. 상이한 처리군과 대조군(MDI) 간의 차이점의 중요성을 Student's t test로 평가하였다(*P≤0.05, **P≤ 0.01, ***P≤0.001).
도 4는 Med가 산소 소비를 증가시키고, C3H10T1/2 세포에서 갈색 지방세포와 유사한 표현형을 촉진함을 보여준다. 도 4의 A의 산소 소비 시험은 Luxcel MitoXpress 형광 분석에 의해 수행되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 % (MDI)±SD로 표시되었다. Gox=포도당 산화 효소(양성 대조군), AA=Antimycin A(음성 대조군). 도 4의 B는 C3H10T1/2 세포를 8일 동안 분화시키고, Bodipy 및 DAPI로 염색한 다음 공 초점 현미경으로 영상을 촬영한 결과를 나타낸 것이다. 삽입된 이미지는 선택된 영역을 확대하여 따로 나타내었다. 스케일 바는 상단 패널에서 50μm, 각각의 하단 이미지에서 5μm를 나타낸다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다.
도 5는 Med가 C3H10T1/2, iWAT 및 BAT 세포에서 열 형성 마커의 발현을 유도함을 보여준다. 도 5의 A는 C3H10T1/2 세포의 Med 처리 중 용량 의존적 Ucp1 유전자 발현을 보여준다. 데이터는 두 가지 독립적인 실험의 평균±SD로 나타내었다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001). 도 5 B 내지 D는 C3H10T1/2, iWAT 및 BAT 세포에서 UCP1, PRDM16, PPARγ 및 PGC-1α의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과를 나타낸다. β-actin 발현은 internal control로서 사용되었다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 대표한다. 웨스턴 블랏 이미지의 정량화는 ImageJ 소프트웨어에서 수행되었다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
도 6은 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서 갈색 지방세포 유사 지방세포의 Med 매개 형성은 AMPK의 활성화에 의해 조절됨을 보여주는 결과이다. 완전히 합류된 C3H10T1/2 세포는 8시간 동안 혈청 기아 후 MDI 조건에서 Med와 함께 또는 없이 배양되었다. 도 6의 A는 표시된 시점에 수집된 단백질 샘플에서 AMPKα 및 phospho-AMPKα에 대한 항체에 의한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. 도 6의 B는 투여량에 의존적인 AMPKα 활성화가 WB에 의해 검출됨을 보여준다. 도 6의 C는 모든 처리 그룹의 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포 두 세트를 완전히 합류시키고, 8시간 혈청 기아 후에 10μM Med를 함유하거나, 함유하지 않은 30μM dorsomorphin(Dor)과 함께 배양하였다. 다음으로, 한 세트의 단백질 샘플을 처리 30분 후에 추출하고, p-AMPKα의 양을 WB로 측정하였다. 분화 8일 후에 단백질 시료를 채취하여 WB 분석으로 UCP1, PPARγ, PRDM16 및 PGC-1α의 발현을 측정하였다. 데이터는 최소 두 개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 7 및 도 8은 AMPKα 및 RNA 및 단백질의 수집에 대한 유전자 사일런싱 결과를 나타낸다. 도 7은 AMPKα, UCP1, PPARγ, PRDM16 및 PGC-1α 발현의 WB 분석 결과를 나타낸다. β-actin은 internal control로 사용되었다. 도 8은 AMPKα 및 다른 하류 유전자의 유전자 발현 수준을 나타낸다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균±SD로 나타내었다(*P<0.05, **P <0.01, ***P<0.001).
도 9는 Med 처리에 의한 AMPK 활성화, 미토콘드리아 생성, 열 형성 유전자 발현, 백색 지방 유전자 발현 저해의 관계 및 Ucp1과 비만과의 상관 관계를 모식적으로 나타낸 그림이다.Figure 1 shows a routine screening procedure for phytochemicals with anti-obesity activity in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells. Fig. 1 (A) is a screening flow chart. Quantification of ORO (Oil Red O dye) and total RNA extraction were performed after 6 days of differentiation. Figure 1B shows Ucp1 gene expression under the influence of the 15 selected phytochemicals, and the data are expressed as mean ± SD (SD) of two independent experiments. The inserted figure shows the structure of Med. C and D in Figures 1 and 2 show the results of evaluating the viability of pre-adipocytes and mature adipocytes derived from C3H10T1 / 2 cells by MTT assay and the data are expressed as mean ± standard deviation of three independent experiments . PA means preadipocyte. Figure 1 E shows an ORO-stained image in fully differentiated C3H10T1 / 2 cells at day 8. The scale bar represents 50 μm, and the data represents three independent experiments.
Figure 2 shows that Med promotes brown and beige fat gene expression in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells, but does not promote white fat gene expression. The qRT-PCR analysis is described in detail in the following examples. FIG. 2A shows gene expression levels of BAT and beige lipid-specific genes, FIG. 2B shows gene expression of WAT specific markers, and FIG. 2C shows gene expression levels of some BMP genes. Data are presented as mean ± standard deviation of three separate experiments. The significance of the difference between the different treatment groups and the control (MDI) was assessed by Student's t test ( * P? 0.05, ** P? 0.01).
Figure 3 shows that Med promotes mitochondrial production. The qRT-PCR analysis is described in detail in the following examples. 3 shows the degree of gene expression of mitochondrial production-specific markers. Fig. 3B shows DAPI (nuclear), Mitotracker (mitochondria) and Ucp1-immunostained confocal images of C3H10T1 / 2 cells differentiated for 8 days . Data represent three independent experiments. The quantification of the immunostained image in Figure 3C was performed by means of the ImageJ software. Data were expressed as mean ± SD of three independent experiments. In Figure 3 D, the relative mitochondrial DNA content was determined by qRT-PCR analysis of the p0 and Cox1 genes. Data were expressed as the ratio of nDNA p0 to mtDNA Cox1 in three independent experiments. In FIG. 3E the whole protein was extracted on day 6 in both C3H10T1 / 2 and BAT cells and Western blot (WB) analysis was performed using anti-SIRT1-antibody. Data represent three independent experiments. Quantification of the western blot image was performed in ImageJ software. Data were expressed as mean ± SD of three independent experiments. The significance of the difference between the different treatment groups and the control group (MDI) was assessed by Student's t test ( * P? 0.05, ** P? 0.01, *** P? 0.001).
Figure 4 shows that Med increases oxygen consumption and promotes a phenotype similar to brown adipocytes in C3H10T1 / 2 cells. The oxygen consumption test of FIG. 4A was performed by Luxcel MitoXpress fluorescence analysis. Data were expressed as% (MDI) ± SD of three independent experiments. G ox = glucose oxidase (positive control), AA = Antimycin A (negative control). Fig. 4B shows the result of C3H10T1 / 2 cells differentiated for 8 days, stained with Bodipy and DAPI, and then imaged with a confocal microscope. The inserted image is enlarged and displayed separately. The scale bar represents 50 μm on the top panel and 5 μm on each bottom image. Data represent three independent experiments.
Figure 5 shows that Med induces the expression of heat-forming markers in C3H10T1 / 2, iWAT and BAT cells. Figure 5A shows dose-dependent Ucp1 gene expression during Med treatment of C3H10T1 / 2 cells. Data were expressed as mean ± SD of two independent experiments ( * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). FIGS. 5B to D show the results of Western blot analysis of protein expression levels of UCP1, PRDM16, PPARγ and PGC-1α in C3H10T1 / 2, iWAT and BAT cells. β-actin expression was used as an internal control. Data represent three independent experiments. Quantification of the western blot image was performed in ImageJ software. Data are presented as mean ± SD of three independent experiments ( * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
FIG. 6 is a graph showing that Med mediated formation of brown adipocyte-like adipocytes in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells is regulated by activation of AMPK. Fully confluent C3H10T1 / 2 cells were incubated with or without Med for 8 hours post-serum starvation MDI conditions. Figure 6A shows the results of western blot analysis by antibodies against AMPKa and phospho-AMPKa in the protein samples collected at the indicated time points. Figure 6B shows that dose dependent AMPKa activation is detected by WB. Fig. 6C shows the complete merging of two sets of C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells of all treatment groups and incubation with 30 [mu] M dorsomorphin (Dor) containing or without 10 [mu] M Med after 8 hours of serum starvation. Next, a set of protein samples were extracted 30 minutes after treatment and the amount of p-AMPKa was measured by WB. After 8 days of differentiation, protein samples were collected and the expression of UCP1, PPARγ, PRDM16 and PGC-1α was measured by WB analysis. Data represent at least two independent experiments.
Figures 7 and 8 show gene silencing results for AMPKa and collection of RNA and protein. Figure 7 shows the results of WB analysis of AMPKa, UCP1, PPARy, PRDM16 and PGC-l [alpha] expression. β-actin was used as an internal control. Figure 8 shows gene expression levels of AMPKa and other downstream genes. Data were presented as means ± SD of three independent experiments ( * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
FIG. 9 is a diagram schematically illustrating the relationship between AMPK activation, mitochondrial generation, heat-producing gene expression, inhibition of white lipid gene expression, and Ucp1 and obesity by Med treatment.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 발명자들은 ORO 스크리닝에 의하여 선택된 phytochemical인 medicarpin(Med)의 항 비만 효과를 검정하기 위하여, C3H10T1/2 중간엽 줄기세포의 지방 생성 모델을 사용하였다. Med는 Swartzia madagascariensis와 Medicago truncatula에서 발견되는 자연적인 pterocarpan이다(16). Med는 골 재생의 자극, 파골 세포 생성의 억제, 세포사멸 유도 및 항진균 활성을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 가지고 있다(17-21). 본 발명의 발명자들이 이해하는 한, C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서 유래된 MDI-자극 백색 지방의 갈색화에 대한 Med의 효과는 아직 밝혀진 바가 없다. 본 발명의 발명자들은 Med가 백색 지방의 갈색화를 유도하여 에너지를 저장하는 백색 지방세포보다는 에너지를 소비하는 "갈색 또는 베이지" 세포 유형으로 변화시키는 효과가 있으므로, 이를 항-비만 치료제로서 개발할 가능성이 있을 것으로 예상하였다.The inventors of the present invention used the fat production model of C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells to test the anti-obesity effect of the phytochemical medicarpin (Med) selected by ORO screening. Med Swartzia madagascariensis and Medicago It is a natural pterocarpan found in truncatula (16) . Med has a variety of biological functions including stimulation of bone regeneration, inhibition of osteoclastogenesis, induction of cell death, and antifungal activity (17-21) . As far as the inventors of the present invention understand, the effect of Med on the bronzing of MDI-stimulated white fats derived from C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells has not yet been elucidated. The inventors of the present invention have an effect of converting Med into a "brown or beige" cell type which induces brown coloration of white fat and consumes energy rather than white adipocytes that store energy, so that it may be developed as an anti-obesity therapeutic agent .

