JP5819209B2 - Differentiation promoter from stem cells to brown adipocytes - Google Patents

Description

本発明は、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を有効成分として含有する幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤、及び該分化促進剤を含有し、肥満の改善及び予防を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品及び飲食品などの各種組成物に関する。   The present invention aims to improve and prevent obesity, comprising an agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes containing an extract of lotus germ and an extract of passionflower as active ingredients, and the agent for promoting differentiation. The present invention relates to various compositions such as pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and foods and drinks.

脂肪組織は、生体に存在する重要な臓器の一つであり、白色脂肪組織と褐色脂肪組織の２つのタイプに大別される。白色脂肪組織は、エネルギーを中性脂質として細胞内に貯蓄する白色脂肪細胞から構成されており、生体内の余剰エネルギーを蓄える働きがある。また、この細胞は、運動や飢餓時等、生体がエネルギーを必要とする際に、蓄積した中性脂質を遊離脂肪酸へと分解し、ミトコンドリアに存在する電子伝達系を介してアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を合成することで、エネルギーを生体へ補給する役割を担っている。   Adipose tissue is one of important organs present in the living body, and is roughly divided into two types: white adipose tissue and brown adipose tissue. White adipose tissue is composed of white adipocytes that store energy in cells as neutral lipids, and has a function of storing surplus energy in the living body. In addition, these cells break down accumulated neutral lipids into free fatty acids when the body needs energy, such as during exercise and starvation, and adenosine triphosphate ( By synthesizing ATP), it plays a role of supplying energy to the living body.

一方、褐色脂肪細胞も、白色脂肪細胞と同様に細胞内に中性脂質を貯蓄するが、脱共役タンパク質１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１：以降、「ＵＣＰ１」と略す）の働きにより、電子伝達系におけるＡＴＰ合成を経ずに、中性脂質を熱へと変換し、直接的にエネルギーを消費させる役割を担っている。   On the other hand, brown adipocytes also store neutral lipids in the cells in the same manner as white adipocytes, but in the electron transport system due to the action of uncoupling protein-1 (hereinafter abbreviated as “UCP1”). Without going through ATP synthesis, neutral lipid is converted into heat and plays a role of consuming energy directly.

したがって、生体内において、白色脂肪細胞がエネルギーを貯蔵及び必要時に補給し、これに対して、褐色脂肪細胞が、熱産生によりエネルギーを消費することで、バランスを調節していることになる（非特許文献１〜３）。   Therefore, in the living body, white adipocytes store energy and replenish energy when necessary, while brown adipocytes consume energy through heat production to regulate the balance (non-) Patent Documents 1 to 3).

近年の研究成果から、これら白色脂肪細胞と褐色脂肪細胞の役割のバランス異常によって生じる脂肪の蓄積が、肥満やメタボリックシンドロームの発症に密接に関与していることが明らかとなっている（非特許文献４、５）。特に、過剰に摂取したエネルギーが白色脂肪組織に貯蓄されることによって肥満が生じ、これがメタボリックシンドローム発症の主な原因と考えられており、これを解消するにはエネルギーを効率的に消費する必要がある。   From recent research results, it has become clear that the accumulation of fat caused by the abnormal balance between the roles of these white and brown adipocytes is closely related to the development of obesity and metabolic syndrome (Non-patent literature). 4, 5). In particular, obesity is caused by the excessive intake of energy stored in white adipose tissue, which is considered to be the main cause of the development of metabolic syndrome. To eliminate this, it is necessary to consume energy efficiently. is there.

したがって、このような肥満やメタボリックシンドロームなどの疾患の予防や治療には、生体内でエネルギーを過剰に貯蔵する白色脂肪細胞を減らし、エネルギーの消費を行う褐色脂肪細胞を増加させることが必要であり、これら細胞のバランスをいかに制御するかが課題である。特に、褐色脂肪細胞の働きは重要であり、この細胞を生体内で効率よく増加させる技術の開発は、今後の肥満やメタボリックシンドロームの改善において、直接的に応用できる可能性がある。   Therefore, to prevent and treat diseases such as obesity and metabolic syndrome, it is necessary to reduce white adipocytes that store excess energy in vivo and increase brown adipocytes that consume energy. The challenge is how to control the balance of these cells. In particular, the function of brown adipocytes is important, and the development of a technique for efficiently increasing the number of these cells in vivo may be directly applicable in the future improvement of obesity and metabolic syndrome.

現在までに、褐色脂肪細胞に着目した肥満の防止方法として、ジェニパー油や共役リノール酸による褐色脂肪組織の重量増加や（特許文献１、２）、わさび含有成分による褐色脂肪細胞におけるＵＣＰ１の発現亢進（特許文献３）などが知られているが、未だ十分な効果はなく、褐色脂肪細胞を増加させる薬剤の開発が望まれていた。   To date, as a method of preventing obesity focusing on brown adipocytes, the weight increase of brown adipose tissue by juniper oil or conjugated linoleic acid (Patent Documents 1 and 2), or the increased expression of UCP1 in brown adipocytes by wasabi-containing components (Patent Document 3) and the like are known, but there is still no sufficient effect, and the development of a drug that increases brown adipocytes has been desired.

特許第３９５１２７１号Japanese Patent No. 3951271 特許第３２０７８２３号Japanese Patent No. 3207823 特開２００６−３２８０５６JP 2006-328056 A

審良 静男，医学のあゆみ，１９９８，１８４，５１３−５１７Shizuo Akira, History of Medicine, 1998, 184, 513-517 斉藤 昌之，肥満の科学，第１２４回日本医学会シンポジウム，６２−７０Masayuki Saito, Science of Obesity, 124th Symposium of the Japanese Medical Association, 62-70 香川 靖雄，医学のあゆみ，１９９８，１８４，５２９−５３３Kagawa Ikuo, History of Medicine, 1998, 184, 529-533 青木茂久ら、日本臨床、２００６、６４巻、増刊９、１７５−１７９Shigehisa Aoki et al., Japanese Clinical, 2006, Volume 64, Special Number 9, 175-179 小川佳宏ら、実験医学、２００７、２５、増刊１５、５４−６０Yoshihiro Ogawa et al., Experimental Medicine, 2007, 25, Special Issue 15, 54-60

本発明は、褐色脂肪細胞を増加させ、肥満やメタボリックシンドロームを改善及び予防することのできる幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide an agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes, which can increase brown adipocytes and improve and prevent obesity and metabolic syndrome.

本発明者らは、上記課題を解決すべき鋭意研究を重ねた結果、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物が、幹細胞から褐色脂肪細胞への優れた分化促進活性を有すること、また、ハス胚芽の抽出物とパッションフラワーの抽出物を併用することにより、相乗的な分化促進効果が得られることを見い出し、本発明を完成させるに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the extract of lotus germ and the extract of passion flower have an excellent differentiation promoting activity from stem cells to brown adipocytes, It was found that a synergistic differentiation promoting effect can be obtained by using a lotus germ extract and a passion flower extract together, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を有効成分として含有する幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤。
(2) 脱共役タンパク質１(ＵＣＰ１）の発現を亢進する、(1)に記載の分化促進剤。
(3) (1)または(2)に記載の分化促進剤を含む医薬品または医薬部外品。
(4) (1)または(2)に記載の分化促進剤を含む化粧品。
(5) (1)または(2)に記載の分化促進剤を含む飲食品。
(6) 飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、または栄養補助食品である、(5)に記載の飲食品。
(7) (1)または(2)に記載の分化促進剤の存在下で幹細胞を培養して褐色脂肪細胞への分化誘導を促進することを特徴とする、幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進方法。
(8) (1)または(2)に記載の分化促進剤の存在下で幹細胞を培養して褐色脂肪細胞へ分化誘導する工程を含む、褐色脂肪細胞の製造方法。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes, which contains a lotus germ extract and a passion flower extract as active ingredients.
(2) The differentiation promoting agent according to (1), which enhances the expression of uncoupling protein 1 (UCP1).
(3) A pharmaceutical or quasi drug containing the differentiation promoting agent according to (1) or (2).
(4) A cosmetic comprising the differentiation promoter according to (1) or (2).
(5) A food or drink containing the differentiation promoting agent according to (1) or (2).
(6) The food or drink according to (5), wherein the food or drink is a health food, a functional food, a food for specified health use, or a dietary supplement.
(7) Promotion of differentiation from stem cells to brown adipocytes, characterized by culturing stem cells in the presence of the differentiation promoting agent according to (1) or (2) to promote differentiation induction into brown adipocytes Method.
(8) A method for producing brown adipocytes, comprising a step of culturing stem cells in the presence of the differentiation promoting agent according to (1) or (2) to induce differentiation into brown adipocytes.

