KR101818177B1 - A kit for assaying Endonuclease or Methyltrasnferase activities based on graphene oxide - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 그라핀 산화물 기반 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 (i) 그라핀 산화물(graphene oxide); 및 (ii) 제1말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 갖고, 제2말단 쪽에는 그라핀 산화물과 인접하면 소광되는 발광 표지물질이 표지되고, 제1말단과 제2말단 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 이중가닥 DNA 기질(substrate)을 포함하는, DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 키트, 상기 키트를 이용한 DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 스크리닝 방법 및 상기 키트를 이용한 DNA 절단효소 및 메틸전이효소 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트를 이용하면, DNA에 영향을 미치는 DNA 절단효소 및 메틸전이효소 활성을 신속하고 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 효소의 억제제를 스크리닝하는 방법에도 사용될 수 있으므로, 시간 효율적인 병렬 분석에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a DNA-cleaving enzyme or a graphene oxide-based kit for the analysis of methyltransferase activity, and more particularly, to a kit comprising (i) graphene oxide; And (ii) a single-stranded DNA tail which is capable of binding to a graphene oxide at a first end thereof, and a luminescent labeling substance which is extinguished when adjacent to the graphene oxide at a second end thereof, A DNA cleavage enzyme or a methyltransferase activity assay kit comprising a double stranded DNA substrate including an enzyme cleavage site between ends thereof, a DNA cleavage enzyme or methyltransferase screening method using the kit, A DNA cleavage enzyme and a methyltransferase inhibitor. By using the kit of the present invention, it is possible to rapidly and accurately analyze the DNA-cleaving enzyme and methyltransferase activity affecting DNA, and can also be used in a method of screening an inhibitor of the enzyme. Therefore, It can be widely used.

Description

ＤＮＡ 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 그라핀 산화물 기반 키트{A kit for assaying Endonuclease or Methyltrasnferase activities based on graphene oxide}[0001] The present invention relates to a kit for assaying a DNA-cleaving enzyme or a methyltransferase activity, which comprises a kit for assaying endonuclease or methyltransferase activity based on graphene oxide,

본 발명은 DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 그라핀 산화물 기반 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 (i) 그라핀 산화물(graphene oxide); 및 (ii) 제1말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 갖고, 제2말단 쪽에는 그라핀 산화물과 인접하면 소광되는 발광 표지물질이 표지되고, 제1말단과 제2말단 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 이중가닥 DNA 기질(substrate)을 포함하는, DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 키트, 상기 키트를 이용한 DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 스크리닝 방법 및 상기 키트를 이용한 DNA 절단효소 및 메틸전이효소 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a DNA-cleaving enzyme or a graphene oxide-based kit for the analysis of methyltransferase activity, and more particularly, to a kit comprising (i) graphene oxide; And (ii) a single-stranded DNA tail which is capable of binding to a graphene oxide at a first end thereof, and a luminescent labeling substance which is extinguished when adjacent to the graphene oxide at a second end thereof, A DNA cleavage enzyme or a methyltransferase activity assay kit comprising a double stranded DNA substrate including an enzyme cleavage site between ends thereof, a DNA cleavage enzyme or methyltransferase screening method using the kit, A DNA cleavage enzyme and a methyltransferase inhibitor.

DNA 절단효소(Endonuclease; ENase)는 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid; DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid; RNA)의 내부 인산이에스터 결합(phosphodiester linkage)을 가수분해하는 효소군이다. 이러한 핵산분해효소는 복제, DNA 복구, 및 핵산 재조합과 같은 유전적 정보 전달과 유전자 발현에 관련된 많은 중요한 생물학적 과정에 연관되어있다. 바이러스 복제과정은 숙주 염색체 DNA에 바이러스 유전체 삽입을 위해 통합효소라 불리는, 핵산분해효소 활성을 가지는, 효소를 필요로 한다. 게다가, 제한효소라 불리는, 특정한 인지 자리에서 DNA를 절단하는, 몇몇 핵산분해효소는 분자생물학 분야 특히 유전자 복제와 DNA 지도작성에 필수적이다.Endonuclease (ENase) is a group of enzymes that hydrolyze internal phosphodiester linkage of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). These nucleic acid degrading enzymes are involved in many important biological processes involved in genetic information transmission and gene expression, such as replication, DNA repair, and nucleic acid recombination. The viral replication process requires enzymes that have a nucleic acid degrading enzyme activity, called an integrated enzyme, for the insertion of viral dielectrics into host chromosomal DNA. In addition, some nucleic acid degrading enzymes, called restriction enzymes, that cleave DNA at specific cognitive sites are essential for molecular biology, particularly for gene cloning and DNA mapping.

DNA 메틸전이효소(DNA methyltransferase; MTase)는 S-아데노실 메티오닌(S-adenosyl methionine; SAM)으로부터 DNA 내의 아데닌 또는 시토신 잔기로 메틸 그룹을 전달하여 핵산을 변형시키는 또다른 중요한 효소이다. MTase는 세포분화 및 발생, 유전자 억제, 종양발생과 유전적 질병에 결정적인 역할을 한다. 따라서 ENase 및 MTase 활성을 분석하는 것은 신약개발 및 임상진단 분야에 있어서 매우 중요하다.DNA methyltransferase (MTase) is another important enzyme that transforms nucleic acids by transferring methyl groups from S-adenosyl methionine (SAM) to adenine or cytosine residues in DNA. MTase plays a crucial role in cell differentiation and development, gene suppression, tumorigenesis and genetic diseases. Therefore, analysis of ENase and MTase activity is very important in the field of drug development and clinical diagnosis.