따라서, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

상기 "비만"이라는 용어는 개체의 지방의 양이 정상 범위를 초과하는 임상적 증상을 의미한다. 또한, 상기 비만에는 비만과 관련된 각종 대사 이상에 의한 대사증후군을 포함하는 개념이다.The term " obesity " refers to a clinical condition in which the amount of fat in an individual exceeds a normal range. In addition, the above-mentioned obesity includes a metabolic syndrome due to various metabolic abnormalities related to obesity.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition containing the active ingredient of the present invention may be formulated into tablets, capsules, suspensions, emulsions, oral preparations such as syrups and aerosols, injections of sterilized injection solutions And may be administered by various routes including oral administration or intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration, and the like.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.Such pharmaceutical compositions may further comprise carriers, excipients or diluents, and examples of suitable carriers, excipients or diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, But are not limited to, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, And the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.In a preferred embodiment, the solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, for example starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like are mixed and formulated. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Examples of the oral liquid preparation include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, Perfumes, preservatives, and the like.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.As a preferable specific example, the preparation for parenteral administration includes sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-drying agents, suppositories, and the like. Examples of the non-aqueous solvent and suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The active ingredient of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.As a preferable example, the effective amount of the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient, and generally 1 to 5,000 mg, preferably 100 to 3,000 mg per kg of body weight per day Or every other day or one to three times a day. However, the dosage may not be limited in any way because it may be increased or decreased depending on route of administration, severity of disease, sex, weight, age, and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject through various routes. All modes of administration may be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine or intracerebroventricular injections.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.In the present invention, " administration " means providing a predetermined substance to a patient by any suitable method, and the administration route of the pharmaceutical composition of the present invention is either oral or non-oral May be administered orally. The composition of the present invention may also be administered using any device capable of delivering an effective ingredient to a target cell.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.In the present invention, the term " object " includes, but is not limited to, human, monkey, cow, horse, sheep, pig, chicken, turkey, quail, cat, dog, mouse, rat, rabbit or guinea pig , Preferably a mammal, more preferably a human.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.The present invention also provides a health functional food for preventing or ameliorating obesity comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 건강 기능 식품은 비만과 관련된 각종 증상의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.The health functional food of the present invention can be variously used for foods and beverages effective for preventing or improving various symptoms related to obesity. Examples of foods containing the active ingredient of the present invention include various foods, beverages, gums, tea, vitamin complex, health supplement foods and the like, and they can be used in the form of powder, granule, tablet, capsule or beverage .

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.The active ingredient of the present invention may generally be added in an amount of 0.01 to 15% by weight of the total food, and the health beverage composition may be added in a proportion of 0.02 to 10 g, preferably 0.3 to 1 g, based on 100 ml.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. The health functional food of the present invention may contain, as an additional ingredient, a food-acceptable food-aid additive such as natural carbohydrates and various flavors, in addition to containing the above-mentioned compound as an essential ingredient in the indicated ratio.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. Examples of the natural carbohydrate include sugar sugars such as glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.Examples of the flavoring agents include natural flavoring agents such as tautatin, rebaudioside A and stiglycerin such as glycyrrhizin, and synthetic flavoring agents such as saccharin and aspartame. The ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 12 g per 100 ml of the health functional food of the present invention. In addition to the above, the health functional food of the present invention may contain various kinds of nutrients, vitamins, minerals, flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavy stabilizers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, Thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. In addition, the health functional food of the present invention may contain flesh for producing natural fruit juice, fruit juice drink, vegetable drink and the like. These components may be used independently or in combination. The ratio of such additives is generally selected in the range of 0.01 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the active ingredient of the present invention.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 슬리밍용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a cosmetic composition for slimming comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

상기 "슬리밍"은 신체의 전체 또는 특정 부위의 체적이 감소되는 현상을 의미하며, 예를 들어, 신체의 전체 또는 특정 부위의 지방의 제거 또는 감소일 수 있다. The term " slimming " means a phenomenon in which the volume of the whole or a specific part of the body is reduced, for example, the elimination or reduction of fat in the whole or a specific part of the body.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 슬리밍 효과를 기대할 수 있다.The active ingredient of the cosmetic composition of the present invention may be contained in an amount of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight, more preferably 1 to 10% by weight based on the total weight of the composition. Appropriate formulation stability can be ensured within such a content range, and a desired slimming effect can be expected.

본 발명의 상기 조성물은 본 발명의 유효성분 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 항노화, 보습, 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.The composition of the present invention may further contain, in addition to the effective ingredient of the present invention, a known natural extract or other ingredients for the antioxidative, anti-aging, moisturizing and skin regeneration promoting effects within the range not inhibiting the active activity of the present invention .

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.In addition, the composition may also contain components commonly added to cosmetic compositions, such as fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, A cosmetic or dermatological composition such as a perfume, a perfume, a surfactant, water, an ionic or nonionic type emulsifier, a filler, a sequestering and chelating agent, a preservative, a vitamin, a barrier, a wetting agent, an essential oil, a dye, a pigment, a hydrophilic or lipophilic active agent May be formulated into a particular formulation, including adjuvants or carriers commonly used in the field of dermatology.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 로션, 화장수, 유연 화장수, 영양 화장수, 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 폼, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다. The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be formulated into various forms such as solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, Containing cleansing, oil and spray, but are not limited thereto. More specifically, the present invention relates to a lotion, a lotion, a flexible lotion, a nutritional lotion, a cream, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a powder foundation, an emulsion foundation, a wax foundation, a cleansing cream, a foam, a cleansing foam, , Spray, powder, fact, lip gloss, lipstick, shadow, shampoo and rinse.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component. In particular, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, Propane / butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.

또한, 본 발명은 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포의 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 시약 조성물을 제공한다.The present invention also relates to a method of inducing the differentiation of mesenchymal stem cells, medullar stem cells, medicinal cells or white adipocytes into brown adipocytes or beige adipocytes, comprising medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Lt; / RTI &gt;

상기 분화 유도된 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포는 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 것이 바람직하다.The differentiation-induced brown adipocytes or beige adipocytes are characterized by increased oxygen consumption, more multilocular lipid droplets generation, increased intracellular mitochondrial content and copy number, and increased expression of UCP1 (uncoupling protein 1) gene Lt; RTI ID = 0.0 &gt; a &lt; / RTI &gt;

상기 분화 유도는 AMPK(5''-AMP-activated protein kinase) 신호 경로의 활성화에 의한 것일 수 있다.The differentiation induction may be due to activation of the AMPK (5 &quot; -AMP-activated protein kinase) signal pathway.

상기 분화 유도용 시약 조성물은, 예를 들어, 연구용 시약 조성물로서 적용될 수 있다. 통상 실험실 조건하에서 본 발명의 분화 유도용 시약 조성물을 세포 또는 실험 동물에 투여할 수 있으며, 구체적인 투여 방법과 안전 규칙 등은 실험자의 각 실험실의 내부 준수 규정에 따라 수행되는 것이 바람직하다. The reagent composition for inducing differentiation can be applied, for example, as a reagent composition for research. The reagent composition for inducing differentiation of the present invention can be administered to a cell or an experimental animal under normal laboratory conditions. It is preferable that the specific administration method and safety rules are performed according to the internal regulations of each laboratory of the experimenter.

또한, 본 발명은 분리된 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포에 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method of inducing differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes, which comprises treating the isolated mesenchymal stem cells, pre-adipocytes or white adipocytes with medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, &Lt; / RTI &gt;

상기 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포는 개체로부터 자연적 또는 인위적 방법으로 분리된 것을 대상으로 한다. 개체로부터 분리된 상기 세포들은 적절한 배양 조건하에서 수일 내지 수주 동안 배양될 수 있으며, 경우에 따라서 동결보관될 수도 있다. The mesenchymal stem cells, whole adipocytes or white adipocytes are those which have been separated from the subject by natural or artificial methods. The cells isolated from the individual can be cultured for several days to several weeks under appropriate culture conditions, and may be stored in a freezer as the case may be.

분리된 상기 세포들에 본 발명의 유효성분을 투여하는 방법은 통상의 기술자에게 자명한 사항이며, 바람직하게는 본 명세서의 하기 실시예에 기재된 바를 따를 수 있을 것이다. Methods for administering the active ingredient of the present invention to the isolated cells are obvious to those of ordinary skill in the art, and preferably those described in the following Examples of the present invention may be followed.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. The following examples illustrate one preferred embodiment of the present invention, and it is apparent that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by the matters described in the following examples.

[[ 실시예Example ]]

1. 재료 및 방법1. Materials and Methods

1.1. 화합물 및 시약1.1. Compounds and reagents

Medicarpin(순도 98%, HPLC)은 ChemFaces Biochemical Co., Ltd.(Wuhan, Hubei, China)에서 구입하였다. DAPI, dexamethasone(Dex), isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), insulin, rosiglitazone, Oil Red O dye(ORO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 및 4% formaldehyde는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Atlas Biologicals(Fort Collins, CO, USA)로부터 구입하였다. Penicillin-streptomycin 용액을 Hyclone Laboratories, Inc.(South Logan, NY, USA)에서 구입하였고, SIRT1, AMPKα 및 phospho-AMPKα에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. PPARγ에 대한 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 구입하였다. UCP1, PGC-1α, PRDM16 및 β-actin에 대한 항체는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다. BCA 단백질 분석 키트는 Thermo Scientific(Rockford, IL, USA)에서 구입하였고, protein loading buffer는 Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercules, CA, USA)에서 구입하였다. Bodipy 493/503은 Life Technologies Corporation(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 총 854 종의 phytochemicals은 한국화학연구원 화학약품은행(http://www.chembank.org/)에서 공급받았다.Medicarpin (purity 98%, HPLC) was purchased from ChemFaces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China). DAPI, dexamethasone (Dex), isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), insulin, rosiglitazone, Oil Red O dye (ORO), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide ) And 4% formaldehyde were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) was purchased from Gibco (Grand Island, NY, USA) and fetal bovine serum (FBS) was purchased from Atlas Biologicals (Fort Collins, CO, USA). Penicillin-streptomycin solutions were purchased from Hyclone Laboratories, Inc. (South Logan, NY, USA) and antibodies against SIRT1, AMPKα and phospho-AMPKα were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Antibodies against PPARy were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. Antibodies against UCP1, PGC-1α, PRDM16 and β-actin were purchased from Abcam (Cambridge, MA, USA). The BCA protein assay kit was purchased from Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) and the protein loading buffer was purchased from Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA). Bodipy 493/503 was purchased from Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). A total of 854 phytochemicals were obtained from the Chemical and Biological Bank of Korea Research Institute (http://www.chembank.org/).