本発明の幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤は、幹細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進し、褐色脂肪細胞を増加させることができる。その結果、褐色脂肪細胞によるエネルギー消費が亢進され、過剰なエネルギー摂取による肥満やメタボリックシンドロームを改善及び予防することができる。また、本発明の分化促進剤の有効成分であるハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物は天然の食用植物を由来とするため副作用がなく安全性が高い。よって、本剤を含む医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品は安心して服用もしくは摂取、使用できる。   The agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes of the present invention can promote differentiation from stem cells to brown adipocytes and increase brown adipocytes. As a result, energy consumption by brown adipocytes is enhanced, and obesity and metabolic syndrome due to excessive energy intake can be improved and prevented. Moreover, the lotus germ extract and passion flower extract, which are the active ingredients of the differentiation promoting agent of the present invention, are derived from natural edible plants and thus have no side effects and are highly safe. Therefore, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, and foods and drinks containing this drug can be taken, ingested or used with confidence.

以下に、本発明について詳細に述べる。
本発明の幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤（以下、「褐色脂肪細胞分化促進剤」という)は、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を有効成分とする。 The present invention will be described in detail below.
The agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes (hereinafter referred to as “brown adipocyte differentiation promoting agent”) of the present invention comprises a lotus germ extract and a passion flower extract as active ingredients.

本発明における「幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進」とは、生体レベルでまたは培養レベルで幹細胞から褐色脂肪細胞の分化を誘導及び促進し、褐色脂肪細胞を増加させ、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）の発現を亢進させることをいう。ここで、幹細胞とは、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、筋肉、皮膚、脂肪、脳、肝臓、膵臓、腎臓等、その他の組織に存在する未分化な状態の細胞（総称して、体性幹細胞という）、さらには遺伝子導入などにより人工的に作成された幹細胞を含む。   In the present invention, “proliferation promotion from stem cells to brown adipocytes” means inducing and promoting the differentiation of brown adipocytes from stem cells at the living body level or culture level, increasing brown adipocytes, and uncoupling protein 1 (UCP1). ) Expression. Here, the stem cells are embryonic stem cells (ES cells) or cells in an undifferentiated state existing in other tissues such as bone marrow, blood, muscle, skin, fat, brain, liver, pancreas and kidney ( Collectively referred to as somatic stem cells), and stem cells artificially created by gene transfer or the like.

上記有効成分である「ハス胚芽」は、スイレン科植物の胚芽で、例えば、ハス属のハス（Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ．）やキバナハス（Ｎ． ｌｕｔｅａ Ｐｅｒｓ．）、オニバス属のオニバス（Ｅｕｙａｌｅ ｆｅｒｏｘ Ｓａｌｉｓｂ．）、またはオオオニバス属のオオオニバス（Ｖｉｃｔｏｒｉａ ｒｅｇｉａＬｉｎｄｌ．）等の胚芽を使用することができる。生薬として流通するものとしては、蓮芯、蓮子芯等が挙げられ、市販品を利用することができる。ハスは、部位によって異なった薬効を有している。例えば、ハス属のハス葉（荷葉）は下痢止め、止血に、果実（蓮肉）と雄しべ（蓮シュ）は強壮、胚芽（蓮芯、蓮子芯）は解熱と異なった薬効が知られている。また、成分も部位によって異なり、果実には多量のデンプンと糖類のラフィノースが、葉にはロエメリン、ヌシフェリン等のアルカロイドが、そして、胚芽にはメチルコリパリンやロツシン等の異なるアルカロイドが含まれていることが知られている（原色日本薬用植物図鑑、木村康一、木村孟淳共著、保育社）。   The “lotus germ” as the active ingredient is a germ of a water lily family, and includes, for example, a lotus of the genus Lotus (Nelumbo nuifera Gaertn.), N. lutea Pers., And Euya ferox Salisb. Alternatively, embryos such as the licorice genus (Victoria regilia Lindl.) Can be used. Examples of products distributed as crude drugs include lotus wicks, lotus wicks and the like, and commercially available products can be used. Lotus has different medicinal effects depending on the site. For example, lotus leaves (cargo leaves) of the genus Lotus are known to have anti-diarrhea, hemostasis, fruit (lotus meat) and stamens (lotus), tonic, and germs (lotus core, lotus core) different from antipyretic. . In addition, the ingredients vary depending on the site, the fruit contains a large amount of starch and sugar raffinose, the leaves contain aloeloids such as loemerin and luciferin, and the germ contains different alkaloids such as methylcolyparin and rotsin. It is known (primary color Japanese medicinal plant picture book, Koichi Kimura, Jun Kimura, nursery company).

本発明に用いるハス胚芽の抽出物は、ハス胚芽から溶媒で抽出することにより得ることができる。その抽出方法は特に限定されず、加熱抽出であっても、常温抽出であってもよい。   The lotus germ extract used in the present invention can be obtained by extracting from the lotus germ with a solvent. The extraction method is not particularly limited, and may be heat extraction or room temperature extraction.

上記有効成分である「パッションフラワー」は、ブラジル原産のトケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）の植物で、学名をパスシフロラ インカルナタ(Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｉｎｃａｒｎａｔａ）といい、薬草として利用されるのは主にｉｎｃａｒｎａｔａ種（チャボトケイソウ）、ｅｄｕｌｉｓ種（クダモノトケイソウ）の葉、蔓、幹の部分で、主な成分は、多糖体とアルカノイド類を含むフラボノイドである。パッションフラワーの主な薬効として、鎮静、精神安定、血圧降下などが知られている。   "Passion flower" which is the above active ingredient is a plant of Passifloraceae native to Brazil, the scientific name is Pasciflora incarnata (Passiflora incarnata), and it is mainly used as a medicinal herb incarnata species (Chabotoceae), The leaves, vines, and trunks of the edulis species are the flavonoids, including polysaccharides and alkanoids. The main medicinal effects of passion flower are known to be sedation, mental stability, and blood pressure drop.

本発明に用いるパッションフラワーの抽出物は、パッションフラワーの葉、茎、果実、花から溶媒で抽出することによって得られる。その抽出方法は特に限定されず、加熱抽出であっても、常温抽出であってもよい。   The passion flower extract used in the present invention can be obtained by extracting with a solvent from the leaves, stems, fruits and flowers of the passion flower. The extraction method is not particularly limited, and may be heat extraction or room temperature extraction.

上記のハス胚芽の抽出及びパッションフラワーの抽出に用いる溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル等）が挙げられるが、好ましくは、水、低級アルコール等の極性溶媒であり、より好ましくは、水、エタノール、および水とエタノールの混合溶媒である。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いてもよい。また、これらの有機溶媒で抽出する際には抽出効率を上げるために、例えば界面活性剤、酵素製剤（ペクチナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ等）などの添加物を本発明の効果を損なわない範囲で抽出溶媒に加えてもよい。   Examples of the solvent used for extraction of the above-mentioned lotus germ and passion flower include water, lower alcohols (such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, and 2-butanol), liquid polyvalent compounds, and the like. Alcohol (1,3-butylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), acetonitrile, esters (ethyl acetate, butyl acetate, etc.), hydrocarbons (hexane, heptane, etc.), ethers (Ethyl ether, tetrahydrofuran, propyl ether, polyoxyethylene cetyl ether, etc.) can be mentioned, preferably polar solvents such as water and lower alcohols, more preferably water, ethanol, and a mixed solvent of water and ethanol. It is. These solvents may be used alone or in combination of two or more. In addition, when extracting with these organic solvents, in order to increase the extraction efficiency, for example, additives such as surfactants, enzyme preparations (pectinase, cellulase, protease, etc.) are used in the extraction solvent as long as the effects of the present invention are not impaired. You may add to.

抽出溶媒として水とアルコール類の混合溶媒を使用する場合は、アルコール濃度が１０〜９０％とすることが好ましい。具体的には、エタノール濃度が２０〜７０％の含水エタノール、１，３−ブチレングリコール濃度が２０〜７０％の含水１，３−ブチレングリコールなどの溶媒が好適に使用される。   When using a mixed solvent of water and alcohols as the extraction solvent, the alcohol concentration is preferably 10 to 90%. Specifically, a solvent such as hydrous ethanol having an ethanol concentration of 20 to 70% and hydrous 1,3-butylene glycol having a 1,3-butylene glycol concentration of 20 to 70% is preferably used.

抽出に使用する溶媒量は、抽出原料１重量部に対して通常２〜２００重量部、好ましくは１０〜１００重量部である。抽出溶媒量がこの範囲を下回ると、抽出原料全体に抽出溶媒が行き渡らず、抽出効率が低下する可能性があり、抽出溶媒量がこの範囲を超えると、後に抽出溶媒除去を行う際の負担が増加する。   The amount of solvent used for extraction is usually 2 to 200 parts by weight, preferably 10 to 100 parts by weight, per 1 part by weight of the extraction raw material. If the amount of the extraction solvent falls below this range, the extraction solvent does not reach the entire extraction raw material, and the extraction efficiency may decrease.If the amount of the extraction solvent exceeds this range, the burden of removing the extraction solvent later will be reduced. To increase.