상기 효소들의 활성에 대한 기존의 분석방법은 겔 전기영동, 고성능 액체크로마토그래피(HPLC), 필터결합, 방사능표지 및 효소-결합 면역흡착분석(ELISA)을 포함한다. 대부분의 실험실에서 ENase/MTase 활성 분석을 위해 겔 전기영동법과 동위원소 표지법을 통상적으로 선택하고 있으나, 이들 방법은 시간 소모적이며 비용면에서 효율적이지 못하다. 최근 나노소재에 기초한 비색 및 형광법과 같은 대체적인 접근법이 ENase 활성을 간편하게 그리고 실시간적으로 관찰하기 위해 개발되고 있다. 예를 들어 DNA-금 나노입자 조립체를 사용한 효소-반응 시스템으로 ENase 활성측정이 가능하다.Conventional analytical methods for the activity of the enzymes include gel electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC), filter binding, radioactivity labeling and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Although gel electrophoresis and isotopic labeling are routinely selected for analysis of ENase / MTase activity in most laboratories, these methods are time consuming and not cost effective. Recently, alternative approaches such as colorimetric and fluorescence methods based on nanomaterials have been developed for the easy and real - time observation of ENase activity. For example, an enzyme-reaction system using a DNA-gold nanoparticle assembly can measure ENase activity.

이에, 본 발명자들은 DNA 절단효소 및/또는 메틸전이효소의 활성을 보다 효과적으로 분석하는 방법을 개발하고자, 그라핀 산화물(graphene oxide, GO) 표면과 DNA 단일가닥 부분이 강한 비공유결합을 형성한다는 점 및 그라핀 산화물이 인접한 형광물질을 소광시키는 점을 이용하여 DNA 절단효소 및 메틸전이효소의 DNA 기질(substrate)을 설계하였다.
Accordingly, the present inventors have found that graphene oxide (GO) surfaces and single strand portions of DNA form strong non-covalent bonds in order to develop a more effective method for analyzing the activity of DNA cleavage enzyme and / or methyltransferase The DNA substrate of the DNA cleavage enzyme and the methyltransferase was designed using the fact that the graphene oxide quenches the fluorescent material adjacent thereto.

본 발명의 주된 목적은 DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 그라핀 산화물기반 키트를 제공하는 것이다.The main object of the present invention is to provide a DNA-cleaving enzyme or a graphene oxide-based kit for methyltransferase activity analysis.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 DNA 절단효소를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a DNA-cleaving enzyme using the kit.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 DNA 메틸전이효소를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a DNA methyltransferase using the kit.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 DNA 절단효소의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening an inhibitor of DNA cleavage enzyme using the kit.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용하여 DNA 메틸전이효소의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a method for screening an inhibitor of DNA methyltransferase using the kit.

제1실시양태로서, 본 발명은 (i) 그라핀 산화물(graphene oxide); 및 (ii) 제1말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 갖고, 제2말단 쪽에는 그라핀 산화물과 인접하면 소광되는 발광 표지물질이 표지되고, 제1말단과 제2말단 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 이중가닥 DNA 기질(substrate)을 포함하는, DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 키트를 제공한다.
As a first embodiment, the present invention provides a method of manufacturing a semiconductor device comprising (i) graphene oxide; And (ii) a single-stranded DNA tail which is capable of binding to a graphene oxide at a first end thereof, and a luminescent labeling substance which is extinguished when adjacent to the graphene oxide at a second end thereof, A DNA cleavage enzyme or a kit for assaying methyltransferase activity, which comprises a double-stranded DNA substrate including an enzyme cleavage site between ends thereof.

그라핀 그라핀 산화물(graphene oxide, GO)은 탁월한 전자적, 열적, 그리고 역학적 성질을 가진 단일원자-두께 2D 탄소 나노소재인 그라핀의 수용성 형태의 화합물로, 흑연을 산화시켜 제조될 수 있는 경제적인 소재이다. 최근에는 약물전달, 생체감응장치 및 효소활성분석과 같은 생물학적 응용에 이용되고 있다. 그라핀 산화물은 소수성 소형분자 또는 단일가닥 DNA와 강하게 결합하고, 인접한 형광물질을 소광시키는 능력이 있다.
Graphene oxide (GO) is a water soluble form of graphene, a single atom-thick 2D carbon nanomaterial with excellent electronic, thermal, and mechanical properties. It is an economical Material. Recently, it has been used in biological applications such as drug delivery, biosensor and enzyme activity assay. The graphene oxide has strong ability to bind hydrophobic small molecule or single strand DNA and quench adjacent fluorescent materials.

본 발명은 그라핀 산화물(graphene oxide, GO) 표면과 DNA 일가닥 부분이 강한 비공유결합을 형성한다는 점 및 그라핀 산화물이 인접한 발광물질을 소광시키는 점을 이용하여, DNA 절단효소 및 메틸전이효소의 활성을 분석하기 위한 기질로, 제1말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 갖고, 제2말단 쪽에는 그라핀 산화물과 인접하면 소광되는 발광 표지물질이 표지되고, 제1말단과 제2말단 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 이중가닥 DNA 기질을 설계한 것이 특징이다.The present invention relates to a DNA-cleaving enzyme and a methyltransferase, using a point that a graphene oxide (GO) surface and a single strand of DNA form strong non-covalent bonds and a graphene oxide extinguishes an adjacent luminescent substance Wherein the first end has a single-stranded DNA tail capable of binding with a graphene oxide and the second end is labeled with a luminescent label substance which is extinguished when adjacent to the graphene oxide, And a double-stranded DNA substrate comprising an enzyme cleavage site between the terminal and the second terminal.

본 발명에 따라 설계된 DNA 기질은 도 1에 도시된 다음과 같은 원리에 의해 DNA 절단효소 또는 DNA 메틸전이효소 활성을 분석하는데 사용될 수 있다.A DNA substrate designed according to the present invention can be used to analyze DNA cleavage enzyme or DNA methyltransferase activity by the following principle shown in Fig.

