KR101926117B1 - 안드로겐 수용체의 변이체 기반 전립선암환자 스크리닝 방법 - Google Patents

안드로겐 수용체의 변이체 기반 전립선암환자 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중 순환 암세포 및 AR변이체의 광학 이미지 분석을 통해서 전립선암환자에 AR 표적 치료가 적용되는지 여부를 분석할 수 있는 전립선암환자 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

안드로겐 수용체의 변이체 기반 전립선암환자 스크리닝 방법{A METHOD FOR SCREENING PROSTATE CANCER SUBJECTS BASED ON ANDROGEN RECEPTOR VARIANT}
본 발명은 전립선암환자 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈중 순환 암세포를 이용하여 AR변이체 및 혈중 순환 암세포의 광학 이미지 분석을 통한 전립선암 환자 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전립선암은 남성에게서 발생하는 흔한 암중에 하나로 서양에서는 두 번째로, 동양에서는 다섯 번째로 흔한 암이다. 전립선암 사망의 대부분은 기존의 안드로겐 차단 요법에 무반응인 전이성 질병의 발병에서 기인한다. 안드로겐 차단 요법은 1940년대부터 전립선암 환자들에 대한 표준 치료로 사용되어 왔다. 안드로겐 차단에도 불구하고, 결국 대부분의 환자들에서 질병이 진행된다. 구체적으로 살펴보면, 정상적인 전립선에서 androgen receptor는 정상 전립선 기능을 위한 단백질 전사를 인코딩하는 유전자의 조절과 전립선의 발달에 주요한 역할을 한다. 대부분의 전립선암은 안드로겐 의존형 암종이다. 전립선암의 종양 세포에서 안드로겐의 수준이 증가하면 androgen receptor(AR) signaling을 촉진한다. 이것은 결과적으로 종양세포의 세포 주기 조절, 생존, 성장, 종양 형성과 관련된 유전자 발현을 조절한다. 전통적으로, 이러한 전립선 암의 치료는 안드로겐의 양과 AR signaling을 감소시키는 외과적 거세나 화학적 거세를 통해 이루어져왔다. 하지만 환자의 90% 정도는 이러한 치료에도 불구하고 이후에 암이 재발하여 거세 저항성 전립선암(Castration-Resistant Prostate Cancer; CRPC)의 형태로 종양증식이 일어난다. 이 경우에 많은 전립선암 환자에게서 비정상적인 Androgen Receptor splice variant 의 발현이 증가하는 양상을 보인다. 그 중 AR-v7은 C-terminal LBD(ligand-binding domain)가 절단되어 없는 AR 단백질을 인코딩하고, 이러한 구조의 AR-v7은 항상 활성상태를 유지하기 때문에 표적유전자의 활성을 촉진시킬 수 있다. 또한, AR-V567 변이체는 enzalutamide의 약효를 저해한다. 그러므로, CRPC와 같은 경우에는 enzalutamide와 같은 기존의 항암제에 저항성을 띄고 종양증식이 진행된다.
전립선암 치료제에 반응하는 환자 또는 반응할 것 같은 환자를 식별하는 것이 전립선암의 효과적인 치료를 위한 목표가 될 수 있다. 전립선암은 혈청 전립선 특이 항원(Prostate Specific Antigen; PSA) 검사, 초음파 검사, 조직생검 등의 방법을 이용하여 진단할 수 있고, AR-v7의 발현양상은 조직생검으로 검사할 수 있다 그러나 조직생검의 경우, 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 환자에게 육체적 부담을 줄 수 있다. 따라서, 환자의 부담을 줄여주면서도 동시에 AR-V7과 AR-V567을 확인할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 혈중 순환 암세포에서 발현되는 AR 변이체를 광학 이미지 분석을 통해 탐지하고 이를 통해서 안드로겐 표적 치료여부가 적용가능한지 여부를 분석하여 상기 안드로겐 표적 치료에 대한 전립선암 환자를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 전립선암환자 스크리닝 방법은
전립선암환자로부터 혈액을 획득하는 단계;
상기 혈액으로부터 바이오칩을 이용하여 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계;
상기 분리된 혈중 순환 암세포를 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자 및 AR 변이체에 특이적으로 결합하는 형광표지자와 반응시키는 단계;
상기 형광표지자와 반응시킨 혈중 순환 암세포 및 AR 변이체를 대상으로 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지를 수신하는 단계;
상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포 및 상기 AR 변이체에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계;
상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지(morphology)를 측정하여 2차 필터링을 수행하는 단계;
상기 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행하는 단계;
상기 3차 필터링이 된 광학 이미지에서 AR 변이체가 혈중 순환 암세포의 핵에 지역화(localization)되었는지 탐지하는 단계; 및
상기 지역화 탐지를 통해서 전립선암환자의 안드로겐 표적 치료 적용여부를 분석하는 단계;