抽出温度は、抽出に使用する溶媒の沸点以下の温度であり、特に限定されず、例えば加熱抽出であってもよいし、常温抽出であってもよい。   The extraction temperature is a temperature not higher than the boiling point of the solvent used for extraction, and is not particularly limited. For example, it may be heat extraction or room temperature extraction.

抽出時間は、常温抽出の場合は１〜２週間、加熱抽出の場合は３０分間〜２４時間、好ましくは１〜１０時間であるが、抽出溶媒の種類、抽出温度等の条件によって適宜調節できる。抽出操作の回数は特に限定されるものではなく、１回であってもよいし、１回目の抽出後に再度新鮮な抽出溶媒を添加し、２回目以降の抽出操作を行なってもよい。また、同一の抽出溶媒を用いて複数回抽出操作を行ってもよい。   The extraction time is 1 to 2 weeks in the case of normal temperature extraction, and 30 minutes to 24 hours, preferably 1 to 10 hours in the case of heat extraction, but can be appropriately adjusted depending on conditions such as the type of extraction solvent and extraction temperature. The number of extraction operations is not particularly limited, and may be one, or a fresh extraction solvent may be added again after the first extraction, and the second and subsequent extraction operations may be performed. Moreover, you may perform extraction operation in multiple times using the same extraction solvent.

抽出方法は、当分野で通常用いられる方法であればよく、室温又は加熱下で、任意の装置を使用して行う。具体的には、抽出溶媒を満たした抽出処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら可溶性成分を溶出した後、濾過して残渣を除去し、抽出物を得る。   The extraction method may be any method commonly used in the art, and is performed using an arbitrary apparatus at room temperature or under heating. Specifically, an extraction raw material is put into an extraction processing tank filled with an extraction solvent, and a soluble component is eluted with occasional stirring as necessary, followed by filtration to remove a residue to obtain an extract.

上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよく、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で更に、濃縮、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理をして用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。   The above extract may be used as it is, and if necessary, it may be further treated for concentration, dilution, filtration, decolorization with activated carbon, deodorization, ethanol precipitation, etc. within the range that does not affect the effect. May be used. Further, the extracted solution may be subjected to a treatment such as concentration to dryness, spray drying, freeze drying, etc., and used as a dried product.

上記のようにして得られたハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物は、幹細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進する作用、脱共役タンパク質１(ＵＣＰ１）の発現亢進作用、中性脂質蓄積抑制作用を有する。したがって、上記のハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物は、褐色脂肪細胞分化促進剤として使用できる。   The lotus germ extract and passion flower extract obtained as described above have an action of promoting the differentiation of stem cells into brown adipocytes, an action of enhancing the expression of uncoupling protein 1 (UCP1), and neutral lipid accumulation. Has an inhibitory effect. Therefore, the lotus germ extract and the passion flower extract can be used as a brown adipocyte differentiation promoter.

ハス胚芽の抽出物とパッションフラワーの抽出物を褐色脂肪細胞分化促進剤に配合する際の比率は特に限定されないが、好ましくは１：１０〜１０：１の範囲であり、より好ましくは１：５〜５：１の範囲であり、さらに好ましくは１：２〜２：１の範囲である。   The ratio of the lotus germ extract and the passion flower extract in the brown adipocyte differentiation promoter is not particularly limited, but is preferably in the range of 1:10 to 10: 1, more preferably 1: 5. It is the range of -5: 1, More preferably, it is the range of 1: 2-2: 1.

本発明の褐色脂肪細胞分化促進剤は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品などの組成物に配合することができる。   The brown adipocyte differentiation promoting agent of the present invention can be administered as it is, but it is a composition such as pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, and foods and drinks together with appropriate additives as long as the effects of the present invention are not impaired. Can be blended.

本発明の褐色脂肪細胞分化促進剤を医薬品として提供する場合は、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物に、医薬上許容され、かつ剤型に応じて適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。   When the brown adipocyte differentiation promoting agent of the present invention is provided as a pharmaceutical, a lotus germ extract and a passion flower extract are pharmaceutically acceptable and appropriately selected depending on the dosage form and a carrier for a formulation. , Excipients, diluents, binders, lubricants, coating agents, disintegrants or disintegrants, stabilizers, preservatives, preservatives, extenders, dispersants, wetting agents, buffers, solubilizers Or a solubilizing agent, isotonic agent, pH adjuster, propellant, coloring agent, sweetener, corrigent, fragrance, etc. are added as appropriate, and systemically or locally administered orally or parenterally by various known methods. What is necessary is just to prepare in the various formulation form which can do.

経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、又はデキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、又はヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。   Preparations for oral administration include, for example, excipients such as starch, glucose, sucrose, fructose, lactose, sorbitol, mannitol, crystalline cellulose, magnesium carbonate, magnesium oxide, calcium phosphate, or dextrin; carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, Disintegrants or disintegration aids such as starch or hydroxypropylcellulose; binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gum arabic, or gelatin; lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, or talc Coating agent such as hydroxypropylmethylcellulose, sucrose, polyethylene glycol, or titanium oxide; petrolatum, liquid paraffin, polyethylene Call, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or the like can be used base hard fat, but are not limited to.

非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。   For preparations for parenteral administration, solvents such as distilled water, physiological saline, ethanol, glycerin, propylene glycol, macrogol, alum water, vegetable oil; isotonic agents such as glucose, sodium chloride, D-mannitol; inorganic acids , PH adjusters such as organic acids, inorganic bases or organic bases can be used, but are not limited thereto.

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。なお、本発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含されるものとする。   The form of the pharmaceutical product of the present invention is not particularly limited. For example, tablets, sugar-coated tablets, capsules, troches, granules, powders, liquids, pills, emulsions, syrups, suspensions, elixirs Oral preparations such as pills, injections (for example, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), drops, suppositories, ointments, lotions, sprays, transdermal absorption agents And parenteral preparations such as transmucosal absorbents and patches. Moreover, you may make it the dry product re-dissolved when using. The pharmaceutical of the present invention includes drugs used for animals, that is, veterinary medicine.

上記製剤中の抽出物の含有量は特に限定されないが、製剤全重量に対して、固形分換算して、０．００１〜３０．０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜１０重量％である。０．００１重量％以下では効果が低く、また３０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくい。又、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。   The content of the extract in the preparation is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.001 to 30.0% by weight, more preferably 0.01 to 10% in terms of solid content with respect to the total weight of the preparation. % By weight. If it is 0.001% by weight or less, the effect is low, and even if it exceeds 30% by weight, the effect is hardly increased. In addition, the method for adding the active ingredient in the formulation may be added in advance or during the production, and may be appropriately selected in consideration of workability.

本発明の褐色脂肪細胞分化促進剤は、有効成分であるハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物が幹細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進する作用、脱共役タンパク質１(ＵＣＰ１）の発現亢進作用、中性脂質蓄積抑制作用をを有するので、肥満（例えば内臓脂肪蓄積、皮下脂肪蓄積）やメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）を改善及び予防するための、あるいは、肥満やメタボリックシンドロームに起因する疾患の治療及び／又は予防のための医薬として有効である。   The brown adipocyte differentiation-promoting agent of the present invention is an action in which the extract of lotus germ and passion flower, which are active ingredients, promotes differentiation from stem cells to brown adipocytes, and increases the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). Because of its action and neutral lipid accumulation inhibitory effect, it is intended to improve and prevent obesity (eg visceral fat accumulation, subcutaneous fat accumulation) and metabolic syndrome (visceral fat syndrome), or diseases caused by obesity and metabolic syndrome It is effective as a medicament for the treatment and / or prevention.

「肥満やメタボリックシンドロームに起因する疾患」としては、例えば、動脈硬化症、高脂血症（高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高LDLコレステロール血症、低HDLコレステロール血症等）、脂肪肝、高血圧症、糖尿病、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞等）、脳血管障害（脳梗塞、脳出血等）などが挙げられる。本発明の医薬品は上記疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。   Examples of “diseases caused by obesity and metabolic syndrome” include arteriosclerosis, hyperlipidemia (hypertriglyceridemia, hypercholesterolemia, hyper-LDL cholesterolemia, hypo-HDL cholesterolemia, etc.), fatty liver Hypertension, diabetes, ischemic heart disease (angina, myocardial infarction, etc.), cerebrovascular disorder (cerebral infarction, cerebral hemorrhage, etc.) and the like. The pharmaceutical agent of the present invention functions as a prophylactic agent that suppresses the onset of the above diseases and / or a therapeutic agent that improves the normal state.