DNA 절단효소는 DNA 기질을 절단할 수 있고, DNA 메틸전이효소는 DNA 절단효소에 의해 DNA 기질이 절단되지 못하도록 DNA 기질을 메틸화시킬 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 기질은 발광 표지물질이 표지되어 있고, 일 말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 가지고 있어서, 발광 표지물질이 DNA 기질에 결합되어 있는 상태에서 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합하게 되면, 발광 표지 물질에 그라핀 산화물이 인접하게 되어 소광된다. 한편, 본 발명의 DNA 기질이 DNA 절단효소에 의해 절단되면 표지물질 포함 부분이 DNA 기질로부터 분리되어 그라핀 산화물으로부터 유리되어 발광이 회복된다.The DNA cleavage enzyme can cleave the DNA substrate, and the DNA methyltransferase can methylate the DNA substrate so that the DNA substrate is not cleaved by the DNA cleavage enzyme. The DNA substrate according to the present invention has a single-stranded DNA tail that is labeled with a luminescent marker and has one end capable of binding with a graphene oxide. Thus, when the luminescent marker is bound to a DNA substrate, When bound to the graphene oxide, the luminescent labeling substance is adjoined to the graphene oxide and is thus extinguished. On the other hand, when the DNA substrate of the present invention is cleaved by a DNA cleavage enzyme, the portion containing the labeling substance is separated from the DNA substrate, liberated from the graphene oxide, and the luminescence is recovered.

단일가닥 DNA 꼬리(tail)의 길이는 20개 이상의 염기이고, 이중가닥 부위의 길이는 13개 염기쌍 이하의 것이 바람직하나 그 외 발광 표지물질이 표지된 DNA 기질이 그라핀 산화물에 의해 소광되는 경우 효소 활성 분석에 사용할 수 있다. The length of a single-stranded DNA tail is more than 20 bases, and the length of the double-stranded region is preferably 13 bases or less. However, when the DNA substrate labeled with the luminescent marker is quenched by graphene oxide, Can be used for activity analysis.

발광 표지물질의 비제한적인 예로는 형광물질이 있다.Non-limiting examples of luminescent markers include fluorescent materials.

형광물질은 공지의 형광물질을 사용할 수 있고, 그 예로서, FAM, HEXTM, NEDTM, ROXTM, Texas RedTM 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.Fluorescent material used may be a known phosphor, as an example, FAM, HEX TM, TM NED, ROX TM, but the like Texas Red TM, but is not limited to this.

형광물질은 형광을 띄는 물질로, 특정한 파장의 에너지를 흡수하여 다른 특정한 파장에서 재방출하는 물질로 방출되는 에너지의 양과 파장은 형광물질 자체와 그 화학적 환경에 의존한다. 이러한 형광물질은 본 발명에서 이중가닥 DNA 말단에 표지되어 그라핀 산화물과 근접했을 때 에너지 전이를 통해 형광이 소광될 수 있다.A fluorescent substance is a fluorescent substance. The amount and wavelength of energy emitted by a substance that absorbs a specific wavelength of energy and re-emits at another specific wavelength depends on the fluorescent substance itself and its chemical environment. Such a fluorescent substance can be quenched through energy transfer when the double-stranded DNA is labeled in the present invention and is in close proximity to the graphene oxide.

본 발명에서 언급되는 DNA 절단효소는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함한다. 엑소뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드의 말단으로부터 순차적으로 가수분해하는 효소이다. 엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 내부의 인산이에스터결합을 가수분해하여 올리고뉴클레오티드를 생성하는데, 기질특이성에 따라 디옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)·디옥시리보뉴클레아제 II(DNase II) 등이 있다. 또한, DNA 염기배열을 특이적으로 절단하는 뉴클레아제의 일종인 제한효소(restriction enzyme)도 포함하고, 미크로코쿠스(micrococcus)라고 하는 구균의 뉴클레아제와 같이, DNA 및 RNA 양쪽을 분해하는 뉴클레아제도 포함한다.The DNA cleavage enzymes mentioned in the present invention include exonuclease and endonuclease. Exonuclease is an enzyme that hydrolyzes sequentially from the end of a polynucleotide. Endonuclease is hydrolyzed by phosphoric acid ester bond in the polynucleotide to produce oligonucleotide. Deoxyribonuclease I (DNase I) and deoxyribonuclease II (DNase II) are available depending on substrate specificity. In addition, a restriction enzyme, which is a type of nuclease that specifically cleaves the DNA base sequence, is also included, and a DNA encoding a DNA polymerase such as a nucleocase of a microorganism called micrococcus, Includes the Nuclear Islands.

분석하고자 하는 DNA 절단효소가 제한 효소인 경우, DNA 기질은 효소 인식 부위를 더 포함할 수 있다. 효소 인식 부위는 DNA 절단효소가 결합할 수 있는 특수한 염기서열로, 통상 효소 인식 부위는 효소의 종류에 따라 그 서열이 다르지만 4 내지 8개의 뉴클레오티드로 구성되고, 앞뒤 역순상 동일 서열의 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, EcoR V는 -GATATC-의 염기서열을, Hae III은 -GGCC-의 염기서열을 특이적으로 인식하여 활성을 나타낸다.When the DNA cleavage enzyme to be analyzed is a restriction enzyme, the DNA substrate may further include an enzyme recognition site. The enzyme recognizing site is a specific nucleotide sequence to which a DNA cleaving enzyme can bind. Usually, the enzyme recognizing site is composed of 4 to 8 nucleotides, although the sequence varies depending on the type of the enzyme. have. For example, EcoR V recognizes the base sequence of -GATATC-, and Hae III recognizes the base sequence of -GGCC- specifically.

