KR101870923B1 - Lmcd1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 이용한 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암 진단방법 - Google Patents

Lmcd1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 이용한 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계; 및 상기 시료로부터 측정된 발현양을 대조군으로부터 측정된 발현양과 비교하는 단계를 포함하는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법 및 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물을 포함하는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

LMCD1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 이용한 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암 진단방법{Diagnosis method of metastatic cancers or the taxanes resistance cancer using LMCD1 protein and a gene encoding the same}
본 발명은 Smad3 단백질 인산화 정도 및 그에 따라 유도되는 LMCD1을 바이오마커로서 이용하여 전이성 암 또는 탁산 계열 약물에 저항성을 갖는 암을 진단하는 방법 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
Smad3는 TGF-b1 신호전달계의 중요 전달인자로서 수용체 인산화를 통해 활성화된 신호를 핵으로 전달하여 활성 유전자의 발현을 조절하여 세포의 기능을 매개한다. TGF-b1은 암의 생성과 진행에 있어 종양 초기 상피세포의 증식을 조절함으로써 종양억제자의 역할을 하나, 종양 말기에 크게 활성화되어 상피중간엽 이행 및 침윤성을 증가시킴으로써 종양촉진자로 역할하게 되는 이중성을 가지고 있다. 최근 연구에서 TGF-b1 신호전달계가 유방암 및 대장암 등의 표적 치료제 및 일반적인 항암치료제의 저항성을 매개하는 것으로 알려져 있어 암의 치료 및 재발에 있어서 근본적인 진단 및 치료법 제시에 필수적인 요소이다.
이 때, Smad3에 위치한 인산화 부위의 활성화에 따라 그 기능이 조절되는 것으로 알려져 있다. Smad3의 인산화 부위는 아미노 말단과 카복시 말단의 2개 도매인을 연결하는 연결부의 부위와 카복시 말단에 집중적으로 위치해 있으며, 수용체 인산화에 의한 신호 전달은 카복시 말단 인산화에 의해 주도적으로 조절된다. 또한 최근 연구에 따르면 Smad3 단백질의 연결부에 위치한 인산화 상태에 따라 TGF-b1에 의한 신호전달계가 유방암 세포의 생성 및 전이를 조절하고 있음이 보고된 바 있다.
한편, 유방암 치료에 있어 임상적으로 널리 사용되는 파클리탁셀(paclitaxel)은 세포의 유사분열 시에 미세소관의 중합화를 억제함으로써 세포를 사멸시키는 항암제로서, 뛰어난 항암효과에 의해 폐암, 유방암, 난소암 및 위암을 포함하여 광범위하게 적용되고 있다. 그러나 약물치료 단계와 무관하게 파클리탁셀에 저항성을 갖는 암이 보고되고 있으며, 파클리탁셀에 저항성을 갖는 유방암 환자의 경우 재발 및 전이가 빈번하게 나타나며, 뛰어난 항암 효과에도 불구하고 파클리탁셀은 골수 림프구 감소증, 이차 감염 및 과민반응 등의 부작용이 빈번하게 보고되므로 저항성을 갖는 환자에 지속적으로 투여했을 때 그 치료적 예후를 불리하게 하고 적절한 치료시기를 놓치게 함으로써 환자의 생존률에 큰 영향을 미칠 수 있다.
일 양상은 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계; 및 상기 시료로부터 측정된 발현양을 대조군으로부터 측정된 발현양과 비교하는 단계를 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물에 저항성을 갖는 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상은 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양상은 본 발명에 따른 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단용 키트에 관한 것이다.
일 양상은 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1(LIM And Cysteine Rich Domains 1) 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계; 및 상기 시료로부터 측정된 발현양을 대조군으로부터 측정된 발현양과 비교하는 단계를 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 LMCD1 단백질은 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있으며, 인간 유래의 LMCD1은 4종 이상의 이소형(isoform)을 가질 수 있다. 상기 LMCD1은 각각 GenBank Accession No. NM_014583.3 (서열번호 5), NM_001278233.1 (서열번호 6), NM_001278234.1 (서열번호 7), 또는 NM_001278235.1 (서열번호 8)을 포함하는 mRNA로부터 각각 NP_055398.1 (서열번호 1), NP_001265162.1 (서열번호 2), NP_001265163.1 (서열번호 3), 또는 NP_001265164.1 (서열번호 4)로 나타나는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 서열번호 5 내지 8의 mRNA와 서열번호 1 내지 4의 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 LMCD1의 mRNA 또는 LMCD1 단백질로 간주될 수 있다. 따라서 일 구체예에서 상기 LMCD1 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 LMCD1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드는 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 염기 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드는 상기 서열번호 5 내지 8 중 중 어느 하나의 염기 서열에서 1개 이상의 염기, 2개 이상의 염기, 3개 이상의 염기, 4개 이상의 염기, 5개 이상의 염기, 6개 이상의 염기 또는 7개 이상의 염기가 상이한 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 LMCD1 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 LMCD1 단백질은 상기 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상의 아미노산 잔기, 3개 이상의 아미노산 잔기, 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 변화된 서열을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
용어 "암"은 "종양"과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 뇌척수암, 두경부암, 흉선종, 취암, 다발성 골수종, 급성 백혈병, 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 암은 유방암이다.
용어 "탁산계 약물"은 디테르펜(diterpene)계 분류인 탁산(taxane)계열에 속하는 약물을 의미하는 것으로서, 탁소이드(taxoid)'와 동일한 의미를 가질 수 있고, 주목 속(genus Taxus)의 식물로부터 유래되어, 탁사디엔(taxadiene) 모핵을 갖는 것을 특징으로 한다. 일 구체예에서 상기 탁산계 약물은 파클리탁셀(또는 탁솔), 도세탁셀(탁소테르(taxotere)), 카바지탁셀 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "저항성"은 탁산 계열 약물의 투여에 의하여 암의 예방, 개선 또는 치료가 효과적으로 이루어지지 않는 것을 의미하는 것으로, 보다 구체적으로, 세포 분열에 필수적인 마이크로튜불 중에 GDP-결합된 튜불린을 안정화시켜 마이크로튜불의 기능을 방해하는 기작을 방해하는 탁산계 약물의 효능이 저하되거나 유발되지 않는 것으로서, 초기 화학치료요법 단계에서 유발되지 않는 경우뿐 아니라, 반복적인 치료, 질병 단계의 진행, 또는 다른 기관에 유발된 암 치료 중 발생된 획득 저항성에 의하여 탁산계 약물의 효능이 저하되거나 유발되지 않게 된 암을 모두 포함한다.
용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 LMCD1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, LMCD1 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 LMCD1 유전자에 의해 코딩되는 LMCD1 단백질을 얻고, 얻어진 LMCD1 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계에서, LMCD1 유전자의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 서열에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA 등의 뉴클레오티드과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는
짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 방사성 원소 등으로 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현양)을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암의 진단을 위한 바이오마커인 LMCD1 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 전이성 또는 탁산계 약물 저항성 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 마커 LMCD1의 mRNA의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 LMCD1 단백질의 발현양의 측정을 통해 전이성 암인지 또는 탁산계 약물에 저항성을 갖는 암인지 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 및 프라이머 세트의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 나타내며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체 및 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체를 포함할 수 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 포스포르아미디트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.
상기 LMCD1 단백질 또는 그 유전자의 mRNA 발현양은 특정 암, 암의 진행 단계, 또는 특정 암에서의 특정 위치(예를 들어, luminal 또는 basal/TNBC 등)에 따라 다량 발현하는 부위를 택하여 시료를 채취하고 그 발현양을 측정할 수 있다.