本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の予防及び／又は治療用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的にまたは非経口的に投与することができる。   Since the active ingredient of the pharmaceutical of the present invention is derived from natural products, it is very safe and has no side effects. Therefore, when used as a pharmaceutical for the prevention and / or treatment of the aforementioned diseases, humans, mice, rats, rabbits, A wide range of doses can be administered orally or parenterally to mammals such as dogs and cats.

本発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度法などに応じて適宜決定することができる。例えば、成人に経口投与する場合には、一日の投与量は、ハス胚芽抽出物は１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇであり、パッションフラワー抽出物は１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜５００ｍｇである。   The dosage of the pharmaceutical agent of the present invention can be appropriately determined according to the type of disease, the age, sex, body weight, symptom severity method, etc. of the administration subject. For example, in the case of oral administration to adults, the daily dose is 1 to 1000 mg, preferably 5 to 200 mg for the lotus germ extract, and 1 to 1000 mg, preferably 5 to 500 mg for the passion flower extract. is there.

また、本発明の褐色脂肪細胞分化促進剤は、医薬品のみならず、痩身効果を得ることを目的とする医薬部外品や化粧品にも配合できる。医薬部外品や化粧品としては、皮膚外用組成物が好ましく、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油二層系、または水−油−粉末三層系等のいずれの剤型でもよい。皮膚外用組成物の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー等が挙げられるが、これらに限定はされない。   Moreover, the brown adipocyte differentiation promoter of the present invention can be blended not only in pharmaceuticals but also in quasi drugs and cosmetics intended to obtain a slimming effect. For quasi-drugs and cosmetics, a composition for external application to the skin is preferable, and an aqueous solution system, a solubilization system, an emulsification system, a powder system, a powder dispersion system, an oil liquid system, a gel system, an ointment system, an aerosol system, and a water-oil system. Any dosage form such as a layer system or a water-oil-powder three-layer system may be used. Examples of the composition for external use of skin include, for example, lotion, milky lotion, gel, cosmetic liquid, general cream, sunscreen cream, pack, mask, facial cleanser, cosmetic soap, foundation, funny, bath preparation, body lotion, body shampoo. However, it is not limited to these.

上記医薬部外品や化粧品は、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等のロウ類、炭化水素類（流動パラフィン、スフワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。   The above quasi-drugs and cosmetics are produced by selecting various ingredients, additives, bases and the like that are usually used in the composition for external use according to the type, blending them appropriately, and producing them according to methods known in the art. be able to. The form may be liquid, emulsion, cream, gel, paste, spray or the like. Examples of the ingredients include oils and fats (olive oil, coconut oil, evening primrose oil, jojoba oil, castor oil, hardened castor oil, etc.), waxes such as lanolin, beeswax, carnauba wax, and hydrocarbons (liquid paraffin, squalene, squalane). , Petrolatum, etc.), fatty acids (lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, etc.), higher alcohols (myristyl alcohol, cetanol, cetostearyl alcohol, stearyl alcohol, behenyl alcohol etc.), esters (myristic acid) Isopropyl, isopropyl palmitate, cetyl octanoate, glyceryl trioctanoate, octyldodecyl myristate, octyl stearate, stearyl stearate, etc., organic acids (citric acid, lactic acid, α-hydroxyacetic acid, pyrrolidone carbo Acid), saccharides (maltitol, sorbitol, xylobiose, N-acetyl-D-glucosamine, etc.), protein and protein hydrolysates, amino acids and salts thereof, vitamins, plant / animal extract components, various surface activity Agents, humectants, ultraviolet absorbers, antioxidants, stabilizers, preservatives, bactericides, fragrances and the like.

本発明の医薬部外品または化粧品におけるハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物の配合量は、幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象製品の一般的な使用量、製品の形態、効能・効果、及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。   The compounding amount of the lotus germ extract and the passion flower extract in the quasi-drug or cosmetic of the present invention may be any amount that can exert differentiation promoting action from stem cells to brown adipocytes. May be set as appropriate in consideration of the amount of product used, the form of the product, efficacy and effects, cost, and the like.

また、本発明の褐色脂肪細胞分化促進剤は、飲食品にも配合できる。本発明において、飲食品とは、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、または特定保健用食品を含む意味で用いられる。さらに、本発明の飲食品をヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、ペットフード、飼料を含む意味で用いることができる。   Moreover, the brown fat cell differentiation promoter of this invention can be mix | blended with food-drinks. In the present invention, the food / beverage product is used to mean including a health food, a functional food, a dietary supplement, or a food for specified health use. Furthermore, when using the food-drinks of this invention for mammals other than a human, it can be used by the meaning containing pet food and feed.

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。   The form of the food or drink may be any form suitable for edible use, for example, solid, liquid, granular, granular, powder, capsule, cream, or paste.

飲食品の種類としては、具体的には、食パン、菓子パン等のパン類；そば、うどん、パスタ、中華麺、即席麺等の麺類；キャンディー、チューインガム、チョコレート、ビスケット・クッキー等の焼き菓子、ゼリー等の菓子類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；しょうゆ、ソース、酢、みりん等の調味料；清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料などの飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）等が挙げられるが、これらに限定はされない。   Specific types of food and drink include breads such as bread and confectionery bread; noodles such as buckwheat, udon, pasta, Chinese noodles and instant noodles; baked confectionery such as candy, chewing gum, chocolate, biscuits and cookies, jelly Confectionery such as ice cream, ice sherbet, shaved ice; dairy products such as processed milk, fermented milk, yogurt, butter, cheese; fishery and livestock processed foods such as kamaboko, chikuwa, ham, sausage; margarine, mayonnaise , Shortening, whipped cream, dressing and other fats and oils processed foods; seasonings such as soy sauce, sauce, vinegar, mirin; soft drinks, carbonated drinks, beauty drinks, nutrition drinks, fruit drinks, milk drinks, etc. (these And the like, but are not limited thereto.

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、澱粉等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。   The food / beverage products of the present invention may be appropriately blended with additives usually used depending on the type. As the additive, any food hygiene-acceptable additive can be used. For example, sweeteners such as glucose, sucrose, fructose, isomerized liquid sugar, aspartame, stevia; citric acid, malic acid, Acidic agents such as tartaric acid; excipients such as dextrin and starch; binders, diluents, fragrances, colorants, buffers, thickeners, gelling agents, stabilizers, preservatives, emulsifiers, dispersants, suspensions Agents, preservatives and the like.

本発明の飲食品におけるハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物の配合量は、幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。   The blending amount of the lotus germ extract and the passion flower extract in the food and drink of the present invention may be any amount that can exert an action of promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes. What is necessary is just to set suitably in consideration of quantity, the form of food / beverage products, efficacy and an effect, taste property, palatability, cost, etc.

本発明によればまた、上記褐色脂肪細胞分化促進剤を用いて、哺乳動物の骨髄、血液、脂肪または皮膚組織をはじめとする生体組織における幹細胞、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を、培養レベルで褐色脂肪細胞へと分化促進する方法及び褐色脂肪細胞の製造方法を提供することができる。本発明の褐色脂肪細胞の製造方法は、幹細胞から褐色脂肪細胞を分化誘導・促進することにより褐色脂肪細胞を製造する方法であって、幹細胞を、上記褐色脂肪細胞分化促進剤の存在下で分化誘導する工程を含む。当該工程は、具体的には、分化誘導時に、上記褐色脂肪細胞分化促進剤の存在下で、幹細胞を培養する工程であることが好ましい。   According to the present invention, the above brown adipocyte differentiation promoting agent is also used to produce stem cells, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotency in biological tissues including mammalian bone marrow, blood, fat or skin tissues. A method for promoting differentiation of sex stem cells (iPS cells) into brown adipocytes at the culture level and a method for producing brown adipocytes can be provided. The method for producing brown adipocytes according to the present invention is a method for producing brown adipocytes by inducing and promoting differentiation of brown adipocytes from stem cells, wherein the stem cells are differentiated in the presence of the brown adipocyte differentiation promoter. Including the step of guiding. Specifically, the step is preferably a step of culturing stem cells in the presence of the brown adipocyte differentiation promoter during differentiation induction.

上記の方法に用いる幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。また、哺乳動物における、分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物から得られた当該細胞を用いることができる。   Stem cells used in the above method may be primary cultured cells, subcultured cells, or frozen cells. Moreover, if it has the same characteristic about the direction of differentiation, the process of differentiation, etc. in mammals, it can be applied to all mammals. For example, the cells obtained from mammals such as human, monkey, mouse, rat, guinea pig, rabbit, cat, dog, horse, cow, sheep, goat and pig can be used.