를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 DAPI, 비멘틴(vimentin)에 특이적인 항체, PSA(prostate specific antigen)에 특이적인 항체, EpCAM에 특이적인 항체 및 CK에 특이적인 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 AR변이체는 AR-V7 또는 AR-V567일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 광학 이미지를 수신하는 단계에서, 상기 복수 파장범위의 광학 이미지는 청색 파장범위 이미지, 녹색 파장범위 이미지, 및 적색 파장범위 이미지를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 청색 파장범위 이미지에서 상기 1차 필터링을 수행하는 단계 및 상기 2차 필터링을 수행하는 단계를 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포핵을 판별할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 녹색 파장범위 이미지와 상기 적색 파장범위 이미지 중 하나 이상의 이미지에서 상기 1차 필터링을 수행하는 단계를 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포막을 판별할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적, 세포크기, 및 진원도(circularity) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 1차 필터링을 수행하는 단계는,
상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 혈중 순환 암세포의 크기를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 세포의 크기보다 미리 정해진 비율 또는 양만큼 큰 다각형 또는 원으로 이루어진 영역을 설정하고, 상기 영역 내에서 혈중 순환 암세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계는 대기압 1000내지 1020hPa하에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 전립선암은 거세저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancer)일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 혈중 순환 암세포에서 발현되는 AR-V7의 이미지 분석을 통해서 안드로겐 표적 치료법이 적용될 수 있는 전립선암 환자를 가려낼 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도1은 혈중 순환 암세포를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도2는 고밀도 마이크로칩에 의해 분리된 혈중 순환 암세포를 찍은 사진이다.
도3은 본 발명에 따른 배양액에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양액에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도4는 본 발명에 따른 배양액을 이용하여, 본 발명에서 사용된 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도5는 청색, 녹색, 및 적색 파장범위에 대한 표적세포 광학 이미지의 샘플 사진이다.
도6은 도 5에 나타난 표적세포 광학 이미지를 병합한 통합 이미지 사진이다.
도7은 여러 형광염료 또는 마커가 결합된 표적세포의 형상과 그 형광강도의 측정 결과를 나타낸다.
도8은 광학적 세포 식별방법을 구현한 프로그램의 구동예이다.
도9는 전립선암 세포주 및 백혈구 spike-in슬라이드를 사용하여, 혈중 순환 세포의 DAPI, EpCAM, pan-CK, AR-V7 및 CD45에 대한 면역형광 이미지이다.
도10은 전립선암환자의 샘플에서 혈중 순환 세포의 DAPI, EpCAM, pan-CK, AR-V7 및 CD45에 대한 면역형광 이미지이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면에 따른 전립선암환자 스크리닝 방법은 (a) 전립선암환자로부터 혈액을 획득하는 단계 (b) 상기 혈액으로부터 바이오칩을 이용하여 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계 (c) 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자 및 AR변이체에 특이적으로 결합하는 형광표지자와 반응시키는 단계 (d) 상기 형광표지자와 반응시킨 혈중 순환 암세포 및 AR 변이체를 대상으로 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지를 수신하는 단계 (e) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포 및 상기 AR 변이체에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계 (f) 상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지(morphology)를 측정하여 2차 필터링을 수행하는 단계 (g) 상기 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행하는 단계 (h) 상기 3차 필터링이 된 광학 이미지에서 AR 변이체가 혈중 순환 암세포의 핵에 지역화(localization)되었는지 탐지하는 단계 (i) 상기 지역화 탐지를 통해서 전립선암환자의 안드로겐 표적 치료 적용여부를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells, CTC)란, 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포를 의미한다. 혈중 순환 암세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한된다. 혈중 순환 암세포의 검출 및 특성 해석에서의 기술은 다중역전사정량중합효소연쇄반응 방법들, 영상화 기반 접근법들, 그리고 미세여과법 및 마이크로칩 장치들을 포함하며 이에 국한되지 않는다. 혈중 순환 암세포는 액상생검검체로 개별화된 치료와 치료 후 경과관찰을 필연적으로 제공할 수 있는 종양생물학적 표지자로 작용할 수 있다. 또한, 혈중 순환 암세포는 종양의 생물학적 특성 및 종양세포의 파종을 이해하기 위한 표적으로 사용될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 혈중 순환 암세포는 폐암 유래 세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈중 순환 암세포는 비소세포폐암 유래 세포일 수 있다.