본 발명에서 사용되는 DNA 메틸전이효소는 공여자에서 수여자로 메틸 작용기를 전달하는 전이효소의 한 형태이며, 상기 효소는 메틸 공여자로서 S-아데노실 메티오닌(SAM)에서 황원자에 결합된 반응성 메틸기를 사용하여, DNA내의 핵산염기에 메틸화를 일으킬 수 있다. DNA 메틸화는 시스틴 잔기에서 통상 일어난다. 한편, MTase는 해당 ENase와 같은 특이적 서열의 자리를 인식한다. ENase는 외적으로 변화된 서열을 인식하여 결합하는 것이 불가능하므로 메틸화는 효소적 절단으로부터 DNA를 보호하는 작용을 한다.The DNA methyltransferase used in the present invention is a type of transfer enzyme that transfers a methyl functional group from a donor to a recipient, and the enzyme is a methyl donor that uses a reactive methyl group bonded to a sulfur atom in S-adenosylmethionine (SAM) Thereby causing methylation in the nucleic acid base in the DNA. DNA methylation usually occurs in cystine residues. On the other hand, MTase recognizes a specific sequence such as ENase. Because ENase is unable to recognize and bind exogenously altered sequences, methylation acts to protect DNA from enzymatic cleavage.

본 발명의 키트는 효소반응용 완충용액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 효소반응용 완충용액은 당 업계에 공지된 바에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서 사용된 EcoR V와 Hae III 및 Hae III MTase에 대해서는 1X EcoR V 반응 완충액 (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1 mM을 포함하는 pH 7.9의 Tris-HCl 완충액), 1X Hae III 반응 완충액 (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 10 mM, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1 mM을 포함하는 pH 7.9의 Tris-HCl 완충액) 및 1X Hae III MTase 반응 완충액 (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 디티오트레이톨 10 mM, SAM 1.6 mM을 포함하는 pH 8.5 Tris-HCl 완충액)이 각각 사용되었다.
The kit of the present invention may further comprise a buffer solution for enzyme reaction. The buffer solution for the enzyme reaction may be prepared as known in the art. For example, for EcoR V and Hae III and Hae III MTase used in the examples of the present invention, 1X EcoR V reaction buffer (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl 2 10 mM, dithiothreitol 1 mM Tris-HCl buffer, pH 7.9) containing 1 mM Hae III reaction buffer (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, MgCl 2 10 mM, dithiothreitol 1 mM) Buffer) and 1X Hae III MTase reaction buffer (pH 8.5 Tris-HCl buffer containing 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM dithiothreitol and 1.6 mM SAM), respectively.

제2실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계; (iii) 상기 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제3단계; 및 (iv) 제3단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제4단계를 포함하는 DNA 절단효소 스크리닝 방법을 제공한다.According to a second aspect, the present invention provides a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2; (iii) a third step of treating the DNA substrate with an analytical enzyme; And (iv) a fourth step of confirming whether or not the result of the treatment in the third step is emitted or emitted.

이때, 제3단계에서, DNA 기질은 분석 효소에 의해 효소 절단 부위가 절단되거나 절단되지 아니할 수 있다.At this time, in the third step, the DNA substrate may not be cleaved or cleaved by the enzymatic cleavage site.

분석효소에 의해 DNA 기질이 절단되면 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하므로, 제4단계에서 발광이 검출되면 분석 효소를 DNA 절단효소인 것으로 판정할 수 있다.When the DNA substrate is cleaved by the analytical enzyme, the second terminal portion labeled with the labeling substance separates from the first terminal portion having the single-stranded DNA tail and emits light. Therefore, when the luminescence is detected in the fourth step, It can be judged to be an enzyme.

또한, 제4단계에서, 발광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 절단 활성 정도도 측정할 수 있다.
Further, in the fourth step, the degree of luminescence can be measured to measure the degree of DNA cleavage activity of the assay enzyme.

제3실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제2단계; (iii) 제2단계의 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제3단계; 및 (iv) 제3단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제4단계를 포함하는 DNA 절단효소 스크리닝 방법을 제공한다.According to a third aspect, the present invention provides a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) a second step of treating the DNA substrate contained in the kit with an analyte enzyme; (iii) a third step of treating the resultant of the second step with the graphene oxide; And (iv) a fourth step of confirming whether or not the result of the treatment in the third step is emitted or emitted.

이때, 제2단계에서, DNA 기질은 분석 효소에 의해 효소 절단 부위가 절단되거나 절단되지 아니할 수 있다. 분석효소에 의해 DNA 기질이 절단되면 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리된다.At this time, in the second step, the DNA substrate may not be cleaved or cleaved by the enzymatic cleavage site. When the DNA substrate is cleaved by the analytical enzyme, the second terminal portion labeled with the labeling substance is separated from the first terminal portion having the single-stranded DNA tail.

한편, 제3단계에서 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합된다. 제3단계에서 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되었을 때 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있으면 소광되고, 표지물질이 분석 효소에 의해 절단되어 분리되면 발광한다.In the third step, on the other hand, a DNA substrate with single-stranded DNA tail is bound to the graphene oxide. In the third step, when the DNA substrate is bound to the graphene oxide, it is extinguished if the labeling substance is connected to the DNA substrate. When the labeling substance is cleaved by the analyzing enzyme, it is released.

따라서, 제4단계에서 발광이 검출되면 분석 효소가 DNA 절단효소인 것으로 판정할 수 있다. Therefore, if luminescence is detected in the fourth step, it can be determined that the analyzing enzyme is a DNA cleaving enzyme.

또한, 제4단계에서, 발광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 절단 활성 정도도 측정할 수 있다.
Further, in the fourth step, the degree of luminescence can be measured to measure the degree of DNA cleavage activity of the assay enzyme.

