KR101849329B1 - Ｒｐｅ 세포의 개선된 생산 방법 및 ｒｐｅ 세포의 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 인간 다능성(pluripotent) 줄기 세포로부터 RPE 세포를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 인간 중복성(multipotent) 또는 다능성 줄기 세포로부터 유래된 인간 망막 색소 상피 세포에 관한 것이다. 배아 줄기 세포로부터 유래된 hRPE 세포는 성체 및 태아-유래 RPE 세포와 분자적으로 다르고, 또한 배아 줄기 세포와도 다르다. 본원에 기술된 hRPE 세포는 망막 변성 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

ＲＰＥ 세포의 개선된 생산 방법 및 ＲＰＥ 세포의 조성물{IMPROVED METHODS OF PRODUCING RPE CELLS AND COMPOSITIONS OF RPE CELLS}

관련 출원

본 출원은 미국 특허 가출원 번호 60/998,766 (2007년 10월 12일 출원), 60/998,668 (2007년 10월 12일 출원), 61/009,908 (2008년 1월 2일 출원), 및 61/009,911 (2008년 1월 2일 출원)을 우선권으로 청구한다. 상기 출원들 각각의 개시내용은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

배경 기술

망막 색소 상피 (RPE)는 감각신경 망막 바로 바깥쪽의 색소 세포층이다. 이러한 세포층은 망막 시각 세포에 영양을 공급하고, 하부의 맥락막 (망막 뒤쪽의 혈관들의 층) 및 상부의 망막 시각 세포에 부착된다. RPE는 어떠한 영양소가 맥락막으로부터 망막에 도달하는지를 결정하는 여과기로서 작용한다. 추가적으로, RPE는 망막과 맥락막 사이의 절연을 제공한다. RPE의 파괴는 망막의 대사를 방해하여, 망막이 얇아지는 것을 야기한다. 망막이 얇아지는 것에는 심각한 결과가 있을 수 있다. 예를 들어, 망막이 얇아지는 것은 "건성" 황반 변성을 야기할 수 있고, 또한 부적절한 혈관 형성에 이를 수 있으며, 이는 "습성" 황반 변성을 야기할 수 있다.

시각적 및 망막 건강을 유지하는 것에서의 RPE의 중요성을 고려하여, RPE를 연구하는 것 및 RPE 세포를 시험관 내에서 생산하기 위한 방법을 개발하는 것에서의 상당한 노력이 있었다. 시험관 내에서 생산된 RPE 세포는 RPE의 발달을 연구하는데, RPE가 파괴되도록 하는 인자를 확인하는데, 또는 내인성 RPE 세포의 복구를 자극하는데 사용될 수 있는 작용제를 확인하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 시험관 내에서 생산된 RPE 세포 자체가 환자의 손상된 RPE 세포 모두 또는 이의 일부분을 대체하거나 복원시키기 위한 치료법으로 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 사용되는 경우, RPE 세포는 황반 변성, 뿐만 아니라 RPE에 대한 손상에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 야기된 기타 질환 및 병태를 치료하기 위한 접근법을 제공할 수 있다.

시험관 내에서 생산된 RPE 세포의 스크리닝을 위한 또는 치료제로서의 용도는 조직적이고 지향성인 방식으로 다수의 RPE 세포를 생산하는데 사용될 수 있는 방법에 의존한다. 이같은 조직적인 분화 방법은 형질전환된 세포주 또는 기타 공급원으로부터의 RPE 세포의 자발적인 분화를 예를 들어 기초로 하는 기존의 계획에 비해 상당한 장점을 제공할 것이다.

발명의 개요

본 발명은 인간 다능성(pluripotent) 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포 및 인간-유도 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 스크리닝 분석법에서, RPE의 기본적인 생물학을 연구하기 위해, 그리고 치료법으로서 사용하기 위한 다수의 분화된 RPE 세포를 생산하는데 사용된다. 본원에서 기술된 바와 같이, 이러한 접근법을 사용하여 다능성 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포는 인간 배아 줄기 세포, 뿐만 아니라 성체 및 태아-유래 RPE 세포와 분자적으로 다르다.

본 발명은 인간 다능성 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포의 제제 및 제약 제제를 또한 제공한다. 이같은 RPE 세포 제제는 인간 배아 줄기 세포, 뿐만 아니라 성체 및 태아-유래 RPE 세포와 분자적으로 다르다.

본 발명은 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포의 상세한 분자적 특성화를 최초로 제공한다. 상세한 특성화에는 기타 공급원으로부터 유래된 RPE 세포 (예를 들어, 성체 RPE 세포 및 태아 RPE 세포)에 대한, 뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포에 대한 비교를 포함한다. 이러한 분석은 RPE 세포의 더 깊은 이해를 제공할 뿐만 아니라, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포가 이러한 세포를 기존에 기술된 RPE 세포와 구별시키는 별개의 분자적 성질을 지닌다는 것을 또한 드러낸다.

본 발명은 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제가 포함되는 RPE 세포의 제제를 제공한다. 예시적인 RPE 세포는 인간 다능성 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 분화된다. 망막 변성 질환을 치료하도록 인간 다능성 줄기 세포-유래 RPE 세포가 제형되어 사용될 수 있다. 추가적으로, 인간 다능성 줄기 세포-유래 RPE 세포는 RPE 세포 생존 (시험관내 및/또는 생체내)을 조정하는 작용제를 확인하기 위한, RPE 세포 성숙을 연구하기 위한, 또는 RPE 세포 성숙을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 분석법에서 사용될 수 있다. 이같은 스크리닝 분석법을 사용하여 확인된 작용제는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 사용될 수 있고, 망막 변성 질환을 치료하기 위해 단독으로 또는 RPE 세포와 조합되어 사용될 수 있는 추가적인 치료법을 제공할 수 있다.

본 발명은 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터의 RPE 세포의 생산을 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 분화된 RPE 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 임의적으로, 착색 수준에 의해 평가되는, 분화된 RPE 세포의 성숙 수준이 분화된 RPE 세포, 성숙한 RPE 세포, 또는 이들의 혼합물이 생산되도록 조정될 수 있다. 눈 장애의 치료를 위한 개선된 방법이 또한 제공된다. 특히, 이러한 방법은 눈 장애, 특히 내인성 RPE 층에 대한 손상 또는 이의 파손에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 야기되거나 악화된 눈 장애의 증상을 치료하거나 완화시키기 위해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 사용하는 것을 수반한다.

특정 양상에서, 본 발명은 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 배양물을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 배양물은 적어도 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99％ 초과의 분화된 RPE 세포를 함유하는 실질적으로 정제된 배양물이다 (성숙도 수준과 상관없이, 배양물의 적어도 75％가 분화된 RPE 세포이다). 특정 실시양태에서, 실질적으로 정제된 배양물은 적어도 30％, 35％, 40％ 또는 45％의 성숙한 분화된 RPE 세포를 함유한다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 정제된 배양물은 적어도 50％의 성숙한 분화된 RPE 세포를 함유한다. 또다른 실시양태에서, 실질적으로 정제된 배양물은 적어도 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 99％ 초과의 성숙한 분화된 RPE 세포를 함유한다. 특정 실시양태에서, 분화된 RPE 세포는 인간 배아 줄기 세포, 인간 iPS 세포, 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된다.

특정 실시양태에서, 하기의 단계들을 포함하는 방법이 제공된다:

a) 인간 배아 줄기 세포를 제공하는 단계;

b) 무혈청 B-27 보충물을 임의적으로 함유하는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 배아체(embryoid body)로서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계;

c) 무혈청 B-27 보충물을 임의적으로 함유하는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 부착 배양물로서 배아체를 배양하는 단계;

d) 무혈청 B-27 보충물을 함유하지 않는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 (c)의 세포의 부착 배양물을 배양하는 단계;

e) (d)의 세포를 고밀도 체세포 배양물의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 배양함으로써, RPE 세포가 세포의 배양물 내에 출현하는 단계;

f) (e)의 배양물을 효소와 접촉시키는 단계;

g) 배양물로부터 RPE 세포를 선별하고, RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지를 함유하는 별도의 배양물로 옮겨서, RPE 세포의 강화된 배양물을 생산하는 단계; 및

h) RPE 세포의 강화된 배양물을 증식시켜, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 생산하는 단계.

또다른 특정 양상에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 성숙한 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 생산하는 방법을 제공한다:

a) 인간 배아 줄기 세포를 제공하는 단계;

b) 무혈청 B-27 보충물을 임의적으로 함유하는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 배아체로서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계;

c) 무혈청 B-27 보충물을 임의적으로 함유하는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 부착 배양물로서 배아체를 배양하는 단계;

d) 무혈청 B-27 보충물을 함유하지 않는, 영양소가 풍부한 저단백질 배지에서 단계 (c)의 세포의 부착 배양물을 배양하는 단계;

e) (d)의 세포를 고밀도 체세포 배양물의 성장을 지지할 수 있는 배지에서 배양함으로써, RPE 세포가 세포의 배양물 내에 출현하는 단계;

f) (e)의 배양물을 효소와 접촉시키는 단계;

g) 배양물로부터 RPE 세포를 선별하고, RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지를 함유하는 별도의 배양물로 옮겨서, RPE 세포의 강화된 배양물을 생산하는 단계;

h) RPE 세포의 강화된 배양물을 증식시키는 단계; 및

i) RPE 세포의 강화된 배양물을 배양하여, 성숙한 RPE 세포를 생산하는 단계.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물은 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포 양쪽 모두를 함유할 수 있다. 성숙한 RPE 세포들 중에서, 색소 수준이 다를 수 있다. 그러나, 성숙한 RPE 세포는 증가된 착색 수준 및 더욱 원주형인 형상을 기초로 RPE 세포로부터 시각적으로 구별될 수 있다.

특정 실시양태에서, 배양물의 밀도를 감소시킴으로써 배양물 내의 성숙한 분화된 RPE 세포의 백분율이 감소될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 더 작은 백분율의 성숙한 RPE 세포를 함유하는 배양물을 생산하기 위해 성숙한 RPE 세포의 집단을 하위배양하는 단계를 방법이 더 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 세포를 배아체로서 배양할 때 사용되는 배지는 세포를 배아체로서 배양하는데 적절한 임의의 배지로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 시판 배지 또는 특허 배지 중에서 선택할 수 있다. 고밀도 배양물을 지지할 수 있는 임의의 배지, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 진핵생물 세포 배양을 위한 배지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 배지는 고영양소, 무단백질 배지, 또는 고영양소, 저단백질 배지일 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포가 MDBK-GM, OptiPro SFM, VP-SFM, EGM-2, 또는 MDBK-MM에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 배지는 B-27 보충물을 또한 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에 기술된 배지에 하나 이상의 성장 인자가 또한 보충될 수 있다. 사용될 수 있는 성장 인자에는, 예를 들어, EGF, bFGF, VEGF 및 재조합 인슐린-유사 성장 인자가 포함된다. 배지는 헤파린, 하이드로코르티손, 아스코르브산, 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청), 또는 성장 매트릭스 (예를 들어, 소 각막 상피로부터의 세포외 매트릭스, 매트리젤(matrigel) (BD biosciences), 또는 젤라틴)와 같은 보충물을 또한 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 기계적 또는 효소적 방법이 배아체의 배양물 내의 비-RPE 세포의 클러스터로부터 RPE 세포를 선별하기 위해, 또는 부착성 세포의 하위-배양을 용이하게 하기 위해 사용된다. 예시적인 기계적 방법에는 파이펫으로의 혼화(tituration) 또는 풀링(pulling)된 바늘로의 절단이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 효소적인 방법에는 세포를 해리시키는데 적절한 임의의 효소 (예를 들어, 트립신, 콜라게나제, 디스파제)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 비-효소 용액, 예컨대 고 EDTA-함유 용액, 예를 들어, 행크스(Hanks)-기반 세포 해리 완충제가 세포들을 해리시키는데 사용된다.

특정 실시양태에서, 상기의 연결식 단계들 중 임의의 것에 대해, 세포가 약 3일 내지 45일 사이, 예컨대 7일, 7-10일, 7-14일, 또는 14-21일 동안 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포가 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 또는 약 46일 동안 배양된다. 특정 실시양태에서, 세포가 약 45일, 40일, 35일, 30일, 25일, 21일, 20일, 18일, 15일, 14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 또는 1일 이하 동안 배양된다. 상기의 연결식 방법 단계들 각각에 대해, 세포가 각각의 단계에 동일한 기간 동안 또는 단계들 중 하나 이상에서 상이한 기간 동안 배양될 수 있다는 것을 주지한다.

특정 실시양태에서, 성숙한 RPE 세포의 배양물이 생산되도록 RPE 세포가 추가로 배양된다. RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포 양쪽 모두 분화된 RPE 세포이다. 그러나, 성숙한 RPE 세포는 분화된 RPE 세포에 비해 증가된 수준의 색소를 특징으로 한다. 분화된 RPE 세포의 배양물의 밀도를 증가 또는 감소시킴으로써 성숙도 및 착색의 수준을 조정할 수 있다. 따라서, 성숙한 RPE 세포가 생산되도록 RPE 세포의 배양물이 추가로 배양될 수 있다. 별법적으로, 성숙한 분화된 RPE 세포의 백분율을 감소시키고 분화된 RPE 세포의 백분율을 증가시키기 위해 성숙한 RPE 세포를 함유하는 배양물의 밀도가 감소될 수 있다.

RPE 세포를 배양하는데 사용된 배지는 세포 배양에 적합한 임의의 배지이고, 당업자에게 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 고밀도 배양물을 지지할 수 있는 임의의 배지, 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 동물 세포 배양을 위한 배지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포는 VP-SFM, EGM-2 및 MDBK-MM에서 배양될 수 있다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포의 상기 실질적으로 정제된 배양물 (성숙한 RPE 세포가 있거나 없음)이 보관용으로 동결된다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 세포가 보관될 수 있고, 예를 들어, 극저온에 의해 동결될 수 있으며, 세포의 보관에 적합한 임의의 온도에서 동결될 수 있다. 예를 들어, 적합하게 -20℃, -80℃, -120℃에서, 또는 세포의 보관에 적합한 임의의 또다른 온도에서 세포가 동결될 수 있다. 극저온에 의해 동결된 세포가 적합한 용기 내에 보관되고 보관용으로 제조되어, 세포 손상의 위험을 감소시키고 세포가 해동에서 생존할 가능성을 최대화한다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 실온에서 유지되거나, 또는, 예를 들어, 약 4℃에서 냉장된다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 우수 제조 기준 (GMP: Good Manufacturing Practice)에 따라 방법이 수행된다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 유래되었다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 초기 단계의 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래되었다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 1×10⁵개 이상의 RPE 세포, 5×10⁵개 이상의 RPE 세포, 1×10⁶개 이상의 RPE 세포, 5×10⁶개 이상의 RPE 세포, 1×10⁷개 이상의 RPE 세포, 2×10⁷개 이상의 RPE 세포, 3×10⁷개 이상의 RPE 세포, 4×10⁷개 이상의 RPE 세포, 5×10⁷개 이상의 RPE 세포, 6×10⁷개 이상의 RPE 세포, 7×10⁷개 이상의 RPE 세포, 8×10⁷개 이상의 RPE 세포, 9×10⁷개 이상의 RPE 세포, 1×10⁸개 이상의 RPE 세포, 2×10⁸개 이상의 RPE 세포, 5×10⁸개 이상의 RPE 세포, 7×10⁸개 이상의 RPE 세포, 또는 1×10⁹개 이상의 RPE 세포를 포함하는 제제를 생산하도록 방법이 사용된다. 특정 실시양태에서, 제제 내의 RPE 세포의 개수는 성숙도의 수준과 상관없이, 그리고 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 상대 백분율과 상관없이, 분화된 RPE 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 제제 내의 RPE 세포의 개수는 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 RPE 세포 중 하나의 개수를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 방법은 분화된 RPE 세포 및/또는 분화된 성숙한 RPE 세포를 제형하여 이식에 적절한 RPE 세포의 제제를 생산하는 단계를 더 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 인간 배아 줄기 세포, iPS 세포, 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 포함하는 제제를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 망막 변성을 특징으로 하는 병태에는, 예를 들어, 스타가르트(Stargardt) 황반 이영양증, 연령-관련 황반 변성 (건성 또는 습성), 당뇨 망막병증, 및 색소성 망막염이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포가 유래된다.

특정 실시양태에서, 제제는 기존에 냉동보존되었고, 이식 전에 해동되었다.

특정 실시양태에서, 치료 방법은 사이클로스포린 또는 하나 이상의 기타 면역억제제의 투여를 더 포함한다. 면역억제제가 사용되는 경우, 이는 전신에 또는 국소적으로 투여될 수 있고, RPE 세포의 투여 전에, 이의 투여와 동시에, 또는 이의 투여 후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, RPE 세포의 투여 후에 면역억제 요법이 수주 동안, 수개월 동안, 수년 동안 또는 무기한으로 계속된다.

특정 실시양태에서, 치료 방법은 단일 용량의 RPE 세포의 투여를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 치료 방법은 RPE 세포가 일정 기간에 걸쳐 여러 번 투여되는 치료법의 과정을 포함한다. 예시적인 치료 과정은 주1회, 2주 당 1회, 월1회, 연4회, 연2회, 또는 년1회의 치료를 포함할 수 있다. 별법적으로, 초기에는 다중 용량이 요구되지만 (예를 들어, 첫주에는 일1회 용량), 이어서 더 적고 덜 빈번한 용량이 요구되는 단계들에서 치료가 진행될 수 있다. 수많은 치료 요법이 구현된다.

특정 실시양태에서, 투여된 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 혼합 집단을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 투여된 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 RPE 세포 중 하나의 실질적으로 정제된 집단을 포함한다. 예를 들어, 투여된 RPE 세포는 25％, 20％, 15％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％ 미만, 또는 1％ 미만의 다른 RPE 세포 유형을 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 내에서 RPE 세포가 제형된다.

특정 실시양태에서, RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 매트릭스 또는 기재에서 이식된다. 특정 실시양태에서, 눈의 망막하 공간 내로의 주사에 의해 제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 10⁴개 내지 약 10⁶개의 세포가 대상에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상에서 망막전위도 응답, 시운동 명료도 역치 또는 휘도 역치를 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계가 방법에 더 포함된다. 방법은 세포의 면역원성 또는 눈에서의 세포의 이동을 모니터링함으로써 치료 또는 예방 효능을 모니터링하는 단계를 또한 포함할 수 있다.

특정 양상에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 유효량으로 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 제약 제제를 제공한다. 투여 경로에 따라 제약상 허용되는 담체 내에 제약 제제가 제형될 수 있다. 예를 들어, 눈의 망막하 공간으로의 투여를 위해 제제가 제형될 수 있다. 조성물은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 5×10⁵개, 6×10⁵개, 7×10⁵개, 8×10⁵개, 9×10⁵개, 10⁶개, 2×10⁶개, 3×10⁶개, 4×10⁶개, 5×10⁶개, 6×10⁶개, 7×10⁶개, 8×10⁶개, 9×10⁶개, 또는 10⁷개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 2×10⁷개, 5×10⁷개, 6×10⁷개, 7×10⁷개, 8×10⁷개, 9×10⁷개, 1×10⁸개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RPE 세포는 성숙한 RPE 세포를 포함할 수 있고, 따라서 세포 개수는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포 양쪽 모두의 합계를 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 RPE 세포의 생존을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포가 RPE 생존을 촉진하는 작용제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 확인된 작용제는, 단독으로 또는 RPE 세포와 함께, 치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 별법적으로, 확인된 작용제는 시험관 내에서 분화된 RPE 세포의 생존을 개선하기 위한 배양 방법의 일부분으로 사용될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 RPE 세포 성숙도를 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 인간 ES 세포로부터 분화된 RPE 세포가 RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 방법이 수행된다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포는 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 유래되었다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 초기 단계의 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래되었다.