용어 "측정"은 시료 중 존재하는 특정 단백질 또는 뉴클레오티드를 탐지하여 수치화하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 '측정'은 상기 방법에서 사용되는 상기 LMCD1 단백질 또는 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적인 결합체에 따라 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩 중에 선택된 어느 하나 이상, RT-PCR, RNase 보호분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩 중 선택된 어느 하나 이상 또는 이들의 조합을 이용하여 수치화하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법은 상기 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계 전에 상기 개체로부터 분리된 시료를 TGF-β에 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 TGFβ (transforming growth factor beta)는 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3로 불리워지는 3개 이소폼이 존재하는 분비된 단백질이다. TGFβ는 큰 단백질 전구체로서 코딩되는데, TGFβ1는 390개 아미노산을 포함하고, TGFβ2 및 TGFβ3은 각각 412개 아미노산을 포함한다. TGFβ는 세포로부터 분비하는데 필요한 20-30개 아미노산의 N 말단 신호 펩티드로서, 잠재성 연관 펩티드 (latency associated peptide) 또는 LAP라고 불리는 프로 영역 (proregion) 및 단백질 절단에 의하여 상기 프로 영역으로부터 방출되어 성숙한 TGFβ 분자가 되도록 하는 112 내지 114개 아미노산의 C 말단 영역을 가지고 있다. 본 명세서 전체에 있어서, TGFβ는 TGFβ의 전구체, 및 성숙한 TGFβ를 포함하는 의미로 사용된다. TGFβ는 예를 들면, TGFβ1의 전구체, 및 성숙한 TGFβ1일 수 있다. 상기 TGFβ는 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물유래의 단백질일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법은 Smad3 단백질의 인산화 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 Smad3 단백질의 인산화 정도를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있고, 상기 인산화는 Smad3 연결부(linker)의 인산화를 의미하는 것일 수 있다. 상기 Smad3 연결부는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 143번 내지 230번의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 부분을 의미하는 것일 수 있다. 다른 구체예에서 상기 인산화는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 Smad3 연결부 내 179번, 204번, 208번 및 213번으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기의 인산화를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 Smad3 단백질은 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있으며, 서열번호 9를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 9와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Smad3 단백질은 상기 서열번호 9의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산 잔기, 2개 이상의 아미노산 잔기, 3개 이상의 아미노산 잔기, 4개 이상의 아미노산 잔기, 5개 이상의 아미노산 잔기, 6개 이상의 아미노산 잔기 또는 7개 이상의 아미노산 잔기가 변화된 서열을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
용어 '인산화'는 특정 아미노산 잔기 중 일부가 인산기로 치환되는 것을 의미하며, 세포 내에서는 예를 들어 키나제와 같은 인산화 효소에 의해 유발될 수 있으며, 일반적으로 단백질 (또는 '폴리펩티드')을 이루는 아미노산 잔기 중 트레오닌 및 세린이 인산화될 수 있다.
본 발명의 진단 방법에서 상기 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합은 Smad3 단백질 전체의 인산기에 특이적이거나, Smad3 단백질 중 인산화 된 아미노산 잔기에 특이적이거나, Smad3 연결부의 인산기에만 특이적이거나, Smad3 연결부의 인산화된 아미노산 잔기에만 특이적이거나, 서열번호 9의 아미노산 서열 중 179번, 204번, 208번 및 213번의 아미노산 잔기 중 하나의 인산화에만 특이적이거나, 상기 179번, 204번, 208번 및 213번 아미노산 잔기 중 둘 이상의 인산화에만 특이적이거나, 또는 179번, 204번, 208번 및 213번 아미노산 잔기 모두가 인산화된 것에만 특이적인 것일 수 있다.
본 발명의 인산화를 측정하는 방법은 인산화된 특정 아미노산 잔기에 특이적인 항체를 이용하거나, 방사선 표지된 인산기를 이용하여 방사선 정도를 측정하거나, 또는 LC-MS/MS 시퀀스 방법 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, LC-MS/MS 시퀀스를 이용하는 경우 펩티드 서열을 시퀀싱하면서 특정 아미노산 잔기의 질량 변화 및 인산화기 질량 등을 측정함으로써 인산화 정도 또는 인산화된 아미노산 잔기를 분석할 수 있다. 또한 방사선 표지된 인산기, 화학적 발광효소, 또는 형광물질을 이용하는 경우, 방사선 노출량, 발광량, 또는 형광량을 측정함으로써 상기 Smad3 단백질의 인산화 정도를 측정할 수 있다.
다른 구체예에서 본 발명의 진단 방법은 개체로부터 분리된 시료 중 암줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 암줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 암줄기세포능 마커의 발현양을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 용어 '암줄기세포능'은 줄기세포와 같이 비대칭적 분열을 통해 자가재생과 분화를 할 수 있으나, 정상 줄기세포와 달리 분열조절능력에 장애가 생겨 종양을 생성시키는 세포로 알려진 것을 의미하는 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 줄기세포능 마커는 Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM) 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법에서 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 상기 발현양의 측정은 RT-PCR, RNase 보호분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것일 수 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
또한 일 구체예에서, 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법에서 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계를 포함하는 경우, 상기 발현양의 측정은 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동(Immunoprecipitation Assay), 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법((Complement Fixation Assay), FACS, 또는 단백질 칩(protein chip)으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것일 수 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
본 발명의 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 마우스(mouse), 쥐(rat), 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 개체의 세포, 지방전구세포, 지방세포 또는 이들로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다. 따라서 용어 '개체로부터 분리된 시료'는 진단 대상 개체로부터 유래되어 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 대상 개체가 되는 포유동물로부터 분리된 것일 수 있고, 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포 외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 진단 방법에서 상기 암은 뇌척수암, 두경부암, 흉선종, 취암, 다발성 골수종, 급성 백혈병, 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 것일 수 있으나, 일 구체예에서 상기 암은 유방암일 수 있고, 상기 유방암은 전이성일 수 있다.
다른 양상은 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서 본 발명의 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물은 TGF-β를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물은 또한 Smad3 연결부의 인산화 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물은 또한 개체로부터 분리된 시료 중 암줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 암줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있고, 상기 줄기세포능 마커는 Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물은 본 발명의 진단 방법을 수행하기 위해 필요한 상기 기재된 구성 요소를 포함하는 것으로서, 앞서 설명한 표적 인자들 (예를 들어, LMCD1, Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM), Smad3 또는 인산화된 Smad3)의 발현양을 측정할 수 있는 물질, 즉 상기 인자에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 또는 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 조성물이 이용될 상기 인자의 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 본 발명의 어느 하나의 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단용 키트를 제공한다.
상기 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 키트는 LMCD1 단백질의 발현양을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양의 측정을 통해 측정함으로써 탁산 계열 약물 저항성을 갖는 암인지 여부 또는 전이성 암인지 여부를 진단할 수 있다. 상기 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 키트는 앞서 설명한 LMCD1 단백질의 발현양을 측정할 수 있는 물질, 즉 LMCD1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 또는 단백질, LMCD1 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 LMCD1 단백질 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 또한 TGF-β; Smad3 단백질의 인산화(특히, Smad3 연결부의 인산화) 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합; 또는 줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있고, Smad3 단백질 인산화 또는 줄기세포능 마커의 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 또한 암줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 암줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 암줄기세포능 마커의 발현양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명의 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 키트는 LMCD1 단백질의 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명의 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 키트는 LMCD1, Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM), Smad3 또는 인산화된 Smad3 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는, 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 전이성 암 또는 탁산계 약물 저항성 암 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 LMCD1, Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, 또는 CD326 (EpCAM) 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.
일 양상에 따른 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계; 및 상기 시료로부터 측정된 발현양을 대조군으로부터 측정된 발현양과 비교하는 단계를 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하는 방법으로써 전이성 암 또는 탁산 계열 약물에 대해 저항성을 갖는 개체를 선별할 수 있어, 불필요한 약물치료를 배제할 수 있다.
다른 양상에 따른 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단용 키트에 의해서, 전이성 암 또는 탁산 계열 약물에 대해 저항성을 갖는 개체를 쉽고 간편하게 선별할 수 있어, 암 치료 효율을 높이고, 빠른 진단 ? 예후 예측을 할 수 있다.
도 1(A)는 LMCD1를 과발현시킨 전이성 유방암 세포에서 탁산계 항암제 감수성 정도를 평가한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 1(B)는 전이성 유방암 세포에서 LMCD1를 과발현에 따른 탁산계 항암제 감수성 정도를 평가한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2(A)는 탁산계 항암제 저항성을 갖는 전이성 유방암 세포에서 LMCD1의 발현 정도를 RT-PCR 결과로 나타낸 것이고, 도 2(B)는 LMCD1 발현 여부에 따른 탁산계 항암제 감수성 변화를 MTT 분석으로서 나타낸 것이고, 도 2(C)는 탁산계 항암제 저항성을 갖는 개체에서 LMCD1 발현 정도를 면역형광법으로 나타낸 것이다.
도 3은 Smad3 단백질의 인산화 부위에 따른 인산화 아미노산 잔기를 표시한 것이다.
도 4(A)는 EPSM 아데노 바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염시킨 후 탁산계 항암제 저항성에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 4(B)는 EPSM 아데노바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염 후 LMCD1 mRNA 발현 정도를 측정한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이고, 도 4(C)는 전이성 유방암 세포에 Smad3 인산화 위치에 따른 탁산계 항암제 저항성 정도를 평가한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 4(D)는 전이성 유방암 세포에 EPSM 아데노바이러스 감염 후 LMCD1 결핍에 따른 탁산계 항암제 감수성 변화를 평가한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5(A)는 전이성 유방암 세포에 LMCD1 과발현 모델에서의 상처회복 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 5(B)는 LMCD1 과발현에 따른 이동성 및 침습성 증가를 트랜스웰 및 마트리젤을 통과한 세포의 핵을 염색한 것을 나타낸 것이고, 도 5(C)는 전이성 유방암 세포에 LMCD1 과발현 억제시 이동성 저해 현상을 트랜스웰을 통과한 세포의 핵을 염색한 것을 나타낸 것이고, 도 5(D)는 전이성 유방암 세포에 LMCD1 과발현 시 MCF10CA1a.cl1 및 MDA-MB231에서 표시된 인자들의 RT-PCR 결과를 나타낸 것이고, 도 5(E)는 Oncomine Compendium of Expression Array data에 따른 public data 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 5(F)는 마우스 폐 전이 모델에서 전이성 유방암 주입 후 전이된 폐 조직에서 LMCD1 발현 정도를 면역형광염색으로 나타낸 것이다.