これら哺乳動物から得られた幹細胞を培養する場合、褐色脂肪細胞分化誘導培地に上記褐色脂肪細胞分化促進剤を添加する以外は、培養方法の条件及び操作は、当該技術分野で常套的な条件及び操作に従って行うことができる。褐色脂肪細胞分化誘導培地は、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Dulbecco's modified Eagle's medium（D-MEM)、Minimum Essential Medium (MEM)、RPMI1640、Basal Medium Eagle (BME)、Dulbecco's modified Eagle's medium:Nutrient Mixture F-12 (D-MEM/F-12)、Glasgow Minimum Essential Meidum (Glasgow MEM)）に、脂肪細胞分化誘導因子として、デキサメタゾン（DEX）、イソブチルメチルキサンチン（IBMX）、インドメタシン（IDMＭ）、インスリン（Ins）、ビオチンの１種以上を添加し、さらに、上記褐色脂肪細胞分化促進剤を添加する。また、必要に応じて、抗生物質を添加してもよい。   When culturing stem cells obtained from these mammals, the conditions and operation of the culture method are the same as those conventionally used in the art, except that the brown adipocyte differentiation-inducing medium is added to the brown adipocyte differentiation-inducing medium. Can be done according to the operation. Brown adipocyte differentiation-inducing medium is a basic medium (for example, Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM), which contains components (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins) necessary for viable cell growth. Minimum Essential Medium (MEM), RPMI1640, Basal Medium Eagle (BME), Dulbecco's modified Eagle's medium: Nutrient Mixture F-12 (D-MEM / F-12), Glasgow Minimum Essential Meidum (Glasgow MEM)) As an inducing factor, one or more of dexamethasone (DEX), isobutylmethylxanthine (IBMX), indomethacin (IDMM), insulin (Ins), and biotin are added, and the brown adipocyte differentiation promoter is added. Moreover, you may add antibiotics as needed.

また、上記培養液には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。   Moreover, it is preferable that serum is contained in the culture solution at a content of 1 to 20%. However, since serum has different components depending on the lot and there are variations in the effects, it is preferable to use the serum after a lot check.

培養は、上記培地にて３７℃、５％炭酸ガスの環境下で行い、１〜３日毎の培地交換を行うことが好ましい。この方法により、効率よく幹細胞から褐色脂肪細胞への分化を促進させることができる。   The culture is preferably performed in the above medium in an environment of 37 ° C. and 5% carbon dioxide, and the medium is changed every 1 to 3 days. By this method, differentiation from stem cells to brown adipocytes can be efficiently promoted.

また、本発明の製造方法によって得られた褐色脂肪細胞を細胞治療に用いる場合には、レシピエントと同種の動物由来の幹細胞を用いることが好ましい。本発明の製造方法によって得られた褐色脂肪細胞の成体への移植方法は、例えば、生理食塩水や培養液に褐色脂肪細胞を１×１０^３〜１×１０^７個／ｍＬとなるように調整し、腹腔内や皮下などへ注射やカテーテルなどにより局所注入することにより行うことできる。 When brown adipocytes obtained by the production method of the present invention are used for cell therapy, it is preferable to use stem cells derived from the same animal species as the recipient. The method of transplanting brown adipocytes obtained by the production method of the present invention into adults is adjusted, for example, to 1 × 10 ³ to 1 × 10 ⁷ cells / mL of brown adipocytes in physiological saline or culture solution. In addition, it can be performed by local injection into the abdominal cavity or subcutaneous region by injection or catheter.

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、処方例、及び試験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。   Next, in order to describe the present invention in detail, examples of production of the extract used in the present invention, formulation examples, and test examples will be given as examples, but the present invention is not limited thereto. The compounding amount shown in the examples indicates% by weight.

［実施例１］
ハス胚芽抽出物及びパッションフラワー抽出物を以下のとおり製造した。
（製造例１）ハス胚芽の熱水抽出物
ハス胚芽の乾燥物（蓮芯）１０ｇに精製水１００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して熱水抽出物を２．６ｇ得た。 [Example 1]
A lotus germ extract and a passion flower extract were produced as follows.
(Production Example 1) Hot water extract of lotus germ 100 g of purified water was added to 10 g of dried lotus germ (lotus wick), extracted at 95-100 ° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated and frozen. It dried and 2.6g of hot water extracts were obtained.

（製造例２）ハス胚芽の５０％エタノール抽出物
ハス胚芽の乾燥物（蓮芯）１０ｇに精製水５０ｍＬおよびエタノール５０ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して５０％エタノール抽出物を２．１ｇ得た。 (Production Example 2) 50% ethanol extract of lotus embryos 50 g of purified water and 50 mL of ethanol were added to 10 g of dried lotus germ (lotus wick), extracted at room temperature for 3 days, filtered, and the filtrate was concentrated. Lyophilization gave 2.1 g of 50% ethanol extract.

（製造例３）ハス胚芽のエタノール抽出物
ハス胚芽の乾燥物（蓮芯）１０ｇにエタノール１００ｍＬを加え、常温で３日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してエタノール抽出物を０．４ｇ得た。 (Production Example 3) Ethanol extract of lotus germ 100 g of ethanol was added to 10 g of dried lotus germ (lotus wick), extracted at room temperature for 3 days, filtered, the filtrate was concentrated, freeze-dried and extracted with ethanol. 0.4 g of product was obtained.

（製造例４）ハス胚芽の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
ハス胚芽の乾燥物（蓮芯）１０ｇに精製水５０ｇおよび１，３−ブチレングリコール（１，３−ＢＧ）５０ｇを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、５０％１，３−ＢＧ抽出物を９０ｇ得た。 (Production Example 4) 50% 1,3-butylene glycol extract of lotus germ 50 g of purified water and 50 g of 1,3-butylene glycol (1,3-BG) are added to 10 g of dried lotus germ (lotus wick), After extraction at room temperature for 7 days, filtration was performed to obtain 90 g of 50% 1,3-BG extract.

（製造例５）パッションフラワーの熱水抽出物
乾燥したパッションフラワーの茎と葉の混合物（フランス産）４０ｇに、精製水８００ｇを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濃縮乾燥してパッションフラワーの熱水抽出物を１１．４ｇ得た。 (Production Example 5) Passion flower hot water extract To 40 g of a mixture of dried passion flower stems and leaves (from France), 800 g of purified water was added and extracted at 95 to 100 ° C for 2 hours. The obtained extract was concentrated and dried to obtain 11.4 g of passion flower hot water extract.

（製造例６）パッションフラワーの１，３−ブチレングリコール抽出物
乾燥したパッションフラワーの茎と葉の乾燥物（フランス産）１００ｇに、精製水５００ｇと１，３−ブチレングリコール５００ｇを加え、室温で２週間抽出した。抽出後、ろ過し、パッションフラワーの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を９５０ｇ得た。 (Production Example 6) 1,3-butylene glycol extract of passion flower To 100 g of dried passion flower stem and leaf (from France), 500 g of purified water and 500 g of 1,3-butylene glycol are added, and at room temperature. Extracted for 2 weeks. After extraction, it was filtered to obtain 950 g of 50% 1,3-butylene glycol extract of passion flour.

（製造例７）パッションフラワーのプロピレングリコール抽出物
パッションフラワーの全草の乾燥物（フランス産）３０ｇに、精製水５００ｇとプロピレングリコール５００ｇを加え、室温で２週間抽出した。抽出後、ろ過し、パッションフラワーのプロピレングリコール抽出物を９５０ｇ得た。 (Production Example 7) Passion Flour Propylene Glycol Extract To 30 g of dried passion flower whole plant (France), 500 g of purified water and 500 g of propylene glycol were added and extracted at room temperature for 2 weeks. After extraction, it was filtered to obtain 950 g of a propion glycol extract of passion flour.

（製造例８）パッションフラワーの５０％エタノール抽出物
パッションフラワーの全草の乾燥物（フランス産）２０ｇに、精製水４００ｇとエタノール４００ｇを加え、室温で１週間抽出した後、ろ過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してパッションフラワーのエタノール抽出物を１０．６ｇ得た。 (Production Example 8) Passion Flower 50% Ethanol Extraction Passion flower whole plant dry product (French) 20g, purified water 400g and ethanol 400g were added, extracted at room temperature for 1 week, filtered, filtered The liquid was concentrated and lyophilized to obtain 10.6 g of passionflower ethanol extract.

（製造例９）パッションフラワーのエタノール抽出物
パッションフラワーの全草の乾燥物（フランス産）２０ｇに、エタノール８００ｇを加え、室温で１週間抽出した後、ろ過し、そのろ液を濃縮し、凍結乾燥してパッションフラワーのエタノール抽出物を２．４ｇ得た。 (Production Example 9) Passion flower ethanol extract Passion flower whole plant dried product (French) 20 g, ethanol 800 g was added, extracted for 1 week at room temperature, filtered, the filtrate was concentrated and frozen It dried and 2.4g of the ethanol extract of passion flower was obtained.