상기 바이오 칩이란, 반도체와 같은 무기물로 된 고체 기질에 생물에서 유래된 DNA, 단백질, 효소, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등의 물질을 고밀도로 집적화하고 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성 소자로서 생체분자의 고유한 기능을 이용하며 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 공정 및 반응 속도 또는 정보 처리 속도를 높이는 도구나 장치를 말한다.
상기 고밀도 마이크로칩이란, 바이오칩의 작용 원리를 기반으로 특정 사이즈의 물질을 분리해낼 수 있는 바이오칩을 말한다.
상기 고밀도 마이크로칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 혈중 순환 암세포를 포착할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5 μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm보다 작을 경우 적혈구 및 백혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 크기보다 커서 혈중 순환 암세포 및 면역세포가 칩을 통과하여 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.
기공들 중 인접하는 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 직경보다 좁게 형성되어 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 직경에 대하여 45~65%로 형성될 수 있다. 상기 고밀도 마이크로칩은 통로를 흐르는 혈액 또는 솔루션의 압력에 의하여 변형되지 않는다.
혈액은 기공들을 통과한 후, 밖으로 배출되며 혈액 속의 혈중 순환 암세포 들은 기공들을 통과하지 못하고 표면에 잔류된다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 혈중 순환 암세포는 폐암 유래 세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈중 순환 암세포는 비소세포폐암 유래 세포일 수 있다.
비표적세포들, 즉 혈중 순환 암세포보다 변형률이 높은 적혈구는 기공들을 쉽게 통과한다.
혈중 순환 암세포들의 여과 후, 혈중 순환 암세포들은 솔루션을 역방향 또는 정방향으로 공급하여 밖으로 배출시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 솔루션은 혈중 순환 암세포의 손상을 최소화할 수 있도록 역방향으로 공급할 수 있다. 상기 솔루션은 주사기, 시린지펌프, 플런저펌프 등에 의하여 공급될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 솔루션은 혈액을 희석하는 희석제, 물(Water) 및 희석용 산으로 구성될 수 있다. 상기 솔루션의 공급에 의하여 밖으로 배출되는 혈중 순환 암세포 및 면역세포들을 컨테이너(Container), 예를 들어 시험관, 배양접시 등에 수거하여 간편하게 채집할 수 있다.
한편, 직경 7.5~15μm의 혈중 순환 암세포는 약 100mmHg의 압력이 가해질 때 직경 8μm의 관을 통과한다. 직경 8μm의 관을 통과하는 직경 15μm의 혈중 순환 암세포는 약 53%의 변형률을 갖는다. 역세척(Back washing), 즉 혈액의 흐름과 반대방향으로 솔루션을 흐르게 하여 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포를 밖으로 배출시킬 때, 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면 두 기공들 사이의 간격은 4μm 이하가 바람직하다. 예를 들어, 비소세포폐암과 유방암은 그 암세포의 직경이 40μm 정도에 이르는 것으로 알려져 있다. 역세척 시 직경 40μm의 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면, 두 기공들 사이의 간격은 21μm 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포가 간격 4μm를 초과하는 두 기공들 사이에 존재할 때, 혈중 순환 암세포가 솔루션의 흐름에 의하여 변형되면서 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 또한, 직경 40μm의 암세포도 간격 21μm를 초과하는 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩에 있어서 솔루션의 압력을 고려하여 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포의 직경에 대하여 45~65%로 이루어진다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 약 4.9μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 직경 40μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 26μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 두 기공들 사이의 표면에 달라붙은 혈중 순환 암세포를 강제로 탈락시키고자 솔루션의 압력을 높이는 경우, 혈중 순환 암세포의 손상이 발생되어 살아 있는 혈중 순환 암세포의 채집율이 저하된다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포에 대한 간격이 45% 미만, 즉 약 3.375μm 미만인 경우, 혈액과 솔루션의 흐름에 의하여 상기 고밀도 마이크로칩이 파손될 우려가 높다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 암세포가 상기 고밀도 마이크로칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 암세포를 다시 한번 상기 고밀도 마이크로칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포가 포함된 용액을 고밀도 마이크로칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중 순환 암세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩은, 혈중 순환 암세포가 분리될 때 상기 고밀도 마이크로칩에 의한 혈중 순환 암세포 데미지를 최소화시키거나 상기 고밀도 마이크로칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중 순환 암세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin) 또는 항체일 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 항상피세포접합분자 항체(Anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule antibody, Anti-EpCAM antibody), 항시토케라틴 항체(Anti-Cytokeratin antibody, Anti-CK antibody) 등으로 구성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin)일 수 있다.