도 6(A)는 LMCD1을 전이성 유방암 세포에 과발현시킨 후 맘모스피어 형성 정도를 분석한 이미지를 나타낸 것이고, 도 6(B)는 전이성 유방암 세포에 LMCD1을 과발현 시킨 후 줄기세포능 마커의 mRNA 변화를 측정한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7(A)는 EPSM 아데노바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염 후 TGF-β 처리에 따른 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 7(B)는 EPSM 아데노바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염 후 TGF-β 처리 군에서 유의하게 변화한 유전자를 나타낸 것이고, 도 7(C)는 EPSM 아데노바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염 후 TGF-β 처리에 따른 Lmcd1 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 7(D)는 EPSM 아데노바이러스를 전이성 유방암 세포에 감염 후 TGF-β 및 TGF-β 억제제인 SB431542 처리에 따른 LMCD1 mRNA 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 7(E)는 Smad3 각 인산화 위치의 인산화 억제에 따른 TGF-β 처리에 의한 LMCD1 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: MTT 분석을 통한 LMCD1 과발현 세포에서의 탁산계 항암제에 대한 저항성 확인
LMCD1 단백질이 과발현하는 유방암 세포가 탁산계 항암제에 대해 저항성을 갖는지 알아보기 위해 인간 MCF-10A-기반 유방암 세포주인 MCF-10CA1a.cl1 및 MDA-MB231에 대해 세포 생존률을 평가할 수 있는 MTT 분석을 수행하였다. 상기 MCF-10CA1a.cl1 및 MDA-MB231 세포주는 전이성이 높은 악성 유방암 세포주로서 특징을 갖는다.
구체적으로 인간 MCF-10A-기반 유방암 세포주인 MCF-10CA1a.cl1 및 MDA-MB231을 CO2 인큐베이터 37℃에서 10% 태아소혈청 및 1% 페니실린/스트렙토미신 (WelGENE)을 함유하는 DMEM 배양액 중에 유지하였다.
세포 내 LMCD1 단백질을 과발현시키기 위해 레트로바이러스 벡터인 pLPCX에 LMCD1을 클로닝하고, Plat-GP 세포를 이용하여 LMCD1 레트로바이러스를 얻었다. 상기 LMCD1 레트로바이러스를 상기 전이성 유방암 세포에 감염시킨 뒤, 퓨로미신으로 LMCD1 단백질 과발현된 세포를 선별한 후, 다시 CO2 인큐베이터 37℃에서 10% 태아소혈청 및 1% 페니실린/스트렙토미신 (WelGENE)을 함유하는 DMEM 배양액 중에 인큐베이션 하였다.
상기 세포를 웰 당 3,000개 세포로 96웰에 파종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양액을 제거하고 탁산계 항암제인 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함한 배양액을 최종 부피 100㎕/웰로 첨가하였다. 72 시간 인큐베이션 후 상기 배양물로부터 배양액을 제거하고, 0.5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 각 웰에 첨가한 후 2시간 동안 인큐베이션 하였다. MTT 용액을 함유하는 PBS를 조심스럽게 제거하고, dimethyl sulfoxide 200㎕를 각 웰에 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션 하였다. 96웰 마이크로 플레이트 검출기 (Molecular Devices)를 사용하여 580 nm 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1(A)에 나타낸 바와 같이 LMCD1 단백질을 과발현시킨 MDA-MB231 세포에서 탁산계 항암제에 대해 저항성이 생겼음을 알 수 있었다. 또한, 도 1(B)에 나타낸 바와 같이 MCF10CA1a.cl1 세포에서도 LMCD1 과발현시 파클리탁셀에 대한 저항성이 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 2: 탁산계 항암제에 대해 저항성을 갖는 세포에서의 LMCD1을 과발현 평가
2-1. 탁산계 항암제 저항성 세포의 제작
탁산계 항암제에 대해 저항성을 갖는 세포에서 LMCD1 단백질이 과발현하는지 여부를 평가하기 위해 탁산계 항암제에 대해 저항성을 갖는 세포를 제작하였다.
구체적으로, 모세포(Parental cell)에 적은 농도 (0.5 nM) 의 파클리탁셀을 처리하고, 생존한 세포를 계대(passaging)하여 늘려가면서 3 내지 4회 반복 처리하였다. 상기 파클리탁셀 반복 처리 과정 후 최종 생존한 세포에 파클리탁셀의 농도를 0.5nM 씩 높여가면서 처리하고 그 후 생존한 세포를 다시 계대하는 과정을 추가 반복하여 IC50 값인 5nM에서도 죽지 않는 파클리탁셀에 저항성을 갖는 세포를 제작하였다.
2-2. 탁산계 항암제 저항성 세포에서의 LMCD1 발현량 평가
탁산계 항암제 저항성 세포에서 LMCD1 발현량을 RT-PCR을 통해 mRNA 수준으로 평가하고, 이를 억제하여 LMCD1 발현량을 감소시키는 경우 탁산계 항암제에 대한 감수성이 회복되는지 여부를 평가하였다.
구체적으로, MCF10CA1a.cl1 세포(M4) 및 실시예 2-1에서 제작된 파클리탁셀 저항성 MCF10CA1a.cl1 세포(M4 PTX)로부터의 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 상기 cDNA를 합성하고 특이적인 프라이머 쌍으로 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 유전자의 mRNA를 GAPDH로 표준화하였다.
또한, 탁산계 항암제에 대한 감수성이 LMCD1 발현량 감소에 따라 회복되는지 여부를 세포 생존률 측면에서 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, 실시예 2-1에서 제작된 파클리탁셀 저항성 MCF10CA1a.cl1 세포를 구입한 LMCD1에 대한 shRNA를 이용하여 293T 세포에 형질주입한 후 LMCD1을 결핍시키기 위한 렌티바이러스를 제조하였다. 상기 렌티바이러스를 유방암세포에 감염시킨 후 퓨로미신으로 선별함으로써 LMCD1이 결핍된 파클리탁셀 저항성 MCF10CA1a.cl1 세포를 생성하였다(PTX-shLmcd1 #1).
그 결과, 도 2(A)에서 확인할 수 있는 바와 같이 파클리탁셀 저항성을 갖는 세포에서 LMCD1 mRNA 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 또한 세포 생존률 측면에서도 2(B)에 나타낸 바와 같이 대조군 (LPCX) 에 비해 LMCD1이 과발현 되거나 파클리탁셀 저항성을 갖는 세포 (PTX)에서 탁산계 약물 민감성이 감소되어 생존률이 비교적 높으나, 파클리탁셀 저항성 세포 (PTX)에 LMCD1을 결핍시켰을 때 (PTX-shLmcd1 #1) 파클리탁셀에 대한 민감성이 다시 증가되었다.
2-3. 인 비보에서 탁산계 항암제 저항성 세포에서의 LMCD1 발현량 평가
탁산계 항암제 저항성을 지닌 개체에서도 LMCD1 발현량이 증가된 것으로 나타나는지 여부를 알아보기 위해 동물 실험을 수행하였다.
구체적으로, 암컷 NOD/SCID 마우스를 Orient Bio Inc. (Seongnam, S. Korea)로부터 얻어, 파클리탁셀-저항성 MDA-MB231 세포 2 x 106개를 암컷 NOD/SCID 마우스의 왼쪽 4번째 유선 지방체에 이식하여 이종이식(xenograft) 모델을 제조하고, 이식 10 주 후, 마우스를 추가 분석을 위해 희생시켰다. 모든 과정은 차병원 동물 실험 위원회(CHA Hospital Animal Care and Use Committee)에 의해 제공된 가이드라인에 따라 수행되었다. 이종이식체의 파라핀 블록을 제작한 후, 4 μM 두께로 잘라 자일렌 및 알코올 중에 파라핀을 제거하였다. 내인성 과산화효소 활성을 및 회수(retrieving) 항원을 차단한 후, 절개물을 37℃에서 1시간 동안 5% BSA를 포함하는 PBS로 블로킹하였다. 상기 절개물을 항-LMCD1 (Abcam)으로 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. Alexa Fluor 488-결합된 염소 항-래빗 IgG를 2차 항체로서 사용하여 1:500로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 상기 절개물을 DAPI (Vector Laboratories)를 포함하는 배양액에 올리고 Confocal Laser Scanning Microscope (LSM-510; Carl Zeiss)로 평가하였다.