제4실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계; (iii) 상기 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제3단계; (iv) 제3단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제4단계; (v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하여, DNA 메틸전이효소를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2; (iii) a third step of treating the DNA substrate with an analytical enzyme; (iv) a fourth step of treating the resultant product of the third step with a DNA-cleaving enzyme; (v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted.

이때, 제3단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화된 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있다. In this case, when the DNA substrate is methylated by the analyzing enzyme in the third step, the DNA substrate in the fourth step may not be cleaved at the enzyme cleavage site.

한편, 제3단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화되지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다. On the other hand, in the case where the DNA substrate is not methylated by the analyzing enzyme in the third step, in the fourth step, the DNA cleavage site of the DNA substrate is cleaved and the second terminal side labeled with the labeling substance is a single- And is emitted separately from the terminal side portion.

따라서, 제5단계에서 소광이 검출되면 분석 효소가 DNA 메틸전이효소인 것으로 판정할 수 있다. Therefore, if quenching is detected in the fifth step, it can be determined that the analyzing enzyme is a DNA methyltransferase.

또한, 제5단계에서, 소광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 메틸전이 활성 정도도 측정할 수 있다.
In the fifth step, the degree of extinction can be measured to measure the DNA methyltransferase activity of the analyte.

제5실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제2단계; (iii) 제2단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제3단계; (iv) 제3단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제4단계; 및 (v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하여, DNA 메틸전이효소를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) a second step of treating the DNA substrate contained in the kit with an analyte enzyme; (iii) a third step of treating the resultant product of the second step with a DNA-cleaving enzyme; (iv) a fourth step of treating the resultant of the third step with graphene oxide; And (v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment of the fourth step is emitted or emitted. The present invention also provides a method for screening a DNA methyltransferase.

이때, 제2단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화된 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있다. 한편, 제4단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합된다. At this time, when the DNA substrate is methylated by the analyzing enzyme in the second step, the DNA substrate in the third step may not cleave the enzyme cleavage site. Meanwhile, in the fourth step, a DNA substrate with a single stranded DNA tail is bound to the graphene oxide.

제2단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화되지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다.When the DNA substrate is not methylated by the analyzing enzyme in the second step, the DNA substrate is cleaved in the third step, and the second terminal portion labeled with the labeling substance is cleaved at the first end with a single-stranded DNA tail And emits light.

제2단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화되면, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니하며, 제4단계에서 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합될 때 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어 소광이 유지된다. 따라서, 제5단계에서 소광이 검출되면 분석 효소가 DNA 메틸전이효소인 것으로 판정할 수 있다.When the DNA substrate is methylated by the analyzing enzyme in the second step, the DNA substrate does not cleave the enzyme cleavage site in the third step, and when the DNA substrate having the single-stranded DNA tail is bound to the graphene oxide in the fourth step The substrate is connected to the labeling material to maintain quenching. Therefore, if quenching is detected in the fifth step, it can be determined that the analyzing enzyme is a DNA methyltransferase.

또한, 제5단계에서, 소광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 메틸전이 활성 정도도 측정할 수 있다.
In the fifth step, the degree of extinction can be measured to measure the DNA methyltransferase activity of the analyte.

제6실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계; (iii) DNA 절단효소에 분석물질을 처리하는 제3단계; (iv) 상기 DNA 기질에 제3단계 처리 결과물을 처리하는 제4단계; 및 (v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하여, DNA 절단효소 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to a sixth aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2; (iii) a third step of treating the DNA-cleaving enzyme with the analyte; (iv) a fourth step of processing the result of the third step treatment on the DNA substrate; And (v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted.

이때, 제3단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광을 유지한다.In this case, if the analyte inhibits the activity of the DNA cleavage enzyme in the third step, the DNA cleavage site of the DNA substrate may not be cleaved in the fourth step, and the labeling substance may be ligated to the DNA substrate bound to the graphene oxide And keeps the extinction.

제3단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다.In the case where the analyte does not inhibit the activity of the DNA cleavage enzyme in the third step, the DNA cleavage site of the DNA substrate is cleaved in the fourth step, and the second terminal region labeled with the labeling substance has a single stranded DNA tail And is emitted separately from the terminal side portion.

따라서, 제5단계에서 소광이 유지되면 분석물질이 DNA 절단효소 억제제인 것으로 판정할 수 있다.
Therefore, if the quenching is maintained in the fifth step, it can be determined that the analyte is a DNA-cleaving enzyme inhibitor.

제7실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) DNA 절단효소에 분석물질을 처리하는 제2단계; (iii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 제2단계 처리 결과물을 처리하는 제3단계; (iv) 제3단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제4단계; 및 (v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하여, DNA 절단효소 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to a seventh aspect, the present invention provides a method for preparing a kit, comprising the steps of: (i) preparing a kit according to the present invention; (ii) a second step of treating the DNA-cleaving enzyme with the analyte; (iii) treating the DNA substrate contained in the kit with a second-stage treatment product; (iv) a fourth step of treating the resultant of the third step with graphene oxide; And (v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted.

이때, 제2단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 제4단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광된다. In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA cleavage enzyme in the second stage, the DNA substrate in the third stage may not be cleaved in the enzyme cleavage site, and in the fourth stage, a DNA substrate having a single stranded DNA tail And is bound to a graphene oxide, wherein the labeling substance is connected to a DNA substrate bound to the graphene oxide, thereby being quenched.

제2단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다.In the case where the analyte does not inhibit the activity of the DNA cleavage enzyme in the second step, the DNA cleavage site of the DNA substrate is cleaved in the third step, and the second terminal side labeled with the labeling substance is a single stranded DNA tail And is emitted separately from the terminal side portion.