또다른 양상에서, 인간 배아 줄기 세포 대신, RPE 세포 또는 이의 제제를 생산하기 위한 출발 물질이 또다른 유형의 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 예를 들어, 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포가 본원에 기술된 방법을 사용하여 RPE 세포를 분화시키기 위한 출발 물질로 사용되는 것이 본 발명에서 구현된다. 이같은 iPS 세포는 세포 은행으로부터 수득될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 앞서 유래될 수 있다. 별법적으로, iPS 세포가 RPE 세포로의 분화를 시작하기 전에 새롭게 생성될 수 있다.

한 실시양태에서, iPS 세포가 포함되는 다능성 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포 또는 제제가 치료 방법에서 사용된다.

본 발명은 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 또는 기타 인간 다능성 줄기 세포로부터 최종적으로 분화된 기능성 인간 망막 색소 상피 세포 (hRPE)를 또한 제공한다. 비-인간 영장류 이식 실험에서, 이러한 hRPE들은 이들의 독특한 물리적 특징에 의해, 예컨대 이들의 독특한 mRNA 및 단백질 발현에 의해 다른 세포와 분리되어 확인될 수 있다. 또한, 망막 변성의 인가된 동물 모델 내로 이식되는 경우, hRPE는 질환에 걸린 동물에서 망막 변성을 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 hRPE는 다양한 망막 변성 장애에 시달리는 환자를 치료하는데 유용하다. 따라서 본 발명은 시력 변성 질환 및 장애의 치료를 위해 GLP-유사 및 GMP-순응성(compliant) 조건 하에 생산 및 제작될 수 있는 hRPE의 재생가능한 공급원을 제공한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 착색되고, 인간 망막 색소 상피 세포가 아닌 세포에서 발현되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는, 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 인간 망막 색소 상피 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 망막 색소 상피 세포는 이의 천연 환경에서 발견되는 하나 이상의 단백질, 분자, 또는 기타 불순물로부터 단리된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 착색되고, 인간 RPE가 아닌 세포에서 발현되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는, 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 이러한 방식으로 사용되는 경우, 착색되었음은 임의 수준의 착색, 예를 들어, RPE 세포가 ES 세포로부터 분화될 때 초기에 발생하는 착색을 지칭한다. 착색은 세포 밀도 및 분화된 RPE 세포의 성숙도에 따라 변할 수 있다. 그러나, 세포가 착색된 것으로 지칭되는 경우, 이 용어는 임의의 모든 수준의 착색을 지칭하는 것으로 이해된다.

일부 실시양태에서, 세포 배양물은 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 집단을 포함한다. hRPE 세포의 실질적으로 정제된 집단은 hRPE 세포가 집단 내의 세포의 적어도 약 75％를 이루는 집단이다. 또다른 실시양태에서, hRPE 세포의 실질적으로 정제된 집단은 hRPE 세포가 집단 내의 세포의 적어도 약 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 97.5％, 98％, 99％, 또는 99％ 초과를 이루는 집단이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물 내의 hRPE 세포의 착색이 균질하다. 또다른 실시양태에서, 세포 배양물 내의 hRPE 세포의 착색이 이질성이고, RPE 세포의 배양물은 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포 양쪽 모두를 포함한다. 본 발명의 세포 배양물은 적어도 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 또는 적어도 약 10⁹개의 hRPE 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 착색 정도가 다양한 인간 망막 색소 상피 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 인간 망막 색소 상피 세포의 착색은 hRPE 세포의 최종 분화 후 평균적인 인간 색소 상피 세포와 동일하다. 특정 실시양태에서, 인간 망막 색소 상피 세포의 착색은 hRPE 세포의 최종 분화 후 평균적인 인간 망막 색소 상피 세포보다 더 착색된다. 또다른 특정 실시양태에서, 인간 망막 색소 상피 세포의 착색은 최종 분화 후 평균적인 인간 망막 색소 상피 세포보다 덜 착색된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 ES 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 분화되고, 하기의 것들 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)을 (mRNA 및/또는 단백질 수준에서) 발현하는 인간 RPE 세포를 제공한다: RPE-65, 베스트로핀(Bestrophin), PEDF, CRALBP, Otx2 및 Mit-F. 특정 실시양태에서, 유전자 발현은 mRNA 발현에 의해 측정된다. 또다른 실시양태에서, 유전자 발현은 단백질 발현에 의해 측정된다. 특정 실시양태에서, RPE 세포는 ES-특이적 유전자, 예컨대 Oct-4, 알칼리성 포스파타제, nanog, 및/또는 Rex-1을 실질적으로 발현하지 않는다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포는 pax-2, pax-6, 및/또는 티로시나제(tyrosinase) 중 하나 이상 (1개, 2개 또는 3개)를 발현한다. 특정 실시양태에서, pax-2, pax-6, 및/또는 티로시나제의 발현으로 분화된 RPE 세포가 성숙한 분화된 RPE 세포와 구별된다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포는 표 2에 제시된 마커들 중 하나 이상을 발현하고, 이러한 하나 이상의 마커의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현 (존재하는 경우)에 비해 RPE 세포에서 상향조절된다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포는 표 3에 제시된 마커들 중 하나 이상을 발현하고, 이러한 하나 이상의 마커의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현 (존재하는 경우)에 비해 RPE 세포에서 하향조절된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 제약 제제는 적어도 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 또는 약 10⁹개의 hRPE 세포를 포함할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 RPE 세포의 냉동보존된 제제를 제공한다. 냉동보존된 제제는 수일 또는 수년 동안의 보관용으로 동결될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 세포가 보관될 수 있고, 예를 들어, 극저온에 의해 동결될 수 있으며, 세포의 보관에 적합한 임의의 온도에서 동결될 수 있다. 예를 들어, 적합하게 -20℃, -80℃, -120℃에서, 또는 세포의 보관에 적합한 임의의 또다른 온도에서 세포가 동결될 수 있다. 극저온에 의해 동결된 세포가 적합한 용기 내에 보관되고 보관용으로 제조되어, 세포 손상의 위험을 감소시키고 세포가 해동에서 생존할 가능성을 최대화한다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 실온에서 유지되거나, 또는, 예를 들어, 약 4℃에서 냉장된다. 본원에 기술된 조성물의 냉동보존된 제제는 적어도 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 또는 약 10⁹개의 hRPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 hRPE 세포는 냉동보존 후 보관으로부터 회복된다. 특정 실시양태에서, 65％, 70％, 75％를 초과하는, 또는 80％를 초과하는 RPE 세포가 냉동보존 후 생육력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％를 초과하는, 또는 99％를 초과하는 RPE 세포가 냉동보존 후 생육력을 유지한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 구조적, 분자적 및 기능적 특성들이 임의로 조합된 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제를 제공한다. 이같은 제제는 투여를 위한 제약 제제로 제형될 수 있고/있거나 냉동보존용으로 제형될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 본원에 기술된 인간 RPE 세포의 용도를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 본원에 기술된 인간 RPE 세포를 포함하는 세포 배양물의 용도를 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 본원에 기술된 인간 RPE 세포를 포함하는 제약 제제의 용도를 제공한다. 치료될 수 있는 병태에는, 비제한적으로, 망막의 변성 질환, 예컨대 스타가르트 황반 이영양증, 색소성 망막염, 황반 변성, 녹내장, 및 당뇨 망막병증이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 포유류 배아 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 포함하는 제제를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 망막 변성을 특징으로 하는 병태에는, 예를 들어, 스타가르트 황반 이영양증, 연령-관련 황반 변성, 당뇨 망막병증, 및 색소성 망막염이 포함된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포, 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래되고, 본원에 기술된 특색들이 임의로 조합된 인간 RPE 세포의 용액을 제공한다. 이같은 용액은 적어도 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 또는 약 10⁹개의 본원에 기술된 바와 같은 hRPE 세포를 포함할 수 있다. 이같은 용액은 대상에게의 주사에 적절하다. 이같은 용액은 본원에 기술된 바와 같은 냉동보존에 적절하다. 본 발명은 RPE 세포의 투여에 의해 치료될 수 있는 질환, 예를 들어, 눈의 망막 변성 질환을 치료하기 위한 의약의 제쟉을 위한 이러한 용액의 용도를 또한 제공한다.

또다른 양상에서, 본 발명의 RPE 세포는 GMP 조건 하에 앞서 유래된 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 인간 ES 세포는, 임의적으로는 배아를 파괴하지 않으면서, 초기 분할 단계의 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된다. 또다른 실시양태에서, 인간 ES 세포는 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리로부터의 것이다. 특정 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포들의 상기 라이브러리는 인간 집단 내에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립유전자에 대해 각각 반접합성(hemizygous), 동종접합성(homozygous), 또는 무효접합성(nullizygous)인 줄기 세포들을 포함하고, 이때 줄기 세포들의 상기 라이브러리의 각각의 구성원은 라이브러리의 나머지 구성원들에 비해 상이한 셋트의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동종접합성, 또는 무효접합성이다. 추가적인 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포의 라이브러리는 인간 집단 내에 존재하는 모든 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동종접합성, 또는 무효접합성인 줄기 세포들을 포함한다. 또다른 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 집단 내에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립유전자에 대해 각각 반접합성, 동종접합성, 또는 무효접합성인 RPE 세포들의 라이브러리를 제공하고, 이때 RPE 세포들의 상기 라이브러리의 각각의 구성원은 라이브러리의 나머지 구성원들에 비해 상이한 셋트의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동종접합성, 또는 무효접합성이다. 추가적인 실시양태에서, 본 발명은 인간 집단 내에 존재하는 모든 MHC 대립유전자에 대해 반접합성, 동종접합성, 또는 무효접합성인 인간 RPE 세포들의 라이브러리를 제공한다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포들의 상기 실질적으로 정제된 배양물 (성숙한 RPE 세포가 있거나 없음)이 보관을 위해 동결된다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 세포가 보관될 수 있고, 예를 들어, 극저온에 의해 동결될 수 있으며, 세포의 보관에 적합한 임의의 온도에서 동결될 수 있다. 예를 들어, 적합하게 -20℃, -80℃, -120℃에서, 또는 세포의 보관에 적합한 임의의 또다른 온도에서 세포가 동결될 수 있다. 극저온에 의해 동결된 세포가 적합한 용기 내에 보관되고 보관용으로 제조되어, 세포 손상의 위험을 감소시키고 세포가 해동에서 생존할 가능성을 최대화한다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 실온에서 유지되거나, 또는, 예를 들어, 약 4℃에서 냉장된다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 인간 RPE 세포가 생산된다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 유래되었다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 초기 단계의 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래되었다. 따라서, 본 발명은 RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제를 포함하는, RPE 세포의 GMP 순응성 제제를 제공한다. 이같은 제제는 바이러스, 박테리아 및/또는 진균류 오염 또는 감염이 실질적으로 없다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포의 조성물 또는 제제는 1×10⁵개 이상의 RPE 세포, 5×10⁵개 이상의 RPE 세포, 1×10⁶개 이상의 RPE 세포, 5×10⁶개 이상의 RPE 세포, 1×10⁷개 이상의 RPE 세포, 2×10⁷개 이상의 RPE 세포, 3×10⁷개 이상의 RPE 세포, 4×10⁷개 이상의 RPE 세포, 5×10⁷개 이상의 RPE 세포, 6×10⁷개 이상의 RPE 세포, 7×10⁷개 이상의 RPE 세포, 8×10⁷개 이상의 RPE 세포, 9×10⁷개 이상의 RPE 세포, 1×10⁸개 이상의 RPE 세포, 2×10⁸개 이상의 RPE 세포, 5×10⁸개 이상의 RPE 세포, 7×10⁸개 이상의 RPE 세포, 또는 1×10⁹개 이상의 RPE 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제제 내의 RPE 세포의 개수는 성숙도의 수준과 상관없이, 그리고 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 상대 백분율과 상관없이, 분화된 RPE 세포를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 제제 내의 RPE 세포의 개수는 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 RPE 세포 중 하나의 개수를 지칭한다.

특정 실시양태에서, 방법은 분화된 RPE 세포 및/또는 분화된 성숙한 RPE 세포를 제형하여 이식에 적절한 RPE 세포의 제제를 생산하는 단계를 더 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 망막 변성을 특징으로 하는 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에게 인간 다능성 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 포함하는 제제를 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, RPE 세포는 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 유래된다. 망막 변성을 특징으로 하는 병태에는, 예를 들어, 스타가르트 황반 이영양증, 연령-관련 황반 변성 (건성 또는 습성), 당뇨 망막병증, 및 색소성 망막염이 포함된다.

특정 실시양태에서, 제제는 기존에 냉동보존되었고, 이식 전에 해동되었다.

특정 실시양태에서, 치료 방법은 사이클로스포린 또는 하나 이상의 기타 면역억제제의 투여를 더 포함한다. 면역억제제가 사용되는 경우, 이는 전신에 또는 국소적으로 투여될 수 있고, RPE 세포의 투여 전에, 이의 투여와 동시에, 또는 이의 투여 후에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, RPE 세포의 투여 후에 면역억제 요법이 수주 동안, 수개월 동안, 수년 동안 또는 무기한으로 계속된다.

특정 실시양태에서, 치료 방법은 단일 용량의 RPE 세포의 투여를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 치료 방법은 RPE 세포가 일정 기간에 걸쳐 여러 번 투여되는 치료법의 과정을 포함한다. 예시적인 치료 과정은 주1회, 2주 당 1회, 월1회, 연4회, 연2회, 또는 년1회의 치료를 포함할 수 있다. 별법적으로, 초기에는 다중 용량이 요구되지만 (예를 들어, 첫주에는 일1회 용량), 이어서 더 적고 덜 빈번한 용량이 요구되는 단계들에서 치료가 진행될 수 있다. 수많은 치료 요법이 구현된다.

특정 실시양태에서, 투여된 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 혼합 집단을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 투여된 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 RPE 세포 중 하나의 실질적으로 정제된 집단을 포함한다. 예를 들어, 투여된 RPE 세포는 25％, 20％, 15％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％ 미만, 또는 1％ 미만의 다른 RPE 세포 유형을 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 내에서 RPE 세포가 제형된다.

특정 실시양태에서, RPE 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 매트릭스 또는 기재에서 이식된다. 특정 실시양태에서, 눈의 망막하 공간 내로의 주사에 의해 제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 각막을 통과하여 제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 10⁴개 내지 약 10⁶개의 세포가 대상에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상에서 망막전위도 응답, 시운동 명료도 역치 또는 휘도 역치를 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계가 방법에 더 포함된다. 방법은 세포의 면역원성 또는 눈에서의 세포의 이동을 모니터링함으로써 치료 또는 예방 효능을 모니터링하는 단계를 또한 포함할 수 있다.

특정 양상에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 유효량으로 포함하는, 망막 변성을 특징으로 하는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 제약 제제를 제공한다. 투여 경로에 따라 제약상 허용되는 담체 내에 제약 제제가 제형될 수 있다. 예를 들어, 눈의 망막하 공간 또는 각막으로의 투여를 위해 제제가 제형될 수 있다. 조성물은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 5×10⁵개, 6×10⁵개, 7×10⁵개, 8×10⁵개, 9×10⁵개, 10⁶개, 2×10⁶개, 3×10⁶개, 4×10⁶개, 5×10⁶개, 6×10⁶개, 7×10⁶개, 8×10⁶개, 9×10⁶개, 또는 10⁷개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 적어도 2×10⁷개, 5×10⁷개, 6×10⁷개, 7×10⁷개, 8×10⁷개, 9×10⁷개, 1×10⁸개의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RPE 세포는 성숙한 RPE 세포를 포함할 수 있고, 따라서 세포 개수는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포 양쪽 모두의 합계를 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 RPE 세포의 생존을 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포가 RPE 생존을 촉진하는 작용제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 확인된 작용제는, 단독으로 또는 RPE 세포와 함께, 치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 별법적으로, 확인된 작용제는 시험관 내에서 분화된 RPE 세포의 생존을 개선하기 위한 배양 방법의 일부분으로 사용될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 RPE 세포 성숙도를 조정하는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들어, 인간 ES 세포로부터 분화된 RPE 세포가 RPE 성숙을 촉진하는 작용제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 방법이 수행된다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 유래되었다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 분화되는 인간 배아 줄기 세포는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 초기 단계의 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래되었다.

또다른 양상에서, 인간 배아 줄기 세포 대신, RPE 세포 또는 이의 제제를 생산하기 위한 출발 물질이 또다른 유형의 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 예를 들어, hES의 특성을 지니는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포가 본원에 기술된 방법을 사용하여 RPE 세포를 분화시키기 위한 출발 물질로서 유사하게 사용될 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 이같은 iPS 세포는 세포 은행으로부터 수득될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 앞서 유래될 수 있다. 별법적으로, iPS 세포가 RPE 세포로의 분화를 시작하기 전에 새롭게 생성될 수 있다.

한 실시양태에서, iPS 세포가 포함되는 다능성 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포 또는 제제가 치료 방법에서 사용된다.

상기 또는 하기에 기술된 양상들 및 실시양태들의 임의의 조합이 본 발명에서 구현된다. 예를 들어, 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 임의의 조합을 포함하는 RPE 세포의 제제가 본원에 기술된 질환 및 병태 중 임의의 것의 치료에서 사용될 수 있다. 유사하게, 인간 배아 줄기 세포를 출발 물질로 사용하여 RPE 세포를 생산하기 위한 본원에 기술된 방법이 임의의 인간 다능성 줄기 세포를 출발 물질로 사용하여 유사하게 수행될 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포의 발달성 개체발생을 나타내는 개략적인 모델이다.
도 2는 정량적 실시간 역전사 PCR (qPCR)에 의한 hES 세포와 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포의 유전자 발현 비교를 나타내는 그래프이다.
도 3은 정량적 실시간 역전사 PCR (qPCR)에 의한 ARPE-19 세포 (기존에 유래된 RPE 세포주)와 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포의 유전자 발현 비교를 나타내는 그래프이다.
도 4는 정량적 실시간 역전사 PCR (qPCR)에 의한 태아 RPE 세포와 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포의 유전자 발현 비교를 나타내는 그래프이다.
도 5는 정량적 실시간 역전사 PCR (qPCR)에 의한 성숙한 RPE 세포와 hES 세포의 유전자 발현 비교를 나타내는 그래프이다.
도 6은 hES-특이적 및 RPE-특이적 마커의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석을 나타내는 현미경사진이다. hES 세포 (레인 2)로부터 유래된 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포 (레인 1)는 hES-특이적 단백질인 Oct-4, Nanog, 및 Rex-1을 발현하지 않았다. 그러나, 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포는 RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 Otx2가 포함되는 RPE-특이적 단백질을 발현하였다. 액틴이 단백질 로딩(loading) 대조군으로 사용되었다.
도 7은 마이크로어레이(microarray) 유전자 발현의 주성분 분석 플롯(plot)을 나타내는 그래프이다. 69％의 변이성을 나타내는 성분 1은 세포 유형을 나타내는 한편, 성분 2는 세포주 (즉, 유전적 변이성)을 나타낸다. 유전자 발현 프로파일의 선형에 가까운 산재는 hES 세포로부터 유래된 hRPE의 발달성 개체발생을 특성화한다.