1.2. 세포 배양, 분화 및 약물 처리1.2. Cell culture, differentiation and drug treatment

10% FBS와 100μg/mL Penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM을 사용하여 C3H10T1/2 마우스 중간엽 줄기세포(한국 세포주은행, KCLB-10092.1), iWAT 세포 (Yunsei University, Yunsei University, ) 및 BAT 세포(GE Kai, NIH의 제공)를 배양하였다. 세포를 5% CO2 배양기에서 37℃로 유지시켰다. 충분히 융합된 상태의 C3H10T1/2, iWAT 및 BAT 세포를 10%의 FBS가 첨가된 DMEM에 10%의 insulin, 1μM의 dexamethasone 및 0.5mM의 3-isobutyl-1-methylxanthine(MDI)으로 구성된 분화 유도 배지에서 유지시키고, 10% FBS 및 10μg/mL insulin이 첨가된 DMEM 성숙 배지로 옮겼다. insulin 첨가 배지는 격일로 보충되었다. 배지에 첨가하기 전에, Med는 DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 완전히 용해시켰고, 저장 용액은 향후 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다. 세포는 MDI 단독, Med(10μM) 보충 배양 배지 또는 MDI 조건의 양성 대조군으로서 rosiglitazone(1μM)으로 처리되었다. Med는 0일째 및 2일째부터 4일째까지 배지에 첨가하였고, 1일을 초과하는 처리에 대해서는 2일마다 배지를 교환하였다.(KCLB-10092.1), iWAT cells (Yunsei University, Yunsei University) and BAT cells (GE) were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 100 μg / mL Penicillin- streptomycin Kai, provided by NIH) were cultured. The cells were maintained at 37 [deg.] C in a 5% CO 2 incubator. The fully fused C3H10T1 / 2, iWAT and BAT cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS in a differentiation induction medium consisting of 10% insulin, 1 μM dexamethasone and 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (MDI) And transferred to DMEM maturation medium supplemented with 10% FBS and 10 [mu] g / mL insulin. Insulin supplemented medium was supplemented every other day. Prior to addition to the medium, Med was completely dissolved in DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) and the stock solution was stored at -20 ° C for future use. Cells were treated with rosiglitazone (1 μM) as a positive control for MDI alone, Med (10 μM) supplemented culture medium or MDI conditions. Med was added to the medium from Day 0 and Day 2 to Day 4 and the medium was changed every 2 days for treatments over 1 day.

1.3. 세포 생존율 측정(Cell viability assay)1.3. Cell viability assay

C3H10T1/2 중간엽 줄기세포를 104/well의 밀도로 시딩하고, 96-well plate에서 배양한 후, 5, 10 및 20μM의 Med를 24, 48 또는 72시간 또는 6일 동안 처리하였다. 배양 종료 후, 5μg/mL의 MTT 용액 20μL를 각 well에 첨가하고, 세포를 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 생성된 formazan 결정을 DMSO 150μL에 용해하고, 흡광도를 590nm의 파장에서 Victor™ X3 multilabel reader(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells were seeded at a density of 10 4 / well, cultured in a 96-well plate, and treated with 5, 10 and 20 μM of Med for 24, 48, 72 or 6 days. After completion of the incubation, 20 μL of 5 μg / mL MTT solution was added to each well, and the cells were incubated at 37 ° C. for 3 hours. The resulting formazan crystals were dissolved in 150 μL of DMSO and the absorbance was measured with a Victor ™ X3 multilabel reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) at a wavelength of 590 nm.

1.4. 1.4. BodipyBodipy 493/503 및 Oil Red O staining 493/503 and Oil Red O staining

C3H10T1/2 세포를 35mm 접시 내의 유리 커버 슬립에서 성장시키고, 10일 동안 분화시켰다. Bodipy 493/503 green stain을 1×PBS(1μM)로 희석하고, 고정 세포와 함께 15분 동안 배양하였다. Alexa Fluor® 488 dye 여기 및 방출 파장을 갖는 confocal microscope(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 사진을 캡처하고, FV10i-ASW 3.0 Viewer software로 분석하였다. 시각적 이해를 향상시키기 위해 이미지의 밝기와 대비를 조정하였지만, 모든 이미지 세트에서 동일한 설정을 사용하여 결과의 해석에 영향을 미치지 않았다. ORO 염색을 위하여, 8일 동안 분화된 세포를 1X PBS로 세척하고, 최소 1시간 동안 10% formalin으로 고정시키고, 0.3% 여과된 ORO 용액으로 15분 동안 염색하였다. 증류수를 사용하여 염색된 세포를 헹구고, 완전히 분화된 세포의 표현형 변화의 이미지를 Axiovert-25 microscope(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 촬영하였다. ORO의 양을 측정하기 위하여, 염색된 세포를 100% isopropanol로 용출시키고, 흡광도를 VictorTM X3을 사용하여 520nm에서 기록하였다.C3H10T1 / 2 cells were grown in glass cover slips in 35 mm dishes and differentiated for 10 days. Bodipy 493/503 green stain was diluted with 1 x PBS (1 μM) and incubated with fixed cells for 15 minutes. Alexa Fluor ® 488 dye here and capture photos using a confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan ) having an emission wavelength, and the mixture was analyzed by FV10i-ASW 3.0 Viewer software. We adjusted the brightness and contrast of the image to improve visual perception, but did not affect the interpretation of the results using the same settings in all image sets. For ORO staining, cells that were differentiated for 8 days were washed with 1X PBS, fixed with 10% formalin for at least 1 hour, and stained with 0.3% filtered ORO solution for 15 minutes. The stained cells were rinsed with distilled water and images of phenotypic changes in fully differentiated cells were taken using an Axiovert-25 microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany). To determine the amount of ORO, the stained cells were eluted with 100% isopropanol and the absorbance was recorded at 520 nm using Victor TM X3.

1.5. 미토콘드리아 DNA 함량 및 1.5. Mitochondrial DNA content and qRTqRT -- PCRPCR (quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction) 분석(quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction) analysis

미토콘드리아 생성은 핵 DNA가 일정하다고 가정할 때, 미토콘드리아 DNA(mtDNA)와 핵 DNA(nDNA)의 비율에 의해 결정되었으며, 다른 곳에서 설명한 바와 같이(22), qRT-PCR에 의해 측정되었다. 각각의 DNA 추출물에 대하여, nuclear gene ribosomal protein large p0 및 mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit I(CoxI)을 실시간 qPCR에 의해 개별적으로 정량화하였다. 데이터는 nuclear gene p0 DNA(ΔΔCT 분석)에 대해 정상화되었다. Mitochondrial production was determined by the ratio of mitochondrial DNA (mtDNA) to nuclear DNA (nDNA), assuming constant nuclear DNA, and was measured by qRT-PCR as described elsewhere (22) . For each DNA extract, the nuclear gene ribosomal protein large p0 and the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit I ( CoxI ) were individually quantified by real-time qPCR. Data were normalized for nuclear gene p0 DNA (ΔΔCT analysis).

RNA extraction kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 총 RNA를 추출하고, Scandrop Analytik Jena AG spectrophotometer(Jena, Germany)를 사용하여 농도를 측정하였다. Maxime RT PreMix kit(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)로 total RNA(1μg)를 RT-PCR하여 cDNA를 합성하였고, 반응은 Veriti 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems, Singapore)에서 수행하였다. qRT-PCR은 iQ™ SYBR Green Supermix kit(Bio-Rad, Singapore)를 사용하여 CFX96™ RT-PCR detection system(Bio-Rad, Singapore)에서 수행되었다. 본 발명에서 사용된 마우스 기원의 프라이머의 서열은 표 1에 열거되어 있다. 표적 유전자 발현의 강도는 glyceraldglyce 3-phosphate dehydrogenase(Gapdh)의 강도로 표준화되었다.Total RNA was extracted using an RNA extraction kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) and the concentration was measured using a Scandrop Analytik Jena AG spectrophotometer (Jena, Germany). CDNA was synthesized by RT-PCR of total RNA (1 μg) with Maxime RT PreMix kit (Intron Biotechnology, Seoul, Korea) and the reaction was performed in Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, Singapore). qRT-PCR was performed on the CFX96 ™ RT-PCR detection system (Bio-Rad, Singapore) using the iQ ™ SYBR Green Supermix kit (Bio-Rad, Singapore). The sequences of the primers of mouse origin used in the present invention are listed in Table 1. The intensity of the target gene expression was normalized to the intensity of glyceraldglyce 3-phosphate dehydrogenase ( Gapdh ).

[표 1] [Table 1] 프라이머primer 서열 리스트 Sequence List

Figure 112017052352515-pat00008
Figure 112017052352515-pat00008

1.6. 세포 총 단백질 제조 및 1.6. Cell total protein production and 웨스턴Western 블랏Blat (western blot) 분석(western blot) analysis

세포 총 단백질 추출 및 western blot analysis는 C3H10T1/2, iWAT 및 BAT 세포를 사용하여 전술한 바와 같이 수행하였다(23).Cell total protein extraction and western blot analysis were performed as described above using C3H10T1 / 2, iWAT and BAT cells (23) .