상기 BSA(Bovine Serum Albumin)용액이란, 소혈청 알부민을 말한다. 분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다. BSA는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해줄 수 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내의 단백질 농도를 보완해주기 위하여 첨가해줄 수도 있다. 그리고 여러 생화학적 실험(Western blot, Immunocytochemistry, ELISA 등) 에서 특정 항체를 검출하고자 하는 단백질을 붙여주기 전에, 비특이적 결합(nonspecific binding), 즉 원하지 않는 단백질 혹은 원치않는 위치에 항체가 달라붙는 비특이적 결합을 막아 주기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 원심분리법을 이용하여 말초 혈액을 상기 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩에 반응시켜서 혈중 순환 암세포를 제외한 기타 생체고분자를 제거할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩을 이용한 분리는 중력으로 이루어질 수 있고, 구체적으로는 대기압 1000 내지 1020hPa에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 대기압1000 내지 1015hPa에서 이루어질 수 있다. 더 바람직하게는 대기압 1000 내지 1013hPa에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액은 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 또는 상기 기공의 내측면에 코팅될 수 있다. 바람직하게는 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 및 상기 기공의 내측면 모두에 코팅될 수 있다
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.05내지 0.15% 농도로 이루어 질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.08 내지 0.012% 농도로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 5내지 15분동안 처리될 수 있다. 볼 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 8내지 12분동안 처리될 수 있다.
도1을 참조해보면, 환자의 혈액에서 먼저 혈구세포를 제거하기 위해서, 채혈된 환자의 혈액에 항체 중합체를 넣어 준 뒤 잘 혼합을 시킨 후 상온에서 반응을 시킨다. 이후 1% FBS가 들어있는 PBS용액을 가하고 Ficoll용액을 반응용액에 올리고 난 뒤 원심분리를 통해 1차적으로 혈구세포를 제거한다. 이렇게 본 발명에서 불필요한 혈구세포를 1차적으로 제거한 뒤, BSA용액으로 특별 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용해서 적혈구를 여과해서 순도가 높은 혈중 순환 암세포를 분리해낸다. 분리된 혈중 순환 암세포는 염색을 통해 동정을 한다. 상기 BSA로 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용하게 되면 본 발명에서 분리하고자 하는 혈중 순환 암세포 손상을 최소화시킨 상태로 분리시킬 수가 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 액상생검샘플로부터 바이오칩을 이용하여 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계이후에, 분리된 혈중 순환 암세포를 단기배양하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스퍼린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어질 수 있다.
상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.
상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순환 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.
상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9 ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.
상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μM, 3~27μM, 3~24μM, 3~21μM, 4~20μM, 4~30μM, 4~27μM, 4~24μM, 4~21μM, 4~20μM, 5~30μM, 5~27μM, 5~24μM, 5~21μM 또는 5~20μM일 수 있다.
본 발명에 따른 단기 배양에서 사용되는 상기 배양플레이트는 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중암세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 상기 배양플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중암세포가 배양플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5 내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12 내지 15일일 수 있다.
상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 혈중 순환 암세포 자체 또는 내외부에 존재하는 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중 순환 암세포를 식별할 수 있는 형광표지자는 세포핵에 특이적으로 결합할 수 있거나 세포내외부에 존재하는 단백질이나 DNA, RNA등에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 세포핵에는 DAPI가 형광표지자로 쓰일 수 있고, 중간경 필라멘트 단백질인 비멘틴(vimentin)에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 쓰일 수 있으며, 전립선 특이적 항원(PSA, prostate specific antigen)과 전립선 특정 막 항원 (PSMA, prostate specific membrane antigen) 에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 사용될 수 있고, 상피 세포 부착 분자(EpCAM, epithelial cell adhesion molecule)과 CK(cytokeratin)에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 사용될 수 있으며, 비표적세포 제거수단으로 쓰이는 CD45에 특이적으로 결합하는 형광표지자가 사용될 수 있다. 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산 또는 단백질로 이루어질 수 있으며, 단백질로 된 항체일 수 있다. 상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하여 식별가능하게 하는 물질이면 가능하다.
상기 전립선 특이적 항원(PSA, prostate specific antigen) 및 전립선 특정 막 항원 (PSMA, prostate specific membrane antigen) 은 전립선의 상피세포에서 합성되는 단백분해 효소로 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아 전립선암의 선별에 이용되는 유용한 바이오마커이다. 하지만, PSA과 PSMA는 전립선 조직에는 특이적이지만 종양에는 특이적이지 않아 전립선 비대증, 전립선염, 전립선 경색 등에서도 증가할 수 있다.