［実施例２］
実施例１で製造したハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を用い、以下の処方と方法により各製品を調製した。 [Example 2]
Using the lotus germ extract and passion flower extract produced in Example 1, each product was prepared by the following formulation and method.

（処方例１）ローション
処方 配合量(重量％）
１．ハス胚芽の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例４） ０．０５
２．パッションフラワーの１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例６） ０．０５
３．１，３−ブチレングリコール ８．０
４．グリセリン ２．０
５．キサンタンガム ０．０２
６．クエン酸 ０．０１
７．クエン酸ナトリウム ０．１
８．エタノール ５．０
９．パントテン酸エチルアルコール ０．１
１０．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１１．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１２．香料 ０．１
１３．精製水 ８４．３７ (Formulation Example 1) Lotion Formulation Amount (wt%)
1. 50% 1,3-butylene glycol extract of lotus germ (Production Example 4) 0.05
2. Passion flower 1,3-butylene glycol extract (Production Example 6) 0.05
3. 1,3-butylene glycol 8.0
4). Glycerin 2.0
5. Xanthan gum 0.02
6). Citric acid 0.01
7). Sodium citrate 0.1
8). Ethanol 5.0
9. Pantothenic acid ethyl alcohol 0.1
10. Methyl paraoxybenzoate 0.1
11. Polyoxyethylene hydrogenated castor oil (40E.O.) 0.1
12 Fragrance 0.1
13. Purified water 84.37

上記成分１〜７および１３と、成分８〜１２をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過してローションを調製した。   The above components 1 to 7 and 13 and components 8 to 12 were uniformly dissolved, and both were mixed and filtered to prepare a lotion.

（比較処方例１）従来のローション
処方例１において、ハス胚芽の５０％１，３−ブチレングリコール抽出物およびパッションフラワーの１，３−ブチレングリコール抽出物を精製水に置き換える以外は処方例１と同じ手順にて従来のローションを調製した。 (Comparative Formulation Example 1) Conventional Lotion Formulation Example 1 is the same as Formulation Example 1 except that 50% 1,3-butylene glycol extract of lotus germ and 1,3-butylene glycol extract of passion flower are replaced with purified water. A conventional lotion was prepared using the same procedure.

（処方例２）クリーム
処方 配合量(重量％）
１．ハス胚芽の５０％エタノール抽出物（製造例２） ０．０３
２．パッションフラワーのプロピレングリコール抽出物（製造例７） ０．０７
３．スクワラン ５．５
４．オリーブ油 ３．０
５．ステアリン酸 ２．０
６．ミツロウ ２．０
７．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ベヘニルアルコール １．５
１０．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１１．香料 ０．１
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１４．１，３−ブチレングリコール ８．５
１５．精製水 ６８．０５ (Formulation example 2) Cream formulation Formulation amount (% by weight)
1. 50% ethanol extract of lotus germ (Production Example 2) 0.03
2. Passion flower propylene glycol extract (Production Example 7) 0.07
3. Squalane 5.5
4). Olive oil 3.0
5. Stearic acid 2.0
6). Beeswax 2.0
7). Octyldodecyl myristate 3.5
8). Polyoxyethylene cetyl ether (20E.O.) 3.0
9. Behenyl alcohol 1.5
10. Glycerol monostearate2.5
11. Fragrance 0.1
12 Methyl paraoxybenzoate 0.2
13. Ethyl paraoxybenzoate 0.05
14.1,3-Butylene glycol 8.5
15. Purified water 68.05

上記成分３〜１０を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２および成分１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、さらに３０℃まで冷却してクリームを調製した。   The above components 3 to 10 are dissolved by heating and mixed, and kept at 70 ° C. to obtain an oil phase. Components 1 and 2 and components 12 to 15 are heated and dissolved and mixed, and the mixture is kept at 75 ° C. to obtain an aqueous phase. A water phase was added to the oil phase to emulsify, and the mixture was cooled while stirring. Component 11 was added at 45 ° C., and the mixture was further cooled to 30 ° C. to prepare a cream.

（比較処方例２）従来のクリーム
処方例２において、ハス胚芽の５０％エタノール抽出物およびパッションフラワーのプロピレングリコール抽出物を精製水に置き換える以外は処方例２と同じ手順にて従来のクリームを調製した。 (Comparative Formulation Example 2) Conventional Cream In Formulation Example 2, a conventional cream was prepared in the same procedure as Formulation Example 2, except that the lotus germ 50% ethanol extract and passion flower propylene glycol extract were replaced with purified water. did.

（処方例３）錠剤
処方 配合量(重量％）
１．ハス胚芽の熱水抽出物（製造例１） ３
２．パッションフラワーの熱水抽出物（製造例５） ２
３．乾燥コーンスターチ ２５
４．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０
５．微結晶セルロース ４０
６．ポリビニルピロリドン ７
７．タルク ３ (Formulation example 3) Tablet formulation Formulation amount (wt%)
1. Hot water extract of lotus germ (Production Example 1) 3
2. Passion flower hot water extract (Production Example 5) 2
3. Dried corn starch 25
4). Carboxymethylcellulose calcium 20
5. Microcrystalline cellulose 40
6). Polyvinylpyrrolidone 7
7). Talc 3

成分１〜６を混合し、次いで１０％の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分７を加えて混合し打錠し、錠剤（１錠０．５２ｇ）を調製した。   Ingredients 1-6 are mixed, then 10% water is added as a binder and dried after extrusion granulation. Ingredient 7 was added to the molded granules, mixed and tableted to prepare tablets (1 tablet 0.52 g).

（比較処方例３）従来の錠剤
処方例３において、ハス胚芽の熱水抽出物及びパッションフラワーの熱水抽出物を精製水に置き換える以外は処方例３と同じ手順にて従来の錠剤を調製した。 (Comparative Formulation Example 3) Conventional Tablet In Formulation Example 3, a conventional tablet was prepared in the same procedure as Formulation Example 3 except that the hot water extract of lotus germ and the hot water extract of passion flower were replaced with purified water. .

（処方例４）飲料
処方 配合量(重量％）
１．ハス胚芽のエタノール抽出物（製造例３） ２．５
２．パッションフラワーのプロピレングリコール抽出物（製造例７） １．５
３．ステビア ０．０５
４．リンゴ酸 ５．０
５．香料 ０．１
６．水 ９０．８５ (Prescription Example 4) Beverage Formulation Amount (% by weight)
1. Lotus extract ethanol extract (Production Example 3) 2.5
2. Passion flower propylene glycol extract (Production Example 7) 1.5
3. Stevia 0.05
4). Malic acid 5.0
5. Fragrance 0.1
6). Water 90.85

成分１〜５を成分６の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分６の残りの水を加えて混合し、飲料を調製した。   Components 1 to 5 are stirred and dissolved in a part of the component 6 water. Next, the remaining water of component 6 was added and mixed to prepare a beverage.

（比較処方例４）従来の飲料
処方例４において、ハス胚芽のエタノール抽出物およびパッションフラワーのプロピレングリコール抽出物を水に置き換える以外は処方例４と同じ手順にて従来の飲料を調製した。 (Comparative Formulation Example 4) Conventional Beverage In Formulation Example 4, a conventional beverage was prepared in the same procedure as Formulation Example 4 except that the lotus germ ethanol extract and passion flower propylene glycol extract were replaced with water.

［実施例３］
（試験例１）マウス脂肪組織由来幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導効率の評価
実施例１で製造したハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を試料として用い、それらの脂肪組織由来幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導効率を、褐色脂肪細胞特異的マーカーである脱共役タンパク質１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１：ＵＣＰ１）の発現を指標として評価した。 [Example 3]
(Test Example 1) Evaluation of differentiation induction efficiency from mouse adipose tissue-derived stem cells to brown adipocytes Using the lotus germ extract and passion flower extract produced in Example 1 as samples, from those adipose tissue-derived stem cells The differentiation induction efficiency into brown adipocytes was evaluated using the expression of uncoupling protein-1 (UCP1), which is a brown adipocyte-specific marker, as an index.

(1) 培養液１（細胞増殖用培地）の調製
細胞増殖用培養液として、Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、１０３ＵのＥＳＧＲＯ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン（シグマ）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ベーリンガー）を添加した培養液（以降、培養液１と記す）を調製した。 (1) Preparation of culture medium 1 (cell growth medium) D-MEM (Gibco), fetal bovine serum (FBS, 10%), 103 U ESGRO (CHEMICON), 100 unit / mL A culture solution (hereinafter referred to as culture solution 1) supplemented with penicillin (Sigma) and 100 μg / mL streptomycin (Boehringer) was prepared.

