CN104561203A - 利用猪肺制备胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用猪肺制备胶原蛋白的方法，包括猪肺碱液预处理、灭菌、生物酶解、超滤膜分离浓缩和冷冻干燥五个工艺步骤，大大节省提取和纯化的时间，并且收率可以达到90%以上，本发明所提供的方法所生产的胶原蛋白分子量均匀分布，纯度高，分子量小，活性高，更易于人体吸收；本发明利用猪肺制备胶原蛋白的方法的整个工艺过程条件温和，对环境友好。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性物质制作技术领域，具体涉及一种利用猪肺制备胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是世界上应用最为广泛的生物材料，目前国际年产量在2万吨左右。在医学领域，胶原蛋白作为高生物相容性、高生物活性材料被广泛应用于创伤控制和转化医学。2011年，国际著名的商务测评机构Frost&Sullivan的市场调研数据也表明，胶原蛋白已经成为最有市场竞争力的生物医学材料，用于再生医学，并将进一步发展，成为器官替代医学两大材料之一。美国医药食品管理局(FDA)预测，到2015年胶原蛋白将占有超过20％的生物医学材料市场，年销售额超过200亿美元。
近年来，国际大型企业(如法国罗赛洛(RUSSELOT)集团)开始着手开发合成胶原蛋白及其类似物的研发，但受合成技术限制，水平较低，产量有限，价格昂贵(目前市面合成高纯度胶原蛋白的售价高达3000美元/毫克)，仅能用于科研应用。
一直以来，胶原蛋白主要从动物的组织器官提取，如猪牛的皮、骨骼和筋腱等。胶原蛋白提取方法有传统酸解法，中性盐萃取法和酶法。所有方法都先将鼠尾清洗后置入萃取溶液进行溶解。离心后，粗提液可以作为产品储存也可以进一步加工处理进行精提。中性盐萃取法有着显著的技术劣势，主要是产率低下不足5％，而且杂质蛋白含量高，基本被淘汰了。目前，中国国内最常见的胶原蛋白提取工艺仍然基于传统的酸解法，而且主要原料是牛筋腱(蹄筋)和鼠尾筋腱。由于技术局限，酸解法提取产率只能从鼠尾筋腱湿重计算，产率不超过60％。为了提高萃取率，很多情况下，还要用胰蛋白酶对筋腱进行预处理。虽然，动物筋腱超过90％的组分为胶原蛋白，但是其从动物体的剥离过程人力消耗大，且不易处理干净，造成产品最后污染，特别是动物血液和肌肉组织的污染很难去除。另外，很多动物组织的蛋白酶仍然存在，在酸解过程中，会和酸同时起作用于胶原蛋白，造成胶原蛋白的不规则水解，大大降低了流程的可控性与可重复性，直接影响到胶原蛋白的质量，特别是其特殊的生物学功能性。因此，需要一种简单可行的方法来提取高纯度的胶原蛋白。
能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1398、放线菌166等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，除此之外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素，目前已知的关于制备胶原蛋白的酶种类也挺多，但是其水解效率普遍不是很高，因此，在水解效率上，还需要发现一种新的酶以进一步提高。
蚯蚓丝氨酸蛋白酶是从蚯蚓体内提取得到的一种酸性蛋白酶，属于胰蛋白酶，它能水解蛋白质底物（如酪蛋白），碱性氨基酸的酯及酰胺。PI3-4；20-50℃范围稳定；是一种糖蛋白酶类。
蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为一组蛋白水解酶，对其酶学性质的研究还不够深入；蚯蚓丝氨酸蛋白酶直接切割纤溶酶原及降解纤维蛋白原是其同时具有激酶和纤溶酶活性的分子基础；对不同合成底物具有专一性说明其具有不同活性中心；蚯蚓丝氨酸蛋白酶能对组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的专一性底物S-2288有水解作用，说明其对纤溶酶原的激活方式与t-PA相似，对猪肺***蛋白有很好的水解作用。
我国是养猪大国，每年出栏生猪约6亿头，年产出近50万吨猪肺，资源十分丰富，对于低廉而滞销的猪肺除少数部分被加工利用外，大部分都没有得到有效利用。目前虽然有关于综合利用猪肺的报道，如用于提取PPS和肝素钠，但由于其生产成本高及技术难点问题，真正在工业生产中应用得极少，因此，这些副产物基本上都作猪或宠物饲料，没有得到很好的利用，有的屠宰场甚至未回收处理，既浪费资源，又污染环境。
研究表明，猪肺的总蛋白含量为12.51％±0.41，粗脂肪含量为3.01％±0.20，水分含量为83.17％士0.33，胶原蛋白含量为3.08％±0.12。如果提取胶原蛋白按3％含量，40％的提取率计，这样1公斤的猪肺就能提取出12克左右的胶原蛋白，一年可提取6000吨胶原蛋白；提取之后的残渣还可再次用来加工成各种饲料，从而真正的达到综合利用猪副产物，又减少环境污染。胶原蛋白产品用途十分广泛，市场前景广阔，工业化生产也不用担心市场销路，加工成保健产品或应用于医疗产品中，至少增值20～50倍。
2010年台湾林咏凯等人研究开发从猪肺中制备胶原蛋白，通过对猪肺除血红蛋白、萃取、离心、冷冻干燥，得到医用级胶原蛋白，从一公斤猪肺中得到6.8克胶原蛋白，在经过生化比对后，确认在结构上与目前日本胶原蛋白间无差异。
国内也有部分机构个人在研究利用猪肺制备胶原蛋白，2007年李小勇等测定了猪肺中胶原蛋白的含量，并研究了提取时猪肺中非胶原蛋白成分的去除，胶原蛋白提取过程中各种因素对提取效果的影响，提取的粗胶原蛋白的纯化，纯化后的胶原蛋白的基本理化特性。其研究制备工艺成本高昂不具备工业化价值。
目前，尚未见从猪肺制备胶原蛋白工业化生产的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够降低胶原蛋白生产成本、提高产品品质和收得率的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，同时得到的肽的含量更高，并且产物分离更加彻底，活性高。
