KR101757785B1

KR101757785B1 - 2-하이드록시아이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid) 생성능이 우수한 류코노스톡 락티스 WIKIM48 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR101757785B1
Application number: KR1020160151824A
Authority: KR
Inventors: 이종희; 박해웅; 최학종; 박보연; 이세희; 황혜련; 손성오; 정민영
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2016-11-15
Filing date: 2016-11-15
Publication date: 2017-07-14

Abstract

본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 항균활성과 2-하이드록시이소카프로익 에시드 생성능을 갖는 프로바이오틱스로서, 사람 또는 동물의 근육 생성 보조, 정장, 항균 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다. 나아가, 발효 식품의 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

2-하이드록시아이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid) 생성능이 우수한 류코노스톡 락티스 WIKIM48 및 이를 포함하는 조성물 {Leuconostoc lactis WIKIM48 having high productivity of 2-hydroxyisocaproic acid and composition for comprising the same}

본 발명은 신규한 류코노스톡 락티스 WIKIM48 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

대표적인 발효식품인 김치에는 유산균을 포함한 다양한 세균이 존재한다. 특히, 유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해를 하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다.

유산균은 크게 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 비피도박테리아 속(Bifidobacteria sp.) 그리고 페디오코커스 속(Pediococcus sp.)으로 나눌 수 있다. 김치는 발효 과정에서 미생물의 우점종의 변이가 발생하고, 유산균에 의한 발효 식품 성분의 대사 작용으로부터 김치의 맛과 풍미가 달라질 수 있다. 김치로부터 분리되는 대사산물인 유기산은 원재료 성분과 유산균의 생물전환능력에 의한 산물이다. 김치의 비휘발성 유기산으로는 젖산(lactic acid), 숙신산(succinic acid), 구연산(citric acid), 말산(malic acid), 타르타르산(tartaric acid), 푸마르산(fumaric acid), 말론산(malonic acid) 등이 있으며, 이 중 김치의 산도 변화 경향은 발효 과정 중 생성되는 젖산과 관련이 있다. 휘발성 유기산으로는 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid), 프로피온산(propionic acid), 부티르산(butyric acid), 발레르산(valeric acid), n-헵탄산(n-heptanoic acid) 등이 있다.

특허문헌 1에는 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 균주가 프로바이오틱스 활성이 우수한 균주 중 하나로 알려져 있으며, 상기 균주의 항균 활성을 개시하고 있다. 하지만 항균활성 물질인 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-Hydroxyisocaproic acid, HICA) 생성에 관한 연구는 보고되지 않고 있다.

한편, 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-Hydroxyisocaproic acid, HICA)은 류신산(leucic acid), 2-하이드록시-4-메틸발레르산(2-hydroxy-4-methylvaleric acid) 또는 2-하이드록시-3-메틸펜탄산(2-hydroxy-4-methypentanoic acid)으로도 불리며, 류신(Leucine)의 최종 대사산물로 알려져 있다. 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 아미노산 전달 효소(Aminotransferase) 작용에 의해 전구물질인 류신으로부터 2-케토이소카프로익 에시드(2-Ketoisocaproic acid)이 생성된 후, 하이드록시이소카프로익 에시드염 탈수소 효소(Hydroxyisocaproate dehydrogenase) 작용에 의해 2-하이드록시이소카프로익 에시드로 생성된다(비특허문헌 1). 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 주로 치즈, 와인, 간장 등과 같은 여러 발효식품에서 발견되거나(비특허문헌 2, 3) 동물시료로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)에 의해 생성되며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 에르기노사(Pseudomonas aeruginosa), 푸소박테리움 누클레아튬(Fusobacterium nucleatum), 칸디다(Candida), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 균에 대하여 항균활성을 나타낸다고 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5).

아울러, 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 근육 보조제로 사용되어 왔으며, 근손실을 방지하고 지연발생근육통(DOMS, Delayed onset muscle soreness)을 완화시킬 수 있다고 보고된 바 있다.

이에, 본 발명자는 본 발명을 통해 김치로부터 분리되고 2-하이드록시이소카프로익 에시드를 생성하는 신규 균주를 발명하고자 한다.

한국 공개특허 제2016-0110744호(2015.09.22)

Mero et al. Journal of the International Society of Sports Nutrition, 2010, 7:1 Van Wyk et al. Journal of Food Science, 1967, Vol.32, Issue 6, pp 664-668 B. A Smit et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, Vol. 64, Issue 3, pp 396-402 M. Sakko et al. International Journal of Antimicrobial Agents, 2012, Vol. 39, Issue 6, pp 539-540 M. Sakko et al. Mycoses, 2013, Vol. 57, Issue 4, pp 214-221 Charles H. Lang et al. Am J Physiol Endocrinol Metab 305: E416-E428, 2013.

본 발명은 2-하이드록시이소카프로익 에시드의 생성능이 우수한 신규한 류코노스톡 속 유산균 균주를 제공하고자 한다.