따라서, 전립선암종을 식별하기 위해서는 전립선 특이적 항원 이외에 AR(Androgen Receptor, 안드로겐 수용체) 변이체, 예를 들어 AR-V7 또는 AR-V567과 같은 바이오마커가 추가적으로 사용되어야 한다.
AR 변이체는 AR에 변이가 일어난 단백질로서, 임상적으로 가장 많이 나타나는 2종류로는 AR-V7과 AR-V567가 있다. 상기 AR-V567은 거세저항성 전립선 암환자의 암조직에서 59% 비율로 존재하고, 안드로겐 차단 요법(androgen deprivation therapy) 또는 abiraterone 치료에 반응하여 발현이 된다(Sun et al., J Clin Invest 120, 2715 (August, 2010); Mostaghel et al., Clin Cancer Res 17, 5913 (Sep. 15, 2011)).
상기 AR-V7(androgen receptor splice variant7)은 C말단 LBD(ligand-binding domain)가 절단되어 없는 AR 단백질을 인코딩한다. 하지만 전사인자로서 구조적으로 활성상태는 유지하고 표적유전자의 활성을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 AR-V7 및 AR-V567은 세포핵으로 침투하여 세포핵내에 지역화(localization)될 수 있다.
상기 AR-V7또는 AR-V567에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 AR-V7 또는 AR-V567에 특이적으로 결합할 수 있는 형광물질일 수 있으며, 구체적으로는 AR-V7 또는 AR-V567에 특이적으로 결합할 수 있는 항체일 수 있다.
상기 광학적 이미지는 이미징 시스템에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이미징 시스템은 세포 이미징 시스템일 수 있으며, 상기 세포 이미징 시스템은 예컨대 슬라이드 글라스와 같은 플랫폼 상에 염색된 세포를 놓고 여러 파장별로 세포를 관찰하고 촬영하는 시스템이다. 세포 이미징 시스템은 자동 셀 카운팅(cell counting) 모듈, 형광 강도(intensity) 분석 모듈, 세포학(cytology) 기반 셀 분류/인식(cell classification/cognition) 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 사용자 편의 기능으로서, 측정(Measurement) 기능, 리포트(Report) 자동 생성 기능, DB 관리 기능을 유저 인터페이스로 포함할 수 있다. 이러한 세포 이미징 시스템은 세포, 배양액, 데브리스(debris) 등을 구별하고, 사용자가 원하는 세포를 판별하고 계수하기 위한 디지털 영상분석 장비가 포함된다. 본 발명의 일실시예에 따른 세포 이미징 시스템은, 광학적 이미지로부터 형광표지된 또는 마커가 결합된 표적세포를 정확히 식별하고 계수할 수 있다.
상기 광학적 이미지는 물체로부터 반사된 반사광에 의해 촬상된 광학 이미지일 수 있다. 세포 광학 이미지는 세포 이미징 장치에 의해 출력되어 배경 상에 세포와 데브리스 등이 촬상된 것일 수 있다. 이 광학 이미지는 특정 파장범위 각각에 대하여 복수개의 분할 이미지를 스티칭(stitching)하여 이루어진 하나의 이미지 파일로 제공되는 것일 수 있다. 여기서, 복수 파장범위의 광학 이미지는 청색 파장범위 이미지, 녹색 파장범위 이미지, 및 적색 파장범위 이미지를 포함할 수 있다. 청색 파장범위에 대한 광학 이미지는 혈중 순환 암세포의 세포핵 판별에 특히 유용하며, 녹색 파장범위 및 적색 파장범위에 대한 광학 이미지는 혈중 순환 암세포의 세포막의 판별에 특히 유용하다. 그 외에도 다양한 색상(컬러)의 파장범위를 이용하여 특정 형광표지자 또는 마커를 식별하는 것이 가능하다.
상기 1차 필터링 또는 2차 필터링에 있어서, 세포 또는 AR 변이체 식별이 원하는 수준으로 이루어지지 않으면, 광학 이미지 데이터에 대한 데이터 필터링을 거치고 다시 한번 1차 필터링 또는 2차 필터링을 수행하는 것도 가능하며, 데이터 필터링을 복수회 거치는 것도 가능하다. 또한, 1차 필터링 또는 2차 필터링이 수행된 이후에는 이미지 데이터를 저장하고 이를 출력할 수 있다.
또한, 제1 파장범위에 대한 광학 이미지에서 1차 필터링 단계 및 2차 필터링 단계를 수행하고, 이어서 제1 파장범위와 상이한 제2 파장범위에 대한 광학 이미지에서 1차 필터링 단계 및 2차 필터링 단계 중 하나 이상의 단계를 더 수행할 수 있다.