발명의 상세한 설명

본원에 기술된 발명이 충분히 이해될 수 있게 하기 위하여, 하기의 상세한 설명이 기재된다. 본 발명의 다양한 실시양태들이 상세하게 기술되고, 제공된 예들에 의해 추가로 설명될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미이다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질들이 본 발명 또는 본 발명의 테스팅에서 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질들이 하기에 기술된다. 물질, 방법 및 예들은 단지 설명적일 뿐이고, 한정적인 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 공보 및 출원, 및 기타 문헌은 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

본 발명을 추가로 규정하기 위해, 하기의 용어들 및 정의들이 본원에서 제공된다.

본원에서의 설명에서, 그리고 하기의 청구항 전반에서 사용된 관사 ("a," "an," 및 "the")의 의미는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수형 언급을 포함한다. 또한, 본원에서의 설명에서 사용된 "에서(in)"의 의미는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 "내에서(in)" 및 "상에서(on)"를 포함한다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 또는 변형 예컨대 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 뜻하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 뜻하지는 않는 것으로 이해될 것이다.

"배아" 또는 "배아의"는 모체 숙주의 자궁막 내로 이식되지 않은 발달 중인 세포 덩이를 의미한다. "배아 세포"는 배아로부터 단리된 또는 배아에 함유된 세포이다. 이는 빠르게는 2세포 단계에 수득된 할구, 및 응집된 할구를 또한 포함한다.

용어 "배아 줄기 세포"는 배아-유래 세포를 지칭한다. 더욱 구체적으로, 이는 주머니배의 속세포덩이 또는 상실배로부터 단리되고 세포주로서 연속 계대된 세포를 지칭한다. 이 용어는 배아의 하나 이상의 할구로부터, 바람직하게는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서, 단리된 세포를 또한 포함한다. 이 용어는, 심지어 비-배아 세포가 프로세스에서 사용되는 경우의, 체세포 핵 이식에 의해 생산된 세포를 또한 포함한다.

용어 "인간 배아 줄기 세포" (hES 세포)는 당업계에서 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다. 이러한 용어는 세포주로서 연속 계대된 인간 주머니배의 속세포덩이 또는 상실배로부터 유래된 세포를 포함한다. hES 세포는 난세포와 정자 또는 DNA의 수정, 핵 이식, 단성생식으로부터, 또는 HLA 영역 내의 동종접합성이 있는 hES 세포를 생성시키는 수단에 의해 유래될 수 있다. 또한 인간 ES 세포는 정자와 난세포의 융합, 핵 이식, 단성생식, 또는 염색질의 리프로그래밍(reprogramming)에 이어서 리프로그래밍된 염색질을 형질막 내로 혼입하여 세포를 생산하는 것에 의해 생산된 접합체, 할구, 또는 주머니배-단계 포유류 배아로부터 유래된 세포이다. 본 발명의 인간 배아 줄기 세포에는 MA01, MA09, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, RPE 세포를 생산하기 위해 사용된 인간 ES 세포는 GMP 기준에 따라 유래되고 유지된다. 인간 배아 줄기 세포는, 이의 공급원 또는 이를 생산하기 위해 사용된 특정 방법과 관계없이, (i) 3가지 모두의 배엽층의 세포로 분화되는 능력, (ii) 적어도 Oct-4 및 알칼리성 포스파타제의 발현, 및 (iii) 면역손상 동물 내로 이식되는 경우 기형종을 생산하는 능력을 기초로 확인될 수 있다.

용어 "인간 배아-유래 세포" (hEDC)는 상실배-유래 세포, 속세포덩이의 것이 포함되는 주머니배-유래 세포, 배아판(embryonic shield), 또는 배아덩이위판(epiblast), 또는 초기 배아의 기타 전능성(totipotent) 또는 다능성 줄기 세포 (원시 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 및 이들의 유도체 포함)를 지칭하고, 다양한 발달 단계로부터의 응집된 단일 할구 또는 배아로부터의 할구 및 세포 덩이를 또한 포함하지만, 세포주로서 계대된 인간 배아 줄기 세포는 제외된다.

본원에서 사용된 용어 "다능성 줄기 세포"에는, 다능성 줄기 세포가 유래된 방법과 관계없이, 배아 줄기 세포, 배아-유래 줄기 세포, 및 유도된 다능성 줄기 세포가 포함된다. 다능성 줄기 세포는 (a) 면역결핍 (SCID) 마우스에 이식되는 경우 기형종을 유도할 수 있고; (b) 3가지 모두의 배엽층의 세포 유형으로 분화될 수 있으며 (예를 들어, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포 유형으로 분화될 수 있음); 및 (c) 배아 줄기 세포의 하나 이상의 마커를 발현 (예를 들어, Oct 4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등을 발현)하는 줄기 세포로 기능적으로 정의된다. 예시적인 다능성 줄기 세포가, 예를 들어, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예시적인 다능성 줄기 세포에는 주머니배 단계 배아의 ICM으로부터 유래된 배아 줄기 세포, 뿐만 아니라 분할 단계 또는 상실배 단계 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포 (임의적으로는, 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 유래됨)가 포함된다. 이같은 배아 줄기 세포는 수정에 의해 또는 체세포 핵 이식 (SCNT), 단성생식 및 숫생식이 포함되는 무성 수단에 의해 생산된 배아 물질로부터 생성될 수 있다. 추가적인 예시적인 다능성 줄기 세포에는 인자들 (본원에서 리프로그래밍 인자들로 지칭됨)의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도하는 것에 의해 체세포를 리프로그래밍시킴으로써 생성된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)가 포함된다. iPS 세포는 태아, 출생후, 신생, 소아 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키는데 사용될 수 있는 인자에는, 예를 들어, Oct4 (때때로 Oct 3/4로 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4의 조합이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키는데 사용될 수 있는 인자에는, 예를 들어, Oct 4, Sox2, Nanog, 및 Lin28의 조합이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 2개 이상의 리프로그래밍 인자, 3개 이상의 리프로그래밍 인자, 또는 4개의 리프로그래밍 인자를 발현시킴으로써 체세포가 리프로그래밍된다. 또다른 실시양태에서, 추가적인 리프로그래밍 인자들이 확인되고, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키도록 단독으로 또는 하나 이상의 다른 리프로그래밍 인자와 조합되어 사용된다.

용어 "RPE 세포" 및 "분화된 RPE 세포" 및 "ES-유래 RPE 세포" 및 "인간 RPE 세포"는 본 발명의 방법을 사용하여 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 지칭하도록 상호교환가능하게 전반적으로 사용된다. 이 용어는 세포의 성숙도와 관계없이 분화된 RPE 세포를 지칭하도록 포괄적으로 사용되고, 따라서 다양한 성숙도 수준의 RPE 세포를 포함할 수 있다. 분화된 RPE 세포는 이의 자갈 형태 및 초기의 색소 출현에 의해 시각적으로 인식될 수 있다. 분화된 RPE 세포는 배아 줄기 세포 마커 예컨대 Oct-4 및 nanog의 발현이 실질적으로 없는 것을 기초로, 뿐만 아니라 RPE 마커 예컨대 RPE-65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀의 발현을 기초로 분자적으로 또한 확인될 수 있다. 기타 RPE-유사 세포가 지칭되는 경우, 일반적으로 이는 성인, 태아 또는 APRE19 세포로 구체적으로 지칭된다는 것을 주지한다. 따라서, 달리 구체화되지 않는 한, 본원에서 사용된 RPE 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 지칭한다.

용어 "성숙한 RPE 세포" 및 "성숙한 분화된 RPE 세포"는 RPE 세포의 초기 분화 후에 발생하는 변화를 지칭하도록 상호교환가능하게 전반적으로 사용된다. 구체적으로, 부분적으로, 초기의 색소 출현을 기초로 RPE 세포가 인식될 수 있지만, 분화 후, 성숙한 RPE 세포가 강화된 착색을 기초로 인식될 수 있다. 분화 후의 착색은 세포의 RPE 상태에서의 변화를 가리키지 않는다 (예를 들어, 세포는 여전히 분화된 RPE 세포이다). 그보다는, 분화 후의 색소에서의 변화는 RPE 세포가 배양 및 유지되는 밀도에 상응한다. 따라서, 성숙한 RPE 세포에는 초기 분화 후에 축적되는 증가된 착색이 있다. RPE 세포에도 어느 정도 수준의 착색이 있지만, 성숙한 RPE 세포는 RPE 세포보다 더욱 착색된다. 착색이 감소되도록, 성숙한 RPE 세포가 더 낮은 밀도에서 하위배양될 수 있다. 이러한 정황에서, RPE 세포를 생산하도록 성숙한 RPE 세포가 배양될 수 있다. 여전히 이같은 RPE 세포는 RPE 분화의 마커를 발현하는 분화된 RPE 세포이다. 따라서, RPE 세포가 분화하기 시작할 때 발생하는 초기의 착색 출현과 반대로, 분화 후의 착색 변화는 현상학적이고, RPE 운명으로부터의 세포의 탈분화를 반영하지 않는다. 분화 후의 착색에서의 변화가 pax-2 발현에서의 변화와 또한 상관된다는 것을 주지한다. 기타 RPE-유사 세포가 지칭되는 경우, 일반적으로 이는 성인, 태아 또는 APRE19 세포로 구체적으로 지칭된다는 것을 주지한다. 따라서, 달리 구체화되지 않는 한, 본원에서 사용된 RPE 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 지칭한다.

"APRE-19"는 기존에 유래된 인간 RPE 세포주의 세포를 지칭한다. APRE-19 세포는 자발적으로 발생되었고, 인간 배아 또는 배아 줄기 세포로부터 유래되지 않는다.

개요

본 발명은 인간 배아 줄기 세포 또는 기타 인간 다능성 줄기 세포로부터 유래된 인간 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 포함하는 제제 및 조성물을 제공한다. RPE 세포는 적어도 어느 정도까지 착색된다. RPE 세포는 배아 줄기 세포 마커 Oct-4, nanog, 또는 Rex-1을 (어떠한 감지할 수 있는 수준으로도) 발현하지 않는다. 구체적으로, 정량적 RT-PCR에 의해 평가했을 때, 이러한 ES 유전자들의 발현이 ES 세포에서보다 RPE 세포에서 약 100-1000배 더 낮다. RPE 세포는, mRNA 및 단백질 수준 양쪽 모두에서, 하기의 것들 중 하나 이상을 발현한다: RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, MitF 및/또는 Otx2. 또다른 특정 실시양태에서, RPE 세포는, mRNA 및 단백질 수준 양쪽 모두에서, Pax-2, Pax-6, MitF, 및 티로시나제 중 하나 이상을 발현한다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포는 분화된 RPE 세포에 비해 착색이 증가된 성숙한 RPE 세포이다.

본 발명은 인간 RPE 세포, 인간 RPE 세포의 실질적으로 정제된 집단을 포함하는 세포 배양물, 인간 망막 색소 상피 세포를 포함하는 제약 제제, 및 인간 RPE 세포의 냉동보존된 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 인간 RPE 세포의 용도를 제공한다. 별법적으로, 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 세포 배양물의 용도를 제공한다. 본 발명은 병태의 치료를 필요로 하는 환자에서 병태를 치료하기 위한 의약의 제작에서의 제약 제제의 용도를 또한 제공한다. 상기의 것들 중 임의의 것에서, RPE 세포를 포함하는 제제는 다양한 성숙도 수준의 분화된 RPE 세포를 포함할 수 있거나, 또는 특정 수준의 성숙도의 분화된 RPE 세포와 관하여 실질적으로 순수할 수 있다. 상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포를 포함하는 제제는 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 제조된다 (예를 들어, 제제는 GMP-순응성이다). 특정 실시양태에서, RPE 세포를 포함하는 제제는 박테리아, 바이러스 또는 진균류 오염 또는 감염이 실질적으로 없다.

인간 RPE 세포 (배아-유래 또는 기타 다능성 줄기 세포로부터 유래됨)는 이의 구조적인 성질을 기초로 확인 및 특성화될 수 있다. 구체적으로, 그리고 특정 실시양태에서, 이러한 세포는 하나 이상의 마커의 발현 또는 발현 결여 (유전자 수준 또는 단백질 수준에서 평가 시)를 기초로 확인 또는 특성화될 수 있다는 점에서 독특하다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 분화된 ES-유래 RPE 세포가 하기의 마커들 중 하나 이상의 발현을 기초로 확인 또는 특성화될 수 있다 (예를 들어, 하기의 마커들 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 발현을 기초로 특성화될 수 있다): RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2 및 Mit-F. 추가적으로 또는 별법적으로, ES-유래 RPE 세포는 PAX2, 티로시나제, 및/또는 PAX6의 발현을 기초로 확인 또는 특성화될 수 있다. 추가적으로 또는 별법적으로, hRPE 세포가 표 1-3 중 임의의 것에서 분석된 마커들 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과)의 발현 또는 발현 결여 (유전자 수준 또는 단백질 수준에서 평가 시)를 기초로 확인 또는 특성화될 수 있다.

추가적으로 또는 별법적으로, ES-유래 RPE 세포는 세포의 착색 정도를 기초로 또한 확인 및 특성화될 수 있다. 급속하게 분열되고 있는 분화된 hRPE 세포는 엷게 착색된다. 그러나, 세포 밀도가 최대 용량에 도달한 경우, 또는 hRPE 세포가 명확하게 성숙된 경우, hRPE는 이의 특징적인 6각형의 표현형 형상을 취하고, 멜라닌 및 리포푸신(lipofuscin)의 축적에 의해 착색 수준이 증가된다. 따라서, 초기의 착색 축적이 RPE 분화의 지표로 작용하고, 세포 밀도와 관련된 증가된 착색이 RPE 성숙도의 지표로 작용한다.

RPE 세포를 포함하는 제제에는 비-RPE 세포 유형에 관하여 실질적으로 순수하지만 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포의 혼합물을 함유하는 제제가 포함된다. RPE 세포를 포함하는 제제에는 비-RPE 세포 유형 및 다른 성숙도 수준의 RPE 세포 양쪽 모두에 관하여 실질적으로 순수한 제제가 또한 포함된다.

상기의 실시양태들 중 임의의 것에 대하여, RPE 세포 (상기 기술된 바와 같이 특성화됨)가 인간 다능성 줄기 세포, 예를 들어 iPS 세포 및 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있다는 것이 본 발명에서 고려된다. 특정 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 방법을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포가 유래된다.

RPE 세포 분화

배아 줄기 세포 (ES)는 미분화 상태로 시험관 내에서 무한 유지될 수 있고, 그럼에도 불구하고 사실상 모든 세포 유형으로 분화될 수 있어, 이식 치료법을 위한 회춘되고(rejuvenated) 조직적합성인 세포의 무한 공급원을 제공한다. 면역 거부의 문제점은 핵 이식 및 단성생식 기술로 극복될 수 있다. 따라서, 인간 배아 줄기 (hES) 세포는 인간 세포의 분화에 대한 연구에 유용하고, 이식 치료법에 대한 잠재적인 공급원으로 고려될 수 있다. 현재까지, 심근세포 ([Kehat et al., 2001], [Mummery et al., 2003], [Carpenter et al., 2002]), 뉴런 및 신경 전구체 ([Reubinoff et al., 2000], [Carpenter et al., 2001], [Schuldiner et al., 2001]), 지방세포 ([Bost et al., 2002], [Aubert et al., 1999]), 간세포-유사 세포 ([Rambhatla et al., 2003]), 조혈 세포 ([Chadwick et al., 2003]), 난모세포 ([Hubner et al., 2003]), 가슴샘세포-유사 세포 ([Lin RY et al., 2003]), 이자섬 세포 ([Kahan, 2003]), 및 골모세포 ([Zur Nieden et al., 2003])가 포함되는 수많은 세포 유형으로의 인간 및 마우스 ES 세포의 분화가 보고되었다 ([Smith, 2001]에서 리뷰됨).

본 발명은 뉴런 계통의 특수 세포인 망막 색소 상피 (RPE)로의 인간 ES 세포의 분화를 제공한다. RPE는 맥락막과 신경 망막 사이의 조밀하게 착색된 상피 단층이다. 이는 혈류와 망막 사이의 장벽의 일부로서 작용한다. 이의 기능에는 쉐딩된(shed) 간체 및 추체 바깥 분절의 포식작용, 미광(stray light)의 흡수, 비타민 A 대사, 레티노이드 재생, 및 조직 복구가 포함된다 ([Grierson et al., 1994], [Fisher and Reh, 2001], [Marmorstein et al., 1998]). RPE는 이의 흑색으로 착색된 세포의 자갈형 세포 형태에 의해 인식될 수 있다. 또한, 첨단부 미세융모에서 또한 발견되는 세포질 단백질인 세포성 레틴알데히드-결합 단백질 (CRALBP) ([Bunt-Milam and Saari, 1983]); 레티노이드 대사에서 수반되는 세포질 단백질인 RPE65 ([Ma et al., 2001], [Redmond et al., 1998]); 베스트(Best) 노른자모양 황반 이영양증 유전자의 생성물인 베스트로핀 (VMD2, [Marmorstein et al., 2000]), 및 혈관억제성(angiostatic) 성질이 있는 48kD의 분비 단백질인 색소 상피 유래 인자 (PEDF) ([Karakousis et al., 2001], [Jablonski et al., 2000])가 포함되는 RPE의 여러 마커가 공지되어 있다.

RPE는 광수용체 유지에서 중요한 역할을 하고, 생체 내에서의 다양한 RPE 기능장애가 다수의 시력-변경 병, 예컨대 RPE 박리, 형성이상, 위축증, 망막병증, 색소성 망막염, 황반 이영양증 또는 변성 (연령-관련 황반 변성 포함)과 관련되며, 이는 광수용체 손상 및 실명을 초래할 수 있다. 이의 상처 치유 능력으로 인해, RPE가 이식 치료법에의 응용에서 광범위하게 연구되었다. 여러 동물 모델 및 인간에서 ([Gouras et al., 2002], [Stanga et al., 2002], [Binder et al., 2002], [Schraermeyer et al., 2001], [Lund et al., 2001] 리뷰), RPE 이식에 시력 복원의 잠재력이 있다는 것이 나타났다. 최근, RPE 이식에 대한 또다른 기대되는 영역이 제안되었고, 심지어 임상 실험 단계에 도달하였다; 이러한 세포들은 도파민을 분비하기 때문에, 파키슨병의 치료에 사용될 수 있다 ([Subramanian, 2001]). 그러나, 면역-특권 구역인 눈에서도, 이식 거부의 문제점이 있어, 동종 이식이 사용되는 경우 이러한 접근법의 진행을 방해한다. 또다른 문제점은 태아 조직에 대한 의존성인데, 이는 성체 RPE은 증식 잠재력이 매우 낮기 때문이다. 본 발명은 이식 거부가 일어날 가능성을 감소시키고, 태아 조직의 사용에 대한 의존성을 제거한다.

면역적합성 조직의 공급원으로서, hES 세포에는 이식 치료법에 대한 전망이 있는데, 면역 거부의 문제점이 핵 이식 기술로 극복될 수 있기 때문이다. 망막 색소 상피-유사 세포 및 뉴런 전구체 세포가 포함되는 인간 ES 세포의 새로운 분화 유도체의 사용, 및 이들을 생산하기 위한 분화 시스템의 사용은 이식을 위한 RPE 및 뉴런 전구 세포의 매력적인 잠재적인 공급원을 제공한다.