이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과는 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 류코노스톡 속 유산균 균주인 류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48)을 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48)은 김치 유래의 류코노스톡 락티스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 류코노스톡 락티스 WIKIM48을 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에의 실시예를 통해 분리된 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내는 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 유산균 균주는 도 1의 트리에서 볼 수 있는 바와 같이, 류코노스톡 락티스와 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.

따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rDNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2016년 10월 14일자로 기탁하였다 (수탁번호 KFCC11695P).

본 발명의 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 그람양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultative anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 간균의 형태를 취하고 있다.

본 발명의 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 류코노스톡 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.

본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서는 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 포함되는 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 한 구체예에서는 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1,000억 마리를 투여할 수 있다.

본 발명은 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 류코노스톡 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.

본 발명은 또한 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid) 생성용 조성물을 제공한다. 하기 실시예에서는, 본 발명의 류코노스톡 락티스 WIKIM48이 2-하이드록시이소카프로익 에시드 생성능 테스트에서 높은 생성율을 보이는 것을 확인하였다. 특히, 상기 균주를 24시간 동안 배양한 경우에 2-하이드록시이소카프로익 에시드의 생성량이 최대임을 알 수 있었다. 본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 하기 화학식 1로 표현되는 화합물로, IUPAC명은 2-Hydroxy-4-methylpentanoic acid이며, 류신산(lecic acid) 또는 2-하이드록시-4-메틸발레르산(2-Hydroxy-4-methylvaleric acid)으로 명명될 수 있다.

[화학식 1]

상기 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 항균 활성 및 근육 생성 보조 효과를 나타내는 성분으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상기 2-하이드록시이소카프로익 에시드는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii), 액티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 에르기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 푸소박테리움 누클레아튬(Fusobacterium nucleatum)에 대해 항균활성을 가질 수 있으며, 근손실을 방지하고 지연발생근육통(DOMS, Delayed onset muscle soreness)을 완화시킬 수 있다.

이에, 본 발명은 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 근육 생성 보조용 조성물 및 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물을 포함하는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.

본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 이러한 유리한 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 또는 사료 첨가제 조성물 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명은 또한 류코노스톡 락티스 WIKIM48을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 근육 생성 보조용 식품일 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 류코노스톡 락티스 WIKIM48 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종식물추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

상기 사료는 동물의 식이욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩곡분, 또는 옥수수/콩곡분믹스로 주로 구성되어 있다.

또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.

상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48은 항균 활성 및 근육 생성 보조 효과를 나타내므로, 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 위장 질환의 예방, 근육 생성 보조, 면역강화, 항균 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다. 나아가, 발효 식품의 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 분자계통학적 유연관계를 보여주는 트리이다.
도 2는 본 발명의 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 생장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 6시간동안 배양한 경우의 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 배양시간에 따른 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 OD600 대비 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 확인한 실험 결과를 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 동정

김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS broth에 배양하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAgen, Germany)를 사용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였으며, 16S rRNA gene을 증폭하기 위하여 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 진행하였고, PCR 조건은 denaturation 95℃ 1분, annealing 45℃ 1 분, extension 72℃ 1 분 30초로 30 사이클을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물은 마크로젠(Seoul, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16SrRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.

본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 유산균 균주는 류코노스톡 락티스와 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다(도 1).

이에, 본 발명의 미생물을 류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48)으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2016년 10월 14일자로 기탁하였다(수탁번호 KFCC11695P).

실시예 2: 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 2- 하이드록시이소카프로익 에시드 (2-HICA) 생성능 측정

류코노스톡 락티스 WIKIM48을 MRSB 배지(Difco)에서 30℃에서 1일 동안 배양하고, OD1.0을 시작으로 0, 6, 12, 24, 48시간 조건에 따라 30℃에서 다시 배양하였다. 균주의 배양액을 12,000rpm/10min으로 원심분리하여 침전물을 제외한 상층액을 sep-pak cartridge(Waters Co., Korea)을 이용하여 추출하였다. LC-MS/MS 분석은 AB SCIEX analyst 소프트웨어를 장착한 AB SCIEX TripleTOF® 5600+ 시스템(AB SCIEX)을 사용하여 electro spray ionization(negative) mode에서 실시하였다. ACQUITY UPLC BEH C₁₈ Column(130ÅA, 1.7㎛, 2.1㎜ⅹ100㎜)에서 아세트산 암모늄 10mM을 포함한 물과 아세토나이트릴을 사용하였으며, 95%-60% water(v/v)를 17분 동안, 45%-10% water(v/v)를 8분 동안, 95% water(v/v)를 5분 동안 진행하여 0.5㎖/min의 유속으로 분리하였다. 결과 분석은 XCMS database(https://metlin.scripps.edu/index.php)와 peakview(AB SCIEX) 소프트웨어를 사용하였다. 또한 균주로부터 생성되는 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량은 multiquant(AB SCIEX) 소프트웨어를 이용하여 정량하였다.