예컨대, 제1 파장범위는 청색 파장범위, 제2 파장범위는 녹색 또는 적색 파장범위일 수 있다. 이 경우, 청색 파장범위 이미지에서 제1 필터링 과정 및 제2 필터링 과정을 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포핵을 판별할 수 있다. 또한, 녹색 파장범위 이미지와 적색 파장범위 이미지 중 하나 이상의 이미지에서 제1 필터링 과정을 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포막을 판별할 수 있다. 이러한 1차 및 2차 필터링을 통해 광학 이미지로부터 세포를 정확히 식별하는 것이 가능하게 된다. 예컨대, 녹색 및 적색 파장범위 이미지를 통해서 예컨대 백혈구와 암세포 등의 표적세포에 대한 식별성이 높아지게 된다. 도 5에는 실제 표적세포에 대한 청색 파장범위 이미지(a), 녹색 파장범위 이미지(b), 및 적색 파장범위 이미지(c)의 샘플 사진이 도시되어 있다.
한편, 2차 필터링 과정에서는 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하게 되는데, 여기서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적(area), 세포 크기(diameter), 및 진원도(circularity) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, AR 변이체에 대한 형광강도 측정은 AR변이체에 특이적으로 결합하는 형광표지자에서 나오는 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 형광강도를 측정함으로써 이루어지며 이에 대해 1차 필터링을 수행할 수 있다.
AR변이체 이외에 혈중 순환 암세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 과정을 더 구체적으로 살펴보면 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 세포의 크기를 측정하고, 이후 측정된 세포의 크기보다 미리 정해진 비율 또는 양만큼 큰 다각형 또는 원으로 이루어진 영역을 설정하고, 이 영역 내에서 세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행할 수 있다.
도 7에는 여러 형광염료 또는 마커가 결합된 혈중 순환 암세포의 형상과 그 형광강도의 측정 결과가 나타나 있는데, 세포 핵을 DAPI로 염색한 경우(a), 비멘틴(vimentin)을 마커로 사용한 경우(b), EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)과 CK(cytokeratins)를 마커로 사용한 경우(c), 및 CD45를 마커 또는 비표적세포 제거수단으로 사용한 경우(d)가 각각 도시되어 있다. 각각의 경우에 대해 예컨대, 청색 파장범위 광학 이미지에서 세포의 크기를 측정한 이후, 측정된 크기보다 10% 이상의 크기를 갖는 사각형을 설 정하고, 이 사각형 내에서 세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행할수 있다. 이후에 다른 컬러, 예컨대 녹색, 적색, 황색 파장범위 광학 이미지에서도 동일한 좌표와 크기의 영역에서 형광강도 측정이 이루어질 수 있다. 도 7의 (a) 내지 (d)는 각각 청색, 녹색, 황색, 및 적색 파장범위 이미지이며, 도 7의 (e)에는 각 파장범위 이미지에서의 형광강도 측정결과가 나타나 있다.
상기 3차 필터링 단계에서, 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행한다. 여기서 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적, 세포 크기, 및 진원도 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예컨대, 도 6에 도시된 바와 같이 청색 파장범위 광학 이미지, 녹색파장범위 이미지, 및 적색 파장범위 이미지를 모두 병합한 통합 이미지를 생성하고, 이 통합 이미지로부터 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행할 수 있다. 이러한 통합 이미지를 이용한 3차 필터링을 통해 예컨대 AR 변이체가 세포핵에 지역화(localization)되어 있는 지 여부를 판별할 수 있다.
상기 3차 필터링은 혈중 순환 암세포 전체에 대해 수행하는 것도 가능하고, 1차 및 2차 필터링 과정에서 세포의 식별이 어려웠던 것에 대해 보충적으로 수행하는 것도 가능하다. 추가 식별이 팔요한 경우에는 별도의 데이터 필터링을 거치거나, 3차 필터링 과정을 다수회 거치는 것도 가능하다.
상기 이미지 분석은 컴퓨터 프로그램에 의해 실행될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램은 프로세서, 콘트롤러, ALU(arithmetic logic unit), 디지털 신호 프로세서(digital signal processor), 마이크로컴퓨터, FPGA(field programmable gate array), PLU(programmable logic unit), 마이크로프로세서, 또는 명령(instruction)을 실행하고 응답할 수 있는 다른 어떠한 장치와 같이, 하나 이상의 범용 컴퓨터 또는 특수 목적 컴퓨터를 이용하여 구현될 수 있다.