(2) 培養液２（褐色脂肪細胞分化誘導培地１）の調製
褐色脂肪細胞分化誘導培地として、Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン（シグマ）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ベーリンガー）、１μＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ、Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍＭのインドメタシン（ＩＤＭ、Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬのインスリン（Ｉｎｓ、Ｓｉｇｍａ）、３３μＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養液（以降、培養液２と記す）を調製した。 (2) Preparation of culture medium 2 (brown adipocyte differentiation induction medium 1) As a brown adipocyte differentiation induction medium, D-MEM (Gibco), fetal bovine serum (FBS, 10%), 100 unit / mL penicillin (Sigma) ) And 100 μg / mL streptomycin (Boehringer), 1 μM dexamethasone (DEX, Sigma), 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX, Sigma), 0.2 mM indomethacin (IDM, Sigma), 10 μg / mL insulin ( Ins, Sigma) and a culture solution (hereinafter referred to as culture solution 2) supplemented with 33 μM biotin (Sigma) were prepared.

(3) 培養液３（褐色脂肪細胞分化誘導培地２）の調製
褐色脂肪細胞分化促進培地として、Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン（シグマ）と１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ベーリンガー）、１０μｇ／ｍＬのインスリン（Ｉｎｓ、Ｓｉｇｍａ）、３３μＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ）を添加した培養液（以降、培養液３と記す）を調製した。 (3) Preparation of culture medium 3 (brown adipocyte differentiation induction medium 2) As a brown adipocyte differentiation promoting medium, D-MEM (Gibco), fetal bovine serum (FBS, 10%), 100 unit / mL penicillin (Sigma) ) And 100 μg / mL streptomycin (Boehringer), 10 μg / mL insulin (Ins, Sigma), and 33 μM biotin (Sigma) were prepared (hereinafter referred to as culture medium 3).

(4) 脂肪組織由来幹細胞の準備
ＩＣＲマウス（雄性、４週齢）を刈毛処理した後、腹部皮下脂肪組織をそれぞれ別々に無菌的に摘出し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、直径６ｃｍの組織培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ製）に移した。それぞれの組織を、尖刃刀により約２ｍｍ角に細切し、０．２％コラゲナーゼ溶液（新田ゼラチン製）を加え、プラスチックディッシュを上下左右に揺らして溶液中に拡散させた。これらを、３７℃で３０分間インキュベートすることで細胞外マトリックスを消化した後、穏やかにピペッティングし細胞を分散させた。この細胞分散液を５０ｍＬ容の遠沈管（Ｆａｌｃｏｎ製）にセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ製）を通しながら移した。さらに、培養液１を適量添加し、よくピペッティングした後、５分間遠心分離した。遠心後、上清画分を除去し、新たに培養液１を加えて細胞を分散させ洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した。洗浄後、遠心分離法により幹細胞を分離し、褐色脂肪細胞への分化誘導に用いた。 (4) Preparation of adipose tissue-derived stem cells After ICR mice (male, 4 weeks old) were shaved, abdominal subcutaneous adipose tissues were separately aseptically removed and washed three times with PBS (−). It transferred to the tissue culture dish (product made from Falcon) of diameter 6cm. Each tissue was chopped into approximately 2 mm squares with a pointed blade, 0.2% collagenase solution (manufactured by Nitta Gelatin) was added, and the plastic dish was shaken up and down and left and right to diffuse into the solution. These were incubated at 37 ° C. for 30 minutes to digest the extracellular matrix and then gently pipet to disperse the cells. This cell dispersion was transferred to a 50 mL centrifuge tube (Falcon) while passing through a cell strainer (Falcon). Further, an appropriate amount of the culture solution 1 was added, pipetted well, and then centrifuged for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant fraction was removed, and the culture medium 1 was newly added to disperse and wash the cells. This washing operation was repeated twice. After washing, stem cells were separated by centrifugation and used to induce differentiation into brown adipocytes.

(5)褐色脂肪細胞への分化誘導方法
上記の方法にて脂肪組織から得られた幹細胞を、培養液１を用いて培養した。具体的には、まず、培養液１に各細胞を懸濁し、組織培養用２４穴プレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーター内でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントな状態を確認後、次に、培養液１を培養液２に交換し、３日間培養後、さらに新しい培養液２に交換して３日間培養した。次に、培養液２を培養液３に交換し、２日間培養後、さらに新しい培養液３に交換して２日間培養した。この時、試料として、培養液３に実施例１で製造したハス胚芽の抽出物（製造例１〜３）を３１３μｇ／ｍＬ、パッションフラワーの抽出物（製造例５〜７）を１２５０μｇ／ｍＬになるように添加した。また、陰性対照には、何も添加せず、比較対照には、カフェインを１００μｇ／ｍＬ添加した。同時に２種類の試料を添加する場合は半分の濃度、すなわち、ハス胚芽の抽出物は１５６μｇ／ｍＬ、パッションフラワーの抽出物は６２５μｇ／ｍＬ、カフェインは５０μｇ／ｍＬとなるように添加した。 (5) Method for Inducing Differentiation into Brown Adipocytes Stem cells obtained from adipose tissue by the above method were cultured using the culture solution 1. Specifically, first, each cell was suspended in the culture solution 1, seeded in a 24-well plate for tissue culture, and cultured in a 5% CO ₂ , 37 ° C. incubator until it became confluent. After confirming the confluent state, the culture medium 1 was then replaced with the culture medium 2, and after culturing for 3 days, the culture medium was further replaced with a new culture medium 2 and cultured for 3 days. Next, the culture medium 2 was replaced with the culture medium 3, and after culturing for 2 days, the culture medium 2 was further replaced with a new culture medium 3 and cultured for 2 days. At this time, the lotus germ extract (Production Examples 1 to 3) produced in Example 1 in the culture solution 3 was 313 μg / mL, and the passion flower extract (Production Examples 5 to 7) was 1250 μg / mL. It added so that it might become. In addition, nothing was added to the negative control, and 100 μg / mL of caffeine was added to the comparative control. When two types of samples were added at the same time, they were added at half the concentration, ie, 156 μg / mL for lotus germ extract, 625 μg / mL for passion flower extract, and 50 μg / mL for caffeine.

(6) ＵＣＰ１遺伝子発現を指標とした幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導効率の評価方法
各試料による脂肪組織由来幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導効率を、褐色脂肪細胞の特異的マーカーである脱共役タンパク質１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＵＣＰ１）の発現を指標に評価した。具体的には、前記(5)の方法にて幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導を完了した細胞を、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞からＲＮＡを抽出した。２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後、下記のプライマーセットを用いてＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、リアルタイムＰＣＲ（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を実施した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。 (6) Method for evaluating differentiation induction efficiency from stem cells to brown adipocytes using UCP1 gene expression as an index The differentiation induction efficiency from adipose tissue-derived stem cells to brown adipocytes by each sample is a specific marker for brown adipocytes The expression of uncoupling protein-1 (UCP1) was evaluated as an index. Specifically, the cells that have been induced to differentiate from stem cells to brown adipocytes by the method of (5) above are washed twice with PBS (−), and RNA is extracted from the cells by Trizol Reagent (Invitrogen). did. 2-STEP real-time PCR kit (Applied Biosystems) was used to reverse-transcribe RNA into cDNA, then ABI7300 (Applied Biosystems) using real-time PCR (95 ° C: 15 seconds, 60 ° C: 30 seconds) using the following primer set: , 40 cycles). Other operations were carried out in accordance with established methods.

ＵＣＰ１用のプライマーセット
５’ＧＣＡＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡ３’（配列番号１）
５’ＧＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴ３’（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
５’ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’（配列番号３）
５’ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ３’（配列番号４） Primer set 5'GCAGCCTACAGAGGTCGGTGAA3 'for UCP1 (SEQ ID NO: 1)
5′GGGTTTGATCCCCATGCAGAT3 ′ (SEQ ID NO: 2)
Primer set 5'TGGCACCACCAACTGCTTTAGC3 'for GAPDH (SEQ ID NO: 3)
5′TCTCTCGGGGTGGCAGTGATG3 ′ (SEQ ID NO: 4)

分化誘導効率は、試料を添加せずに分化誘導した細胞におけるＵＣＰ１ ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出したＵＣＰ１遺伝子相対発現量（ＵＣＰ１遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ発現量）の値を１．０とし、これに対し、試料を添加して分化誘導した細胞におけるＵＣＰ１遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。その結果を表１に示す。   The differentiation induction efficiency was determined by calculating the relative expression level of UCP1 gene (UCP1 gene expression level / GAPDH expression) as the ratio of the expression level of UCP1 mRNA in cells induced to differentiation without adding a sample to the expression level of GAPDH mRNA as an internal standard. The value of the relative expression level of UCP1 gene in cells induced to differentiate by adding a sample was calculated and evaluated. The results are shown in Table 1.