1.7. 1.7. 면역형광염색Immunofluorescent staining (( ImmunofluorescentImmunofluorescent staining) staining)

C3H10T1/2 세포를 35mm dish의 glass coverslip에 플레이팅하였다. 분화 10일 후, 세포 단층을 1X PBS로 2회 세척 한 후, Mitotracker(Red) stain을 100nM의 농도로 성장 배지에 희석시키고, 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 -20℃에서 15분간 ice-cold methanol상에서 고정시키고, 5분 동안 PBS로 3회 헹구었다. 세포를 3% BSA 중 0.1% Triton X-100으로 15분간 침투 가능화시키고, 1% BSA, 5% goat serum 및 0.3% Triton X-100을 함유한 1X PBS로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 그 다음, 세포를 4℃에서 오버나이트로 UCP1(Abcam)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 실온에서 1시간 동안 2차 항체인 Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody(Cell Signaling Technology)로 인큐베이션하였다. DNA 염색을 위하여, 실온에서 1분 동안 1μg/mL DAPI로 세포를 처리한 후, 0.05% Tween 20을 함유한 1x PBS로 3회 세척하였다. coverslip을 anti-fading agent(Dako, CA, USA)를 함유하는 fluorescent mounting medium과 함께 마운트시켰다. Confocal microscope(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 이미지를 촬영하고, FV10i-ASW 3.0 Viewer software를 사용하여 분석하였다.C3H10T1 / 2 cells were plated on glass coverslips of 35 mm dishes. After 10 days of differentiation, the cell monolayer was washed twice with 1X PBS, and Mitotracker (Red) stain was diluted in the growth medium to a concentration of 100 nM and incubated at 37 ° C for 15 minutes. The cells were then fixed in ice-cold methanol at -20 ° C for 15 minutes and rinsed 3 times with PBS for 5 minutes. Cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 in 3% BSA for 15 minutes and blocked with 1X PBS containing 1% BSA, 5% goat serum and 0.3% Triton X-100 for 1 hour at room temperature. Cells were then incubated with primary antibody against UCP1 (Abcam) overnight at 4 ° C and incubated with Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody (Cell Signaling Technology), a secondary antibody, for 1 hour at room temperature. Lt; / RTI &gt; For DNA staining, cells were treated with 1 μg / mL DAPI for 1 minute at room temperature and then washed three times with 1 × PBS containing 0.05% Tween 20. The coverslip was mounted with a fluorescent mounting medium containing an anti-fading agent (Dako, CA, USA). Images were taken using Confocal microscope (Olympus, Tokyo, Japan) and analyzed using FV10i-ASW 3.0 Viewer software.

1.8. 산소 소비 분석1.8. Oxygen consumption analysis

MitoXpress® Xtra Oxygen Consumption Assay Kit는 Luxcel Biosciences Ltd.(Inchera, Little Island, Cork, Ireland)에서 구입하였다. 양성 대조군으로 glucose oxidase와 음성 대조군으로서 Antimycin A(complex III inhibitor)를 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. C3H10T1/2 세포를 배지 200μL에 well 당 약 40,000-80,000세포의 밀도로 96-well plate에 접종하고, 37℃의 CO2 배양기에서 오버나이트로 배양하였다. 다음날 산소 소비 분석을 제조자의 프로토콜에 따라 수행하고, 파장 380nm 및 650nm에서 Victor™ X3 multilabel reader(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 데이터는 대조군(MDI)에 대한 퍼센트로 표현되었다.The MitoXpress ® Xtra Oxygen Consumption Assay Kit was purchased from Luxcel Biosciences Ltd. (Inchera, Little Island, Cork, Ireland). Antimycin A (complex III inhibitor) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA) as a positive control and glucose oxidase as a negative control. C3H10T1 / 2 cells were inoculated into a 96-well plate at a density of about 40,000-80,000 cells per well in 200 mu L of the medium, and cultured in the CO 2 incubator at 37 DEG C with an overnight. The following day oxygen consumption analysis was performed according to the manufacturer's protocol and the absorbance was measured using a Victor 占 X3 multilabel reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) at wavelengths of 380 nm and 650 nm. Data were expressed as a percentage of the control (MDI).

1.9. 1.9. siRNAsiRNA (small interfering RNA)에 의한 (small interfering RNA) AMPKα의AMPKα 사일런싱Silence (silencing)(silencing)

C3H10T1/2 중간엽 줄기세포를 AMPK siRNA(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ololigonucleo duplex로 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 80%에서 90% 융합된 상태에서 트랜스펙션시켰다. 간략하게, 80pM siRNA를 4개의 6-well plate에서 5μL/well Lipofectamine 2000으로 트랜스펙션시켰다. Lipofectamine 2000과 siRNA를 Opti-MEM medium(5분간 인큐베이션됨) 100μL로 개별 희석 및 혼합하고, 실온에서 20분간 배양한 후 각 well에 첨가하였다. Med의 존재 또는 부재 하에서 후 융합(postconfluence) 2일 후에 배지를 제거하고, 유도 배지(MDI)로 대체하였다. 24시간의 트랜스펙션 후 WB에 의해 siRNA 사일런싱 효율을 결정하였다. 단백질 및 RNA를 세포 분화 8일째에 수집하고, 다운스트림 유전자의 분석을 위해 웨스턴 블랏 및 qRT-PCR을 수행하였다.C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells were transfected with 80% to 90% fusion of AMPK siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ololigonucleo duplex using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's protocol. Briefly, 80 pM siRNA was transfected in 4 6-well plates to 5 μL / well Lipofectamine 2000. Lipofectamine 2000 and siRNA were individually diluted and mixed with 100 μL of Opti-MEM medium (incubated for 5 minutes), cultured at room temperature for 20 minutes, and then added to each well. The medium was removed and replaced with induction medium (MDI) 2 days post-confluence in the presence or absence of Med. The siRNA silencing efficiency was determined by WB after 24 hours of transfection. Proteins and RNA were harvested on the eighth day of cell differentiation and Western blot and qRT-PCR were performed for analysis of downstream genes.

1.10. 이미지 정량화(Image quantification)1.10. Image quantification

웨스턴 블랏 이미지는 ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij)를 사용하여 정량화되었다. 면역형광염색된 이미지는 이전에 설명한 대로 정량하였다(24). 간단히 설명하면, 면역 염색된 이미지를 가중치 8비트 회색조 이미지로 변환한 다음 ImageJ에서 역전시키고 정량화하였다.The western blot image was quantified using ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij). Immunofluorescent stained images were quantified as previously described (24) . Briefly, the immuno-stained image was converted to a weighted 8-bit grayscale image and then inverted and quantified in ImageJ.

1.11. 통계 분석(Statistical analyses)1.11. Statistical analysis

모든 데이터는 두 번 이상의 개별 실험의 평균±표준 편차(SD)로 표현되었다. 달리 명시하지 않는 한, MDI 처리 샘플을 대조군으로 사용하였다. 여러 다른 처리군들과 대조군 간의 차이점을 Student's t test로 평가하였다. <0.05의 P 값을 갖는 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.All data were expressed as mean ± standard deviation (SD) of two or more separate experiments. Unless otherwise indicated, MDI treated samples were used as controls. Differences between the different treatment groups and the control group were assessed by Student's t test. A difference having a P value of < 0.05 was considered statistically significant.

2. 2. 결 과result

2.1. 2.1. C3H10T1C3H10T1 /2 세포 분화에 대한 항 비만 식물성 화학 물질의 스크리닝/ 2 Screening of anti-obesity phytochemicals for cell differentiation

854종의 phytochemicals에 대한 통상적인 스크리닝은 Oil Red O(ORO) 염색에 의해 완전히 분화된 3T3-L1 세포에서 triglyceride(TG)의 축적을 정량화함으로써 주로 수행되었다. 잠재적인 항 비만 물질을 확인하기 위해, 먼저 본 발명의 발명자들은 분화 동안 10μM의 화합물로 세포를 처리하고, 이어서 ORO 정량화를 수행하였다. ORO 결과와 현미경 검사를 분석한 결과, 2차 스크리닝을 위해 81가지 화합물을 먼저 선택하였다. 결과를 확인하기 위해, 다음으로 본 발명의 발명자들은 동일한 절차에 의해 3T3-L1 및 C3H10T1/2 세포 모두에서 TG 축적 분석을 수행하여 15개의 적중 화합물을 수득하였다. 또한, 본 발명의 발명자들은 모든 ORO-stained plate를 현미경으로 검사하여 작은 LD 형성의 특징을 확인하였다. 그런 다음, qRT-PCR을 통해 유전자 수준에서 세포를 분석하여 위에서 언급한 절차를 사용하여 15가지 화합물 중 하나를 처리한 C3H10T1/2 세포의 Ucp1 mRNA 발현 수준을 정량화하였다(스크리닝 흐름도는 도 1의 A에 표시됨). 잠재적으로, Ucp1 mRNA 발현을 증가시킬 수 있는 7가지 물질을 확인하였다(도 1의 B). 추가 분석을 하기 전에, 화합물 817(medicarpin: Med)이 미분화 C3H10T1/2 세포와 C3H10T1/2 유래 지방세포 모두에서 10μM의 농도에서 세포 독성이 없음을 확인하였다(도 1의 C 및 D). Med 처리는 시각적으로 ORO 염색(도 1의 E)에 의해 입증된 것처럼 C3H10T1/2 세포에서 작은 다소포 LDs의 가능한 갈색/베이지 지방세포 특징을 유도하였다. 도 1의 E에서, 대조군(MDI)은 세포의 대부분의 영역을 커버하는 크고 단일한 LD(흑색 화살표)를 보였으나, 양성 대조로서의 로시글리타존(rosiglitazone)은, 이전에 보고된 바와 같이(24), 다원화와 중심 핵의 명백한 결과를 가져왔다. 지방 세포의 소형 다소포 LD 및 중심 핵은 갈색 지방세포와 유사한 특성으로 알려져있다.Conventional screening for 854 species of phytochemicals was performed primarily by quantifying the accumulation of triglyceride (TG) in 3T3-L1 cells that were completely differentiated by Oil Red O (ORO) staining. To identify potential anti-obesity substances, the inventors of the present invention first treated the cells with 10 μM of compound during differentiation followed by ORO quantification. Analysis of ORO results and microscopy showed that 81 compounds were first selected for secondary screening. To confirm the results, the inventors of the present invention conducted TG accumulation analysis on both 3T3-L1 and C3H10T1 / 2 cells by the same procedure to obtain 15 hit compounds. The inventors of the present invention also examined microscopic observation of all ORO-stained plates and confirmed the characteristics of small LD formation. Cells were then analyzed at the gene level by qRT-PCR and the level of Ucp1 mRNA expression in C3H10T1 / 2 cells treated with one of the 15 compounds was quantified using the procedure described above As shown in FIG. Potentially, seven substances were identified that could increase Ucp1 mRNA expression (Fig. 1B). Before further analysis, it was confirmed that the compound 817 (medicarpin: Med) was not cytotoxic at a concentration of 10 μM in both the undifferentiated C3H10T1 / 2 cell and the C3H10T1 / 2-derived adipocyte (FIGS. Med treatment induced a possible brown / beige adipocyte characteristic of small, multi-cellular LDs in C3H10T1 / 2 cells, as evidenced by ORO staining visually (Fig. 1E). In FIG. 1E, the control (MDI) showed a large single LD (black arrow) covering most of the cell area, whereas rosiglitazone as a positive control, as previously reported (24) Resulting in the manifestation of multiple nucleation and central nuclei. Small LDL and central nuclei of adipocytes are known to be similar to brown adipocytes.