2-하이드록시아이소카프로익 에시드의 검출을 위한 LC-MS/MS 분석 조건을 아래 표 1에 나타내었다. 도 2는 배양시간에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48 균주의 성장곡선을 나타내었고, 도 3은 6시간 배양 조건에서의 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타내었으며, 도 4는 배양시간에 따른 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타내었고, 도 5는 OD600 대비 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타낸 그래프이다.

컬럼	ACQUITY UPLC BEH C₁₈ Column(130ÅA, 1.7㎛, 2.1㎜ ⅹ 100㎜)
컬럼 온도	60℃
이동상	시간	이동상A: 10mM 아세트산 암모늄 증류수 희석액		이동상B: 10mM 아세트산 암모늄 아세토나이트릴 희석액
	0.50	95.0		5.0
	14.50	70.0		30.0
	15.50	68.0		32.0
	16.50	60.0		40.0
	17.0	45.0		55.0
	19.0	45.0		55.0
	25.0	10.0		90.0
	30.0	95.0		5.0
유속	0.5㎖/min
오토샘플러 온도	25℃
	음이온 모드, MRM 모드
검출기(MS/MS)	화합물	m/z	충돌에너지	30
	2-Hydroxyisocaproic acid	131
	L-norvaline (Internal standard)	116
	Collision energy spread	15	source Temp	500℃
	curtain gas	30	Ionspray voltage	4500
	Ion source gas(GS1)	40
	Ion source gas(GS2)	50

도 2 내지 5에 따르면, WIKIM48 균주를 6시간 배양한 조건에서 WIKIM48 균주가 MRS broth 대비 약 80배 정도 높은 80ug/ml을 생성하는 것을 확인하였다. 또한, 배양시간에 따른 류코노스톡 락티스 WIKIM48의 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 비교 분석한 결과, 배양 시간이 경과할수록 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량이 증가하는 것을 알 수 있었으며, WIKIM48 균주의 생장곡선을 통해 24시간 배양 조건에서 가장 우수한 2-하이드록시아이소카프로익 에시드 생성량을 나타내는 것을 확인하였다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11695P

20161014

<110> Korea Food Research Institute <120> Leuconostoc lactis WIKIM48 having high productivity of 2-hydroxyisocaproic acid and composition for comprising the same <130> P16R10C1356 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1452 <212> RNA <213> Leuconostoc lactis WIKIM48 <400> 1 ctaatacatg caagtcgaac gcgcagcgaa aggtgcttgc acctttcaag cgagtggcga 60 acgggtgagt aacacgtgga taacctgcct caaggctggg gataacattt ggaaacagat 120 gctaataccg aataaaactt agtatcgcat gatacaaagt tgaaaggcgc tacggcgtca 180 cctagagatg ggtccgcggt gcattagtta gttggtgggg taaaggccta ccaagacaat 240 gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact 300 cctacgggag gctgcagtag ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat ggagcaacgc 360 cgcgtgtgtg atgaaggctt tagggtcgta aagcactgtt gtatgggaag aaatgctaga 420 atagggaatg attctagttc gacggtacca taccagaaag ggacggctaa atacgtgcca 480 gcagccgcgg taatacgtat gtcccgagcg ttatccggat ttattgggcg taaagcgagc 540 gcagacggtt gattaagtct gatgtgaaag cccggagctc aactccggaa tggcattgga 600 aactggttaa cttgagtgtt gtagaggtaa gtggaactcc atgtgtagcg gtggaatgcg 660 tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggcttact ggacaacaac tgacgttgag 720 gctcgaaagt gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacac cgtaaacgat 780 gaatactagg tgttaggagg tttccgcctc ttagtgccga agctaacgca ttaagtattc 840 cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900 cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960 tttgaagctt ttagagatag aagtgttctc ttcggagaca aagtgacagg tggtgcatgg 1020 tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1080 tgttagttgc cagcattcag ttgggcactc tagcgagact gccggtgaca aaccggagga 1140 aggcggggac gacgtcagat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200 tggcgtatac aacgagttgc caacccgcga gggtgagcta atctcttaaa gtacgtctca 1260 gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca cgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1320 agcacgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380 tttgtaatgc ccaaagccgg tggcctaacc ttatggaggg agccgtctaa ggcaggacag 1440 atgactaggg tg 1452

Claims

수탁번호 KFCC11695P의 류코노스톡 락티스 WIKIM48{Leuconostoc lactis WIKIM48}.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P)또는 이의 배양물을 포함하는, 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid, 2-HICA) 생성용 식품 조성물.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P)또는 이의 배양물을 포함하는, 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid, 2-HICA) 생성에 의한 근육 생성 보조용 건강기능식품 조성물.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P)또는 이의 배양물을 포함하는, 2-하이드록시이소카프로익 에시드(2-hydroxyisocaproic acid, 2-HICA) 생성용 사료 조성물.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P)또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 식품 조성물.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물.
류코노스톡 락티스 WIKIM48(Leuconostoc lactis WIKIM48, 수탁번호 KFCC11695P) 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터.