따라서, 본 발명의 한 양상은 정제 및/또는 단리될 수 있는, 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 RPE 세포를 생성시키는 개선된 방법을 제공하는 것이다. 이같은 세포는 망막 변성 질환, 예를 들어, 색소성 망막염, 황반 변성 및 기타 눈 장애를 위한 치료법에 유용하다. 본 발명을 사용하여 생산될 수 있는 세포 유형에는 RPE 세포 및 RPE 선조 세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한 생산될 수 있는 세포에는 홍채 색소 상피 (IPE) 세포 및 기타 시력 관련 신경 세포, 예컨대 개재 뉴런 (예를 들어 내핵층 (INL)의 "중계" 뉴런) 및 무축삭 세포가 포함된다. 추가적으로, 망막 세포, 간체, 추체, 및 각막 세포가 생산될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 눈의 혈관계를 제공하는 세포가 또한 생산될 수 있다.

인간 배아 줄기 세포가 이러한 방법의 출발 물질이다. 배아 줄기 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로, 예컨대 피더(feeder) 세포의 존재 또는 부재 하에 배양될 수 있다. 추가적으로, 임의의 방법을 사용하여 생산된 인간 ES 세포가 RPE 세포를 생산하기 위한 출발 물질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 ES 세포가 난자와 정자의 시험관내 수정의 생성물인 주머니배 단계 배아로부터 유래될 수 있다. 별법적으로, 인간 ES 세포가, 임의적으로는 나머지 배아를 파괴시키지 않으면서, 초기 분할 단계 배아로부터 제거된 하나 이상의 할구로부터 유래될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 인간 ES 세포가 핵 이식을 사용하여 생산될 수 있다. 출발 물질로서, 기존에 냉동보존된 인간 ES 세포가 사용될 수 있다.

RPE 세포를 생산하기 위한 이러한 방법의 첫번째 단계에서, 인간 배아 줄기 세포가 배아체로서 배양된다. 배아 줄기 세포기 펠렛화되고, 배양 배지 내에 재현탁되고, 배양 접시 (예를 들어, 부착성이 낮은 배양 접시) 상에 플레이팅될 수 있다. 고밀도에서의 세포 성장에 충분한 임의의 배지, 예컨대 바이러스, 박테리아, 곤충 또는 동물 세포 배양을 위한 시판되는 배지에서 세포가 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 영양소가 풍부한 저단백질 배지가 사용된다 (예를 들어, 약 150 ㎎/㎖ (0.015％)의 동물-유래 단백질을 함유하는 MDBK-GM 배지). 저단백질 배지가 사용되는 경우, 예를 들어, 배지는 약 5％, 4％, 3％, 2.5％, 2％, 1.5％, 1％, 0.75％, 0.5％, 0.25％, 0.2％, 0.1％, 0.05％, 0.02％, 0.016％, 0.015％ 이하, 또는 심지어 0.010％ 이하의 동물-유래 단백질을 함유한다. 저단백질 배지 내에 존재하는 단백질의 백분율에 대한 언급은 배지 단독을 지칭하고, 예를 들어 B-27 보충물 내에 존재하는 단백질은 차지하지 않는다는 것을 주지한다. 따라서, 세포가 저단백질 배지 및 B-27 보충물에서 배양되는 경우, 배지 내에 존재하는 단백질의 백분율은 더 높을 수 있는 것으로 이해된다.

특정 실시양태에서, 영양소가 풍부한 무단백질 배지가 사용된다 (예를 들어, MDBK-MM 배지). 배양 배지의 또다른 예로는, 예를 들어, OptiPro SFM, VP-SFM, 및 EGM-2가 포함된다. 이같은 배지는 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 글루타민, 알부민, 에탄올아민, 페투인, 펩톤, 정제된 지질단백질 물질, 비타민 A, 비타민 C, 및 비타민 E와 같은 영양소 성분을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 저단백질 배지 또는 무단백질 배지 내의 세포 배양물에 무혈청 B-27 보충물 ([Brewer et al., Journal of Neuroscience Research 35:567-576 (1993)])이 보충된다. B27 보충물의 영양소 성분에는 비오틴, L-카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D+-갈락토스, 환원된 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 셀레늄, 트리도-1-타이로닌 (T3), DL-알파-토코페롤 (비타민 E), DL-알파-토코페롤 아세테이트, 소 혈청 알부민, 카탈레이스, 인슐린, 과산화물 디스뮤테이스, 및 트랜스페린이 포함될 수 있다. 세포가 B-27이 보충된 무단백질 배지에서 배양되는 경우, 무단백질은 B-27의 첨가 전의 배지를 지칭한다.

배지는 보충물 예컨대 헤파린, 하이드로코르티손, 아스코르브산, 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청), 또는 성장 매트릭스 (예를 들어, 소 각막 상피로부터의 세포외 매트릭스, 매트리젤 (BD biosciences), 또는 젤라틴)을 또한 함유할 수 있다.

본 발명의 이러한 방법에서, RPE 세포가 배아체로부터 분화된다. EB로부터 RPE 세포를 단리하는 것은 시험관 내에서의 강화된 배양물에서의 RPE 세포의 확장을 허용한다. 인간 세포에 대해, RPE 세포가 90일 미만 동안 성장된 EB로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, RPE 세포가 7-14일 동안 성장된 인간 EB에서 발생된다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 14-28일 동안 성장된 인간 EB에서 발생된다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 28-45일 동안 성장된 인간 EB에서 확인되고, 단리될 수 있다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포가 45-90일 동안 성장된 인간 EB에서 발생된다. 배아 줄기 세포, 배아체, 및 RPE 세포를 배양하기 위해 사용된 배지가 임의의 간격으로 제거되고/되거나 동일하거나 상이한 배지로 교체될 수 있다. 예를 들어, 0-7일, 7-10일, 10-14일, 14-28일, 또는 28-90일 후에 배지가 제거 및/또는 교체될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 매일, 격일로, 또는 적어도 3일마다 배지가 교체된다.

특정 실시양태에서, EB로부터 분화되는 RPE 세포가 세정되고 해리된다 (예를 들어, 트립신/EDTA, 콜라게나제 B, 콜라게나제 IV, 또는 디스파제). 특정 실시양태에서, 비-효소성 용액, 예컨대 EDTA를 고농도로 함유하는 용액 예컨대, 예를 들어, 행크스-기반 세포 해리 완충제가 세포를 해리시키는데 사용된다.

RPE 세포가 해리된 세포로부터 선별되고, 별도로 배양되어, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물이 생산된다. RPE 세포와 관련된 특성들을 기초로 RPE 세포가 선별된다. 예를 들어, 자갈형 세포 형태 및 착색에 의해 RPE 세포가 인식될 수 있다, 또한, 첨단부 미세융모에서 또한 발견되는 세포질 단백질인 세포성 레틴알데히드-결합 단백질 (CRALBP) ([Bunt-Milam and Saari, 1983]); 레티노이드 대사에서 수반되는 세포질 단백질인 RPE65 ([Ma et al., 2001], [Redmond et al., 1998]); 베스트 노른자모양 황반 이영양증 유전자의 생성물인 베스트로핀 (VMD2, [Marmorstein et al., 2000]), 및 혈관억제성 성질이 있는 48kD의 분비 단백질인 색소 상피 유래 인자 (PEDF) ([Karakousis et al., 2001], [Jablonski et al., 2000])가 포함되는 RPE의 여러 마커가 공지되어 있다. 별법적으로, 세포 기능, 예컨대 쉐딩된 간체 및 추체 바깥 분절의 포식작용, 미광의 흡수, 비타민 A 대사, 레티노이드 재생, 및 조직 복구 ([Grierson et al., 1994], [Fisher and Reh, 2001], [Marmorstein et al., 1998])를 기초로 RPE 세포가 선별될 수 있다. 평가는 거동 테스트, 형광 혈관조영술, 조직학, 치밀 이음부 전도도, 또는 전자 현미경을 사용하는 평가를 사용하여 또한 수행될 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태는 RPE 세포의 전령 RNA 전사물을 생체 내에서 유래된 세포와 비교함으로써 RPE 세포를 확인하는 방법이다. 특정 실시양태에서, 세포의 분취량을 배아 줄기 세포가 RPE 세포로 분화되는 동안 다양한 간격으로 취하고, 상기 기술된 마커들 중 임의의 것의 발현에 대해 분석한다. 이러한 특징들로 분화된 RPE 세포를 구별한다.

RPE 세포 배양 배지에 하나 이상의 성장 인자 또는 작용제가 보충될 수 있다. 사용될 수 있는 성장 인자에는, 예를 들어, EGF, FGF, VEGF 및 재조합 인슐린-유사 성장 인자가 포함된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 또다른 성장 인자에는 6Ckine (재조합), 액티빈 A, 알파A-인터페론, 알파-인터페론, 앰피레굴린, 안지오제닌, B-내피 세포 성장 인자, 베타 셀룰린, B-인터페론, 뇌-유래 향신경성(neurotrophic) 인자, Cl0 (재조합), 카디오트로핀-1, 섬모 향신경성 인자, 사이토카인-유도 중성구 화학유인물질-1, 내피 세포 성장 보충물, 에오탁신, 표피 성장 인자, 상피 중성구 활성화 펩티드-78, 에리트로포이에틴, 에스트론 수용체-알파, 에스트로겐 수용체-B, 섬유모세포 성장 인자 (산성/염기성, 헤파린-안정화, 재조합), FLT-3/FLK-2 리간드 (FLT-3 리간드), 감마-인터페론, 아교세포주-유래 향신경성 인자, Gly-His-Lys, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, GRO-알파/MGSA, GRO-B, GRO-감마, HCC-1, 헤파린-결합 표피 성장 인자 유사 성장 인자, 간세포 성장 인자, 헤레굴린-알파 (EGF 도메인), 인슐린 성장 인자 결합 단백질-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질-1/IGF-1 복합체, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 II, 2.5S 신경 성장 인자 (NGF), 7S-NGF, 대식세포 염증성 단백질-1B, 대식세포 염증성 단백질-2, 대식세포 염증성 단백질-3 알파, 대식세포 염증성 단백질-3B, 단핵구 화학주성 단백질-1, 단핵구 화학주성 단백질-2, 단핵구 화학주성 단백질-3, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, NGF-B (인간 또는 래트 재조합), 옹코스타틴 M (인간 또는 마우스 재조합), 뇌하수체 추출물, 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 플레이오트로핀, 란테스, 줄기 세포 인자, 간질 세포-유래 인자 1B/프리(pre)-B 세포 성장 자극 인자, 트롬보포이에틴, 전환 성장 인자 알파, 전환 성장 인자-B1, 전환 성장 인자-B2, 전환 성장 인자-B3, 전환 성장 인자-B5, 종양 괴사 인자 (알파 및 B), 및 혈관 내피 성장 인자가 포함된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 작용제에는 사이토카인 예컨대 인터페론-알파 A, 인터페론-알파 A/D, 인터페론-베타., 인터페론-감마, 인터페론-감마-유도성 단백질-10, 인터루킨-1, 인터루킨-2, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-5, 인터루킨-6, 인터루킨-7, 인터루킨-8, 인터루킨-9, 인터루킨-10, 인터루킨-11, 인터루킨-12, 인터루킨-13, 인터루킨-15, 인터루킨-17, 각질세포 성장 인자, 렙틴, 백혈병 억제 인자, 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 대식세포 염증성 단백질-1 알파가 포함된다.

본 발명에 따른 작용제에는 호르몬 및 호르몬 길항제, 예컨대 17B-에스트라디올, 부신겉질자극 호르몬, 아드레노메둘린, 알파-멜라닌세포 자극 호르몬, 융모성 성선자극호르몬, 코르티코스테로이드-결합 글로불린, 코르티코스테론, 덱사메타손, 에스트리올, 난포 자극 호르몬, 가스트린 1, 글루카곤, 성선자극호르몬, 하이드로코르티손, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, L-3,3',5'-트리요오드타이로닌, L-3,3',5-트리요오드타이로닌, 렙틴, 황체형성 호르몬, L-티록신, 멜라토닌, MZ-4, 옥시토신, 부갑상선 호르몬, PEC-60, 뇌하수체 성장 호르몬, 황체호르몬, 프로락틴, 세크레틴, 성 호르몬 결합 글로불린, 갑상선 자극 호르몬, 갑상선자극호르몬 방출 인자, 티록신-결합 글로불린, 및 바소프레신이 또한 포함된다.

추가적으로, 본 발명에 따른 작용제에는 세포외 매트릭스 성분 예컨대 피브로넥틴, 피브로넥틴의 단백질용해성 단편, 라미닌, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 어그리칸(aggrecan), 및 신데칸(syndecan)이 포함된다.

본 발명에 따른 작용제에는 다양한 인자들에 대한 항체, 예컨대 항-저밀도 지질단백질 수용체 항체, 항-황체호르몬 수용체, 내부 항체, 항-알파 인터페론 수용체 사슬 2 항체, 항-c-c 케모카인 수용체 1 항체, 항-CD118 항체, 항-CD119 항체, 항-콜로니 자극 인자-1 항체, 항-CSF-1 수용체/c-fins 항체, 항-표피 성장 인자 (AB-3) 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체, 항-표피 성장 인자 수용체, 포스포-특이적 항체, 항-표피 성장 인자 (AB-1) 항체, 항-에리트로포이에틴 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체 항체, 항-에스트로겐 수용체, C-말단 항체, 항-에스트로겐 수용체-B 항체, 항-섬유모세포 성장 인자 수용체 항체, 항-염기성 섬유모세포 성장 인자 항체, 항-감마-인터페론 수용체 사슬 항체, 항-감마-인터페론 인간 재조합 항체, 항-GFR 알파-1 C-말단 항체, 항-GFR 알파-2 C-말단 항체, 항-과립구 콜로니-자극 인자 (AB-1) 항체, 항-과립구 콜로니-자극 인자 수용체 항체, 항-인슐린 수용체 항체, 항-인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 항체, 항-인터루킨-6 인간 재조합 항체, 항-인터루킨-1 인간 재조합 항체, 항-인터루킨-2 인간 재조합 항체, 항-렙틴 마우스 재조합 항체, 항-신경 성장 인자 수용체 항체, 항-닭 p60 항체, 항-부갑상선 호르몬-유사 단백질 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자 수용체-B 항체, 항-혈소판-유래 성장 인자-알파 항체, 항-황체호르몬 수용체 항체, 항-레티노산 수용체-알파 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체 항체, 항-갑상선 호르몬 핵 수용체-알파 1/Bi 항체, 항-트랜스페린 수용체/CD71 항체, 항-전환 성장 인자-알파 항체, 항-전환 성장 인자-B3 항체, 항-종양 괴사 인자-알파 항체, 및 항-혈관 내피 성장 인자 항체가 또한 포함된다.

본원에 기술된 성장 인자, 작용제, 및 기타 보충물은 단독으로 또는 다른 인자, 작용제 또는 보충물과 조합되어 사용될 수 있다. 인자, 작용제 및 보충물은 세포 배양 직후 또는 세포 배양 후의 임의의 시간에 배지에 첨가될 수 있다.

특정 실시양태에서, RPE 세포가 추가로 배양되어, 성숙한 RPE 세포의 배양물이 생산된다. RPE 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 고밀도 세포 배양물 성장에 적합한 임의의 배지, 예컨대 본원에 기술된 것들일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 세포가 VP-SFM, EGM-2 및 MDBK-MM에서 배양될 수 있다.

본 발명의 상기 기술된 특색들의 특정한 유효한 조합들의 더욱 상세한 설명이 하기에서 제공된다.

특정 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포의 앞서 유래된 배양물이 제공된다. 예를 들어, 주머니배 (수정 또는 핵 이식에 의해 생산됨)로부터, 또는 초기 분할 단계 배아로부터의 하나 이상의 할구로부터 (임의적으로는 나머지 배아를 파괴하지 않으면서), hES 세포가 앞서 유래될 수 있다. 인간 ES 세포가 현탁 배양물로서 배양되어, 배아체 (EB)가 생산된다. 배아체가 약 7-14일 동안 현탁 배양된다. 그러나, 특정 실시양태에서, EB가 7일 미만 (7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 미만, 또는 1일 미만) 또는 14일 초과 동안 현탁 배양될 수 있다. B-27 보충물이 임의적으로 보충된 배지에서 EB가 배양될 수 있다.

현탁 배양에서 EB를 배양한 후, 부착 배양물이 생산되도록 EB를 옮길 수 있다. 예를 들어, EB를 젤라틴이 코팅된 플레이트 상의 배지에 플레이팅할 수 있다. 부착 배양물로서 배양되는 경우, EB는 현탁액에서 성장되는 경우와 동일한 유형의 배지에서 배양될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포가 부착 배양물로서 배양될 때 배지에 B-27 보충물이 보충되지 않는다. 또다른 실시양태에서, 초기에는 배지에 B-27이 보충되지만 (예를 들어, 약 7일 이하 동안), 이어서 부착 배양물로서 나머지 기간에는 B-27의 부재 하에 배양된다. EB가 약 14-28일 동안 부착 배양물로서 배양될 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, EB가 14일 미만 (14일, 13일, 12일, 11일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일 미만, 또는 1일 미만) 또는 28일 초과 동안 배양될 수 있다.

RPE 세포가 EB의 부착 배양물 내의 세포들 가운데서 분화하기 시작한다. RPE 세포는 이의 자갈 형태 및 초기의 착색 출현을 기초로 시각적으로 인식될 수 있다. RPE 세포가 계속 분화함에 따라, RPE 세포들의 클러스터가 관찰될 수 있다.

RPE 세포를 강화시키고, RPE 세포의 실질적으로 정제된 배양물을 수립하기 위해, RPE 세포를 기계적 및/또는 화학적 방법을 사용하여 서로 및 비-RPE 세포로부터 해리시킨다. 그후, RPE 세포의 현탁액을 신선한 배지 및 신선한 배양 용기로 옮겨서, RPE 세포의 강화된 집단을 제공할 수 있다.

RPE 세포의 강화된 배양물을 적합한 배지, 예를 들어, EGM-2 배지에서 배양할 수 있다. 이러한 배지 또는 기능적으로 등가이거나 유사한 배지에 하나 이상의 성장 인자 또는 작용제 (예를 들어, bFGF, 헤파린, 하이드로코르티손, 혈관 내피 성장 인자, 재조합 인슐린-유사 성장 인자, 아스코르브산, 인간 표피 성장 인자)가 보충될 수 있다.

RPE 세포가 성숙된 실시양태를 위해, 원하는 성숙 수준이 수득될 때까지 RPE 세포가, 예를 들어 MDBK-MM 배지에서 추가로 배양될 수 있다. 이는 성숙 동안 착색 수준에서의 증가를 모니터링함으로써 결정될 수 있다. MDBK-MM 배지에 대한 대안으로서, 기능적으로 등가이거나 유사한 배지가 사용될 수 있다. RPE 세포를 성숙시키는데 사용된 특정 배지와 관계없이, 배지에 하나 이상의 성장 인자 또는 작용제가 임의적으로 보충될 수 있다.

RPE 세포의 배양물, 및 따라서 이러한 배양물로부터 제조된 RPE 세포의 제제는 25％, 20％, 15％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％ 미만, 또는 1％ 미만의 비-RPE 세포를 함유하는, 실질적으로 순수한 RPE 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, (비-RPE 세포에 관하여) 실질적으로 순수한 배양물은 다양한 성숙도 수준의 RPE 세포를 함유한다. 또다른 실시양태에서, 배양물은 비-RPE 세포 및 다른 성숙도 수준의 RPE 세포 양쪽 모두에 관하여 실질적으로 순수하다.