따라서, 제5단계에서 소광이 검출되면 분석물질이 DNA 절단효소 억제제인 것으로 판정할 수 있다.
Therefore, when the quenching is detected in the fifth step, it can be judged that the analyte is a DNA cleaving enzyme inhibitor.

제8실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계; (iii) DNA 메틸전이효소에 분석물질을 처리하는 제3단계; (iv) 상기 DNA 기질에 제3단계 처리 결과물을 처리하는 제4단계; (v) 제4단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제5단계; 및 (vi) 제5단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제6단계를 포함하여, DNA 메틸전이효소 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to an eighth aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2; (iii) a third step of treating the DNA methyltransferase with an analyte; (iv) a fourth step of processing the result of the third step treatment on the DNA substrate; (v) a fifth step of treating the DNA cleavage enzyme with the resultant product of the fourth step; And (vi) a sixth step of confirming whether or not the result of the treatment of the fifth step is emitted or emitted, thereby providing a screening method for a DNA methyltransferase inhibitor.

이때, 제3단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되지 아니하여, 제5단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다.In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA methyltransferase in the third step, the DNA substrate is not methylated by the DNA methyltransferase in the fourth step, and in the fifth step, the DNA substrate cleaves the enzyme cleavage site And the second terminal portion labeled with the labeling substance is separated from the first terminal portion having the single-stranded DNA tail and emits light.

제3단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되어, 제5단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니하여 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광을 유지한다.If the analyte does not inhibit the activity of the DNA methyltransferase in the third step, the DNA substrate is methylated by the DNA methyltransferase in the fourth step, and the DNA substrate is not cleaved for the enzyme cleavage site in the fifth step The labeling substance is connected to the DNA substrate bound to the graphene oxide to maintain quenching.

따라서, 제6단계에서 발광이 검출되면 분석물질이 DNA 메틸전이효소 억제제인 것으로 판정할 수 있다.
Therefore, if luminescence is detected in the sixth step, it can be determined that the analyte is a DNA methyltransferase inhibitor.

제9실시양태에 의하면, 본 발명은 (i) 전술한 본 발명에 따른 키트를 준비하는 제1단계; (ii) DNA 메틸전이효소에 분석물질을 처리하는 제2단계; (iii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 제2단계 처리 결과물을 처리하는 제3단계; (iv) 제3단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제4단계; (v) 제4단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제5단계; 및 (vi) 제5단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제6단계를 포함하여, DNA 메틸전이효소 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.According to a ninth aspect of the present invention, there is provided a kit comprising: (i) a first step of preparing a kit according to the present invention; (ii) a second step of treating the DNA methyltransferase with the analyte; (iii) treating the DNA substrate contained in the kit with a second-stage treatment product; (iv) a fourth step of treating the resultant product of the third step with a DNA-cleaving enzyme; (v) a fifth step of treating the resultant of the fourth step with the graphene oxide; And (vi) a sixth step of confirming whether or not the result of the treatment of the fifth step is emitted or emitted, thereby providing a screening method for a DNA methyltransferase inhibitor.

이때, 제2단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되지 아니하여, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광한다.In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA methyltransferase in the second step, the DNA substrate is not methylated by the DNA methyltransferase in the third step, and in the fourth step, the DNA substrate cleaves the enzyme cleavage site And the second terminal portion labeled with the labeling substance is separated from the first terminal portion having the single-stranded DNA tail and emits light.

제2단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되어, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 제5단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광된다.If the analyte does not inhibit the activity of the DNA methyltransferase in the second step, the DNA substrate is methylated by the DNA methyltransferase in the third step, and the DNA substrate in the fourth step may not cleave the enzyme cleavage site In a fifth step, a DNA substrate with a single stranded DNA tail is bound to the graphene oxide, where the label is attached to a DNA substrate bound to the graphene oxide and is thus quenched.

따라서, 제6단계에서 발광이 검출되면 분석물질이 DNA 메틸전이효소 억제제인 것으로 판정할 수 있다.
Therefore, if luminescence is detected in the sixth step, it can be determined that the analyte is a DNA methyltransferase inhibitor.

본 발명의 키트를 이용하면, DNA에 영향을 미치는 DNA 절단효소 및 메틸전이효소 활성을 신속하고 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 효소의 억제제를 스크리닝하는 방법에도 사용될 수 있으므로, 시간 효율적인 병렬 분석에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the kit of the present invention, it is possible to rapidly and accurately analyze the DNA-cleaving enzyme and methyltransferase activity affecting DNA, and can also be used in a method of screening an inhibitor of the enzyme. Therefore, It can be widely used.