表１の結果に示されるように、ハス胚芽の抽出物又はパッションフラワーの抽出物を添加することによって、ＵＣＰ１遺伝子相対発現量を亢進し、褐色脂肪細胞への分化が促進されることが確認できた。また、単独で添加した場合と比較して、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を同時に添加することにより、ＵＣＰ１遺伝子相対発現量の亢進に相乗作用が認められ、褐色脂肪細胞への分化を相乗的に促進することが確認できた。一方、カフェインを添加した場合、ＵＣＰ１遺伝子相対発現量はわずかに増加するのみであった。また、ハス胚芽の抽出物又はパッションフラワーの抽出物との相乗作用も認められなかった。   As shown in the results of Table 1, it can be confirmed that the addition of a lotus germ extract or passion flower extract increases the relative expression level of the UCP1 gene and promotes differentiation into brown adipocytes. It was. Moreover, compared with the case where it is added alone, a lotus germ extract and passion flower extract are added at the same time, so that a synergistic effect is observed in the increased relative expression level of the UCP1 gene, and differentiation into brown adipocytes is achieved. It was confirmed that this was promoted synergistically. On the other hand, when caffeine was added, the relative expression level of the UCP1 gene increased only slightly. In addition, no synergistic action with the lotus germ extract or the passion flower extract was observed.

（試験例２）中性脂質蓄積量の評価
試験例１と同様の方法にて分化誘導した褐色脂肪細胞について、中性脂質の蓄積量を評価した。具体的には、各試料により脂肪組織由来幹細胞から褐色脂肪細胞への分化誘導を完了した細胞を、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００溶液に溶解した。細胞溶解溶液について、トリグリセライド Ｅ−テストワコー（和光純薬工業製）を用いて中性脂質量を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてタンパク質量を測定し、タンパク質当たりの細胞内中性脂質蓄積量（ｍｇ／ｍｇタンパク質）を算出した。さらに、試料を添加せずに分化誘導した細胞における細胞内中性脂質蓄積量を１００とし、これに対し、試料を添加して分化誘導した細胞における細胞内中性脂質蓄積量の値を算出し、評価した。その結果を表２に示した。 Test Example 2 Evaluation of Neutral Lipid Accumulation Amount of neutral lipid was evaluated for brown adipocytes induced to differentiate by the same method as in Test Example 1. Specifically, cells in which differentiation induction from adipose tissue-derived stem cells to brown adipocytes by each sample was completed were washed twice with PBS (−) and dissolved in 0.2% Triton-X 100 solution. For the cell lysis solution, the amount of neutral lipid was measured using triglyceride E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), the amount of protein was measured using BCA Protein Assay Reagent kit (manufactured by Thermo Scientific), and cells per protein were measured. The internal neutral lipid accumulation amount (mg / mg protein) was calculated. Furthermore, the amount of intracellular neutral lipid accumulation in cells induced to differentiate without adding a sample is defined as 100, while the value of intracellular neutral lipid accumulation in cells induced to differentiate by adding a sample is calculated. ,evaluated. The results are shown in Table 2.

表２の結果に示されるように、ハス胚芽の抽出物又はパッションフラワーの抽出物を添加することによって、細胞内中性脂質蓄積量が抑制されることが確認できた。また、単独で添加した場合と比較して、ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を同時に添加することにより、細胞内中性脂質蓄積量は相乗的に抑制されることが確認できた。また、カフェインを添加した場合、細胞内中性脂質蓄積量の抑制作用は確認できたものの、ハス胚芽の抽出物又はパッションフラワーの抽出物との相乗作用は認められなかった。   As shown in the results of Table 2, it was confirmed that the amount of intracellular neutral lipid accumulation was suppressed by adding a lotus germ extract or a passion flower extract. In addition, it was confirmed that the amount of intracellular neutral lipid accumulation was synergistically suppressed by simultaneously adding the lotus germ extract and the passion flower extract as compared with the case where it was added alone. In addition, when caffeine was added, an inhibitory effect on the amount of intracellular neutral lipid accumulation was confirmed, but a synergistic effect with the lotus germ extract or the passion flower extract was not observed.

（試験例３）製品の使用試験１
処方例１のローション、処方例２のクリーム、比較処方例１の従来のローションおよび比較処方例２の従来のクリームを用いて、女性３０人（２１〜４６才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、肌の引き締め感、肌の張り、肌の弾力感に関する痩身効果をアンケートにより判定した。これらの試験結果を表３に示した。 (Test Example 3) Product use test 1
One month use for 30 women (21 to 46 years old) using the lotion of Formulation Example 1, the cream of Formulation Example 2, the conventional lotion of Comparative Formulation Example 1 and the conventional cream of Comparative Formulation Example 2. A test was conducted. After use, the slimming effect on the feeling of skin tightening, skin tension and skin elasticity was determined by questionnaire. These test results are shown in Table 3.

表３の結果に示されるように、ハス胚芽の抽出物およびパッションフラワーの抽出物を含む処方例１のローションおよび処方例２のクリームは、従来のローションおよび従来のクリームに比べて優れた痩身作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。   As shown in the results of Table 3, the lotion of Formulation Example 1 and the cream of Formulation Example 2 containing a lotus germ extract and a passion flower extract have superior slimming effects as compared to the conventional lotion and the conventional cream. showed that. During the test period, there was no skin problem and there was no problem with safety. There was also no problem with the deterioration of the prescription ingredients.

（試験例４）製品の使用試験２
処方例３の錠剤、処方例４の飲料、比較処方例３の従来の錠剤および比較処方例４の従来の飲料を用いて、軽度肥満の男性２０人（３５〜５５才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用前後に、体重、皮下脂肪厚および胴囲を測定し、痩身効果を判定した。これらの試験結果を表４に示した。 (Test Example 4) Product usage test 2
One month for 20 mildly obese men (35 to 55 years old) using the tablets of Formulation Example 3, the beverage of Formulation Example 4, the conventional tablet of Comparative Formulation Example 3, and the conventional beverage of Comparative Formulation Example 4. A usage test was conducted. Before and after use, body weight, subcutaneous fat thickness and waist circumference were measured to determine the slimming effect. The test results are shown in Table 4.

表４の結果に示されるように、ハス胚芽の抽出物およびパッションフラワーの抽出物を含む処方例３の錠剤および処方例４の飲料は、従来の錠剤および従来の飲料に比べて優れた痩身効果を示した。なお、試験期間中、体調を崩した被験者は一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。   As shown in the results of Table 4, the tablets of Formulation Example 3 and the beverage of Formulation Example 4 containing the lotus germ extract and the passion flower extract were superior to the conventional tablets and conventional beverages in terms of slimming effect. showed that. During the test period, there was no subject who was unwell, and there was no problem with safety. There was also no problem with the deterioration of the prescription ingredients.

本発明は、肥満やメタボリックシンドロームの改善及び予防を目的とした医薬品、医薬部外品や化粧品、機能性食品やサプリメントなどの飲食品の製造分野において利用できる。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used in the field of manufacturing foods and drinks such as pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, functional foods and supplements for the purpose of improving and preventing obesity and metabolic syndrome.

Claims (8)

ハス胚芽の抽出物及びパッションフラワーの抽出物を有効成分として含有する幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進剤。   An agent for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes, which contains a lotus germ extract and a passion flower extract as active ingredients. 脱共役タンパク質１(ＵＣＰ１）の発現を亢進する、請求項１に記載の分化促進剤。   The differentiation promoting agent according to claim 1, which enhances the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). 請求項１または２に記載の分化促進剤を含む医薬品または医薬部外品。   A pharmaceutical or quasi-drug containing the differentiation promoting agent according to claim 1 or 2. 請求項１または２に記載の分化促進剤を含む化粧品。   A cosmetic comprising the differentiation promoting agent according to claim 1 or 2. 請求項１または２に記載の分化促進剤を含む飲食品。   Food-drinks containing the differentiation promoter of Claim 1 or 2. 飲食品が、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、または栄養補助食品である、請求項５に記載の飲食品。   The food or drink according to claim 5, wherein the food or drink is a health food, a functional food, a food for specified health use, or a dietary supplement. 請求項１または２に記載の分化促進剤の存在下で幹細胞を培養して褐色脂肪細胞への分化誘導を促進することを特徴とする、幹細胞から褐色脂肪細胞への分化促進方法。   A method for promoting differentiation from stem cells to brown adipocytes, comprising culturing stem cells in the presence of the differentiation promoting agent according to claim 1 or 2 to promote differentiation induction into brown adipocytes. 請求項１または２に記載の分化促進剤の存在下で幹細胞を培養して褐色脂肪細胞へ分化誘導する工程を含む、褐色脂肪細胞の製造方法。   A method for producing brown adipocytes, comprising a step of culturing stem cells in the presence of the differentiation promoting agent according to claim 1 or 2 to induce differentiation into brown adipocytes.