그 결과, 도 2C에 나타낸 바와 같이 파클리탁셀 저항성을 지닌 세포에서 유래된 종양에서 대조군에 비해 LMCD1 발현이 증가된 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 파클리탁셀 저항성 세포에서 LMCD1 과발현 및 Smad3 단백질 인산화 억제 확인
3-1. Smad3 인산화 억제 모델 제작
파클리탁셀 저항성 세포에서 LMCD1 과발현과 함께 Smad3 인산화 억제가 나타나는지 확인하기 위해, 도 3에 나타낸 바와 같이 Smad3 인산화 부위에 따른 인산화 억제 모델을 제작하였다. GFP, Smad3 야생형, C-말단 인산화 억제 돌연변이(3SA) smad3 및 연결부 인산화 억제 돌연변이(EPSM) 아데노바이러스는 Dr. Sushil G. Rane (NIDDK, NIH, Bethesda, MD)으로부터 제공받았다. 형질도입 효율을 측정하기 위해 GFP 아데노바이러스를 사용하여 대조군으로 하였다. 세포들을 배양액 중에 75 내지 100 바이러스입자/세포로 형질도입하고, 각 형질도입은 3회 반복하였다.
3-2. 파클리탁셀 저항성 세포에서 LMCD1 발현량 및 Smad3 단백질 인산화 평가
파클리탁셀 저항성 세포에서 LMCD1 과발현과 함께 Smad3 인산화 억제가 나타나는지 확인하기 위해, Smad3 인산화 위치에 따른 파클리탁셀에 대한 저항성을 LMCD1 mRNA 발현량 및 세포 생존률 면에서 평가하였다.
구체적으로, MCF10CA1a.cl1 세포, MDA-MB231 세포 및 실시예 3-1에서 제작된 세포를 웰 당 3,000개 세포로 96웰에 파종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양액을 제거하고 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 포함한 배양액을 최종 부피 100㎕/웰로 첨가하였다. 72 시간 인큐베이션 후 상기 배양물로부터 배양액을 제거하고, 0.5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 각 웰에 첨가한 후 2시간 동안 인큐베이션 하였다. MTT 용액을 함유하는 PBS를 조심스럽게 제거하고, 디메틸 설폭시드 200㎕를 각 웰에 첨가한 후 상온에서 5분 동안 인큐베이션 하였다. 96웰 마이크로 플레이트 검출기 (Molecular Devices)를 사용하여 580 nm 흡광도를 측정하였다.
또한, GFP-바이러스 감염 및 EPSM 바이러스 감염 세포로부터 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하고, 추출된 RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 상기 cDNA를 합성하고 특이적인 프라이머 쌍으로 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 다양한 유전자의 mRNA를 3배수로 측정하고 GAPDH로 표준화하였다.
그 결과, 도 4(A) 및 도 4(C)에서 알 수 있는 바와 같이 Smad3 연결부 인산화가 차단된 경우(EPSM) 대조군에 비해서 세포 생존률이 증가하고, 다른 인산화 부위에 비해서 Smad3 연결부 인산화가 차단되는 경우(특히, EPSM)에만 세포 생존률 증가 정도가 현저한 것으로 나타나 파클리탁셀 저항성이 유발됨을 알 수 있었다. 이는 파클리탁셀 저항성 세포에서 LMCD1이 증가되는 현상과 함께 도 4(B)에서 알 수 있는 바와 같이 Smad3 연결부 인산화가 차단되는 경우 LMCD1 mRNA 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 EPSM 아데노바이러스 감염 세포에서 LMCD1을 결핍시키는 경우 (EPSM-SV-shLmcd1 #1) 다시 파클리탁셀 감수성을 회복하여 Smad3 연결부의 인산화 억제를 통한 LMCD1 발현 증가로 파클리탁셀 저항성 습득 현상이 나타날 수 있음을 의미한다.
따라서 탁산계 약물 저항성 세포에서 LMCD1 과발현과 함께 Smad3 인산화 억제 (특히, Smad3 연결부 인산화 억제)가 나타날 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: LMCD1 과발현에 따른 전이성 증가
4-1. LMCD1 과발현에 의한 유방암세포 전이성 평가
LMCD1이 과발현되는 경우 유방암 세포의 전이성이 증가하는지 평가하기 위해 상처회복 분석(Wound healing assay), 이동성(migration) 및 침윤성(invasion) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 먼저 상처회복 분석을 위해 MCF10CA1a.cl1 세포를 6-웰 플레이트에 파종하고 모든 배양물이 실험에 사용하기에 적합한 콘플루언스에 도달할 때까지 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 피펫의 팁으로 직선의 스크래치를 형성시키고, 세포를 관찰하여 BX43 Clinical (IX51 Inverted) Microscope (Olympus)로 이미지를 수득하였다.
또한 이동성 및 침윤성 분석을 위해 해리된 MCF10CA1a.cl1 세포 (이동성 분석을 위해 5 x 104 개 및 침윤성 분석을 위해 1 x 105 개)를 Transwell 및 Matrigel invasion chamber (BD Biosciences)의 상위 웰 상에 플레이팅하였다. 침윤성 분석을 위하여, 상기 상위 챔버는 0.1% FBS 를 포함하는 DMEM을 함유하였고, 하위 챔버는 10% FBS 를 포함하는 DMEM를 함유하였다. 24시간 인큐베이션 후, 막을 통과하여 이동성한 세포를 70% 에탄올로 고정시키고, 침윤 및 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거한 뒤, 0.05% crystal violet으로 염색하였다. 정량을 위하여 세포를 4개의 무작위 필드에서 현미경으로 이미지화하였고, Image J software를 이용하여 정량하였다. 또한 LMCD1가 결핍된 세포주는 실시예 2-2에서와 같이 LMCD1 결핍을 위한 렌티바이러스를 제작하여 세포주에 감염시켰다.
그 결과, 도 5(A)에 나타낸 바와 같이 LMCD1이 과발현 되는 경우 세포의 이동성이 증가하였고, 도 5(B)에 나타낸 바와 같이 침윤성 또한 증가하는 것으로 나타났고, 이는 LMCD1 발현이 억제되는 경우 다시 이동성 및 침윤성이 감소되는 것으로 나타났다(도 5C). 뿐만 아니라, 본 실시예에 사용된 MCF10CA1a.cl1 세포는 전이성이 높은 악성 유방암 세포주로 알려져 있으므로, 상기 결과에 따르면 MCF10CA1a.cl1 세포와 같은 유방암 세포가 전이성을 갖는데에 LMCD1이 관여함을 알 수 있으므로, 개체의 시료 내 LMCD1 발현량을 측정함으로써 유방암 세포의 성질, 유방암 진행 단계, 치료 후 예후 관찰, 또는 완치 후 전이 및 재발 여부를 모니터링할 수 있음을 알 수 있다.
4-2. 전이성 유방암에서 LMCD1 과발현 여부의 임상 통계적 평가
임상적으로도 전이성 유방암에서 LMCD1이 과발현되는 것으로 나타나는지 여부를 평가하기 위해 public data 분석을 수행하였다. 구체적으로 유방암 및 다른 종류의 암의 LMCD1의 발현 정도에 대해 Oncomine Compendium of Expression Array data (https ://www.oncomine.org)를 이용하여 분석하였다. 분석 수치에 대한 P 값은 0.05로 설정하였다.
그 결과 임상적으로도 인간 유방암에서 LMCD1의 발현이 전이성(침습성) 유방암을 갖는 경우 더욱 증가되어 있는 것을 알 수 있었다 (도 5E).
4-3. 전이성 유방암에서의 Smad3 연결부 인산화 영향력 평가
유방암의 전이성 획득 여부에도 Smad3 연결부 인산화가 영향력을 갖는지 평가하기 위해 EPSM 아데노바이러스 감염에 의한 면역형광염색 분석을 수행하였다.
구체적으로, Orient Bio Inc. (Seongnam, S. Korea)로부터 얻은 암컷 NOD/SCID 마우스에 Smad3 EPSM 아데노바이러스를 감염시킨 MCF10CA1a.cl1 세포를 5 x 105개로 하여 상기 암컷 NOD/SCID 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. 주입 3주 후, 마우스를 내부 장기에 전이가 존재하는지 부검하여 검사하였다. 전이의 현미경 정량화를 폐-횡단 절개(section)상에서 수행하였다. 그 후 NOD/SCID 마우스의 꼬리-정맥을 통해 주입된 GFP 및 EPSM-감염된 MCF10CA1a.cl1 세포가 전이된 폐의 파라핀 블록을 제작하고, 4 μM 두께로 잘라 자일렌 및 알코올 중에 파라핀을 제거하였다. 내인성 과산화효소 활성을 및 회수(retrieving) 항원을 차단한 후, 절개물을 37℃에서 1시간 동안 5% BSA를 포함하는 PBS로 블로킹하였다. 상기 절개물을 항- LMCD1 (Abcam)으로 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. Alexa Fluor 488-결합된 염소 항-래빗 IgG를 2차 항체로서 사용하여 1:500로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 상기 절개물을 DAPI (Vector Laboratories)를 포함하는 배양액에 올리고 Confocal Laser Scanning Microscope (LSM-510; Carl Zeiss)로 평가하였다.