도 1은 그라핀 산화물에 의한 형광 소광에 기초한 DNA 절단효소 및 메틸전이효소의 활성분석 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2는 그라핀 산화물의 특성을 분석한 결과를 도시한 그래프이다. 그라핀 산화물의 a) 원자간력 현미경 영상 및 b) 높이계수를 나타낸 것으로 0.1 내지 3 μm 너비와 0.97 nm의 높이를 갖는다. 그라핀 산화물의 c) 라만 스펙트럼 및 d) FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로, sp2 탄소 도메인의 구조적 이상과 GO에서 산소를 포함하는 작용기들의 특성 피크를 나타낸다.
도 3은 다양한 그라핀 산화물 농도에서 a) EcoR V 및 b) Hae III에 의한 절단반응 전과 후의 형광세기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 a) EcoR V와 Hae III ENases에 대한 기질의 서열을 나타낸 것으로, DNA1과 DNA2는 각각 EcoR V와 Hae III의 인식자리를 가지고 있고 이를 음영으로 처리했다. Hae III 기질은 또한 Hae III MTase에 의한 메틸화실험에도 사용되었다. b)와 c)는 온전한 기질 DNA와 절단된 기질 DNA의 형광 스펙트럼이다. 각각 적정 농도의 그라핀 산화물(30 및 10 μg/ml)에서 EcoR V와 Hae III 효소작용의 의한 FAM 형광 소광에 대한 영향을 나타낸 그래프 이다.
도 5는 (a, c) DNA1과 EcoR V, (c, d) DNA2와 Hae III 및 (e, f) DNA2와 Hae III MTase의 반응 혼합물에 대한 시간 의존적 및 효소 농도 의존적 형광세기를 나타낸 것이다. MTase 활성은 DNA2와 Hae III MTase 혼합물에 Hae III을 첨가하여 메틸화되지 않은 DNA2가 절단되도록 하여 측정했다. 모든 실험에서 DNA의 농도는 600 nM이다.
도 6은 소형 분자에 의한 Hae III, EcoR V 및 Hae III MTase 반응의 용량 의존적 억제를 나타낸 그래프이다. a) EDTA 및 b) ATA에 의한 Hae III의 억제, c) ATA에 의한 EcoR V의 억제, 및 d) SAH에 의한 Hae III MTase의 억제를 측정하였으며, 계산된 IC50 값을 함께 표기했다. e)는 억제제의 분자구조를 나타낸다.
도 7에는 기존의 겔 기반 분석법과 본 발명의 그라핀 산화물 기반 분석법을 비교하여 나타내었다. a) 다양한 농도의 Hae III와 기질 DNA를 포함하는 시료를 15% 폴리아크릴아미드 겔에 적용시킨 겔 전기영동 결과이다. b) 96-well plate에서 반응 혼합물에 대해 그라핀 산화물 기반 형광분광법으로 형광영상을 얻었다. c) ENase 및 MTase의 억제에 대한 반응 혼합물의 형광영상이다. 열 1: EDTA에 의한 Hae III 활성억제; 열 2: ATA에 의한 Hae III 활성억제; 열 3: ATA에 의한 EcoR V 활성 억제; 열 4: SAH에 의한 Hae III MTase 활성억제.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of analysis of DNA cleavage enzymes and methyltransferases based on fluorescence extinction by graphene oxide. FIG.
2 is a graph showing the results of analyzing the characteristics of the graphene oxide. A) Atomic force microscopy images of graphene oxide and b) Height factor, with a width of 0.1 to 3 μm and a height of 0.97 nm. C) Raman spectrum of the graphene oxide and d) FT-IR spectrum, which shows the characteristic peaks of the sp2 carbon domains and the functional groups containing oxygen at the GO.
Figure 3 is a graph showing the fluorescence intensities before and after the cleavage reaction by a) EcoR V and b) Hae III at various concentrations of graphene oxide.
Figure 4 shows a) the sequence of the substrate for EcoR V and Hae III ENases, with DNA1 and DNA2 having recognition sites for EcoR V and Hae III, respectively, and shaded. Hae III substrate was also used for methylation experiments with Hae III MTase. b) and c) are fluorescence spectra of whole substrate DNA and truncated substrate DNA. FIG. 5 is a graph showing the effect of the EcoR V and Hae III enzymatic action on FAM fluorescence quenching in the respective concentrations of graphene oxide (30 and 10 μg / ml), respectively.
Figure 5 shows the time dependent and enzyme concentration dependent fluorescence intensities for reaction mixtures of (a, c) DNA1 and EcoR V, (c, d) DNA2 and Hae III and (e, f) DNA2 and Hae III MTase. MTase activity was measured by adding Hae III to a mixture of DNA2 and Hae III MTase to cleave non-methylated DNA2. The DNA concentration in all experiments is 600 nM.
Figure 6 is a graph showing dose dependent inhibition of Hae III, EcoR V and Hae III MTase responses by small molecules. The inhibition of Hae III by a) EDTA and b) ATA, c) the inhibition of EcoR V by ATA, and d) the inhibition of Hae III MTase by SAH were measured and the calculated IC 50 values were also indicated. e) represents the molecular structure of the inhibitor.
FIG. 7 shows a comparison between the conventional gel-based analysis method and the graphene oxide-based analysis method of the present invention. a) Gel electrophoresis results obtained by applying a sample containing various concentrations of Hae III and substrate DNA to a 15% polyacrylamide gel. b) Fluorescence images were obtained by graphene oxide-based fluorescence spectroscopy on the 96-well plates. c) Fluorescence images of reaction mixtures for inhibition of ENase and MTase. Column 1: inhibition of Hae III activity by EDTA; Column 2: inhibition of Hae III activity by ATA; Column 3: Inhibition of EcoR V activity by ATA; Column 4: Inhibition of Hae III MTase activity by SAH.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the constitution and effects of the present invention will be described in more detail through examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these embodiments.

실시예Example 1 :  One : 그라핀Graphene 산화물의 제조 Manufacture of oxides

이전에 보고된 방법에 따라 그라핀 산화물 (GO) 나노시트를 제조했다. 0.5 g의 천연 흑연을 0.5 g의 질산나트륨 및 23 ml의 황산과 얼음 수조에서 격렬히 저어주면서 혼합했다. 이후 3 g의 과망간산칼륨을 천천히 가했다. 첨가 후, 혼합용액을 35℃ 수조에 옮겨 한시간 동안 교반시켰다. 다음으로, 40 ml의 증류수를 가하고 30 분간 수조의 온도를 90℃까지 올렸다. 그리고 나서 추가로 100 ml의 증류수를 가했다. 그 다음, 30 % 과산화수소 3 ml을 한방울씩 가하여 용액의 색은 진한 갈색에서 노란색으로 바뀌게 되었다. 합성된 GO 용액을 뷰흐너 깔대기로 거르고 충분한 양의 증류수로 세척했다. 필터 케이크는 데시케이터에서 건조하고 증류수로 재분산시켰다.A graphene oxide (GO) nanosheet was prepared according to the previously reported method. 0.5 g of natural graphite was mixed with 0.5 g of sodium nitrate and 23 ml of sulfuric acid in an ice water bath with vigorous stirring. Then 3 g of potassium permanganate was slowly added. After the addition, the mixed solution was transferred to a water bath at 35 캜 and stirred for one hour. Next, 40 ml of distilled water was added and the temperature of the water bath was raised to 90 캜 for 30 minutes. Then, an additional 100 ml of distilled water was added. Then, 3 ml of 30% hydrogen peroxide was added dropwise to change the color of the solution from dark brown to yellow. The synthesized GO solution was filtered with a Buchner funnel and washed with a sufficient amount of distilled water. The filter cake was dried in a desiccator and redispersed in distilled water.