상기 실시양태들 중 임의의 것에 대해, RPE 세포 (상기 기술된 바와 같이 특성화됨)가 인간 다능성 줄기 세포, 예를 들어 iPS 세포 및 배아 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 것으로 본 발명에서 고려된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 RPE 세포가 유래된다.

분화된 다능성 줄기 세포-유래 RPE 세포

본 발명은 인간 다능성 줄기 세포-유래 RPE 세포의 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제제는 인간 배아 줄기 세포-유래 RPE 세포의 제제이다. 특정 실시양태에서, 제제는 인간 iPS 세포-유래 RPE 세포의 제제이다. 특정 실시양태에서, 제제는 분화된 ES-유래 RPE 세포를 포함하는 (비-RPE 세포에 관하여) 실질적으로 정제된 제제이다. 비-RPE 세포에 관하여 실질적으로 정제됨은 제제가 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상, 또는 심지어 99％ 초과의 RPE 세포를 포함한다는 것을 의미한다. 바꿔 말하면, RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 25％, 20％, 15％, 10％, 9％, 8％, 7％, 6％, 5％, 4％, 3％, 2％ 미만, 또는 1％ 미만의 비-RPE 세포 유형을 함유한다. 특정 실시양태에서, 이같은 실질적으로 정제된 제제 내의 RPE 세포는 다양한 성숙도/착색 수준의 RPE 세포를 함유한다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포는 비-RPE 세포 및 다른 성숙도 수준의 RPE 세포 양쪽 모두에 관하여 실질적으로 순수하다. 특정 실시양태에서, 제제는 비-RPE 세포에 관하여 실질적으로 정제되고, 성숙한 RPE 세포에 대해 강화된다. 성숙한 RPE 세포에 대해 강화됨은 RPE 세포의 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상, 또는 심지어 99％ 초과가 성숙한 RPE 세포임을 의미한다. 또다른 실시양태에서, 제제는 비-RPE 세포에 관하여 실질적으로 정제되고, 성숙한 RPE 세포보다는 분화된 RPE 세포에 대해 강화된다. 강화됨은 RPE 세포의 30％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상, 또는 심지어 99％ 초과가 성숙한 RPE 세포보다는 분화된 RPE 세포임을 의미한다. 특정 실시양태에서, 성숙한 RPE 세포는 하기의 것들 중 하나 이상에 의해 RPE 세포와 구별된다: 착색 수준, Pax-2, Pax-6 및/또는 티로시나제의 발현 수준. 특정 실시양태에서, 제제는 적어도 1×10³개의 RPE 세포, 5×10³개의 RPE 세포, 1×10⁴개의 RPE 세포, 5×10⁴개의 RPE 세포, 1×10⁵개의 RPE 세포, 2×10⁵개의 RPE 세포, 3×10⁵개의 RPE 세포, 4×10⁵개의 RPE 세포, 5×10⁵개의 RPE 세포, 6×10⁵개의 RPE 세포, 7×10⁵개의 RPE 세포, 8×10⁵개의 RPE 세포, 9×10⁵개의 RPE 세포, 1×10⁶개의 RPE 세포, 5×10⁶개의 RPE 세포, 6×10⁶개의 RPE 세포, 7×10⁶개의 RPE 세포, 8×10⁶개의 RPE 세포, 9×10⁶개의 RPE 세포, 1×10⁷개의 RPE 세포, 5×10⁷개의 RPE 세포, 1×10⁸개의 RPE 세포, 1×10⁹개의 RPE 세포, 또는 심지어 1×10⁹개를 초과하는 RPE 세포를 포함한다.

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는 ES 세포 마커를 발현하지 않는다. 예를 들어, ES 세포 유전자인 Oct-4, nanog, 및/또는 Rex-1의 발현이, 정량적 RT-PCR에 의해 평가 시, ES 세포에서보다 RPE 세포에서 약 100-1000배 더 낮다. 따라서, ES 세포에 비해, RPE 세포는 Oct-4, nanog, 및/또는 Rex-1 유전자 발현에 대해 실질적으로 음성이다.

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는, mRNA 및 단백질 수준에서, 하기의 것들 중 하나 이상을 발현한다: RPE65, 베스트로핀, PEDF, CRALBP, Otx2, 및 MitF. 특정 실시양태에서, RPE 세포는 이러한 마커들 중 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개를 발현한다. 특정 실시양태에서, RPE 세포는, mRNA 및 단백질 수준에서, 하기의 것들 중 하나 이상 (1개, 2개, 또는 3개)을 발현한다: pax-2, pax6, 및 티로시나제. 또다른 실시양태에서, RPE 세포의 성숙도 수준이 pax-2, pax6, 및 티로시나제 중 하나 이상 (1개, 2개, 또는 3개)의 발현에 의해 평가된다.

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는, mRNA 및/또는 단백질 수준에서, 표 1에 열거된 RPE-특이적 유전자들 (pax-6, pax-2, RPE65, PEDF, CRALBP, 베스트로핀, mitF, Otx-2, 및 티로시나제) 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개), 뿐만 아니라 표 1에 열거된 신경망막 유전자들 (CHX10, NCAM, 네스틴, 베타-튜불린) 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 또는 4개)을 발현한다. 그러나, RPE 세포는 ES 세포 특이적 유전자인 Oct-4, nanog, 및/또는 Rex-1을 실질적으로 발현하지 않는다 (예를 들어, ES 세포 특이적 유전자의 발현이, 정량적 RT-PCR에 의해 결정 시, RPE 세포에서 100-1000배 더 적다).

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는, mRNA 및/또는 단백질 수준 수준에서, 표 2에 열거된 유전자들 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 또는 48개 초과)을 발현하고, 이러한 하나 이상의 유전자의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현 수준 (존재하는 경우)에 비해 RPE 세포에서 증가된다. 별법적으로 또는 추가적으로, ES-유래 RPE 세포는, mRNA 및/또는 단백질 수준에서, 표 3에 열거된 유전자들 중 하나 이상 (1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 초과)을 발현하지만, 이러한 하나 이상의 유전자의 발현이 인간 ES 세포에서의 발현 수준에 비해 RPE 세포에서 감소된다 (거의 검출가능하지 않은 수준으로의 감소 포함).

특정 실시양태에서, RPE 세포의 실질적으로 정제된 제제는 상이한 성숙도 수준의 RPE 세포들 (예를 들어, 분화된 RPE 세포 및 성숙한 분화된 RPE 세포)을 포함한다. 이같은 예에서, 착색을 지시하는 마커의 발현과 관련하여 제제 간에 변이성이 있을 수 있다. 예를 들어, 이같은 RPE 세포들에서 RPE65, PEDF, CRALBP, 및 베스트로핀의 발현이 실질적으로 동일할 수 있다. RPE 세포는, 성숙도 수준에 따라, pax-2, pax-6, mitF, 및/또는 티로시나제 중 하나 이상의 발현에 관하여 다를 수 있다.

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는 비-RPE 세포 유형으로 역분화되지 않는 안정적으로 최종적으로 분화된 RPE 세포이다. 특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는 기능성 RPE 세포이다.

특정 실시양태에서, ES-유래 RPE 세포는 동물 내로의 각막, 망막하 또는 기타 이식 또는 투여 시 망막 내로 통합되는 능력을 특징으로 한다.

제제는 GMP 기준에 따라 생산된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 제제는 GMP 순응성 제제이다. 또다른 실시양태에서, 제제에는 바이러스, 박테리아 및/또는 진균류 감염 및 오염이 실질적으로 없다.

특정 실시양태에서, 제제는 보관 및 추후의 사용을 위해 냉동보존된다. 따라서, 본 발명은 실질적으로 정제된 RPE 세포를 포함하는 냉동보존된 제제를 제공한다. 냉동보존된 제제는 냉동보존 동안 및 냉동보존 후에 세포 생육력을 유지하는데 적절한 부형제 내에 제형된다. 특정 실시양태에서, 냉동보존된 제제는 적어도 1×10³개의 RPE 세포, 5×10³개의 RPE 세포, 1×10⁴개의 RPE 세포, 5×10⁴개의 RPE 세포, 1×10⁵개의 RPE 세포, 2×10⁵개의 RPE 세포, 3×10⁵개의 RPE 세포, 4×10⁵개의 RPE 세포, 5×10⁵개의 RPE 세포, 6×10⁵개의 RPE 세포, 7×10⁵개의 RPE 세포, 8×10⁵개의 RPE 세포, 9×10⁵개의 RPE 세포, 1×10⁶개의 RPE 세포, 5×10⁶개의 RPE 세포, 6×10⁶개의 RPE 세포, 7×10⁶개의 RPE 세포, 8×10⁶개의 RPE 세포, 9×10⁶개의 RPE 세포, 1×10⁷개의 RPE 세포, 5×10⁷개의 RPE 세포, 1×10⁸개의 RPE 세포, 1×10⁹개의 RPE 세포, 또는 심지어 1×10⁹개를 초과하는 RPE 세포를 포함한다. 냉동보존된 제제는 상기 상술된 바와 같이 비-RPE 세포에 관하여 및/또는 다양한 성숙도 수준의 RPE 세포에 관하여 순수도 수준이 동일할 수 있다. 특정 실시양태에서, RPE 세포의 냉동보존된 제제 내의 RPE 세포의 65％ 이상이 해동 후 생육력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포의 냉동보존된 제제 내의 RPE 세포의 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 81％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상, 또는 99％ 초과가 해동 후 생육력을 유지한다.

본원에서 제공된 RPE 세포는 인간 세포이다. 그러나, 인간 세포가 인간 환자, 뿐만 아니라 동물 모델 또는 동물 환자에서 사용될 수 있음을 주지한다. 예를 들어, 인간 세포가 망막 변성의 래트, 개, 또는 비-인간 영장류 모델에서 테스트될 수 있다. 추가적으로, 인간 세포가 이를 필요로 하는 동물을 처치하기 위해, 예컨대 수의학 환경에서 치료적으로 사용될 수 있다.

제제는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 내에 제조된 제약 제제로 제형될 수 있다. 바람직한 제제는 눈 (예를 들어, 망막하, 각막, 안구 등)에의 투여를 위해 특히 제형된다.

상기의 것들 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, RPE 세포는 인간 다능성 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 iPS 세포로부터 유래된다. 본원에 기술된 제제들 중 임의의 것이 적합한 인간 다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있는 것으로 본 발명에서 구현된다.

임의의 상기 특색들 중 하나 이상을 포함하는 제제가 구현된다.

실질적으로 정제된 제제 및 특정한 최소 개수의 RPE 세포가 있는 제제가 포함되는 상기 RPE 세포 제제들 중 임의의 것이 본원에 기술된 적응증들 중 임의의 것의 치료에서 사용될 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 추가적으로, 본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 분화된 RPE 세포가 본원에 기술된 적응증들 중 임의의 것의 치료에서 사용될 수 있다.

RPE 세포-기반 치료법

본원에 기술된 방법에 의해 생산되고/되거나 본원에 기술된 RPE 세포 제제의 특징이 있는 RPE 세포 및 RPE 세포를 포함하는 제약 제제는 RPE 세포가 필요하거나 치료를 개선시킬 세포-기반 치료용으로 사용될 수 있다. 하기의 섹션은 RPE 세포-기반 치료법이 이로울 수 있는 다양한 병태를 치료하기 위해 본 발명에 의해 제공된 RPE 세포를 사용하는 방법들을 기술한다. 특정 치료 요법, 투여 경로, 및 임의의 보조 요법이 특정 병태, 병태의 중증도, 및 환자의 전체적인 건강을 기초로 맞춤 제작될 수 있다. 추가적으로, 특정 실시양태에서, RPE 세포의 투여가 임의의 시력 상실 또는 기타 증상을 완전히 복원하는데 효과적일 수 있다. 또다른 실시양태에서, RPE 세포의 투여가 증상의 중증도를 감소시키는데 및/또는 환자의 병태에서의 추가적인 변성을 방지하는데 효과적일 수 있다. RPE 세포를 포함하는 제제의 투여가 상기 또는 하기의 병태들 중 임의의 것을 치료 (전체적으로 또는 부분적으로 증상의 중증도를 감소시키는 것 포함)하는데 사용될 수 있는 것으로 본 발명에서 구현된다. 추가적으로, RPE 세포 투여가 내인성 RPE 층에 대한 임의의 손상의 증상을 치료하는 것을 돕는데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 방법들 중 임의의 것을 사용하여 유래된 RPE 세포 (RPE 세포를 포함하는 제제 포함)가 본원에 기술된 적응증들 중 임의의 것의 치료에서 사용될 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 추가로, 본원에 기술된 RPE 세포를 포함하는 제제들 중 임의의 것이 본원에 기술된 적응증들 중 임의의 것의 치료에서 사용될 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다.

색소성 망막염은 비정상적인 유전학적 프로그래밍을 통해 시각 수용체가 점진적으로 파괴되는 유전성 병태이다. 일부 형태는 비교적 어린 나이에 완전한 실명을 야기하는 한편, 또다른 형태는 시력은 거의 파괴하지 않으면서 특징적인 "뼈 가시(bone spicule)" 망막 변화를 나타낸다. 전세계적으로 약 150만명이 이러한 질환에 걸려 있다. 보통염색체 열성 색소성 망막염을 야기하는 2개의 유전자 결함이 RPE에서 배타적으로 발현되는 유전자들에서 발견되었다. 하나는 비타민 A 대사에 수반되는 RPE 단백질 (시스(cis) 레틴알데히드 결합 단백질)로 인한 것이다. 두번째는 RPE에 독특한 또다른 단백질인 RPE65를 수반한다. 본 발명은 RPE 세포의 투여에 의해 색소성 망막염의 이러한 형태들 양쪽 모두를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 황반 변성이 포함되는 망막 변성과 관련된 장애를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가적인 양상은 유전성 및 후천성 눈 질환이 포함되는 눈 질환의 치료법을 위한 RPE 세포의 용도이다. 후천성 또는 유전성 눈 질환의 예는 연령-관련 황반 변성, 녹내장 및 당뇨 망막병증이다.

연령-관련 황반 변성 (AMD)은 서양 국가들에서 법적인 실명의 가장 통상적인 원인이다. 황반하 망막 색소 상피의 위축 및 맥락막 혈관신생 (CNV)의 발달은 2차적으로 중심 시력의 상실을 초래한다. 중심와하 CNV 및 지도형 위축이 있는 환자 대다수에 대해, 현재 중심 시력의 상실을 방지하기 위해 이용가능한 치료가 없다. AMD의 초기 징후는 망막 색소 상피와 바닥 복합층(Bruch's membrane) 사이의 침적물 (드루젠(drusen))이다. 질환 동안, 맥락막 혈관이 황반의 망막하 공간 내로 발아된다. 이는 중심 시력 및 읽기 능력의 상실에 이른다.

녹내장은 눈에서의 압력이 비정상적으로 증가된 일군의 질환에 주어진 명칭이다. 이는 시야 제한 및 보는 능력에서의 일반적인 감소에 이른다. 가장 통상적인 형태는 원발 녹내장이고, 이의 2가지 형태가 구별된다: 만성 둔각 녹내장 및 급성 폐쇄각 녹내장. 2차 녹내장이 감염, 종양 또는 손상에 의해 야기될 수 있다. 3번째 유형인 유전성 녹내장은 일반적으로 임신 동안의 발달 장애로부터 유래된다. 안구 내의 방수는 눈의 광학 성질에 필요한 특정 압력 하에 있다. 이러한 안압은 정상적으로는 15 내지 20 수은 밀리미터이고, 방수 생산과 방수 유출 간의 평형에 의해 제어된다. 녹내장에서는, 전방각에서의 방수의 유출이 차단되어, 눈 내부의 압력이 상승한다. 녹내장은 일반적으로 중년 또는 노년에 발달되지만, 유전성 형태 및 질환이 아동 및 청년에서 드물지 않다. 안압이 약간만 상승되고, 더욱이 명확한 증상이 없더라도, 점진적인 손상, 특히 시야의 제한이 발생한다. 반면에, 급성 폐쇄각은 통증, 발적, 동공 확장, 및 시력의 중증 장애를 야기한다. 각막이 혼탁해지고, 안압이 크게 상승된다. 질환이 진행됨에 따라, 시야가 점점 좁아지고, 이는 안과 기구인 시야계를 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. 일반적으로 만성 녹내장은 국소적으로 투여된, 방수 유출을 강화시키는 의약에 잘 응답한다. 방수 생산을 감소시키기 위해 전신 활성 물질이 때때로 제공된다. 그러나, 약물 처치가 항상 성공적이지는 않다. 약물 요법이 실패하면, 방수에 대한 새로운 유출로를 생성시키기 위해 레이저 요법 또는 통상적인 수술이 사용된다. 급성 녹내장은 의료 응급상황이다. 안압이 24시간 이내에 감소되지 않으면, 영구적인 손상이 발생한다.

당뇨 망막병증은 진성 당뇨병의 경우에 발생한다. 이는 단백질의 글리코실화의 결과로서 혈관 내피 세포의 기저막의 비후에 이를 수 있다. 이는 초기 혈관 경화 및 모세혈관 동맥류 형성의 원인이다. 이러한 혈관 변화가 수년에 걸쳐 당뇨 망막병증에 이른다. 혈관 변화는 모세혈관 영역의 관류저하를 야기한다. 이는 지질 침착물 (경질 삼출물) 및 혈관증대(vasoproliferation)에 이른다. 임상 경과는 진성 당뇨병 환자들에서 가변적이다. 연령-관련 당뇨병 (II형 당뇨병)에서, 모세혈관 동맥류가 먼저 나타난다. 그후, 손상된 모세혈관 관류로 인해, 망막 실질 내의 경질 및 연질 삼출물 및 점 모양의 출혈이 나타난다. 당뇨 망막병증의 후기 단계에서, 지방 침착물이 황반 주변에 관(corona)처럼 배열된다 (환상 망막염). 이러한 변화에는 눈의 후극에서의 부종이 종종 동반된다. 부종이 황반을 수반하는 경우, 시력에서의 심각한 급성 악화가 있다. I형 당뇨병에서의 주요 문제점은 눈의 기저부 영역에서의 혈관 증식이다. 표준 요법은 눈의 기저부의 침범 영역의 레이저 응고법이다. 초기에 레이저 응고법은 망막의 침범 구역 내에 초점을 맞춰서 수행된다. 삼출물이 지속되면, 레이저 응고법의 구역이 확장된다. 가장 선명한 시력 부위가 있는 망막의 중심, 즉 황반 및 유두황반 다발은 응고될 수 없는데, 시술이 시력에 가장 중요한 망막의 일부분의 파괴를 초래할 것이기 때문이다. 증식이 이미 발생한 경우, 증식을 기초로 병소가 매우 고밀도로 가압되는 것이 종종 필요하다. 이는 망막 영역의 파괴를 일으킨다. 결과는 상응하는 시야 상실이다. I형 당뇨병에서, 알맞은 시기의 레이저 응고법이 실명으로부터 환자를 구할 종종 유일한 기회이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 RPE 세포는 중추 신경계의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. RPE 세포가 CNS 내로 이식될 수 있다. 현재까지, 다수의 상이한 세포 유형이 동물 실험에서 또는 파키슨병 환자에서 임상 연구에서 사용되었다. 예는 인간 태아의 뇌로부터 수득된 태아 세포이다. 도파민성 뉴런 또는 복측 중뇌로부터의 태아 세포가 300명을 초과하는 파키슨병 환자에 대한 임상 연구에서 이미 이식되었다 (리뷰를 위해, [Alexi T, Borlongan CV, Faull RL, Williams CE, Clark RG, Gluckman PD, Hughes PE (2000) (Neuroprotective strategies for basal ganglia degeneration: Parkinson's and Huntington's diseases. Prog Neurobiol 60: 409 470)] 참조). 비-뉴런 세포가 포함되는 다수의 상이한 세포 유형, 예를 들어, 부신 피질로부터의 세포, 생식샘 상의 세르톨리(Sertoli) 세포 또는 경동맥 소체로부터의 사구 세포, 섬유모세포 또는 성상세포가 파키슨병 환자에서 또는 동물 모델에서 자발적으로 또는 유전자 전달 후 도파민을 교체하기 위한 목적으로 사용되었다 ([Alexi et al., 2000, 상기 문헌]). 이식된 태아 도파민성 뉴런의 생존율은 5.8％이고, 이는 징후 및 증상에서의 경미한 개선을 야기하는데 충분하였다 ([Alexi et al., 2000, 상기 문헌]).