그 결과, 도 5(F)에 나타낸 바와 같이 EPSM 이 감염된 MCF10ca1a.cl1 세포의 의해 전이된 폐 주변에서 LMCD1의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한 특히, 전이성 유방암의 경우 Smad3 연결부 인산화 억제 및 LMCD1 과발현이 동시에 나타날 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: LMCD1 과발현에 의한 하위 발현인자 분석
5-1. LMCD1 과발현에 의한 줄기세포능 마커의 발현 증가
도 6(A)를 참조하면 암줄기세포 유사 특성을 가진 암세포를 관찰할 수 있는 맘모스피어(Mammosphere) 형성 분석을 통해, LMCD1이 과별현 되었을 때 MCF10CA1a.cl1 세포의 암줄기세포능이 상당히 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 LMCD1 과발현과 함께 유방암 세포의 특성(예를 들어, 전이성, 종양형성능 등) 및 특정 약물에 대한 저항성 여부를 평가하는데 하위 분석 마커로 기능할 수 있는 인자로서 암줄기세포능 마커가 선택될 수 있는지 여부를 mRNA 측면에서 평가하였다.
구체적으로, MCF-10CA1a.cl1 및 MDA-MB231 세포를 CO2 인큐베이터 37℃에서 10% 태아소혈청 및 1% 페니실린/스트렙토미신 (WelGENE)을 함유하는 DMEM 배양액 중에 유지하였다.
LMCD1의 과발현은 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
상기 대조군 및 LMCD1를 과발현시킨 세포로부터의 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA로 전환시키고, 상기 cDNA를 합성한 후 Oct4, Nanog 및 Sox2에 특이적인 프라이머 쌍으로 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 다양한 유전자의 mRNA를 3배수로 측정하고 GAPDH로 표준화하였다.
그 결과, 도 6B에서 알 수 있는 바와 같이 LMCD1 과발현에 따라 암줄기세포능 마커인 Oct4, Nanog 및 Sox2의 발현이 유의하게 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, LMCD1 과발현과 함께 유방암 세포의 특성 및 특정 약물에 대한 저항성 여부를 평가하는데 상기 암줄기세포능 마커들이 하위 분석 마커로서 기능할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6: 전이성 또는 탁산계 저항성에 대한 TGF -β 처리에 대한 반응 및 Smad3 인산화 활성
6-1. TGF -β 처리 및 Smad3 연결부 인산화 억제에 따른 세포 내 인자 발현량 변화 분석
TGF-β 처리 및 Smad3 연결부 인산화 억제에 따라 세포 내에서 발현량이 변화하는 인자를 알아보기 위해 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
구체적으로, MCF10CA1a.cl1 세포에 GFP, Smad3 wild-type, 및 Smad3 EPSM 아데노바이러스를 각각 48시간 동안 감염시킨 후, TGF-β (5 ng/ml)을 처리하고 24시간 동안 인큐베이션한 후 DNA 마이크로어레이를 실시하였다.
그 결과, 도 7(A) 및 도 7(B)에 나타낸 바와 같이 TGF-β를 처리하고 Smad3 단백질 인산화를 억제시킨 시료에서 LMCD1이 과발현함을 알 수 있었다.
6-2. TGF -β 처리 및 Smad3 연결부 인산화 억제에 따른 LMCD1 발현량 변화 분석
실시예 6-1의 마이크로어레이 분석에서 TGF-β 처리 및 Smad3 연결부 인산화 억제에 의해 LMCD1가 과발현한 것을 확인하기 위해, Lmcd1 프로모터 분석 및 mRNA 변화를 측정하였다.
구체적으로, Lmcd1 프로모터 분석을 위하여 MCF10CA1a.cl1 세포를 GFP 및 EPSM 아데노바이러스로 이틀 동안 감염시킨 후 FuGENE HD (Promega)를 이용하여 Lmcd1 프로모터로 일시적 형질감염시켰다. 세포를 수확하기 24시간 전에 TGF-β 3 ng/ml로 자극하였다. 루시퍼라제 활성을 Luciferase Assay System kit (Promega)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다. 모든 분석은 3배수(triplicate)로 수행하였고, 모든 수치를 β-갈락토시다제 활성에 대하여 형질감염 효율을 표준화하였다.
LMCD1의 mRNA 측정은 MDA-MB231 세포에서 세포를 GFP 및 EPSM 아데노바이러스로 이틀 동안 감염시킨 후 TGF-β 처리하기 2시간 전에 SB431542 10μM을 전처리(pre-treat)하고, TGF-beta 5 ng/ml을 처리한 후 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포로부터 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 상기 cDNA를 합성하고 특이적인 프라이머 쌍으로 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 유전자의 mRNA를 GAPDH로 표준화하였다.
그 결과, 도 7(C) 및 도 7(D)에 나타낸 바와 같이, TGF-β를 처리하고 Smad3 연결부 인산화를 억제한 경우, LMCD1의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
6-3. Smad3 단백질 인산화 위치에 따른 LMCD1 발현량 변화 분석
실시예 6-2의 LMCD1가 과발현 현상이 Smad3 연결부 인산화 억제에 의한 것인지 확인하기 위하여, Smad3의 각 인산화 부위별 인산화 억제에 따른 LMCD1 mRNA 변화를 측정하였다.
구체적으로, MDA-MB231 세포에 GFP, Smad3 야생형, C-말단 인산화 억제 돌연변이(3SA), smad3 연결부 인산화 활성 돌연변이(STD) 및 연결부 인산화 억제 돌연변이(EPSM) 아데노바이러스는 Dr. Sushil G. Rane (NIDDK, NIH, Bethesda, MD)으로부터 제공받았다. 형질도입 효율을 측정하기 위해 GFP 아데노바이러스를 사용하여 대조군으로 하였다. 세포들을 배양액 중에 75 내지 100 바이러스입자/세포로 이틀 동안 감염시키고, TGF-β 5 ng/ml로 24시간 동안 자극하였다. 상기 세포로부터 총 RNA를 제조사의 지침에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 추출하였다. RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 상기 cDNA를 합성하고 특이적인 프라이머 쌍으로 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co.)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 유전자의 mRNA를 GAPDH로 표준화하였다.
그 결과, 도 7(E)에 나타낸 바와 같이, Smad3 연결부의 인산화가 특이적으로 억제되는 경우 TGF-β 처리에 의한 LMCD1의 과발현 현상이 나타남을 알 수 있었다.
상기 실시예 1 내지 5를 참조하면 세포 내 LMCD1의 발현량이 증가하는 경우 암줄기세포능 또는 전이성 관련 인자들의 발현량이 증가하고, 탁산계 약물 저항성이 증가한다. 또한, 전이성 유방암 및 탁산계 약물 저항성 암에서 LMCD1의 발현량이 증가함을 확인하였고, 실제로 임상 데이터 분석에서도(실시예 4-2) 전이성 유방암에서 LMCD1 발현이 증가해있음을 관찰하였다. 따라서, 개체로부터 분리된 시료 중 세포가 TGF-β에 의해 자극되어 LMCD1을 과발현시키는 경우, 상기 개체는 전이성 또는 탁산계 약물 저항성을 가질 수 있고, 그러한 개체로부터 분리된 시료 중 세포는 동시에 Smad3 단백질 인산화가 억제(특히, Smad3 연결부 인산화가 억제)되어 있는 현상이 함께 관찰될 수 있음을 알 수 있다.