도 8은 이미지 분석을 구현한 프로그램의 구동예로서, 본발명의 실시예에 의한 광학적 이미지 분석을 알고리즘으로 구현한 분석 소프트웨어의 사용자 인터페이스 중의 한 예이다. 이 소프트웨어를 통해 세포의 식별과 계수가 빠른 시간 내에 자동적으로 이루어질 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 고밀도 마이크로칩 제작
실험에서 사용되는 고밀도 마이크로칩은 기공의 크기(pore-size)가 5.5~8.5μm로 형성되어 있어, 5.5μm보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 5.5 μm보다 큰 사이즈의 표적 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.
참고로, 고밀도 마이크로칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 스파이킹 세포 수 회수 된 세포 수 세포 회수율(%)
1 10 9 90
2 100 86 86
3 1000 850 85
칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.
실시예 2 : 혈중 순환 암세포(CTC) 분리과정
1. 혈액 5㎖에 항체 중합체 250㎕를 넣은 뒤 3초 정도 혼합한 후 상온에서 20분간 반응시킨다.
2. 1% FBS가 든 PBS 5ml을 가한다.
3. Ficoll 용액 15㎖가 담긴 50㎖ tube에 반응용액 10㎖을 조심스럽게 올린다.
4. 용액을 20분간 1200g에서 원심분리 하여 1차적으로 혈구세포를 제거한다.
5. 불필요한 세포의 흡착을 방지하기 위하여 고밀도 마이크로칩(HD Microporous chip, 여과망)을 0.1% BSA 용액으로 10 분간 처리하여 코팅한 다음 PBS로 린스한다.
6. Ficoll 의 상층용액을 여과망위에 올리고 미량 존재하는 적혈구를 중력으로 여과하여 2차적으로 순도가 높은 혈중 순환 암세포를 분리한다. 이는 원심분리나 immunobead와 같은 처리를 하지 않음으로써 혈중 순환 암세포가 손상되는 것을 방지해 준다.
7. 분리된 혈중 순환 암세포는 염색을 통해 동정한다.
실시예 3. 분리된 혈중 순환 암세포의 단기 배양
본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩에 의해 분리된 혈중 순환 암세포를 중성전하를 가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra-low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml의 인슐린, 22ng/ml의 트랜스페린, 2ng/ml의 EGF 및 8μM의 ROCK 억제제를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO2 조건하에서 배양을 실시했다.
실시예 4. 혈중 순환 암세포의 확인
상기 실시예3에 따라 단기 배양된 혈중 순환 암세포는 염색 방법을 통해 암 세포임을 확인하기 위하여, 하기 방법을 이용하여 세포 염색과정을 수행한다.
1. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다.
2. 항체가 세포 내부로 들어갈 수 있도록 투과(permeabilization)과정을 수행한다.
3. PBS로 워싱(washing) 과정을 수행한다.
4. PBS를 이용하여 1% BSA(bovine serum albumin)를 만들고, 비특이적 반응(non-specific binding)과 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)를 줄이기 위해 블러킹(blocking) 과정을 수행한다.
5. 1차 항체로 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CK(cytokeratin) 및 CD(cluster of differentiation) 45를 상온에서 60분간 반응시킨다.
6. 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 상온에서 60분간 반응시킨다.
7. PBS로 워싱 과정을 수행한다.
8. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 반응시킨다.
9. 염색된 세포들을 관찰하면서, 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.
실시예 5. 혈중 순환 암세포 및 AR-V7형광 이미지 분석
1. 상기 실시예4에서 형광 표지된 혈중 순환 암세포를 준비한다.
2. AR-V7에 특이적인 1차 항체(마우스)를 상기 실시예4에서 형광표지된 혈중 순환 암세포와 반응시킨 후 2차 항체(Alexa546(마우스)를 반응시켜서 AR-V7을 형광표지시킨다(AR-V7관련 1,2차 항체는 1차 AR-V7 항체(토끼) - 2차 항체 Alexa546(토끼)의 조합을 사용할도 있다).
3. 상기 반응 후에 혈중 순환 암세포를 슬라이드 위에 로딩한 후, 상기 슬라이드를 SmartBiopsy Cell Image Analyzer(CIA 020)의 플랫폼 위에 위치시킨다.
4. 복수의 파장 범위를 설정하여 이미지를 촬영한 후 형광 강도 측정을 실시한다.
5. 복수의 파장 범위에서 실시된 상기 형광 강도 측정에서 혈중 순환 암세포 및 AR-V7의 형광 파장을 측정하여 1차필터링을 수행한다.
6. 상기 1차 필터링을 통해 혈중 순환 암세포의 세포핵 및 세포막에 대해 형광표지자(DAPI, EpCAM, CK, CD45)의 형광 파장(청색, 녹색 및 적색)을 측정한다.