최근, 성체 척추동물의 뇌로부터의 뉴런 줄기 세포가 단리되었고, 시험관 내에서 확장되었으며, CNS 내로 재이식된 후, 순수한 뉴런으로 분화되었다. 그러나, CNS에서의 이의 기능은 여전히 불명확하다. 뉴런 전구체 세포가 또한 유전자 전달에 사용되었다 ([Raymon HK, Thode S, Zhou J, Friedman GC, Pardinas JR, Barrere C, Johnson RM, Sah DW (1999) Immortalized human dorsal root ganglion cells differentiate into neurons with nociceptive properties. J Neurosci 19: 5420 5428]). NGF 및 GDNF를 과발현한 슈반(Schwann) 세포가 파키슨증의 모델에서 신경보호 효과가 있었다 ([Wilby MJ, Sinclair SR, Muir EM, Zietlow R, Adcock KH, Horellou P, Rogers JH, Dunnett SB, Fawcett JW (1999) A glial cell line-derived neurotrophic factor-secreting clone of the Schwann cell line SCTM41 enhances survival and fiber outgrowth from embryonic nigral neurons grafted to the striatum and to the lesioned substantia nigra. J Neurosci 19: 2301 2312]).

따라서, 본 발명의 또다른 양상은 신경 질환, 특히 신경계의 질환, 바람직하게는 CNS 질환, 특별히 파키슨병의 치료법을 위한 색소 상피 세포의 용도이다.

CNS의 통상적인 질환의 예는 뇌의 만성 퇴행성 질환인 파키슨병이다. 파키슨병은 기저 핵의 영역 내의 특수 뉴런 세포의 변성에 의해 야기된다. 도파민성 뉴런의 사망은 파키슨병 환자에서 중요한 신경전달물질인 도파민의 합성 감소를 초래한다. 표준 치료법은 L-dopa로의 약물 치료법이다. L-Dopa는 기저 핵에서 도파민으로 대사되고, 그곳에서 결손된 내인성 신경전달물질의 기능을 대신한다. 그러나, L-dopa 치료법은 수년 후 활성을 잃는다.

본원에 기술된 방법을 사용하여 생산된 RPE 세포의 효능을 테스트하기 위해 사용되거나 치료될 수 있는 색소성 망막염의 동물 모델에는 설치류 (rd 마우스, RPE-65 녹아웃(knockout) 마우스, 통 모양(tubby-like) 마우스, RCS 래트), 고양이 (아비시니아(Abyssinian) 고양이), 및 개 (추체 변성 "cd" 개, 진행성 간체-추체 변성 "prcd" 개, 초기 망막 변성 "erd" 개, 간체-추체 형성이상 1, 2 & 3 "rcd1, rcd2 & rcd3" 개, 광수용체 형성이상 "pd" 개, 및 브리아르(Briard) "RPE-65" (개))가 포함된다.

본 발명의 또다른 실시양태는 RPE 계통 또는 전구체를 혈관신생을 방지하는 능력이 증가된 RPE 세포로 유도체화시키는 방법이다. 세포의 정상적인 복제 수명의 10％ 이상이 통과된 경우로 텔로머라제가 짧아지도록 환자로부터의 체세포를 노화시킨 후, 상기 체세포를 핵 이식 도너 세포로 사용하여 혈관형성 억제제 예컨대 색소 상피 유래 인자 (PEDF/EPC-1)를 과발현하는 세포를 생성시킴으로써 이같은 세포가 생산될 수 있다. 별법적으로, 이같은 세포가 혈관신생을 억제하는 외인성 유전자로 유전자 변형될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포 (예를 들어, 인간 배아 줄기 세포, iPS 세포, 또는 기타 다능성 줄기 세포)로부터 분화된 RPE 세포의 제제가 상기의 질환 또는 병태들 중 임의의 것, 뿐만 아니라 내인성 RPE 층의 손상을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 본 발명에서 구현된다. 다양한 성숙도 수준의 분화된 RPE 세포들의 혼합물을 포함하는 RPE 세포의 제제, 뿐만 아니라 성숙한 분화된 RPE 세포 또는 분화된 RPE 세포에 대해 강화된 분화된 RPE 세포의 제제로 이러한 질환들이 치료될 수 있다.

투여 방식

본 발명의 RPE 세포는 국소적으로, 전신에, 또는 국부적으로, 예컨대 주사 (예를 들어, 유리체내 주사)에 의해, 또는 장치 또는 이식물 (예를 들어, 서방성 이식물)의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 유리체절제술 수술을 사용함으로써 망막하 공간 내로 본 발명의 세포가 이식될 수 있다.

투여 방법에 따라, 전해질-균형 완충 수용액, 윤활 중합체가 있는 전해질-균형 완충 수용액, 미네랄 오일 또는 광유(petrolatum)-기반 연고, 기타 오일, 리포솜, 시클로덱스트린, 서방성 중합체 또는 젤에 RPE 세포가 첨가될 수 있다. 이러한 제제가 환자의 일생까지의 기간 동안 하루에 1회 내지 6회로 눈에 국소적으로 투여될 수 있다.

특정 실시양태에서, 망막 변성과 관련된 병태를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법은 국부적으로 (예를 들어, 안내 주사 또는 본 발명의 조성물을 방출하는 서방성 기구의 삽입에 의해), 국소 수단에 의해, 또는 전신 투여에 의해 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 흡입, 경구, 폐내 및 근육내 경로를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 혈류에서의 약물의 생체내 전신 흡수 또는 축적에 이은 전신에 걸친 분포를 허용하는 투여 경로에 의해), 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 조성물의 안내 투여에는, 예를 들어, 유리체 내로의 전달, 각막통과(transcorneal) 전달, 눈의 결막하(sub-conjunctival), 공막주변(juxtascleral), 공막 후방(posterior scleral) 및 테논낭하(sub-tenon) 부분으로의 전달이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,943,145; 6,943,153; 및 6,945,971을 참고하고, 이들의 내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.

본 발명의 RPE 세포는 제약상 허용되는 안약 제형에서 전달될 수 있다. 유리체내 주사에 의해 제형을 투여하는 경우, 예를 들어, 최소 부피가 전달될 수 있도록 용액이 농축되어야 한다. 주사액의 농도는 본원에 기술된 인자들에 따라, 효과적이고 비-독성인 임의의 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자의 치료를 위한 RPE 세포는 약 10⁴개의 세포/㎖의 용량으로 제형된다. 또다른 실시양태에서, 환자의 치료를 위한 RPE 세포는 약 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 10⁹개, 또는 10¹⁰개의 세포/㎖의 용량으로 제형된다.

세포가 눈의 침범 영역, 예를 들어, 전방, 후방, 유리체, 방수, 유리체액, 각막, 홍채/모양체, 수정체, 맥락막, 망막, 공막, 맥락막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막외 공간, 각막내 공간, 각막외 공간, 평면부, 수술에 의해 유도된 무혈관 영역, 또는 황반을 투과하도록 하는데 충분한 시간 동안 조성물이 눈 표면과 접촉되어 유지되도록, RPE 세포가 제약상 허용되는 안약 부형제에서 전달용으로 제형될 수 있다. 본 발명의 작용제를 포함하는 제품 및 시스템, 예컨대 전달 비히클, 특히 제약 조성물로 제형된 것들, 뿐만 아니라 이같은 전달 비히클 및/또는 시스템을 포함하는 키트 또한 본 발명의 일부인 것으로 구현된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법은 본 발명의 RPE 세포를 이식물 또는 장치로서 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 장치는 생체분해성 중합체 매트릭스 내에 분산된 활성제를 포함하는 눈의 의학 병태를 치료하기 위한 생체침식성(bioerodible) 이식물이고, 이때 활성제의 입자의 약 75％ 이상은 직경이 약 10 ㎛ 미만이다. 생체침식성 이식물은 눈 영역에서의 이식용으로 사이징(sizing)된다. 눈 영역은 전방, 후방, 유리체강, 맥락막, 맥락막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막외 공간, 각막내 공간, 각막외 공간, 공막, 평면부, 수술에 의해 유도된 무혈관 영역, 황반, 및 망막 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 생체분해성 중합체는, 예를 들어, 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 공중합체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 내의 락트산 단량체 대 글리콜산 단량체의 비율은 약 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 중량 백분율, 더욱 바람직하게는 약 50/50이다. 추가적으로, PLGA 공중합체는 생체침식성 이식물의 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 내지 약 90 중량％일 수 있다. 특정한 바람직한 실시양태에서, PLGA 공중합체는 생체침식성 이식물의 약 30 내지 약 50 중량％, 바람직하게는 약 40 중량％일 수 있다.

본원에 기술된 방법에 따라 투여되는 조성물의 부피는 투여 방식, RPE 세포의 개수, 환자의 연령 및 체중, 및 치료될 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자들에 또한 좌우된다. 예를 들어, 액체로 경구 투여되는 경우, 본 발명의 조성물을 포함하는 액체 부피는 약 0.5 ㎖ 내지 약 2.0 ㎖, 약 2.0 ㎖ 내지 약 5.0 ㎖, 약 5.0 ㎖ 내지 약 10.0 ㎖, 또는 약 10.0 ㎖ 내지 약 50.0 ㎖일 수 있다. 주사에 의해 투여되는 경우, 본 발명의 조성물을 포함하는 액체 부피는 약 5.0 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 약 50 ㎕ 내지 약 250 ㎕, 약 250 ㎕ 내지 약 1 ㎖, 약 1 ㎖ 내지 약 5 ㎖, 약 5 ㎖ 내지 약 25 ㎖, 약 25 ㎖ 내지 약 100 ㎖, 또는 약 100 ㎖ 내지 약 1 ℓ일 수 있다.

안내 주사에 의해 투여되는 경우, RPE 세포가 환자의 일생에 걸쳐 주기적으로 1회 이상 전달될 수 있다. 예를 들어 RPE 세포가 1년에 1번, 6-12개월 마다 1번, 3-6개월 마다 1번, 1-3개월 마다 1번, 또는 1-4주마다 1번 투여될 수 있다. 별법적으로, 특정 병태 또는 장애에 대해 더욱 빈번한 투여가 바람직할 수 있다. 이식물 또는 장치로 투여되는 경우, RPE 세포는 특정 환자 및 치료될 장애 또는 병태에 필요한 대로 1회, 또는 환자의 일생에 걸쳐 주기적으로 1회 이상 투여될 수 있다. 경시적으로 변화되는 치료 요법이 유사하게 구현된다. 예를 들어, 처음에는 더욱 빈번한 치료가 필요할 수 있다 (예를 들어, 매일 또는 매주 치료). 경시적으로, 환자의 병태가 개선됨에 따라, 덜 빈번한 치료가 필요할 수 있거나, 심지어 추가적인 치료가 필요하지 않을 수 있다.

특정 실시양태에서, RPE 세포의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 면역억제 요법이 환자에게 또한 투여된다. 면역억제 요법은 환자의 일생에 걸쳐 또는 더 짧은 기간 동안 필요할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 RPE 세포가 제약상 허용되는 담체와 함께 제형된다. 예를 들어, RPE 세포가 단독으로 또는 제약 제형의 성분으로서 투여될 수 있다. 대상 화합물은 인간 의약에서의 사용을 위한 임의의 편리한 방식으로 투여용으로 제형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 경구 투여에 적절한 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 무균성의 등장성 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용 직전에 무균성 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 무균성 분말과 조합된 RPE 세포를 포함할 수 있고, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 제형이 의도된 수용자의 혈액과 등장성이게 하는 용질, 또는 현탁 또는 증점제를 함유할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물에서 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비-수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다.

본 발명의 조성물은 보조제, 예컨대 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제를 또한 함유할 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 미생물의 작용이 확실하게 방지될 수 있다. 등장성 작용제, 예컨대 당, 염화나트륨 등이 조성물에 포함되는 것이 또한 바람직할 수 있다. 추가적으로, 주사가능한 제약 형태의 장기 흡수가 흡수를 지연시키는 하나 이상의 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 초래될 수 있다.

투여되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료 조성물은, 당연히, 발열원이 없는 생리학적으로 허용되는 형태이다. 추가로, 바람직하게는 조성물이 각막 또는 맥락막 손상 부위로의 전달을 위해 유리체액 내로 다양한 형태로 주사 또는 캡슐화될 수 있다.

복잡성이 감소된 RPE 세포를 수득하기 위한 인간 배아 줄기 세포 내의 MHC 유전자 조작

본 발명의 RPE 세포를 생산하는 방법을 위한 출발점으로 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 인간 집단 내에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립유전자에 대해 각각 반접합성 또는 동종접합성인 인간 배아 줄기 세포들의 라이브러리로부터 또한 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포들의 상기 라이브러리의 각각의 구성원은 라이브러리의 나머지 구성원들에 비해 상이한 셋트의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동종접합성이다. 특정 실시양태에서, 줄기 세포들의 라이브러리는 인간 집단 내에 존재하는 모든 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동종접합성이다. 본 발명의 환경에서, 하나 이상의 조직적합 항원 유전자에 대해 동종접합성인 줄기 세포들에는 하나 이상의 (그리고, 일부 실시양태에서는 모든) 이같은 유전자에 대해 무효접합성인 세포가 포함된다. 유전자좌에 대한 무효접합성은 유전자가 이러한 유전자좌에서 무효라는 것, 즉 이러한 유전자의 대립유전자 양쪽 모두가 결실 또는 불활성화된 것을 의미한다. 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들어, 유전자 표적화 및/또는 이종접합성 손실 (LOH: loss of heterozygosity)에 의해, 모든 MHC 유전자에 대해 무효접합성인 줄기 세포가 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 US 20040091936, US 20030217374 및 US 20030232430, 및 US 가출원 번호 60/729,173을 참조하고, 이들 모두의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함된다.

따라서, 본 발명은 MHC 복잡성이 감소된 RPE 세포 (RPE 세포의 라이브러리 포함)를 수득하는 방법에 관한 것이다. 환자 매칭(matching)과 관련된 난점들이 제거될 것이 때문에, MHC 복잡성이 감소된 RPE 세포는 치료 용도를 위한 이용가능한 세포의 공급을 증가시킬 것이다. 이같은 세포는 MHC 복합체의 유전자에 대해 반접합성 또는 동종접합성이도록 조작된 줄기 세포로부터 유래될 수 있다.

인간 ES 세포는 세포의 MHC 복합체 내의 자매 염색체의 대립유전자들 중 하나에 대한 변형을 포함할 수 있다. 유전자 변형을 생성시키기 위한 다양한 방법, 예컨대 유전자 표적화를 사용하여 MHC 복합체 내의 유전자를 변형시킬 수 있다. 추가로, 이어서 세포 내의 MHC 복합체의 변형된 대립유전자가 동일한 대립유전자가 자매 염색체 상에 존재하도록 동종접합성이게 조작될 수 있다. 이종접합성 손실 (LOH)과 같은 방법이 MHC 복합체 내의 동종접합성 대립유전자를 갖도록 세포를 조작하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 어버이 대립유전자로부터의 MHC 유전자들의 셋트 내의 하나 이상의 유전자가 반접합성 세포를 생성시키기 위해 표적화될 수 있다. MHC 유전자의 나머지 셋트가 유전자 표적화 또는 LOH에 의해 제거되어, 무효 세포주가 제조될 수 있다. 이러한 무효 세포주는 다른 면에서는 유전적 배경이 균일한 반접합성 또는 동종접합성 은행을 제조하기 위해, HLA 유전자, 또는 개별적인 유전자들의 어레이(array)를 드랍(drop)하기 위한 배아 세포주로서 추가로 사용될 수 있다.

한 양상에서, 라이브러리의 각각의 구성원이 하나 이상의 HLA 유전자에 대해 동종접합성인 ES 세포주들의 라이브러리가 본 발명의 방법에 따라 RPE 세포를 유도하는데 사용된다. 또다른 양상에서, 본 발명은 ES 세포의 여러 세포주들이 선택되어 RPE 세포로 분화된, RPE 세포들 (및/또는 RPE 계통 세포들)의 라이브러리를 제공한다. 이러한 RPE 세포 및/또는 RPE 계통 세포는 세포-기반 치료법을 필요로 하는 환자용으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 실시양태는 복잡성이 감소된 배아 줄기 세포로부터 유래된 인간 RPE 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 인간 RPE 세포를 환자에게 투여하는 것을 수반하는 처치를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계; (b) 환자의 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 단백질을 확인하는 단계; (c) 본 발명의 RPE 세포를 생산하는 방법에 의해 제조된, MHC 복잡성이 감소된 인간 RPE 세포의 라이브러리를 제공하는 단계; (d) 이러한 환자의 세포 상의 MHC 단백질에 매칭되는 RPE 세포를 라이브러리로부터 선별하는 단계; (e) 단계 (d)로부터의 세포 중 임의의 것을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 지역 센터, 예를 들어, 병원, 클리닉, 진료실, 및 기타 건강 관리 시설에서 수행될 수 있다. 추가로, 환자에 대해 매칭되는 것으로 선별된 RPE 세포는, 적은 세포수로 보관된 경우, 환자 처치 전에 확장될 수 있다.

기타 상업 용도 및 방법

본 발명의 특정 양상은 상업적인 양에 도달하기 위한 RPE 세포의 생산에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, RPE 세포가 대규모로 생산되고, 필요하다면 보관되고, 병원, 임상의 또는 기타 건강 관리 시설에 공급된다. 일단 환자가, 예를 들어, 스타가르트 황반 이영양증, 연령-관련 황반 변성 또는 색소성 망막염과 같은 적응증을 나타내면, RPE 세포가 시기적절한 방식으로 주문 및 공급될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상업적인 규모의 세포를 달성하기 위해 RPE 세포를 생산하는 방법, 상기 방법으로부터 유래된 RPE 세포를 포함하는 세포 제제, 뿐만 아니라 병원 및 임상의에게 RPE 세포를 제공하는 (즉, 생산하고, 임의적으로 보관하고, 판매하는) 방법에 관한 것이다

따라서, 본 발명의 특정 양상은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RPE 세포의 생산, 보관 및 보급 방법에 관한 것이다. RPE 생산 후, RPE 세포를 수확 및 정제할 수 있고, 임의적으로는 환자의 치료 전에 보관할 수 있다. RPE 세포는 임의적으로 환자 특이적일 수 있거나, 또는 HLA 또는 기타 면역학적 프로파일을 기초로 특이적으로 선택될 수 있다.