<110> Advanced Institutes of Convergence Technology <120> Diagnosis method of metastatic cancers or the taxanes resistance cancer using LMCD1 protein and a gene encoding the same <130> PN115514 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Lys Val Ala Lys Asp Leu Asn Pro Gly Val Lys Lys Met Ser 1 5 10 15 Leu Gly Gln Leu Gln Ser Ala Arg Gly Val Ala Cys Leu Gly Cys Lys 20 25 30 Gly Thr Cys Ser Gly Phe Glu Pro His Ser Trp Arg Lys Ile Cys Lys 35 40 45 Ser Cys Lys Cys Ser Gln Glu Asp His Cys Leu Thr Ser Asp Leu Glu 50 55 60 Asp Asp Arg Lys Ile Gly Arg Leu Leu Met Asp Ser Lys Tyr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Thr Ala Arg Val Lys Gly Gly Asp Gly Ile Arg Ile Tyr Lys Arg 85 90 95 Asn Arg Met Ile Met Thr Asn Pro Ile Ala Thr Gly Lys Asp Pro Thr 100 105 110 Phe Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Trp Ala Pro Pro Gly Val Thr Gln Lys 115 120 125 Leu Gly Leu Gln Tyr Met Glu Leu Ile Pro Lys Glu Lys Gln Pro Val 130 135 140 Thr Gly Thr Glu Gly Ala Phe Tyr Arg Arg Arg Gln Leu Met His Gln 145 150 155 160 Leu Pro Ile Tyr Asp Gln Asp Pro Ser Arg Cys Arg Gly Leu Leu Glu 165 170 175 Asn Glu Leu Lys Leu Met Glu Glu Phe Val Lys Gln Tyr Lys Ser Glu 180 185 190 Ala Leu Gly Val Gly Glu Val Ala Leu Pro Gly Gln Gly Gly Leu Pro 195 200 205 Lys Glu Glu Gly Lys Gln Gln Glu Lys Pro Glu Gly Ala Glu Thr Thr 210 215 220 Ala Ala Thr Thr Asn Gly Ser Leu Ser Asp Pro Ser Lys Glu Val Glu 225 230 235 240 Tyr Val Cys Glu Leu Cys Lys Gly Ala Ala Pro Pro Asp Ser Pro Val 245 250 255 Val Tyr Ser Asp Arg Ala Gly Tyr Asn Lys Gln Trp His Pro Thr Cys 260 265 270 Phe Val Cys Ala Lys Cys Ser Glu Pro Leu Val Asp Leu Ile Tyr Phe 275 280 285 Trp Lys Asp Gly Ala Pro Trp Cys Gly Arg His Tyr Cys Glu Ser Leu 290 295 300 Arg Pro Arg Cys Ser Gly Cys Asp Glu Ile Ile Phe Ala Glu Asp Tyr 305 310 315 320 Gln Arg Val Glu Asp Leu Ala Trp His Arg Lys His Phe Val Cys Glu 325 330 335 Gly Cys Glu Gln Leu Leu Ser Gly Arg Ala Tyr Ile Val Thr Lys Gly 340 345 350 Gln Leu Leu Cys Pro Thr Cys Ser Lys Ser Lys Arg Ser 355 360 365 <210> 2 <211> 292 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Lys Tyr Ser Thr Leu Thr Ala Arg Val Lys Gly Gly Asp 1 5 10 15 Gly Ile Arg Ile Tyr Lys Arg Asn Arg Met Ile Met Thr Asn Pro Ile 20 25 30 Ala Thr Gly Lys Asp Pro Thr Phe Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Trp Ala 35 40 45 Pro Pro Gly Val Thr Gln Lys Leu Gly Leu Gln Tyr Met Glu Leu Ile 50 55 60 Pro Lys Glu Lys Gln Pro Val Thr Gly Thr Glu Gly Ala Phe Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gln Leu Met His Gln Leu Pro Ile Tyr Asp Gln Asp Pro Ser 85 90 95 Arg Cys Arg Gly Leu Leu Glu Asn Glu Leu Lys Leu Met Glu Glu Phe 100 105 110 Val Lys Gln Tyr Lys Ser Glu Ala Leu Gly Val Gly Glu Val Ala Leu 115 120 125 Pro Gly Gln Gly Gly Leu Pro Lys Glu Glu Gly Lys Gln Gln Glu Lys 130 135 140 Pro Glu Gly Ala Glu Thr Thr Ala Ala Thr Thr Asn Gly Ser Leu Ser 145 150 155 160 Asp Pro Ser Lys Glu Val Glu Tyr Val Cys Glu Leu Cys Lys Gly Ala 165 170 175 Ala Pro Pro Asp Ser Pro Val Val Tyr Ser Asp Arg Ala Gly Tyr Asn 180 185 190 Lys Gln Trp His Pro Thr Cys Phe Val Cys Ala Lys Cys Ser Glu Pro 195 200 205 Leu Val Asp Leu Ile Tyr Phe Trp Lys Asp Gly Ala Pro Trp Cys Gly 210 215 220 Arg His Tyr Cys Glu Ser Leu Arg Pro Arg Cys Ser Gly Cys Asp Glu 225 230 235 240 Ile Ile Phe Ala Glu Asp Tyr Gln Arg Val Glu Asp Leu Ala Trp His 245 250 255 Arg Lys His Phe Val Cys Glu Gly Cys Glu Gln Leu Leu Ser Gly Arg 260 265 270 Ala Tyr Ile Val Thr Lys Gly Gln Leu Leu Cys Pro Thr Cys Ser Lys 275 280 285 Ser Lys Arg Ser 290 <210> 3 <211> 253 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Phe Gly Met Gln Gly Asp Val Phe Gly Leu Arg Ala Thr Phe Met 1 5 10 15 Glu Gly Leu Gln Tyr Met Glu Leu Ile Pro Lys Glu Lys Gln Pro Val 20 25 30 Thr Gly Thr Glu Gly Ala Phe Tyr Arg Arg Arg Gln Leu Met His Gln 35 40 45 Leu Pro Ile Tyr Asp Gln Asp Pro Ser Arg Cys Arg Gly Leu Leu Glu 50 55 60 Asn Glu Leu Lys Leu Met Glu Glu Phe Val Lys Gln Tyr Lys Ser Glu 65 70 75 80 Ala Leu Gly Val Gly Glu Val Ala Leu Pro Gly Gln Gly Gly Leu Pro 85 90 95 Lys Glu Glu Gly Lys Gln Gln Glu Lys Pro Glu Gly Ala Glu Thr Thr 100 105 110 Ala Ala Thr Thr Asn Gly Ser Leu Ser Asp Pro Ser Lys Glu Val Glu 115 120 125 Tyr Val Cys Glu Leu Cys Lys Gly Ala Ala Pro Pro Asp Ser Pro Val 130 135 140 Val Tyr Ser Asp Arg Ala Gly Tyr Asn Lys Gln Trp His Pro Thr Cys 145 150 155 160 Phe Val Cys Ala Lys Cys Ser Glu Pro Leu Val Asp Leu Ile Tyr Phe 165 170 175 Trp Lys Asp Gly Ala Pro Trp Cys Gly Arg His Tyr Cys Glu Ser Leu 180 185 190 Arg Pro Arg Cys Ser Gly Cys Asp Glu Ile Ile Phe Ala Glu Asp Tyr 195 200 205 Gln Arg Val Glu Asp Leu Ala Trp His Arg Lys His Phe Val Cys Glu 210 215 220 Gly Cys Glu Gln Leu Leu Ser Gly Arg Ala Tyr Ile Val Thr Lys Gly 225 230 235 240 Gln Leu Leu Cys Pro Thr Cys Ser Lys Ser Lys Arg Ser 245 250 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Lys Val Ala Lys Asp Leu Asn Pro Gly Val Lys Lys Met Ser 1 5 10 15 Leu Gly Gln Leu Gln Ser Ala Arg Gly Val Ala Cys Leu Gly Cys Lys 20 25 30 Gly Thr Cys Ser Gly Phe Glu Pro His Ser Trp Arg Lys Ile Cys Lys 35 40 45 Ser Cys Lys Cys Ser Gln Glu Asp His Cys Leu Thr Ser Asp Leu Glu 50 55 60 Asp Asp Arg Lys Ile Gly Arg Leu Leu Met Asp Ser Lys Tyr Ser Thr 65 70 75 80 Leu Thr Ala Arg Val Lys Gly Gly Asp Gly Ile Arg Ile Tyr Lys Arg 85 90 95 Asn Arg Met Ile Met Thr Asn Pro Ile Ala Thr Gly Lys Asp Pro Thr 100 105 110 Phe Asp Thr Ile Thr Tyr Glu Trp Ala Pro Pro Gly Val Thr Gln Lys 115 120 125 Leu Gly Leu Gln Tyr Met Glu Leu Ile Pro Lys Glu Lys Gln Pro Val 130 135 140 Thr Gly Thr Glu Gly Ala Phe Tyr Arg Arg Arg Gln Leu Met His Gln 145 150 155 160 Leu Pro Ile Tyr Asp Gln Asp Pro Ser Arg Cys Arg Gly Leu Leu Glu 165 170 175 Asn Glu Leu Lys Leu Met Glu Glu Phe Val Lys Gln Tyr Lys Ser Glu 180 185 190 Ala Leu Gly Val Gly Glu Val Ala Leu Pro Gly Gln Gly Gly Leu Pro 195 200 205 Lys Glu Glu Gly Lys Gln Gln Glu Lys Pro Glu Gly Ala Glu Thr Thr 210 215 220 Ala Ala Thr Thr Asn Gly Ser Leu Ser Asp Pro Ser Lys Glu Val Glu 225 230 235 240 Tyr Lys Pro Val Pro Leu Val 245 <210> 5 <211> 1757 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 agctgcgcct ggctgcgcac agagctccct cccaggcccg cgaacttggc cattcagccg 60 ccgctgtccc cgctgcgcgc cctcgcgcct ctgcctgaga agccaggcgc tgttccccca 120 ccccagaaga ggatggcaaa ggtggctaag gacctcaacc caggagttaa aaagatgtcc 180 ctgggccagc tgcagtcagc aagaggtgtg gcatgtttgg gatgcaaggg gacgtgttcg 240 ggcttcgagc cacattcatg gaggaaaata tgcaagtctt gcaaatgcag ccaagaggac 300 cactgcctaa catctgacct agaagacgat cggaaaattg gccgcttgct gatggactcc 360 aagtattcca ccctcactgc tcgggtgaaa ggcggggacg gcatccggat ttacaagagg 420 aaccggatga tcatgaccaa