本发明为实现上述发明目的，采用如下技术方案：利用猪肺制备胶原蛋白的方法，该
方法采用如下步骤：
（1）预处理：将猪肺清洗干净绞碎成肺浆，加入0.2%-0.4%的碱性溶液进行浸泡20-40min，待用；
（2）称取一定量的预处理后的原料，按照物料比1:2(w/v)-1:4(w/v)加入去离子水，80-85℃灭菌30-40min，冷却至40℃；
（3）按称取预处理后的原料重量的1-3‰加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶；
（4）酶解工艺条件控制：PH控制在6.5-8.0，37-42℃保温水解6-7h，80-85℃灭活30min，然后离心过滤，取过滤清液；
（5）使用截留分子量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液；
（6）将透出液进行干燥，得到胶原蛋白。
所述步骤（1）中，碱性溶液为0.4%的NaOH溶液。
所述步骤（2）中，灭菌温度为85℃，30min。
所述步骤（3）中，加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶的量为称取预处理后的原料重量的2‰。
所述步骤（4）中，PH控制在7.0，保温水解的温度为40℃，水解时间6.5小时，灭活温度为80℃。
所述步骤（5）中，所述超滤设备为管式抗污染膜，孔径为10000道尔顿，经过5-20倍连续洗滤，获得高纯度溶液至含盐量低于0.1%后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
所述步骤（6）中，所述干燥采用冷冻干燥,冻干的时间为48-72h。
本发明方法的积极效果如下：
（1）收率高:本发明的方法在萃取猪肺胶原蛋白时，用碱溶液预处理可以除去猪肺中的脂肪、污渍、杂质，同时使猪肺***的体积至少膨胀百分之五十而形成一膨胀***，不仅有助于胶原蛋白的萃取，以提高胶原蛋白的产率，还有助于去除纤维蛋白组织，以提高胶原蛋白的纯度，胶原蛋白纯度达到95%以上，每公斤猪肺可提取22-25克，收率达到70%以上，提高猪肺的生物利用价值；
（2）品质好：本发明创造性的利用蚯蚓丝氨酸蛋白酶作为酶法制备胶原蛋白的酶原，其水解效率显著提高，这些可以从水解后的肽含量（达到80%以上）等其他数据上看出，其明显高于其他已知酶类；其成品分子量小，活性高，更易于人体吸收；
(3)制备时间短:本发明采用超滤技术可以将纯化时间缩短到几小时，而传统的酸解法和酶解法提取纯化时间需要3天，甚至一周以上。
(4) 应用广泛：本发明涉及的胶原蛋白适用于生物医学研究，也适合做医疗器械产品，还可以应用于体细胞的三维培养；也可以作为细胞贴壁培养的培养基。
Claims (7)
1.一种利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理：将猪肺清洗干净绞碎成肺浆，加入0.2%-0.4%的碱性溶液进行浸泡20-40min，待用；
（2）称取一定量的预处理后的原料，按照物料比1:2(w/v)-1:4(w/v)加入去离子水，80-85℃灭菌30-40min，冷却至40℃；
（3）按称取预处理后的原料重量的0.1-0.3%加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶；
（4）酶解工艺条件控制：PH控制在6.5-8.0，37-42℃保温水解6-7h，80-85℃灭活30min，然后离心过滤，取过滤清液；
（5）使用截留分子量为10000道尔顿的超滤设备进行超滤，并补加纯化水使超滤更加完全，取透出液；
（6）将透出液进行干燥，得到胶原蛋白。
2.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述碱性溶液为0.4%的NaOH溶液。
3.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）中，灭菌温度为85℃，30min。
4.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（3）中，加入蚯蚓丝氨酸蛋白酶的量为称取预处理后的原料重量的2‰。
5.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（4）中，PH控制在7.0，保温水解的温度为40℃，水解时间6.5小时，灭活温度为80℃。
6.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述超滤设备为管式抗污染膜，孔径为10000道尔顿，经过5-20倍连续洗滤，获得高纯度溶液至含盐量低于0.1%后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
7.如权利要求1中所述的利用猪肺制备胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述干燥采用冷冻干燥,冻干的时间为48-72h。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109337951A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-02-15 | 江苏省农业科学院 | 一种基于家禽肺部胶原蛋白的提取方法 |
| CN113425902A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-09-24 | 陈基施展 | 可3d打印的可见光交联胶原蛋白生物墨水及其制备方法 |
| TWI814022B (zh) * | 2021-06-23 | 2023-09-01 | 東海大學 | 豬肺水解產物之製備方法及其用於治療或/及預防代謝相關疾病之用途 |
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2014
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