따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 병원, 건강 관리 센터, 및 임상의에게 RPE 세포를 공급하는 방법을 제공하고, 이에 의해 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RPE 세포가 보관되고, 병원, 건강관리 센터 또는 임상의에 의해 요구에 응하여 주문되며, RPE 세포 치료법을 필요로 하는 환자에게 투여된다. 별법적인 실시양태에서, 병원, 건강관리 센터, 또는 임상의가 환자 특이적 데이터를 기초로 RPE 세포를 주문한다. RPE 세포가 환자의 상세사항에 따라 생산되고, 이어서 주문한 병원 또는 임상의에게 공급된다.

특정 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포로부터 RPE 세포를 분화시키는 방법이 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 수행된다. 특정 실시양태에서, 인간 배아 줄기 세포의 초기 유도 또는 생산이 또한 우수 제조 기준 (GMP)에 따라 수행된다. 예를 들어, 세포 또는 배양 배지 내에 바이러스, 박테리아, 또는 진균 감염 또는 오염이 없다는 것을 확실히 하기 위해, 분화 프로토콜 전반에 걸쳐 1회 이상의 시점에 세포를 테스트할 수 있다. 유사하게, 바이러스, 박테리아, 또는 진균 감염 또는 오염이 없다는 것을 확실히 하기 위해 출발 물질로 사용된 인간 배아 줄기 세포를 테스트할 수 있다.

특정 실시양태에서, 분화된 RPE 세포 또는 성숙한 분화된 RPE 세포의 생산이 상업적인 용도를 위해 규모가 확대된다. 예를 들어, 적어도 1×10⁵개, 5×10⁵개, 1×10⁶개, 5×10⁶개, 1×10⁷개, 5×10⁷개, 1×10⁸개, 5×10⁸개, 1×10⁹개, 5×10⁹개, 또는 1×10¹⁰개의 RPE 세포를 생산하는데 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 양상은 매칭되는 세포를 잠재적인 환자 수용자에게 제공할 수 있는 RPE 세포의 라이브러리에 관한 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 조직적합 항원에 대해 동종접합성인 RPE 세포 제제를 제공하는 단계를 포함하는, 제약 산업을 수행하기 위한 방법을 제공하고, 이때 세포는 본원에 개시된 방법에 의해 확장될 수 있는 RPE 세포의 라이브러리를 포함하는 세포들의 은행으로부터 선택되고, 각각의 RPE 세포 제제는 인간 집단 내에 존재하는 하나 이상의 MHC 대립유전자에 대해 반접합성 또는 동종접합성이며, RPE 세포들의 상기 은행은 세포들의 은행 내의 다른 구성원에 비해 MHC 대립유전자의 상이한 셋트에 대해 각각 반접합성 또는 동종접합성인 세포들을 포함한다. 상기 언급된 바와 같이, 유전자 표적화 또는 이종접합성 손실을 사용하여, RPE 세포를 유도하는데 사용되는 반접합성 또는 동종접합성 MHC 대립유전자 줄기 세포를 생성시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 특정 RPE 세포 제제가 환자에게 적절한 것으로 선택된 후, 환자 치료에 적합한 양에 도달하도록 확장된다. 제약 산업을 수행하는 방법은 판매용으로 제제를 보급하기 위한 보급 시스템을 수립하는 단계를 또한 포함할 수 있거나, 제약 제제의 마케팅을 위한 세일즈 그룹을 확립하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 제약, 화학 또는 생물공학 회사, 병원, 또는 학술 또는 연구 기관과 같은 환경에서의 연구 도구로서의 본 발명의 RPE 세포의 용도에 관한 것이다. 이같은 용도에는, 예를 들어, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 RPE 생존을 촉진하는데 사용될 수 있거나 또는 RPE 성숙을 촉진하는데 사용될 수 있는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 분석법에서의 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포의 용도가 포함된다. 확인된 작용제는, 예를 들어, 이의 잠재적인 용도를 단독으로 또는 RPE 세포와 조합하여 평가하기 위해 시험관 내에서 또는 동물 모델에서 연구될 수 있다.

본 발명은 환자로부터 인간 ES 세포를 수득한 후 ES 세포로부터 유래된 RPE 세포를 생성시키고 확장시키는 방법을 또한 포함한다. 이러한 RPE 세포는 보관될 수 있다. 또한, 이러한 RPE 세포는 ES가 수득된 환자 또는 이러한 환자의 친척을 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 기술된 방법 및 용도가 치료, 제약 제제, 및 RPE 세포의 보관에 관련되기 때문에, 본 발명은 이같은 용도에 적절한 RPE 세포의 용액에 또한 관련된다. 따라서, 본 발명은 환자 내로의 주사에 적절한 RPE 세포의 용액에 관한 것이다. 이같은 용액은 생리학적으로 허용되는 액체 (예를 들어, 생리식염수, 완충 용액, 또는 평형 염 용액)에서 제형될 수 있다. 용액 내의 세포의 수는 약 10²개 이상, 약 10⁹개 미만의 세포일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 용액 내의 세포의 개수는 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 또는 10⁸개 내지 약 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개, 또는 10⁹개 범위일 수 있고, 이때 상한 및 하한은 독립적으로 선택되며, 단 하한은 항상 상한보다 낮다. 추가로, 세포는 단일 또는 다중 투여로 투여될 수 있다.

본원에 기술된 방법에 의해 제공되는 세포는 즉각적으로 사용될 수 있거나, 또는 동결되어 수일 또는 수년 동안 냉동보존될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 RPE 세포의 냉동보존된 제제를 제공하고, 이때 상기 냉동보존된 제제는 적어도 약 10¹개, 10²개, 5×10²개, 10³개, 5×10³개, 10⁴개, 5×10⁴개, 10⁵개, 5×10⁵개, 또는 10⁶개를 포함한다. 냉동보존된 제제는 적어도 약 5×10⁶개, 10⁷개, 5×10⁷개, 10⁸개, 5×10⁸개, 10⁹개, 5×10⁹개, 또는 10¹⁰개의 세포를 더 포함할 수 있다. RPE 세포의 냉동보존 방법이 유사하게 제공된다. RPE 세포는 분화 직후에, 시험관내 성숙 후에, 또는 일정 기간의 배양 후에 냉동보존될 수 있다. 제제 내의 RPE 세포는 분화된 RPE 세포 및 성숙한 RPE 세포의 혼합물을 포함할 수 있다.

기타 다능성 세포

상기의 논의들은 독특한 RPE 세포를 제조하기 위한 출발 물질로서의 인간 배아 줄기 세포의 용도, 뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포를 사용하는 제제 및 방법에 집중된다. 그러나, 상기에 상술된 방법 및 용도들이 다른 유형의 인간 다능성 줄기 세포를 출발 물질로 사용하여 RPE 세포 (및 적절한 제제)를 생성시키기 위해 유사하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 또는 하기의 양상 및 실시양태들 중 임의의 것이 다른 유형의 인간 다능성 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포의 방법 및 용도에 유사하게 적용될 수 있는 것으로 본 발명에서 고려된다. 특히, 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포에 배아 줄기 세포의 특징들이 있음을 고려하여, 이같은 세포가 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포와 동일하거나 실질적으로 동일한 RPE 세포를 생산하는데 사용될 수 있음을 주지한다.

본원에서 사용된 용어 "다능성 줄기 세포"에는, 다능성 줄기 세포가 유래된 방법과 관계없이, 배아 줄기 세포, 배아-유래 줄기 세포, 및 유도된 다능성 줄기 세포가 포함된다. 다능성 줄기 세포는 (a) 면역결핍 (SCID) 마우스에 이식되는 경우 기형종을 유도할 수 있고; (b) 3가지 모두의 배엽층의 세포 유형으로 분화될 수 있으며 (예를 들어, 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포 유형으로 분화될 수 있음); 및 (c) 배아 줄기 세포의 하나 이상의 마커를 발현 (예를 들어, Oct 4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등을 발현)하는 줄기 세포로 기능적으로 정의된다. 예시적인 다능성 줄기 세포가, 예를 들어, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예시적인 다능성 줄기 세포에는 주머니배 단계 배아의 ICM으로부터 유래된 배아 줄기 세포, 뿐만 아니라 분할 단계 또는 상실배 단계 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포 (임의적으로는, 나머지 배아를 파괴하지 않으면서 유래됨)가 포함된다. 이같은 배아 줄기 세포는 수정에 의해 또는 체세포 핵 이식 (SCNT), 단성생식, 세포 리프로그래밍 및 숫생식이 포함되는 무성 수단에 의해 생산된 배아 물질로부터 생성될 수 있다. 추가적인 예시적인 다능성 줄기 세포에는 인자들 (본원에서 리프로그래밍 인자들로 지칭됨)의 조합을 발현시키거나 이들의 발현을 유도하는 것에 의해 체세포를 리프로그래밍시킴으로써 생성된 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포)가 포함된다. iPS 세포는 태아, 출생후, 신생, 소아 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키는데 사용될 수 있는 인자에는, 예를 들어, Oct4 (때때로 Oct 3/4로 지칭됨), Sox2, c-Myc, 및 Klf4의 조합이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키는데 사용될 수 있는 인자에는, 예를 들어, Oct 4, Sox2, Nanog, 및 Lin28의 조합이 포함된다. 또다른 실시양태에서, 2개 이상의 리프로그래밍 인자, 3개 이상의 리프로그래밍 인자, 또는 4개의 리프로그래밍 인자를 발현시킴으로써 체세포가 리프로그래밍된다. 또다른 실시양태에서, 추가적인 리프로그래밍 인자들이 확인되고, 체세포를 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍시키도록 단독으로 또는 하나 이상의 다른 리프로그래밍 인자와 조합되어 사용된다.

배아 줄기 세포는 다능성 줄기 세포의 한 예이다. 또다른 예는 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포이다.

특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 배아-유래 세포이다. 또다른 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 체세포 내에서 하나 이상의 리프로그래밍 인자를 발현시키거나 이의 발현을 유도함으로써 생산된 유도된 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포, 예컨대 피부 섬유모세포, 활막 섬유모세포, 또는 폐 섬유모세포이다. 또다른 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포가 아니고, 그보다는 비-섬유모세포성 체세포이다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 리프로그래밍 인자, 3개 이상의 리프로그래밍 인자, 또는 4개의 리프로그래밍 인자를 발현시킴으로써 체세포가 리프로그래밍된다. 또다른 실시양태에서, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 리프로그래밍 인자를 발현시킴으로써 체세포가 리프로그래밍된다. 특정 실시양태에서, 리프로그래밍 인자는 Oct 3/4, Sox2, Nanog, Lin28, c-Myc, 및 Klf4로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 발현된 리프로그래밍 인자들의 셋트는 상기 목록의 리프로그래밍 인자들 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상을 포함하고, 임의적으로 하나 이상의 또다른 리프로그래밍 인자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 체세포를 하나 이상의 리프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 하나 이상의 작용제, 예컨대 소형 유기 분자 작용제와 접촉시킴으로써 상기 또는 또다른 리프로그래밍 인자들 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 발현이 유도된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리프로그래밍 인자가 발현되고 (예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여 발현됨), 하나 이상의 리프로그래밍 인자의 발현이 유도되는 (예를 들어, 소형 유기 분자를 사용하여 유도됨), 조합형 접근법을 사용하여 체세포가 리프로그래밍된다.

특정 실시양태에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 감염에 의해 체세포에서 리프로그래밍 인자가 발현된다. 또다른 실시양태에서, 비-통합성 벡터, 예컨대 에피솜 플라스미드를 사용하여 체세포에서 리프로그래밍 인자가 발현된다. 리프로그래밍 인자가 비-통합성 벡터를 사용하여 발현되는 경우, 전기천공, 형질감염, 또는 벡터로의 체세포의 형질전환을 사용하여 인자가 세포에서 발현될 수 있다.

특정 실시양태에서, 다능성 줄기 세포가 체세포로부터 생성되고, 상기 체세포는 배아, 태아, 신생, 소아 또는 성인 세포로부터 선택된다.

리프로그래밍 인자를 발현시키거나 이의 발현을 유도함으로써 iPS 세포를 제조하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 간략하게, 체세포가 리프로그래밍 인자를 발현하는 발현 벡터로 감염되거나, 이러한 벡터로 형질감염되거나, 또는 다른 방식으로 이러한 벡터가 형질도입된다. 마우스의 경우, 통합성 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, c-myc, 및 Klf4)의 발현이 체세포를 리프로그래밍시키는데 충분하였다. 인간의 경우, 통합성 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자 (Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28)의 발현이 체세포를 리프로그래밍시키는데 충분하였다. 그러나, 더 적은 인자 또는 기타 리프로그래밍 인자의 발현 또는 (이의 발현 유도)가 또한 충분할 수 있다. 추가적으로, 통합성 벡터의 사용은 세포에서 리프로그래밍 인자를 발현시키기 위한 하나의 메커니즘일 뿐이다. 비-통합성 벡터의 사용이 예를 들어 포함되는 또다른 방법이 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 체세포를 하나 이상의 리프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 하나 이상의 작용제, 예컨대 소형 유기 분자 작용제와 접촉시킴으로써 상기 또는 또다른 리프로그래밍 인자들 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 발현이 유도된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리프로그래밍 인자가 발현되고 (예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여 발현됨), 하나 이상의 리프로그래밍 인자의 발현이 유도되는 (예를 들어, 소형 유기 분자를 사용하여 유도됨), 조합형 접근법을 사용하여 체세포가 리프로그래밍된다.

일단 리프로그래밍 인자가 세포에서 발현되면, 세포가 배양된다. 시간이 지남에 따라, ES 특성이 있는 세포들이 배양 접시에 출현한다. 예를 들어, ES 형태를 기초로, 또는 선택가능하거나 검출가능한 마커의 발현을 기초로, 이러한 세포를 채집하고 하위배양한다. ES 세포처럼 보이는 세포의 배양물이 생산되도록 세포가 배양된다. 이러한 세포는 추정 iPS 세포이다.

iPS 세포의 다능성을 확증하기 위해, 세포를 하나 이상의 다능성 분석법에서 테스트할 수 있다. 예를 들어, 세포를 ES 세포 마커의 발현에 대해 테스트할 수 있다; 세포를 SCID 마우스 내로 이식되었을 때 기형종을 생산하는 능력에 대해 평가할 수 있다; 세포를 3가지 배엽층 모두의 세포 유형을 생산하도록 분화되는 능력에 대해 평가할 수 있다.

일단 다능성 iPS 세포가 수득되면 (신선하게 유도되거나, 또는 기존에 유도된 세포의 은행 또는 저장물로부터), 이같은 세포를 사용하여 RPE 세포를 제조할 수 있다.

특정 실시양태에서, iPS 세포의 제조가 RPE 세포 생산에서의 초기 단계이다. 또다른 실시양태에서, 기존에 유래된 iPS 세포가 사용된다. 특정 실시양태에서, 조직에 매칭되는 RPE 세포를 생성시키려는 목적으로 특정 환자 또는 매칭되는 도너로부터의 물질을 사용하여 iPS 세포가 특이적으로 생성된다. 특정 실시양태에서, iPS 세포는 실질적으로 면역원성이지 않은 유니버설(universal) 도너 세포이다.

본 발명이 하기의 예들을 참조로 이제 더욱 상세하게 기술될 것이고, 이러한 예들은 설명적일 뿐이고, 상기 기술된 본 발명을 한정하는 것으로 고려되지 않아야 한다.

실시예

지금까지 일반적으로 기술된 본 발명이 하기의 예들을 참조로 더욱 쉽게 이해될 것이고, 이러한 예들은 본 발명의 특정 양상 및 실시양태의 설명을 위해서만 포함되며, 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다.

2개의 전사 인자 Oct4 (Pou5f1) 및 Nanog의 섬세한 상호 균형에 의해 배아 줄기 세포의 다능성이 부분적으로 유지된다. ES 세포 분화 동안, 이러한 유전자들의 발현이 하향조절되고, 최근의 증거는 이러한 단백질들을 코딩하는 유전자들의 과다메틸화가 원인임을 시사하였다. 이러한 유전자들 중 하나 또는 양쪽 모두의 발현의 손실은 세포 분화와 관련된 유전자의 전사 활성화를 초래한다.

망막 색소 상피 (RPE)는 신경외배엽으로부터 발달되고, 신경 망막 및 맥락막에 인접하여 위치하여, 혈관계와 망막 사이의 장벽을 제공한다. 본원에서 제공된 데이터는, 세포들이 공통 선조를 공유할 수는 있지만, RPE 세포가 최종 분화 후 주변의 광수용체와 유전적 및 기능적으로 구별된다는 것을 가리킨다.

이러한 모델은 본 발명가들의 배양 방법 청구항에 독특한 요소들이 FGF, EGF, WNT4, TGF-베타, 및/또는 산화 스트레스를 통해 작용하여, 페어드-박스(Paired-box) 6 (PAX6)의 발현을 유도하도록 MAP-키나제 및 잠재적인 C-Jun 말단 키나제 경로에 신호를 전달한다는 것을 가리킨다. PAX6는 PAX2와 상승작용적으로 작용하여, RPE-특이적 유전자 예컨대 티로시나제(Tyrosinase) (Tyr), 및 하류 표적 예컨대 RPE-65, 베스트로핀, CRALBP, 및 PEDF가 전사되도록 Mit-F 및 Otx2의 조정을 통해 성숙한 RPE를 최종적으로 분화시킨다.

망막 색소 상피 (RPE)로의 인간 배아 줄기 세포 (hESc) 분화 프로세스 동안의 발달 단계들을 특성화하기 위해, 각각의 대표적인 발달 단계에 주요한 유전자들의 발현 수준을 확인하도록 여러 분석법들이 사용되었다. 여러 유전자가 RPE 세포에서 mRNA 및 단백질로서 독특하게 발현되었음이 발견되었다. 예를 들어, PAX6이 PAX2와 상승작용적으로 작용하여, RPE-특이적 유전자 예컨대 티로시나제 (Tyr), 및 하류 표적 예컨대 RPE-65, 베스트로핀, CRALBP, 및 PEDF가 전사되도록 Mit-F 및 Otx2의 조정을 통해 성숙한 RPE 세포를 최종적으로 분화시킨다는 것이 발견되었다. 중요하게, mRNA 및 단백질 발현의 RPE-특이적 서명이 hES 세포뿐만 아니라, 태아 RPE 및 ARPE-19 세포와 달리 또한 독특하였음이 발견되었다. 본원에 기술된 RPE 세포는 hES 세포, 태아 RPE 세포, 또는 ARPE-19 세포에서 발현되지 않은 다중 유전자들을 발현하였다 (도 3, 4, 및 6). 본 발명의 RPE 세포에서의 mRNA 및 단백질의 독특한 발현은 이러한 RPE 세포를 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포, ARPE-19 세포, 및 태아 RPE 세포와 별개이도록 하는 마커 셋트를 구성한다.

실시예 1: RPE 분화 및 배양

냉동보존된 hES 세포를 해동시키고, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 B-27 보충물이 보충된 MDBK-성장 배지 (Sigma - SAFC Biosciences) 또는 OptimPro SFM (Invitrogen) 내의 Lo-bind Nunclon 페트리 접시 상의 현탁 배양물 내에 놓았다. hES 세포는 초기 분할 단계 인간 배아로부터 생검된 단일 할구들로부터 기존에 유래되었다. 나머지 인간 배아는 파괴되지 않았다. 단일 할구로부터 유래된 2개의 hES 세포주가 사용되었다 - MA01 및 MA09. 세포들을 7-14일 동안 배아체 (EB)로서 배양하였다.