ccctattgct actgggaaag atcccacttt tgacaccatc 480 acctacgagt gggctccccc tggagtcacc cagaaactgg gactgcagta catggagctc 540 atccccaagg agaagcagcc agtgacaggc acagagggtg ccttttaccg ccgccgccag 600 ctcatgcacc agctccccat ctatgaccag gatccctcgc gctgccgtgg acttttggag 660 aatgagttga aactgatgga agaatttgtc aagcaatata agagcgaggc cctcggcgtg 720 ggagaagtgg ccctcccggg gcagggtggc ttgcccaagg aggaggggaa gcagcaggaa 780 aagccagagg gggcagagac cactgctgct accaccaacg gcagtctcag tgacccgtcc 840 aaagaagtgg aatacgtctg cgagctctgc aagggagcgg cccctcctga cagccccgtg 900 gtctactcgg acagggcagg ctacaacaag cagtggcacc ccacctgctt tgtgtgtgcc 960 aagtgctccg agccgctggt ggacctcatc tacttctgga aggatggtgc accctggtgc 1020 ggccgccatt actgcgagag tctgcggccc cggtgctccg gctgcgatga gataatattc 1080 gctgaggact accagcgtgt ggaagatctg gcctggcacc gaaagcactt tgtctgtgag 1140 ggttgtgagc agctgctgag cggccgggcg tacatcgtca ccaagggtca gcttctgtgc 1200 ccaacttgca gcaagtccaa acgctcctga agggctgccc acccacagcc agaatccaca 1260 ggatcccacc gagaaggaga gccaggtgtg ccgagaccat cctaagggtc cgatgtgaca 1320 gcaagcaagt gaaataaaca atgatttgct tttcagtgag aatatatata tgagatatat 1380 atagatatat attctaggtt gggtggtggt agatccttga gggtcagtag tttcaaaacc 1440 aaaaatattc taagaagtct taggatggag ttccttttct ttctgttgtt gtttcccagc 1500 tacaaccaac taaagacaca aatggcgttc tgcaagggga ctctgggagg agttttccag 1560 aatgcaattc cgagtgagca aatcgcatag ctgtagaatg tgcgtgcttt tttgtggaca 1620 caggagctcc tccaggagca ggctgggatc ccaactatcg cttgttgcct ctttttcaag 1680 tggaatttga attttaaata aacaactttt tttggcatga taaacagatc aataaaagtt 1740 ttgtgaattc cacatac 1757 <210> 6 <211> 1668 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agctgcgcct ggctgcgcac agagctccct cccaggcccg cgaacttggc cattcagccg 60 ccgctgtccc cgctgcgcgc cctcgcgcct ctgcctgaga agccaggcgc tgttccccca 120 ccccagaaga ggatggcaaa ggtggctaag gacctcaacc caggagttaa aaaggaaaat 180 atgcaagtct tgcaaatgca gccaagagga ccactgccta acatctgacc tagaagacga 240 tcggaaaatt ggccgcttgc tgatggactc caagtattcc accctcactg ctcgggtgaa 300 aggcggggac ggcatccgga tttacaagag gaaccggatg atcatgacca accctattgc 360 tactgggaaa gatcccactt ttgacaccat cacctacgag tgggctcccc ctggagtcac 420 ccagaaactg ggactgcagt acatggagct catccccaag gagaagcagc cagtgacagg 480 cacagagggt gccttttacc gccgccgcca gctcatgcac cagctcccca tctatgacca 540 ggatccctcg cgctgccgtg gacttttgga gaatgagttg aaactgatgg aagaatttgt 600 caagcaatat aagagcgagg ccctcggcgt gggagaagtg gccctcccgg ggcagggtgg 660 cttgcccaag gaggagggga agcagcagga aaagccagag ggggcagaga ccactgctgc 720 taccaccaac ggcagtctca gtgacccgtc caaagaagtg gaatacgtct gcgagctctg 780 caagggagcg gcccctcctg acagccccgt ggtctactcg gacagggcag gctacaacaa 840 gcagtggcac cccacctgct ttgtgtgtgc caagtgctcc gagccgctgg tggacctcat 900 ctacttctgg aaggatggtg caccctggtg cggccgccat tactgcgaga gtctgcggcc 960 ccggtgctcc ggctgcgatg agataatatt cgctgaggac taccagcgtg tggaagatct 1020 ggcctggcac cgaaagcact ttgtctgtga gggttgtgag cagctgctga gcggccgggc 1080 gtacatcgtc accaagggtc agcttctgtg cccaacttgc agcaagtcca aacgctcctg 1140 aagggctgcc cacccacagc cagaatccac aggatcccac cgagaaggag agccaggtgt 1200 gccgagacca tcctaagggt ccgatgtgac agcaagcaag tgaaataaac aatgatttgc 1260 ttttcagtga gaatatatat atgagatata tatagatata tattctaggt tgggtggtgg 1320 tagatccttg agggtcagta gtttcaaaac caaaaatatt ctaagaagtc ttaggatgga 1380 gttccttttc tttctgttgt tgtttcccag ctacaaccaa ctaaagacac aaatggcgtt 1440 ctgcaagggg actctgggag gagttttcca gaatgcaatt ccgagtgagc aaatcgcata 1500 gctgtagaat gtgcgtgctt ttttgtggac acaggagctc ctccaggagc aggctgggat 1560 cccaactatc gcttgttgcc tctttttcaa gtggaatttg aattttaaat aaacaacttt 1620 ttttggcatg ataaacagat caataaaagt tttgtgaatt ccacatac 1668 <210> 7 <211> 1501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agctgcgcct ggctgcgcac agagctccct cccaggcccg cgaacttggc cattcagccg 60 ccgctgtccc cgctgcgcgc cctcgcgcct ctgcctgaga agccaggcgc tgttccccca 120 ccccagaaga ggatggcaaa ggtggctaag gacctcaacc caggagttaa aaagatgtcc 180 ctgggccagc tgcagtcagc aagaggtgtg gcatgtttgg gatgcaaggg gacgtgttcg 240 ggcttcgagc cacattcatg gagggactgc agtacatgga gctcatcccc aaggagaagc 300 agccagtgac aggcacagag ggtgcctttt accgccgccg ccagctcatg caccagctcc 360 ccatctatga ccaggatccc tcgcgctgcc gtggactttt ggagaatgag ttgaaactga 420 tggaagaatt tgtcaagcaa tataagagcg aggccctcgg cgtgggagaa gtggccctcc 480 cggggcaggg tggcttgccc aaggaggagg ggaagcagca ggaaaagcca gagggggcag 540 agaccactgc tgctaccacc aacggcagtc tcagtgaccc gtccaaagaa gtggaatacg 600 tctgcgagct ctgcaaggga gcggcccctc ctgacagccc cgtggtctac tcggacaggg 660 caggctacaa caagcagtgg caccccacct gctttgtgtg tgccaagtgc tccgagccgc 720 tggtggacct catctacttc tggaaggatg gtgcaccctg gtgcggccgc cattactgcg 780 agagtctgcg gccccggtgc tccggctgcg atgagataat attcgctgag gactaccagc 840 gtgtggaaga tctggcctgg caccgaaagc actttgtctg tgagggttgt gagcagctgc 900 tgagcggccg ggcgtacatc gtcaccaagg gtcagcttct gtgcccaact tgcagcaagt 960 ccaaacgctc ctgaagggct gcccacccac agccagaatc cacaggatcc caccgagaag 1020 gagagccagg tgtgccgaga ccatcctaag ggtccgatgt gacagcaagc aagtgaaata 1080 aacaatgatt tgcttttcag tgagaatata tatatgagat atatatagat atatattcta 1140 ggttgggtgg tggtagatcc ttgagggtca gtagtttcaa aaccaaaaat attctaagaa 1200 gtcttaggat ggagttcctt ttctttctgt tgttgtttcc cagctacaac caactaaaga 1260 cacaaatggc gttctgcaag gggactctgg gaggagtttt ccagaatgca attccgagtg 1320 agcaaatcgc atagctgtag aatgtgcgtg cttttttgtg gacacaggag ctcctccagg 1380 agcaggctgg gatcccaact atcgcttgtt gcctcttttt caagtggaat ttgaatttta 1440 aataaacaac tttttttggc atgataaaca gatcaataaa agttttgtga attccacata 1500 c 1501 <210> 8 <211> 2261 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agctgcgcct ggctgcgcac agagctccct cccaggcccg cgaacttggc cattcagccg 60 ccgctgtccc cgctgcgcgc cctcgcgcct ctgcctgaga agccaggcgc tgttccccca 120 ccccagaaga ggatggcaaa ggtggctaag gacctcaacc caggagttaa aaagatgtcc 180 ctgggccagc tgcagtcagc aagaggtgtg gcatgtttgg gatgcaaggg gacgtgttcg 240 ggcttcgagc cacattcatg gaggaaaata tgcaagtctt gcaaatgcag ccaagaggac 300 cactgcctaa catctgacct agaagacgat cggaaaattg gccgcttgct gatggactcc 360 aagtattcca ccctcactgc tcgggtgaaa ggcggggacg gcatccggat ttacaagagg 420 aaccggatga tcatgaccaa ccctattgct actgggaaag atcccacttt tgacaccatc 480 acctacgagt gggctccccc tggagtcacc cagaaactgg gactgcagta catggagctc 540 atccccaagg agaagcagcc agtgacaggc acagagggtg ccttttaccg ccgccgccag 600 ctcatgcacc agctccccat ctatgaccag gatccctcgc gctgccgtgg acttttggag 660 aatgagttga aactgatgga agaatttgtc aagcaatata agagcgaggc cctcggcgtg 720 ggagaagtgg ccctcccggg gcagggtggc ttgcccaagg aggaggggaa gcagcaggaa 780 aagccagagg gggcagagac cactgctgct accaccaacg gcagtctcag tgacccgtcc 840 aaagaagtgg aatacaagcc agtcccactc gtgtgataac ccattaatct attaagccat 900 aagtggatta atccattcct gaggacctga gccctcacga