7. 상기 측정된 형광 파장에서 다시 혈중 순환 암세포를 표지한 형광 물질의 파장에 대해서 혈중 순환 암세포의 면적, 세포의 크기 및 원형의 정도(circularity)를 측정하는 2차 필터링을 수행한다.
8. 상기 2차 필터링은 상기 1차 필터링된 이미지에서 혈중 순환 암세포의 세포핵을 추가적으로 측정 및 분석하며 CD45 (적색)이 염색된 세포를 제외하는 과정을 수행하는 것을 포함한다.
9. 상기 1차 필터링 및 2차 필터링 이미지를 전체를 통합시킨 후 다시 혈중 순환 암세포의 면적, 세포의 크기 및 원형의 정도(circularity)를 측정 및 분석하는 3차 필터링을 수행한다.
10. 각 형광 파장의 강도의 세기를 측정하고, 이를 수치화 한다.
비교예 1. 배양액에 따른 혈중 순환 암세포의 배양된 세포수 변화
일반적으로 세포 배양에 사용되는 세포 배양액과 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 암세포의 분열 및 성장 정도를 비교실험하였다. 일반적으로 세포 배양에 사용되는 배양액은 25 nM sodium selenite, 50 nM Hydrocortisone, 0.01 mM ethanolamine, 0.01 mM phosphorylethanolamine, 100 pM triiodothyronine, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 4.5mM L-glutamine 및 1X antibiotic-antimycotic 을 포함하고 있으며, 본 발명의 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다. 또한 배양 조건은 일반적인 플레이트를 이용한 점을 제외하고는 실시예3과 동일하다.
도3을 보면, CD45-는 배양되는 혈중 순환 암세포에 대한 바이오마커이며, Normal growth media는 일반적인 세포 배양액, CG growth media는 본 발명에 따른 배양액을 의미한다. 도3은 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 본 발명에 따른 배양액이 일반적인 배양액보다 혈중 순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 전립선암환자로부터 혈액을 획득하는 단계;
    상기 혈액으로부터 바이오칩을 이용하여 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 혈중 순환 암세포를 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자 및 AR 변이체에 특이적으로 결합하는 형광표지자와 반응시키는 단계;
    상기 형광표지자와 반응시킨 혈중 순환 암세포 및 AR 변이체를 대상으로 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지를 수신하는 단계;
    상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포 및 상기 AR 변이체에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계;
    상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지(morphology)를 측정하여 2차 필터링을 수행하는 단계;
    상기 복수 파장범위 각각에 대한 광학 이미지 중 전체 또는 일부를 병합한 통합 이미지에서 상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지를 측정하여 3차 필터링을 수행하는 단계;
    상기 3차 필터링이 된 광학 이미지에서 AR 변이체가 혈중 순환 암세포의 핵에 지역화(localization)되었는지 탐지하는 단계; 및
    상기 지역화 탐지를 통해서 전립선암환자의 안드로겐 표적 치료 적용여부를 분석하는 단계;
    를 포함하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합하는 형광표지자는 DAPI, 비멘틴(vimentin)에 특이적인 항체, PSA(prostate specific antigen)에 특이적인 항체, EpCAM에 특이적인 항체 및 CK에 특이적인 항체로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 AR 변이체는 AR-V7 또는 AR-V567인 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 광학 이미지를 수신하는 단계에서, 상기 복수 파장범위의 광학 이미지는 청색 파장범위 이미지, 녹색 파장범위 이미지, 및 적색 파장범위 이미지를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 청색 파장범위 이미지에서 상기 1차 필터링을 수행하는 단계 및 상기 2차 필터링을 수행하는 단계를 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포핵을 판별하는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 녹색 파장범위 이미지와 상기 적색 파장범위 이미지 중 하나 이상의 이미지에서 상기 1차 필터링을 수행하는 단계를 수행하여 혈중 순환 암세포의 세포막을 판별하는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 혈중 순환 암세포에 대한 모폴로지는 세포 면적, 세포크기, 및 진원도(circularity) 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 1차 필터링을 수행하는 단계는,
    상기 복수 파장범위 전체 또는 일부의 광학 이미지에서 혈중 순환 암세포의 크기를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 혈중 순환 암세포의 크기보다 미리 정해진 비율 또는 양만큼 큰 다각형 또는 원으로 이루어진 영역을 설정하고, 상기 영역 내에서 혈중 순환 암세포에 대한 형광강도를 측정하여 1차 필터링을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계는 대기압 1000내지 1020hPa하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩인 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅되는 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 전립선암은 거세저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancer)인 것을 특징으로 하는 전립선암환자 스크리닝 방법.
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