7-14일 후, EB를 돼지 피부로부터의 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. B-27 보충물 없이 L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신물이 보충된 MDBK-성장 배지 또는 OptimPro SFM에서 추가로 14-28일 동안 EB가 부착 배양물로서 성장되었다.

EB의 부착 배양물 내의 세포들 중에서, RPE 세포가 가시적이게 되었고, 이의 자갈형 세포 형태 및 착색의 출현에 의해 인지되었다.

실시예 2: RPE 단리 및 증식

분화된 RPE 세포가 부착 배양물에서 계속 나타남에 따라, 분화된 RPE의 클러스터들이 세포 형상을 기초로 가시적으로 눈에 띠게 되었다. 동결된 콜라게나제 IV (20 ㎎/㎖)를 해동시키고, 7 ㎎/㎖로 희석하였다. 콜라게나제 IV를 RPE 클러스터를 함유하는 부착 배양물에 적용하였다 (6웰 플레이트 내의 각각의 웰에 1.0 ㎖). 약 1-3시간에 걸쳐, 콜라게나제 IV가 세포 클러스터들을 해리시켰다. 배양물 내의 다른 세포로부터 RPE 클러스터를 해리시킴으로써, RPE 세포의 강화된 현탁액이 수득되었다. 강화된 RPE 세포 현탁액을 배양 플레이트로부터 제거하고, 10 ㎖의 MEF 배지가 있는 100 ㎜ 조직 배양 접시로 옮겼다. 착색된 응괴를 줄기 세포 절단 도구 (Swemed-Vitrolife)로 3 ㎖의 MEF 배지를 함유하는 6웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 모든 응괴를 채집한 후, 착색된 세포의 현탁액을 7 ㎖의 MEF 배지를 함유하는 15 ㎖ 코니칼(conical) 튜브로 옮기고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하였다. 0.25％ 트립신 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물 5 ㎖을 세포에 첨가하였다. 세포를 10분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 응괴가 거의 잔존하지 않을 때까지 5 ㎖ 파이펫에서의 파이펫팅(pipetting)에 의해 세포를 분산시켰다. 5 ㎖의 MEF 배지를 세포에 첨가하고, 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 원래의 배양물을 EGM-2 배양 배지 (Cambrex) 내에 1:3으로 스플릿(split)하면서 젤라틴이 코팅된 플레이트 상에 세포를 플레이팅하였다.

RPE 세포의 배양물을 EGM-2 배지에서의 연속 배양에 의해 확장시켰다. 필요하다면, 0.25％ 트립신 EDTA 및 세포 해리 완충제의 1:1 혼합물을 사용하여 1:3 내지 1:6 비율로 세포를 계대시켰다.

성숙한 분화된 RPE 세포를 강화시키기 위해, 세포를 EGM-2에서 거의 합류할 때까지 성장시켰다. 그후, RPE 세포의 성숙을 추가적으로 촉진하는 것을 돕도록 배지를 MDBK-MM (SAFC Biosciences)으로 교체하였다.

실시예 3: 정량적 실시간 역전사 PCR ( qPCR )에 의해 측정된 RPE -특이적 mRNA 발현

망막 색소 상피 (RPE)로의 인간 배아 줄기 세포 (hES) 분화 프로세스 동안의 발달 단계들을 특성화하기 위해, 각각의 대표적인 발달 단계에 주요한 유전자들의 발현 수준을 확인하도록 여러 분석법들이 사용되었다. RPE 분화 프로세스에서 관심이 있는 세포 유형-특이적 mRNA 전사물의 존재도(abundance)의 정량적 및 상대적 측정을 제공하도록 qPCR이 개발되었다. 인간 배아 줄기 세포에서, 눈 발달 동안 신경망막 세포에서, 그리고 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포에서 독특하게 발현되는 유전자들을 결정하기 위해 qPCR이 사용되었다. 각각의 세포 유형에 대한 유전자가 하기 표 1에서 열거된다.

hES-특이적 유전자에는 Oct-4 (POU5F1), Nanog, Rex-1, TDGF-1, SOX-2, 및 DPPA-2가 포함됨이 결정되었다. 신경 외배엽 / 신경 망막에 특이적인 유전자에는CHX10, NCAM, 네스틴, 및 베타-튜불린이 포함되었다. 대조적으로, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 RPE 세포는 PAX-6, PAX-2, RPE-65, PEDF, CRALBP, 베스트로핀, MitF, Otx-2, 및 Tyr을 독특하게 발현하는 것으로 qPCR 측정에 의해 확인되었다.

qPCR 데이터로부터 명백하듯이, hES-특이적 유전자들은 hES로부터 유래된 RPE 세포에서 총체적으로 하향조절된 반면 (거의 1000배), RPE 및 신경외배엽에 특이적인 유전자들은 hES로부터 유래된 RPE 세포에서 크게 상향조절되었다 (약 100배).

또한, 완전히 성숙한 RPE의 qPCR 분석은 RPE-특이적 마커인 RPE65, 티로시나제, PEDF, 베스트로핀, MitF, 및 Pax6의 높은 수준의 발현을 나타냈다. 이러한 발견은 상기 묘사된 개체발생을 추가로 부연하고, MitF의 Pax2-유도 조절 및 최종적으로 분화된 RPE와 관련된 유전자들의 하류 활성화와 관련된 현재의 문헌과 일치한다.

실시예 4: 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 RPE -특이적 단백질 발현

상기 qPCR 결과를 입증하기 위해, 그리고 RPE 세포에서 독특하게 발현되는 단백질들을 확인하기 위해, hES-특이적 및 RPE-특이적 마커들의 부분집합을 웨스턴 블롯에 의한 분석법에 대한 후보물로서 선택함으로써, PCR에 의해 검출된 메시지의 번역을 실연하였다. 웨스턴 분석은 다른 분석법의 로버스트성(robustness)의 절대 척도에 반-정량적 (농도측정법을 통해) 및 정성적 데이터를 제공한다. 결과가 도 6에 도해된다. 액틴이 단백질 로딩 대조군으로 사용되었다.

hES 세포로부터 유래된 RPE 세포는 hES-특이적 단백질인 Oct-4, Nanog, 및 Rex-1을 발현하지 않은 반면, RPE65, CRALBP, PEDF, 베스트로핀, PAX6, 및 Otx2를 발현하였다. 따라서 이러한 단백질은 hES 세포로부터 분화된 RPE 세포의 두드러진 마커이다. 대조적으로, APRE-19 세포는 결론에 이르지 못하는 패턴의 프로테옴(proteomic) 마커 발현을 나타냈다.

실시예 5: RPE 세포의 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링

수동으로 정제된, hES 세포에서 분화된 hRPE는 시험관 내에서 확장 단계 동안 배양물 내에서 상당한 형태학적 이벤트를 겪는다. 박막 배양물 내에 플레이팅된 단일-세포 현탁액이 탈색되고, 세포가 표면 영역에서 증가된다. 세포가 급속하게 분열되고 있을 때 hRPE 세포는 이러한 형태를 유지한다. 그러나, 세포 밀도가 최대 용량에 도달하면, RPE가 이의 특징적인 6각형의 표현형 형상을 취하고, 멜라닌 및 리포푸신의 축적에 의해 착색 수준이 증가된다.

착색 수준이 RCS 래트 모델에서의 본 발명가들의 약리학 연구에서 중요한 역할을 하였다. 따라서, 단일 할구-유래 hES 세포주 MA01 및 MA09 양쪽 모두로부터 유래된 hRPE 세포 상에서의 마이크로어레이를 통해 전반적인 유전자 발현 분석을 수행하였다. 추가적으로, 태아 RPE, ARPE-19, 및 망막모세포종 세포주를 대조군으로서 분석하였다

본 발명가들의 데이터는 이러한 표현형 변화가 이러한 세포들의 전반적인 유전자 발현 패턴에서의 변화, 특히 PAX6, PAX2, Otx2, MitF, 및 Tyr의 발현과 관련된 변화에 의해 구동된다는 것을 가리킨다.

도 7은 각각의 샘플 간의 변이성을 설명하는 유전자들의 최소 개수를 기초로 각각의 샘플이 산재되어 있는 주성분 분석 플롯을 도해한다. 69％의 변이성을 나타내는 성분 1은 세포 유형을 나타내는 한편, 성분 2는 세포주 (즉, 유전적 변이성)을 나타낸다. 명백하게 볼 수 있듯이, 유전자 발현 프로파일의 선형에 가까운 산재는 hES 세포로부터 유래된 hRPE의 발달성 개체발생을 특성화한다.

각각의 hES 세포주를 이의 RPE 대응물에 비교하는 ANOVA 분석을 기초로, 100개의 최고 및 최저 발현 유전자를 선택하였고, 컴퓨터 분석을 수행하여 다능성 및 눈 발달에 관련된 유전자를 선택하였다. 상향조절된 유전자가 표 2에 제시된다. 하향조절된 유전자가 표 3에 제시된다.

본 개시내용은 잘 규정되고 재생가능한 조건 하에 인간 RPE 세포가 인간 ES 세포로부터 쉽게 분화 및 확장될 수 있다는 것을 실연하여, 망막 변성 장애가 있는 환자에 대한 세포의 무한한 공급원을 제시한다. 이러한 세포의 농도는 이용가능성에 의해 한정되지 않을 것이고, 그보다는 개체의 정확한 임상 요구에 맞춰질 수 있다. 의사가 필요하다고 생각하면 환자의 일생에 걸친 동일한 세포 집단의 반복 주입 또는 이식이 또한 가능할 것이다. 또한, RPE 세포가 이로부터 생산될 수 있는, 매칭되는 또는 복잡성이 감소된 HLA hES 세포주의 은행을 생성시키는 능력은 잠재적으로 면역억제성 약물 및/또는 면역조정 프로토콜에 대한 요구를 전적으로 감소시키거나 제거할 수 있다.

본 개시내용은 본원에 기술된 방법에 의해 분화된 RPE 세포가 hES 세포, 태아 RPE 세포, 또는 ARPE-19 세포에 의해 발현되지 않는 여러 유전자를 발현한다는 것을 또한 실연한다. ES-세포에서 유래된 본 발명의 RPE 세포에서의 mRNA 및 단백질 발현의 독특한 지문은 RPE-65, 베스트로핀, PEDF, CRABLP, Otx2, Mit-F, PAX6 및 PAX2와 같은 마커들의 셋트를 구성하고, 이는 이러한 RPE 세포를 당업계의 세포, 예컨대 hES 세포, ARPE-19 세포, 및 태아 RPE 세포와 별개이도록 만든다.

실시예 6: 배아 줄기 세포로부터의 RPE 세포를 사용한 시각 기능의 구조

특정 망막 질환은 망막 색소 상피 (RPE)의 변성을 특징으로 하고, 이는 차례로 광수용체 상실을 초래한다. 예로는 인간의 스타가르트 황반 이영양증 및 왕립 외과 의사회 (RCS: Royal College of Surgeons) 래트의 유전적으로 결정되는 이영양증이 포함된다. 이같은 프로세스는 황반 변성에서 또한 역할을 할 수 있어, 미국에서만 천만명을 초과하여 악영향을 미친다.

본 발명가들은 배아 줄기 세포주로부터 유래되고 GMP-순응성 조건 하에 제작된 고도로 특성화된 인간 RPE 세포가 RCS 래트에서 시각 기능을 최적으로 구조할 수 있는 조건을 연구하였다. MA01- 및 MA09-유래 RPE 세포를 23일령 (P23) RCS 래트의 망막하 공간 내로 주사하고, 시술 후 경구 사이클로스포린 A 면역억제에서 유지시켰다. 역치 시운동 명료도 및 위둔덕으로부터 기록된 휘도 역치에 의해 기능 효능을 테스트하였다. 모든 처치된 눈을 허위로 주사된 눈 및 미처치 눈과 비교하였다. 이러한 기능 평가 후 조직학적 시험을 수행하였다.

실험 결과는 RCS 래트에서 명백한 용량-응답을 나타냈다. 5×10⁴개의 RPE 세포를 포함하는 제제의 투여는 허위보다 약간만 더 양호한 시운동 역치를 제공한 반면, 2×10⁵개의 RPE 세포를 포함한 제제는 대조군에 비해 개선된 성능을 제공하였다. 5 ×10⁵개의 RPE 세포를 포함한 제제는 우수한 성능을 일으켰고, 이는 경시적으로 지속되었다. 동물들은 P60에 0.48 c/d를 수행하였으며, 이는 허위(0.26 c/d)보다 유의하게 (p<0.001) 양호하였고, 처치된 눈들 중 일부는 P90에의 최상의 사례에서 정상적인 역치 (0.6 c/d) 및 0.5 c/d 초과를 나타냈다 (허위 동물 및 미처치 동물은 실질적인 시력 손상을 가리키는 수준인 0.16 c/d의 숫자를 제공하였다).

P94의 위둔덕 기록 또한 RPE 세포가 주사된 눈에서 훨씬 더 낮은 휘도 역치 응답을 나타냈고, 일부 개체의 기록은 정상 범위 내였다. 조직학적 연구는 도너 세포가 내인성의 숙주 RPE에 대해 바로 안쪽으로 반-연속성 착색 세포층으로서 침착되었음을 나타냈다. 도너 RPE 세포는 RPE65 및 베스트로핀에 대해 양성이었고, 이는 이식된 세포가 RPE 세포였고, 세포가 이식 후 이의 세포 운명을 유지한다는 것을 가리킨다.

추가적으로, 이식된 동물은 대조군 동물과 비교하여 광수용체 두께를 유지하였다. 허위 처치군 및 미처치 대조군에서는 오직 1개의 층이 있는 것과 비교하여, RPE로 처치된 동물에서의 광수용체는 구조된 영역에서 세포 4-5개의 두께였다.

결과는 배아 줄기 세포로부터 유래되고 GMP-순응성 조건 하에 제작된 잘 특성화된 RPE 세포가 RCS 래트의 망막하 공간으로의 이식 후 생존하고, 망막 내로 이동하지 않으며, RPE의 특징적인 분자들을 계속 발현한다는 것을 가리킨다. 가장 중요하게는, 이들은 광수용체 변성의 동물 모델에서 용량 의존적인 방식으로 시각 기능의 유의한 구조를 달성한다. 데이터는 이러한 세포들이 인간 질환에서 RPE-구동 광수용체 변성을 동반하는 시력의 악화를 제한하고/하거나 역전시키는데 효과적일 수 있음을 추가로 시사한다.

참조문헌:

모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 전체적으로 거명에 의해 포함되는 것으로 명확하게 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 전체적으로 거명에 의해 본원에 포함된다.

등가물

당업자는 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시양태들의 다수의 등가물을 인지하거나 또는 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이같은 등가물들은 하기의 청구항에 의해 포함되도록 의도된다.

Claims (134)

1. a) 중량 기준 5% 이하의 동물-유래 단백질을 포함하는 배지에서 분리된 인간 배아 줄기(hES) 세포를 현탁 배양으로 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성하는 단계로서, 상기 배양은 7 내지 14일 동안 배양하는 것인 단계로서, 상기 배지는 EGF를 포함하지 않으면서 무혈청인 것인 단계;
   b) 중량 기준 5% 이하의 동물-유래 단백질을 포함하는 배지에서 상기 배아체를 배양 용기에 부착시켜 배양하여, 망막 색소 상피(RPE) 세포를 형성시키는 단계로서, 상기 배지는 무혈청 배지이고 상기 배양은 14일 이상 28일 미만 동안 배양하는 것인 단계;
   c) (b)의 배양물로부터 상기 RPE 세포를 선택하는 단계;
   d) (c) 단계에서 선택된 RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지에서 배양하여, 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물을 생산하는 단계로서, 상기 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물은 배양물 중 성숙한 RPE 세포의 비율이 (c)로부터 수득된 배양물에 비해 증가된 배양물이고, 상기 RPE 세포는 자갈(cobble stone) 형태이고, 상기 성숙한 RPE 세포는 육각형(hexagonal) 형태인 것인 단계; 및
   e) 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물을 증식시켜, 성숙한 RPE 세포의 정제된 배양물을 생산하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 정제된 배양물을 생산하는 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, (d)에서, 상기 성장 인자가 보충된 배지는 성장 인자가 보충된 VP-SFM, EGM-2 및 MDBK-MM으로 이루어진 군으로부터 선택된 배지인 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, (d)의 배지가 헤파린, 하이드로코르티손 및 아스코르브산 중 하나 이상을 함유하는 것인 방법.
5. 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hES 세포가 모든 MHC 대립유전자에 대해 동종접합성 또는 반접합성인 것인 방법.
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14. a) 중량 기준 5% 이하의 동물-유래 단백질을 포함하는 배지에서 분리된 인간 다능성 줄기 세포를 현탁 배양으로 배양하여, 배아체(embryoid body) 또는 응집체(aggregate)를 형성하는 단계로서, 상기 배양은 7 내지 14일 동안 배양하는 것인 단계로서, 상기 배지는 EGF를 포함하지 않으면서 무혈청인 것인 단계;
    b) 중량 기준 5% 이하의 동물-유래 단백질을 포함하는 배지에서 상기 배아체 또는 응집체를 배양 용기에 부착시켜 배양하여, 망막 색소 상피(RPE) 세포를 형성시키는 단계로서, 상기 배지는 무혈청 배지이고 상기 배양은 14일 이상 28일 미만 동안 배양하는 것인 단계;
    c) (b)의 배양물로부터 상기 RPE 세포를 선택하는 단계;
    d) (c) 단계에서 선택된 RPE 세포를 성장 인자가 보충된 배지에서 배양하여, 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물을 생산하는 단계로서, 상기 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물은 배양물 중 성숙한 RPE 세포의 비율이 (c)로부터 수득된 배양물에 비해 증가된 배양물이고, 상기 RPE 세포는 자갈 형태이고, 상기 성숙한 RPE 세포는 육각형 형태인 것인 단계; 및
    e) 성숙한 RPE 세포의 강화된 배양물을 증식시켜, 성숙한 RPE 세포의 정제된 배양물을 생산하는 단계를 포함하는, 망막 색소 상피 (RPE) 세포의 정제된 배양물을 생산하는 방법.
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16. 제14항에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포인 방법.
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18. 제14항에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
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20. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b)의 배지 중 하나 이상의 배지가 무혈청의 B-27 보충물을 함유하는 것인 방법.
21. 제14항에 있어서, 단계 (d)에서, 상기 성장 인자가 보충된 배지는 성장 인자가 보충된 VP-SFM, EGM-2 및 MDBK-MM으로 이루어진 군으로부터 선택된 배지인 것인 방법.
22. 제14항에 있어서, 단계 (d)의 배지가 헤파린, 하이드로코르티손 및 아스코르브산 중 하나 이상을 함유하는 것인 방법.
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27. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 또는 (b)의 배지가 MDBK-GM, MDBK-MM, OptiPro SFM 및 VP SFM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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29. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 배지가 EGM-2 및 MDBK-MM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
30. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 성장 인자가 EGF, bFGF, VEGF 및 재조합 인슐린-유사 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
31. 제14항에 있어서, (d)의 배지가 헤파린, 하이드로코르티손 및 아스코르브산 중 하나 이상을 함유하는 것인 방법.
32. 제1항, 제3항, 제4항, 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계 전에 (b)의 배양물을 효소와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 효소가 트립신, 콜라게나제 및 디스파제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
33. 제14항에 있어서, 인간 다능성 줄기 세포가 모든 MHC 대립유전자에 대해 동형접합성 또는 반접합성인 것인 방법.
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