2.2. 2.2. Med에In Med 의한  by C3H10T1C3H10T1 /2 /2 중간엽Intermediate lobe 줄기세포에서의 갈색 및 베이지 지방 유전자 발현 촉진 및 백색 지방 유전자 발현 감소 Promoting the expression of brown and beige fat genes in stem cells and decreasing expression of white fat genes

WAT는 과도한 에너지를 저장하지만, BAT와 베이지 세포는 에너지를 열로 발산시키는 것으로 전문화되어 있으며, 알려진 마커의 발현에 대한 연구에 관심을 기울이고 있다. 도 2의 A에 나타난 바와 같이, Med의 처리는 갈색-지방 마커로서 알려진 Ucp1(2.6배), Pgc - 1α(4.5배), Prdm16(2배), Pparγ(7배), Cidea(1.9배), Pparα(2.3배) 및 Elov13(4.8배)의 유전자 발현을 크게 증가시켰다(25, 26). 특히, Med 처리는 베이지-지방 마커인 CD137(2.1배), P2RX5(4.3배), Fgf21(1.9배), Tmem26(3배) 및 Tbx1(2.6배)의 유전자 발현을 증가시켰다(27)(도 2의 A). 반면에, Med 처리는 aP2와 Resistin 발현량을 약간 증가시켰으나, 백색-지방 마커인 Asc -1(0.3배), Leptin(0.8배), Psat1(0.6배) 및 Serpina3k(0.8배)의 발현을 감소시켰다(25, 28)(도 2의 B). 유전자 Bmp2(2.5배), Bmp4(1.9배), Bmp5(2배) 및 Bmp7(1.8배)이 유의하게 증가되었음이 주목할 만하다(도 2의 C). Bmp4와 Bmp7은 갈색 지방세포화 유도제로 보고되어 있다(29). 또한, Bmp2에 대한 상반되는 보고가 있는데, 한 연구는 Bmp2가 지방 생성을 촉진한다는 것을 보여 주며(30), Bmp2 처리가 말초 신경 전구 세포에서 갈색 지방 세포와 유사한 세포의 형성을 촉진한다는 것을 보여주는 또 다른 보고도 있다(31).While WAT stores excess energy, BAT and beige cells are specialized in dissipating energy into heat and are interested in the study of the expression of known markers. As shown in Fig. A 2, the process of Med brown-known as fat marker Ucp1 (2.6-fold), Pgc - 1 α (4.5-fold), Prdm16 (2 times), Ppar γ (7-fold), Cidea (1.9 Fold), Ppar alpha (2.3-fold) and Elov13 (4.8-fold) gene expression (25, 26) . In particular, Med process beige increased fat marker gene expression of CD137 (2.1-fold), P2RX5 (4.3-fold), Fgf21 (1.9-fold), Tmem26 (3 times) and Tbx1 (2.6-fold) (27) (Fig. 2, A). Med treatment, on the other hand, decreased expression of aP2 and resistin, but reduced the expression of white-fat markers Asc- 1 (0.3-fold), Leptin (0.8-fold), Psat1 (0.6-fold) and Serpina3k (25, 28) (Fig. 2B). It is noteworthy that the genes Bmp2 (2.5-fold), Bmp4 (1.9-fold), Bmp5 (2-fold) and Bmp7 (1.8-fold) were significantly increased (FIG. Bmp4 and Bmp7 have been reported as brown fat saturation inducers (29) . There is also a controversial report on Bmp2 , which shows that Bmp2 promotes lipogenesis (30) and that Bmp2 treatment promotes the formation of brown adipocyte-like cells in peripheral neural progenitor cells There are other reports (31) .

2.3. 2.3. Med에In Med 의한 미토콘드리아 생성 촉진 Promoting the production of mitochondria by

뇌 및 말초 조직에서의 미토콘드리아 기능 장애는 약한 운동 부하 및 조기 노화를 동반하는 당뇨병, 신경 퇴행성 질환, 심혈관계 근병증 및 암을 비롯한 다양한 질병의 주요 원인이 된다(32, 33). 높은 미토콘드리아 함량 또는 미토콘드리아 카피수(즉, 미토콘드리아 생성)가 이러한 모든 이상에 대해 보호 효과를 가질 수 있다고 생각된다. rosiglitazone은 미토콘드리아 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다(6, 34). 그러므로, 본 발명의 발명자들은 미토콘드리아 생성에 대한 Med의 효과를 시험하고, rosiglitazone과 비교하였다. Cox7a, Cox8b(11배, n=3), Tfam(12배)과 같은 미토콘드리아 유전자의 발현은 Med 처리로 현저하게 증가했다(도 3의 A). 더욱이, 미토콘드리아 융합 단백질 OPA1(1.8배)의 mRNA는 상향 조절되었고, 미토콘드리아 분열 단백질 dynamin-related protein 1(Drp1)은 하향 조절되었다(0.9배). 또한, 본 발명의 발명자들은 mitochondrial mass의 평가를 위해 immunostaining을 수행하였고, mitochondrial membrane protein 및 UCP1과 함께, MitoTracker에 의해 확인하였다(도 3의 B 및 C). rosiglitazone 처리된 C3H10T1/2 세포는 증가된 mitochondrial mass을 보였다. Med 처리는 mitochondrial mass와 UCP1 발현을 4배 이상 증가시켰다(도 3의 D). 또한, 우리는 C3H10T1/2 세포와 BAT 세포에서 SIRT1 단백질의 발현을 측정하였다. 주요 미토콘드리아 생성 마커인 SIRT1은 Med 처리에 의해 현저히 상향 조절되었다(도 3의 E). PGC-1α와 함께 SIRT1은 미토콘드리아 생성의 지표로 보고되어 있다(35, 36). 미토콘드리아 생성의 마스터 조절자인 PGC-1α의 단백질 발현은 C3H10T1/2 및 BAT 세포 모두에서 증가되었고(도 5의 B 및 D)(36), C3H10T1/2 세포에서 Pgc - 1α의 mRNA 농도는 Med 처리에 의하여 크게 증가하였다(도 2의 A). 또한, 이러한 처리는 앞에서 설명한 mtDNA Cox1과 nDNA P0의 비율에 따라 미토콘드리아 DNA 함량을 3배 증가시켰다(도 3의 D). PPARα는 지방세포에서의 미토콘드리아 생성과 지방산 산화의 유전자를 상향조절하는데 중요하다(30). 본 발명의 발명자들은 Pparα 유전자 발현이 2배 증가하는 것을 관찰하였다(도 2의 A). 이 데이터들은 Med가 미토콘드리아 생성을 촉진한다고 제안할 수 있게 한다.Mitochondrial dysfunction in the brain and peripheral tissues is a major cause of diverse diseases, including diabetes mellitus, neurodegenerative diseases, cardiovascular myopathy and cancer, which are associated with weak exercise and premature aging (32, 33) . It is believed that high mitochondrial content or mitochondrial copy number (i. E., Mitochondrial production) may have a protective effect on all these abnormalities. Rosiglitazone is known to promote the production of mitochondria (6, 34) . Therefore, the inventors of the present invention tested the effect of Med on mitochondrial production and compared it with rosiglitazone. Expression of mitochondrial genes such as Cox7a , Cox8b (11-fold, n = 3) and Tfam (12-fold) significantly increased with Med treatment (Fig. Furthermore, the mRNA of the mitochondrial fusion protein OPA1 (1.8-fold) was up-regulated and the mitochondrial cleavage protein dynamin-related protein 1 ( Drp1 ) was down-regulated (0.9-fold). In addition, the inventors of the present invention conducted immunostaining for evaluation of mitochondrial mass, and confirmed mitochondrial membrane protein and UCP1 together with MitoTracker (FIGS. 3B and 3C). Rosiglitazone - treated C3H10T1 / 2 cells showed increased mitochondrial mass. Med treatment increased mitochondrial mass and UCP1 expression more than four-fold (Figure 3 D). We also measured the expression of SIRT1 protein in C3H10T1 / 2 and BAT cells. The major mitochondrial generation marker, SIRT1, was significantly up-regulated by Med treatment (FIG. 3E). SIRT1 with PGC-1α has been reported as an indicator of mitochondrial production (35, 36) . Protein expression of PGC-1 alpha, the master regulator of mitochondrial production, was increased in both C3H10T1 / 2 and BAT cells (B and D in Figure 5) (36) , and the mRNA concentration of Pgc - 1α in C3H10T1 / (Fig. 2A). In addition, this treatment increased the mitochondrial DNA content by a factor of 3 according to the ratio of mtDNA Cox1 and nDNA P0 described above (FIG. 3D). PPARα is important in upregulating the genes for fatty acid oxidation and mitochondrial production in adipocytes (30) . The inventors of the present invention observed that the expression of Ppar alpha gene was increased by a factor of two (A in FIG. 2). These data allow Med to suggest that it promotes mitochondrial production.