cccaatcatc tcttaaaggc 960 cccacctctc aatactgcca tgcagaggat tatgtttcaa cctgagtgtt tggaggggat 1020 gttcaaccca taggaagtgg cagtgtggaa gaagtgctgc tgaggagtga gtcactgggg 1080 gccattttga gaaaacagaa aggagaagcc agagttgggg agatgaaagc ctcatggctt 1140 ggtttgtctt aaactgcccc acagaaggcg aaaggaatgc ttgaggctgg accacgtggg 1200 tctagcgtgt actgcgtttc tggtccccag cccctgtttt accttttgct cctcctgccc 1260 catcaaccaa gtgtcttcat ttgtttctat ggcaattaac ttttggagat agaagtccca 1320 gcacacgaga tccccaagca cattatctac cttgctgaac aggctggcag tcacacatga 1380 gccaggcgac ccagggaaat gccagcccaa acaaagctgc tgccacatcc agagagggcc 1440 ggactctttc tcccttgtag tcactcaagc taatcatcca aaacctgcat cctccatctc 1500 caagccccat cttattagca ccatctggga ttgccaacca agaaactgtt ttatctgaga 1560 actctaagac caaagaacaa gatttatttc ctctactaca gatttggcag tgacgcataa 1620 aaggcccatt tctcaggaag aatacatgtc ctaaggatgt aaaaaagaaa aaaatattag 1680 atctagttac catggtctat aaactggtct tttcccgccc caccctgatc ctggcttctg 1740 tccaccctca aatagctgtt tgttcataaa ccctaaatac tagataattc taagttggaa 1800 ggagacctct aagtcactgt agcatttcca aatcgccatt cccaagagac atgtggatct 1860 gacatcgtgt tttattcttg actgagcctc gcatatttgt tctgtgtgga acaaaggcaa 1920 aggcagccca agaacccggg tccttgccta cagtcagctt taggaaatga ttgtgaactt 1980 gggaagcatt taaatagcaa tactagacag taaatggaaa aggccaaagt cagaaaataa 2040 gtagggattc caaaggaagc ctttattggt tgggctaggc tgggctagct gtggaagata 2100 gacttctatg tccctgcccc aaccacaatt ttactttaat tattatgtaa ttagtgaatc 2160 gatgtctgtc accgtctgta gatgctgagg tcttgttcat ctctttattt gcattgatat 2220 acatagccat tgctcaataa atatgtgacc catgaaaaaa a 2261 <210> 9 <211> 425 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Ile Val Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Lys Lys Gly Glu Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Val Lys Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Gln Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln Asn Val Asn Thr Lys Cys 50 55 60 Ile Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg 65 70 75 80 Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp 85 90 95 Leu His Ser His His Glu Leu Arg Ala Met Glu Leu Cys Glu Phe Ala 100 105 110 Phe Asn Met Lys Lys Asp Glu Val Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln 115 120 125 Arg Val Glu Thr Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro Arg His Thr 130 135 140 Glu Ile Pro Ala Glu Phe Pro Pro Leu Asp Asp Tyr Ser His Ser Ile 145 150 155 160 Pro Glu Asn Thr Asn Phe Pro Ala Gly Ile Glu Pro Gln Ser Asn Ile 165 170 175 Pro Glu Thr Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Glu Asp Gly Glu Thr Ser 180 185 190 Asp His Gln Met Asn His Ser Met Asp Ala Gly Ser Pro Asn Leu Ser 195 200 205 Pro Asn Pro Met Ser Pro Ala His Asn Asn Leu Asp Leu Gln Pro Val 210 215 220 Thr Tyr Cys Glu Pro Ala Phe Trp Cys Ser Ile Ser Tyr Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Asn Gln Arg Val Gly Glu Thr Phe His Ala Ser Gln Pro Ser Met Thr 245 250 255 Val Asp Gly Phe Thr Asp Pro Ser Asn Ser Glu Arg Phe Cys Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ser Asn Val Asn Arg Asn Ala Ala Val Glu Leu Thr Arg Arg 275 280 285 His Ile Gly Arg Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Glu Val Phe 290 295 300 Ala Glu Cys Leu Ser Asp Ser Ala Ile Phe Val Gln Ser Pro Asn Cys 305 310 315 320 Asn Gln Arg Tyr Gly Trp His Pro Ala Thr Val Cys Lys Ile Pro Pro 325 330 335 Gly Cys Asn Leu Lys Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu 340 345 350 Ala Gln Ser Val Asn Gln Gly Phe Glu Ala Val Tyr Gln Leu Thr Arg 355 360 365 Met Cys Thr Ile Arg Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr 370 375 380 Arg Arg Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Gly Pro Leu Gln Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Ile Arg Cys Ser Ser Val Ser 420 425

Claims (21)

  1. 개체로부터 분리된 시료 중 LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계;
    상기 시료로부터 측정된 발현양을 대조군으로부터 측정된 발현양과 비교하는 단계; 및
    상기 시료로부터 측정된 발현양이 상기 대조군으로부터 측정된 발현양 보다 높은 경우 상기 개체가 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    상기 암은 유방암인 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 LMCD1 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 LMCD1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 LMCD1의 발현양을 측정하는 단계 전에 상기 개체로부터 분리된 시료를 TGF-β에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 3에 있어서, 상기 방법은 Smad3 연결부(Smad3 linker)의 인산화에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 Smad3 연결부의 인산화 정도를 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 Smad3 연결부(Smad3 linker)는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 143번 내지 230번의 아미노산 잔기인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 인산화는 Smad3 연결부의 아미노산 서열인 서열번호 9의 아미노산 서열 중 179번, 204번, 208번 및 213번으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기의 인산화인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 분리된 시료 중 암줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 암줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 형성되는 복합체로부터 암줄기세포능 마커의 발현양을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법으로서,
    상기 암줄기세포능 마커는 Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM) 또는 이들의 조합인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 발현양의 측정은 RT-PCR, RNase 보호분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 발현양의 측정은 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. LMCD1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 LMCD1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 조성물로서,
    상기 조성물은 대조군 대비 증가된 LMCD1 발현양을 검출하기 위한 것이고,
    상기 암은 유방암인 것인 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 LMCD1 단백질은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 LMCD1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 내지 8 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 TGF-β를 더 포함하는 조성물.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 Smad3 연결부의 인산화에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 Smad3 연결부는 서열번호 9의 아미노산 서열 중 143번 내지 230번의 아미노산 잔기인 조성물.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 인산화는 Smad3 연결부의 아미노산 서열인 서열번호 9의 아미노산 서열 중 179번, 204번, 208번 및 213번으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기의 인산화인 조성물.
  18. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 암줄기세포능 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 암줄기세포능 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 조성물로서,
    상기 암줄기세포능 마커는 Oct4, Nanog, Sox2, CD44, CD24, ALDH1, CD326 (EpCAM) 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 청구항 12 내지 18 중 어느 하나의 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 암 또는 탁산 계열 약물 저항성 암 진단용 키트로서,
    상기 암은 유방암인 것인 키트.
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