2.4. 2.4. Med에In Med 의한  by C3H10T1C3H10T1 /2 세포, / 2 cells, iWATiWAT 및 BAT 세포에서의  And BAT cells UCP1UCP1 발현 유도 Induction of expression

UCP1은 저체온증, 비만 및 당뇨병에 중대한 영향을 미치는 주요 열 형성 마커이다(27). Rosiglitazone은 UCP1 발현을 증가시키고 PGC-1α, PRDM16 및 PPARγ를 포함하는 UCP1 전사 조절 인자를 상향 조절함으로써 백색에서 갈색으로의 지방 분화를 촉진시킨다(6, 24, 25, 34). 본 발명의 발명자들은 rosiglitazone과 Med의 효과를 이들 마커의 발현으로 비교하였다. 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, C3H10T1/2 세포에서 Med 처리는 Ucp1 mRNA 발현을 용량 의존적으로 유의하게 유도하였다. C3H10T1/2와 BAT 세포에서, rosiglitazone과 마찬가지로 Med 처리는 PRDM16과 PPARγ의 단백질 농도를 증가시켰으나, UCP1과 PGC-1α 발현은 rosiglitazone 투여군에서 Med 투여군에서보다 높았다(도 5의 B 및 D). iWAT 세포에서, PRDM16과 PPARγ 발현은 rosiglitazone 처리 후보다 Med 처리 후에 더 높았으며, UCP1과 PGC-1α 발현은 rosiglitazone 군과 유사하였다(도 5의 C). 다음으로, 본 발명의 발명자들은 mitochondrial stain MitoTracker와 함께 anti-UCP1 antibody로 면역 염색하여 UCP1의 발현을 확인하려고 시도하였고, 도 3의 C에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 함량이 4배 증가한 것과 함께 UCP1 발현을 유의하게 증가시켰다(3.7배, n=3). 이러한 데이터는 Med가 백색 지방세포에서 갈색 지방세포와 유사한 유전자 및 단백질의 발현을 촉진한다는 것을 분명하게 보여준다.UCP1 is a major heat-forming marker that has a profound effect on hypothermia, obesity and diabetes (27) . Rosiglitazone enhances UCP1 expression and promotes white to brown lipid differentiation by upregulating UCP1 transcription factors including PGC-1α, PRDM16 and PPARγ (6, 24, 25, 34) . The inventors of the present invention compared the effects of rosiglitazone and Med with the expression of these markers. As shown in Fig. 5A, Med treatment significantly induced Ucp1 mRNA expression in C3H10T1 / 2 cells in a dose-dependent manner. In C3H10T1 / 2 and BAT cells, med treatment increased the protein concentration of PRDM16 and PPARγ as well as rosiglitazone, but the expression of UCP1 and PGC-1α was higher in the rosiglitazone-treated group than in the Med-treated group (FIGS. In iWAT cells, expression of PRDM16 and PPARγ was higher after Med treatment than after rosiglitazone treatment, and UCP1 and PGC-1α expression were similar to rosiglitazone (Fig. 5C). Next, the inventors of the present invention attempted to confirm the expression of UCP1 by immunostaining with anti-UCP1 antibody together with mitochondrial stain MitoTracker. As shown in FIG. 3C, the mitochondrial content was increased 4-fold and UCP1 expression was increased Significantly increased (3.7 times, n = 3). These data clearly show that Med promotes the expression of genes and proteins similar to brown adipocytes in white adipocytes.

2.5. 2.5. Med에In Med 의한 산소 소비 증가 및 갈색 지방세포 유사 특성의 유도 Of increased oxygen consumption and induction of brown fat cell-like properties

일부 실험실의 이미징 연구에 따르면, 성인 인체의 BAT가 포도당 섭취량과 산화 용량을 증가시키는 것으로 나타났다. 인체 BAT는 WAT보다 산소 소비율이 높다(37). 우리는 반응물의 표면적이 높을수록 반응 속도가 더 빨라진다는 것을 알고 있다. 또한, 반응물 입자가 작을수록 표면적이 커진다. 따라서, 에너지 증가에 대한 요구가 높아지면서 더 빠른 지질 대사를 돕기 위해 BAT 세포는 지질을 여러 개의 작은 LD로 저장하여 반응의 표면적을 증가시키는 반면, WAT는 지방 분해를 억제하기 위해 세포 당 하나의 큰 지질 액적으로 지방을 저장한다(38). BAT 세포의 독특한 형태는 중심 핵을 둘러싼 많은 LDs와 더 높은 산화 능력의 메커니즘을 지원하는 많은 수의 미토콘드리아의 존재를 특징으로 한다(38). 본 발명에서, Med 처리는 대조군(MDI 군)과 비교하여 120분 이내에 평균 10%의 산소 소비를 증가시키고, 양성 대조군 포도당 산화 효소(Gox)는 60% 만큼 증가하는 반면, 음성 대조군 Antimycin A(AA, Complex III inhibitor)는 10% 만큼 하향 조절되었다(도 4의 A). 또한, Med 처리는, rosiglitazone 처리와 달리, 중심 핵 주위에 갈색 지방세포와 유사한 다중 크기의 LD를 산출하는 반면, MDI 처리는 말초 핵을 가진 단일 지질 액적을 생성한다는 것을 발견하였다(도 4의 B).In some laboratory imaging studies, adult human BAT has been shown to increase glucose uptake and oxidative capacity. Human body BAT has higher oxygen consumption rate than WAT (37) . We know that the higher the surface area of the reactants, the faster the reaction rate. In addition, the smaller the reactant particles, the larger the surface area. Thus, as the demand for energy increases, BAT cells store lipids in several small LDs to increase the surface area of the reaction to help faster lipid metabolism, whereas WAT is one large Lipid stores fat (38) . The unique form of BAT cells is characterized by the presence of large numbers of mitochondria that support many LDs surrounding the central nucleus and a mechanism of higher oxidative capacity (38) . In the present invention, Med treatment increased the average 10% oxygen consumption within 120 min compared to the control (MDI group) and increased the positive control glucose oxidase (G ox ) by 60%, while the negative control Antimycin A AA, Complex III inhibitor) was downregulated by 10% (FIG. 4A). In addition, Med treatment, unlike rosiglitazone treatment, produced multi-sized LDs similar to brown adipocytes around the central nucleus, whereas MDI treatment produced a single lipid droplet with peripheral nuclei (Fig. 4B ).

2.6. 2.6. AMPKαAMPKα 활성화에 의한  By activation C3H10T1C3H10T1 /2 /2 중간엽Intermediate lobe 줄기세포에서  In stem cells MedMed 매개  medium 갈색화Brown

활성화된 AMP-activated protein kinase(AMPK)는 에너지가 부족한 경우 ATP 생산을 촉진시키거나 이화 과정의 단백질 발현을 증가시킨다. AMPK, SIRT1 및 mitochondria PGC-1α의 마스터 조절 인자는 조절 네트워크에서 대사 항상성에 중요하다(39). AMPK의 활성화 인자인 AICAR는 인간의 백색 지방세포에서 베이지-유사 표현형을 유도한다(40). Circumin은 AMPK의 활성화를 통해 3T3-L1 세포와 1차 백색 지방세포에서 갈색 지방과 같은 표현형을 촉진한다고 보고된 바 있다(40). 본 발명의 발명자들은, AMPKα의 용량-의존적 활성(도 6의 B)뿐만 아니라, 10분 후 Med에 의한 AMPKα 활성화를 관찰하였으며(도 6의 A), 이는 Med에 의한 AMPK 경로의 명확한 활성화를 보여주는 것이다. 특정 저해제인 dorsomorphin(compound C)에 의한 AMPK의 저해는 PPARγ, PRDM16 및 PGC-1α와 같은 전사 인자의 상향 조절 뿐만 아니라, UCP1 단백질 발현의 Med의 효과를 제거하는데, 이는 AMPK 경로가 Med 유도된 갈색화에 밀접하게 관련되어 있음을 시시한다. AMPKα siRNA에 의한 AMPKα의 유전자 사일런싱은 주요 갈색화 인자, 즉 Ucp1, Pgc-1α, Pparγ 및 Prdm16의 단백질 발현에 대한 Med의 영향을 배제시켰다(도 7 및 도 8). 또한, Med-induced mRNA 발현은 AMPKα의 silencing시 제거되어 AMPK가 전사 단계에서 갈색화를 조절함을 시사한다.Activated AMP-activated protein kinase (AMPK) stimulates ATP production in the absence of energy or increases protein expression in the catabolic process. Master regulators of AMPK, SIRT1 and mitochondria PGC-1α are important for metabolic homeostasis in regulatory networks (39) . AICAR, an activator of AMPK, induces a beige-like phenotype in human white adipocytes (40) . Circum has been reported to promote phenotypes such as brown fat in 3T3-L1 cells and primary white adipocytes through activation of AMPK (40) . The inventors of the present invention observed AMPKa activation by Med after 10 minutes as well as the dose-dependent activity of AMPKa (Fig. 6B) (Fig. 6A), indicating a clear activation of the AMPK pathway by Med will be. Inhibition of AMPK by a specific inhibitor, dorsomorphin (compound C), not only upregulates transcription factors such as PPARγ, PRDM16 and PGC-1α, but also eliminates the effect of Med on UCP1 protein expression, . The gene silencing of AMPKa by AMPKa siRNA excluded the effect of Med on protein expression of the major brownening factors Ucp1, Pgc-l [alpha], Ppar [gamma] and Prdm16 (FIGS. 7 and 8). In addition, Med-induced mRNA expression is eliminated by silencing of AMPKα, suggesting that AMPK regulates browning at the transcriptional stage.

3. 3. 토 론debate

체중 감량의 목표는 미용 표준인 슬림함을 달성하기보다는 질병율을 감소시켜야 한다. 질병율의 감소는 대사-프로필 개선을 필요로 한다. 증가된 에너지 소비, 더 높은 포도당 이용 및 더 높은 산소 소비, 지방 분해, 미토콘드리아 생성 및 β-산화와 함께 백색 지방의 갈색화는 대사 프로파일의 개선으로 간주된다(4, 8). 운동 및 식이 요법 관리가 이러한 모든 이점을 가져올 수 있지만(41), 인류가 에너지 소비 또는 신체 활동의 패턴을 변경하지 않으려 하는 것은 에너지를 저장하는 WAT를 에너지-소비 BAT 또는 베이지 지방으로 전환하여 에너지의 균형을 맞출 필요가 있음을 강조한다. 비만 퇴치를 위한 이 새로운 패러다임을 구현하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 이러한 세포들이 주로 MDI 호르몬 자극 후 백색 지방을 생성하는 경향이 있기 때문에 연구를 위한 모델 시스템으로 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포를 이용한 갈색화에 중점을 두었다. MDI 호르몬 자극 동안 C3H10T1/2 세포를 백색 지방세포보다는 갈색 또는 베이지 지방세포로 분화할 수 있는 약물 후보 물질을 찾기 위하여, 우리는 지질 축적의 저해와 LD 크기의 형태학적 검출을 포함하는 종래의 스크리닝 방법과 함께 중요한 열 형성 마커인 Ucp1 유전자 발현의 정량화를 사용하였다. 이 스크리닝 방법을 사용하여, 우리는 Med을 잠재적인 후보 물질로 성공적으로 확인하고, 비만 또는 관련 대사 문제의 가능한 치료를 위한 분자 작용 메커니즘을 입증하였다. 이러한 처리는 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포로부터의 갈색 지방세포-유사 세포의 형성 및 iWAT 및 BAT 세포에서의 발열 인자의 발현을 유도한다.The goal of weight loss should be to reduce the disease rate rather than achieve the slimming standard of beauty. Reduced disease rates require metabolic - profile improvement. Increased energy expenditure, higher glucose utilization and higher oxygen consumption, lipolysis, mitochondrial production, and brown coloration of white fats with β-oxidation are considered to improve metabolic profiles (4, 8) . Although exercise and dietary management can bring all of these benefits (41) , what humanity does not want to change the pattern of energy consumption or physical activity is to convert energy-consuming WAT into energy-consuming BAT or beige fat Emphasize the need to balance. In order to implement this new paradigm for the fight against obesity, the inventors of the present invention have found that these cells tend to produce white fats after stimulation of MDI hormones, so that the model system for the study is browning using C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells . In order to find candidate drug candidates capable of differentiating C3H10T1 / 2 cells into brown or beige adipocytes rather than white adipocytes during MDI hormone stimulation, we have used conventional screening methods including inhibition of lipid accumulation and morphological detection of LD size And quantification of Ucp1 gene expression, an important heat-forming marker, was used. Using this screening method, we successfully identified Med as a potential candidate and demonstrated a molecular action mechanism for possible treatment of obesity or related metabolic problems. This treatment induces the formation of brown adipocyte-like cells from C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells and the expression of pyrogenic factors in iWAT and BAT cells.

천연 pterocarpan으로서 Med는 백색 지방세포에서 갈색 지방세포와 유사한 특성, 예를 들어, C3H10T1/2 중간엽 줄기세포의 베이지 지방세포 특이적 마커를 유도하는 능력과 함께 다소포 LD의 형성, 높은 산소 소비, 증가된 미토콘드리아 함량 및 UCP-1 발현을 촉진시킨다. 첫째로, 본 발명의 발명자들은 Med 처리가 UCP1 mRNA의 발현 및 단백질 농도를 현저히 증가시킬 수 있음을 발견하였고, 또한, 증가된 AMPK 활성화를 관찰하였다. 중요한 열 생성 마커인 UCP1은 BAT와 베이지 지방세포에 풍부하다. 미토콘드리아 내부 막에서 UCP1은 ATP 대신 열(열 발생)을 생성하는 양성자 기울기를 누출한다(42). 일부 보고에 따르면, 지방 조직에서 UCP1이 과다하게 발현되면 AMPK가 계속 활성화되면서 AMP/ATP 비율이 증가한다는 사실이 밝혀졌다(42). 반대 방향으로, resveratrol과 curcumin에 의한 AMPK 활성화는 증가된 UCP1 발현과 함께 갈색 유사 지방세포를 유도할 수 있고(11, 13), AMPK 활성화, UCP1 발현, 산소 소비, 미토콘드리아 생성에서의 Med 매개된 증가 및 갈색-지방세포-유사 표현형의 분화와 유사하다.As a natural pterocarpan, Med has similar characteristics to brown adipocytes in white adipocytes, for example, the ability to induce beige adipocyte-specific markers of C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells, Promotes increased mitochondrial content and UCP-I expression. First, the inventors of the present invention have found that Med treatment can significantly increase the expression and protein concentration of UCP1 mRNA, and also observed increased AMPK activation. UCP1, an important heat-producing marker, is abundant in BAT and beige adipocytes. In mitochondrial inner membrane, UCP1 leaks a proton gradient that generates heat (heat generation) instead of ATP (42) . According to some reports, overexpression of UCP1 in adipose tissue has been shown to increase AMP / ATP ratios as AMPK continues to be activated (42) . Conversely, AMPK activation by resveratrol and curcumin can induce brown-like adipocytes with elevated UCP1 expression (11, 13) , mediated by AMPK activation, UCP1 expression, oxygen consumption, and mitochondrial production And brown-fat cell-like phenotype.

에너지 항상성의 주요 조절자인, 고갈된 에너지 준위에 반응하여 활성화되는 AMPK 경로는 식욕과 동화 작용을 조절할 뿐만 아니라, 포도당 섭취, β 산화 및 미토콘드리아 생성과 마이토파지(mitophagy)를 촉진한다(43). 본 발명에서, 우리는 Med가 효과적으로 AMPK의 인산화를 촉진할 수 있음을 발견했다. dorsomorphin이나 AMPK siRNA에 의한 AMPK의 특이적 저해는 AMPK의 총 단백질 함량과 하류의 갈색-지방세포-유사 유전자 발현을 크게 감소시켰다. 이러한 데이터는 Med가 AMPK 경로를 통해 백색 지방세포에서 갈색-지방세포-유사 표현형을 촉진한다는 것을 나타낸다. 또한, 갈색 및 베이지 지방세포의 고유한 특징은 증가된 UCP1 발현의 가능한 원인인 증가된 미토콘드리아 함량 및 카피 수이다(4). 일련의 보고에 따르면, PPARγ 항진제인 rosiglitazone은 지방세포 분화 속도의 증가와 함께 미토콘드리아 생성을 증가시킨다(6, 34). TFAM은 미토콘드리아 생성의 중요한 조절 인자로 여겨지고 있다. 따라서, 미토콘드리아 함량의 증가는 AMPK 경로를 통한 TFAM 상향 조절에 의해 조절된다(44). 본 연구에서, 우리는 Med가 Tfam 유전자 발현을 유도할 수 있음을 발견하였으며, 이는 AMPK 경로를 통해 Med-유도된 미토콘드리아 생성을 더욱 강화시킨다. 미토콘드리아 융합은 소뇌의 신경 퇴행을 예방하고, 골격근에서의 mtDNA 안정성 및 mtDNA 돌연변이에 대한 내성에 필요하다는 것이 밝혀졌다(45, 46). 미토콘드리아 분열의 저해는 노화의 두 가지 곰팡이 모델에서 수명과 적합성을 증가시키고, HL-1 세포에 대한 실험에서 허혈-재관류 손상으로부터 심장을 보호한다(47, 48). OPA1과 DRP1은 각각 미토콘드리아 융합과 분열을 조절하며 미토콘드리아 다이나믹스에 중요하다(49). Pgc-1α와 Sirt1은 미토콘드리아 생성을 조절하고, Tfam의 발현을 조절하는 Nrf1과 같은 여러 유전자를 활성화시킨다(35, 36, 50). 상기 제시된 다양한 데이터는 Med 처리가 미토콘드리아 함량과 mtDNA 함량을 증가시키고, 미토콘드리아 유전자와 단백질 Sirt1과 Pgc-1α의 발현을 증가시킨다는 것을 밝혀냈다. 이 발견은 미토콘드리아 생성을 의미한다. 참고로, Opa1 유전자 발현의 증가와 Drp1 유전자 발현의 억제는 미토콘드리아 생성을 유발할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 다이나믹스 및 항상성을 향상시킨다는 것을 시사한다.The AMPK pathway, which is activated in response to depleted energy levels, a major regulator of energy homeostasis, regulates appetite and anabolic as well as promotes glucose uptake, β-oxidation and mitochondrial production and mitophagy (43) . In the present invention, we have found that Med can effectively promote phosphorylation of AMPK. The specific inhibition of AMPK by dorsomorphin or AMPK siRNA significantly reduced the total protein content of AMPK and the downstream brown - fat cell - like gene expression. These data indicate that Med promotes the brown-fat cell-like phenotype in white adipocytes through the AMPK pathway. In addition, a unique feature of brown and beige adipocytes is the increased mitochondrial content and copy number, a possible cause of increased UCP1 expression (4) . According to a series of reports, the PPARγ agonist rosiglitazone increases mitochondrial production with an increase in adipocyte differentiation rate (6, 34) . TFAM is considered to be an important regulator of mitochondrial production. Thus, increased mitochondrial content is regulated by TFAM upregulation through the AMPK pathway (44) . In this study, we found that Med can induce Tfam gene expression, which further enhances Med-induced mitochondrial production through the AMPK pathway. Mitochondrial fusion has been shown to prevent neural degeneration in the cerebellum, and is required for mtDNA stability and resistance to mtDNA mutations in skeletal muscle (45, 46) . Inhibition of mitochondrial division increases lifespan and fitness in two fungal models of aging and protects the heart from ischemia-reperfusion injury in experiments on HL-1 cells (47, 48) . OPA1 and DRP1 regulate mitochondrial fusion and division, respectively, and are important for mitochondrial dynamics (49) . Pgc-1α and Sirt1 activate several genes, such as Nrf1 , which regulate mitochondrial production and regulate Tfam expression (35, 36, 50) . The various data presented above reveal that Med treatment increases mitochondrial and mtDNA content and increases the expression of mitochondrial genes and proteins Sirt1 and Pgc-l [alpha]. This finding implies mitochondrial production. For reference, the increase Drp1 and inhibition of gene expression of Opa1 gene expression suggests that sikindaneun not only result in the mitochondria generation and improve mitochondrial dynamics and homeostasis.

전반적인 리뷰에서, Matthew Harms & Patrick Seale은 PGC-1α가 냉기 노출 또는 β-작용제 처리 후 활성화를 통해 갈색 및 베이지 지방의 모든 유형을 조절한다는 것을 보여주었다(4). 그들은 PRMD16이 PPARγ에 결합하고, PGC-1α와 UCP1 및 다른 베이지 지방 특이적 유전자의 발현을 증가시킴으로써 백색 지방을 베이지 지방으로 전환시키는 것을 촉진한다는 것을 밝혀냈다. 그 후, 이들 세포는 다발성의 작은 LDs와 높은 산소 소비량을 보인다. Med가 베이지 지방세포 발달과 관련된 표현형 변화의 중요한 요소의 발현을 자극한다는 본 발명의 발명자들에 의한 발견은 Matthew Harms & Patrick Seale의 설명과 일치한다(4). 그럼에도 불구하고, 에너지 소비와 냉기 노출에 의한 비오한열생성의 활성화는 상응하는 경로의 시상 하부 자극을 필요로 한다. 본 발명에서는 시험관 내 세포 배양 모델을 사용했기 때문에 본 발명은 시상 하부 활성화와 같은 전체 메커니즘을 다루지는 못했다. 이러한 측면에서 생체 내 모델에 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 보인다. 다소포 소형 LD의 형성과 높은 에너지 소비는 더 큰 LDs를 분해하고, 유리 지방산을 시스템으로 방출하기 위해 지방 분해를 필요로 하며, 그 다음 미토콘드리아 β 산화에 의해 연소되고 산소 소비를 증가시킨다. 본 발명의 발명자들은 미토콘드리아 생성, 더 작은 LD 및 더 높은 산소 소비를 관찰했지만, 연구는 범위가 제한적이며, 지방 분해 및 β 산화에 대한 연구와 같은 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.In an overall review, Matthew Harms & Patrick Seale showed that PGC-1α regulates all types of brown and beige fats through activation after cold exposure or β-agonist treatment (4) . They found that PRMD16 binds to PPARγ and promotes the conversion of white fats to beige fat by increasing expression of PGC-1α and UCP1 and other beige fat-specific genes. Then, these cells show small LDs and high oxygen consumption. Discovery by the inventors of the present invention that Med mediates the expression of an important element of phenotypic change associated with beige adipocyte development is consistent with Matthew Harms & Patrick Seale's explanation (4) . Nonetheless, activation of noxious heat generation by energy consumption and cold exposure requires hypothalamic stimulation of the corresponding pathway. In the present invention, since the in vitro cell culture model was used, the present invention did not cover the entire mechanism such as activation of the hypothalamus. More research on in vivo models is needed in this respect. Formation of a rather compact LD and high energy consumption require decomposition of fat to decompose larger LDs and release free fatty acids into the system, which is then burned by mitochondrial β oxidation and increases oxygen consumption. The inventors of the present invention have observed mitochondrial production, smaller LD and higher oxygen consumption, but the study is limited in scope and further studies such as studies on lipolysis and beta oxidation are likely to be required.

4. 4. 결 론conclusion

본 발명에서 Med는 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포가 산소 소비량 증가, 다소포 LDs, 미토콘드리아 생성 및 UCP-1와 PGC-1α 발현과 같은 갈색 지방세포 유사 특성을 획득할 뿐만 아니라, 베이지-지방세포 마커를 유도함을 보여준다. 또한, Med는 AMPK 활성화 및 후속 열 생성 프로그램을 자극한다(도 9). 이것은 C3H10T1/2 중간엽 줄기세포에서 갈색 및 베이지 지방세포 표현형에 대한 Med의 자극 효과에 관한 첫 번째 보고이다. 본 발명의 발명자들의 연구는 Med가 비만이나 비만 관련 대사성 질환의 치료를 위한 유망한 치료 후보자임을 밝힌 것에 의의가 있다.In the present invention, Med not only acquires brown fat cell-like characteristics such as C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells increase oxygen consumption, more or less LDLs, mitochondrial production and UCP-1 and PGC-1alpha expression, . Med also stimulates AMPK activation and subsequent heat generation programs (Figure 9). This is the first report on the stimulating effect of Med on the brown and beige fat cell phenotype in C3H10T1 / 2 mesenchymal stem cells. The study of the inventors of the present invention is significant in that Med is a promising candidate for treatment of obesity or obesity-related metabolic diseases.

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gggtggatt 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pgc1a reverse primer <400> 46 tgaggaccgc tagcaagttt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara forward primer <400> 47 gcgtacggca atggctttat 20 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara reverse primer <400> 48 gaacggcttc aggttctt 18 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 49 tttgaaagaa gcggtgaacc ac 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pparg reverse primer <400> 50 accattgggt cagctcttgt g 21 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 51 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 reverse primer <400> 52 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 forward primer <400> 53 taccgccttg tcaagaaacc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 reverse primer <400> 54 agtggagcgc cagaatagaa 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin forward primer <400> 55 tgccagtgtg caaggataga ct 22 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin reverse primer <400> 56 cgctcacttc cccgacat 18 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k forward primer <400> 57 ggctgaaggc aaagtcagtg t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k reverse primer <400> 58 tggaatctgt cctgctgtcc t 21 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam forward primer <400> 59 gtccataggc accgtattgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam reverse primer <400> 60 cccatgctgg aaaaacactt 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 forward primer <400> 61 ggcattcaga ggcaaatcag ct 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 reverse primer <400> 62 cgcaagttca cagtcgttcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin forward primer <400> 63 cacacacgca gtcggtatcc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin reverse primer <400> 64 agcccaggaa tgaagtccaa 20 <110> SOON CHUN HYANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF OBESITY          COMPRISING MEDICARPIN OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS          THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT <160> 64 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 forward primer <400> 1 gggtggcact caagaaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Asc-1 reverse primer <400> 2 agtgttccag gacacccttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp2 forward primer <400> 3 gggacccgct gtcttctagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp2 reverse primer <400> 4 tcaactcaaa ttcgctgagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp4 forward primer <400> 5 gacttcgagg cgacacttct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp4 reverse primer <400> 6 gccggtaaag atccctcatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp5 forward primer <400> 7 ttacttaggg gtattgtggg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp5 reverse primer <400> 8 ccgtctctca tggttccgta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp7 forward primer <400> 9 acggacaggg cttctcctac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Bmp7 reverse primer <400> 10 atggtggtat cgagggtgga 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cidea forward primer <400> 11 tgctcttctg tatcgcccag t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cidea reverse primer <400> 12 gccgtgttaa ggaatctgct g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox1 forward primer <400> 13 tctactattc ggagcctgag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox1 reverse primer <400> 14 ctactgatgc tcctgcatgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox7a1 forward primer <400> 15 cagcgtcatg gtcagtctgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox7a1 reverse primer <400> 16 agaaaaccgt gtggcagaga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox8b forward primer <400> 17 gaaccatgaa gccaacgact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Cox8b reverse primer <400> 18 cgcaagttca cagtcgttcc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Drp1 forward primer <400> 19 ctgacgcttg tggatttacc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Drp1 reverse primer <400> 20 cccttcccat caatacatcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Elov13 forward primer <400> 21 tccgcgttct catgtaggtc t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Elov13 reverse primer <400> 22 ggacctgatg caaccctatg a 21 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Mouse Fabp4 (aP2) forward primer <400> 23 gtgatgcctt tgtgggaaac ctggaag 27 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Mouse Fabp4 (aP2) reverse primer <400> 24 tcataaactc ttgtggaagt cacgcc 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Gapdh forward primer <400> 25 gacatgccgc ctggagaaac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Gapdh reverse primer <400> 26 agcccaggat gccctttagt 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 forward primer <400> 27 gagcatgttt tcagacgact ttg 23 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Hspb7 reverse primer <400> 28 ccgagggtct tcatgtttcc tt 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD137 forward primer <400> 29 cgtgcagaac tcctgtgata ac 22 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CD137 reverse primer <400> 30 gtccacctat gctggagaag g 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fgf21 forward primer <400> 31 agatcaggga ggatggaaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Fgf21 reverse primer <400> 32 tcaaagtgag gcgatccata 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tbx1 forward primer <400> 33 ggcaggcaga cgaatgttc 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tbx1 reverse primer <400> 34 ttgtcatcta cgggcacaaa g 21 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tmem26 forward primer <400> 35 accctgtcat cccacagag 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tmem26 reverse primer <400> 36 tgtttggtgg agtcctaagg tc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Opa1 forward primer <400> 37 cagctggcag aagatctcaa g 21 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Opa1 reverse primer <400> 38 tatgagcagt ttgacaca 18 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse p0 forward primer <400> 39 gcactttcgc tttctggagg gtgt 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse p0 reverse primer <400> 40 tgacttggtt gctttggcgg gatt 24 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse P2rx5 forward primer <400> 41 ctgcagctca ccatcctgt 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse P2rx5 reverse primer <400> 42 cactctgcag ggaagtgtca 20 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pat2 forward primer <400> 43 gtgccaagaa gctgcagag 19 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pat2 reverse primer <400> 44 tgttgccttt gaccagatga 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pgc1a forward primer <400> 45 acagctttct gggtggatt 19 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pgc1a reverse primer <400> 46 tgaggaccgc tagcaagttt 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara forward primer <400> 47 gcgtacggca atggctttat 20 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ppara reverse primer <400> 48 gaacggcttc aggttctt 18 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 49 tttgaaagaa gcggtgaacc ac 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Pparg reverse primer <400> 50 accattgggt cagctcttgt g 21 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 forward primer <400> 51 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Prdm16 reverse primer <400> 52 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 forward primer <400> 53 taccgccttg tcaagaaacc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Psat1 reverse primer <400> 54 agtggagcgc cagaatagaa 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin forward primer <400> 55 tgccagtgtg caaggataga ct 22 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Resistin reverse primer <400> 56 cgctcacttc cccgacat 18 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k forward primer <400> 57 ggctgaaggc aaagtcagtg t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Serpina3k reverse primer <400> 58 tggaatctgt cctgctgtcc t 21 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam forward primer <400> 59 gtccataggc accgtattgc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Tfam reverse primer <400> 60 cccatgctgg aaaaacactt 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 forward primer <400> 61 ggcattcaga ggcaaatcag ct 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Ucp1 reverse primer <400> 62 cgcaagttca cagtcgttcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin forward primer <400> 63 cacacacgca gtcggtatcc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Leptin reverse primer <400> 64 agcccaggaa tgaagtccaa 20

Claims (8)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포의 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 시약 조성물.A reagent composition for inducing the differentiation of mesenchymal stem cells, medullar stem cells, or adipocytes into brown adipocytes or beige adipocytes, comprising Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. 제 5항에 있어서, 상기 분화 유도된 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포는 산소 소비 증가, 다소포 지질 액적(multilocular lipid droplets) 생성, 세포 내 미토콘드리아 함량 및 카피 수의 증가 및 UCP1(uncoupling protein 1) 유전자의 발현량 증가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 분화 유도용 시약 조성물.6. The method according to claim 5, wherein the differentiation-induced brown adipocytes or beige adipocytes have increased oxygen consumption, more multilocular lipid droplets, increased intracellular mitochondrial content and copy number, and increased UCP1 (uncoupling protein 1) And a phenotype selected from the group consisting of an increase in the expression level of the expression vector. 제 5항에 있어서, 상기 분화 유도는 AMPK(5''-AMP-activated protein kinase) 신호 경로의 활성화에 의한 것임을 특징으로 하는 분화 유도용 시약 조성물.6. The reagent composition according to claim 5, wherein the differentiation induction is by activation of AMPK (5 &quot; -AMP-activated protein kinase) signal pathway. 분리된 중간엽 줄기세포, 전 지방세포 또는 백색 지방세포에 메디카르핀(Medicarpin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 갈색 지방세포 또는 베이지 지방세포로의 분화 유도 방법. A method of inducing differentiation into brown adipocytes or beige adipocytes comprising treating isolated mesenchymal stem cells, pre-adipocytes or white adipocytes with Medicarpin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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