도 2는 GO의 특성을 나타내는 측정들을 나타낸 것이다. 우선 도 2a는 원자간력 현미경 영상을 나타낸 것으로 단일층 GO 시트의 형성을 확인할 수 있었다. 도 2b는 형성된 GO 시트의 높이 계수로, GO 시트가 0.1 내지 3 μm의 너비에 약 1 nm의 두께로 비교적 형성되었음을 보여준다. 도 2c와 2d는 각각 형성된 GO의 라만과 FT-IR 스펙트럼으로, 라만 스펙트럼은 산화와 박리로 인한 탄소의 sp2 도메인의 구조적 이상에 기인하는 D 피크 (1361 cm-1)와 정돈된 탄소 sp2 도메인의 G 피크 (1598 cm-1)를, FT-IR 스펙트럼은 1716 cm- 1(C=O 신장)와 1079 cm-1(C-O 신장)에서 산소를 포함하는 작용기의 특징적 피크를 보여준다.
Figure 2 shows measurements showing the characteristics of the GO. 2a shows an atomic force microscope image showing formation of a single layer GO sheet. Fig. 2B shows the height coefficient of the formed GO sheet, which shows that the GO sheet is relatively formed with a thickness of about 1 nm to a width of 0.1 to 3 mu m. FIGS. 2c and 2d are Raman and FT-IR spectra of GO formed, respectively. The Raman spectra show a D peak (1361 cm -1 ) due to the structural abnormality of the sp2 domain of carbon due to oxidation and exfoliation, the G peak (1598 cm -1), FT- IR spectra 1716 cm - shows the characteristic peak of the functional groups containing oxygen at 1 (C = O extension) and 1079 cm -1 (CO height).

실시예Example 2 :  2 : GOGO 기반 플랫폼에 의한  Based platform DNADNA 절단효소 활성분석 Cleavage enzyme activity assay

실시예Example 2-1: 적정  2-1: Titration GOGO 농도 결정 Concentration determination

본 실험에 앞서 각 효소에 대한 적정 GO 농도를 결정하기 위해 상기 제시된 DNA의 각 효소에 의해 완전히 절단된 생성물과 절단되지 않은 대조군 DNA를 준비했다. 이를 최종 GO 농도 10 μg/ml 간격으로 0 내지 40 μg/ml이 되도록 준비된 절단 전후의 DNA 시료와 혼합하여 형광을 관찰하고 대조군과 실험군의 형광세기 차이가 극대화될 때 사용된 GO 농도를 이후 효소활성 분석실험에 사용했다. 도 3a와 3b는 각각 GO 농도에 따른 EcoR V와 Hae III 효소작용 전후 형광세기의 차이를 나타낸다. 이렇게 결정된 적정 GO 농도는 EcoR V와 Hae III에 대해 각각 30 μg/ml과 10 μg/ml이며 도 4b와 4c는 해당농도에서 효소작용 전후의 형광스펙트럼을 나타낸다.
Prior to this experiment, a product completely cleaved by each enzyme of the above-mentioned DNA and a control DNA not cleaved were prepared to determine the appropriate GO concentration for each enzyme. The fluorescence was observed by mixing with a DNA sample prepared before and after cleavage prepared to have a final GO concentration of 10 μg / ml at a concentration of 0 to 40 μg / ml, and the GO concentration used when the fluorescence intensity difference between the control group and the experimental group was maximized, It was used for analytical experiments. FIGS. 3A and 3B show fluorescence intensities before and after EcoR V and Hae III enzyme activities, respectively, according to the GO concentration. The determined GO concentrations were 30 μg / ml and 10 μg / ml for EcoR V and Hae III, respectively. Figures 4b and 4c show fluorescence spectra before and after enzyme reaction at the corresponding concentrations.

실시예Example 2-2:  2-2: DNADNA 절단효소 활성분석 Cleavage enzyme activity assay

본 발명에서는 두가지 형태의 제한 효소, EcoR V와 Hae III을 사용하였다. 먼저 EcoR V의 두가닥 DNA 기질(DNA1)을 준비하기 위해, 100 μM 농도의 형광조영제를 표지한 짧은 바닥가닥 DNA(5'-FAM-ACT AT G ATA TC C A-3'; 도 4a) 2.5 μl를 1.2배 과량의 긴 윗가닥 DNA(5'-CTA GCT ATG TGC CGA ATT TCA AGG ACA GTT GTA TG G ATA TC A TAC T-3'; 도 4a)와 50 mM Tris-HCl과 50 mM NaCl을 포함하는 pH 8.0의 완충용액에서 혼합했다. 그리고 나서 혼합물은 90℃로 가열하여 5분간 서냉상동결합(annealed)하고 실온으로 한시간 동안 서서히 냉각했다. EcoR V의 활성분석을 위해, 반응 혼합물은 1X EcoR V 반응 완충액 (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1 mM을 포함하는 pH 7.9의 Tris-HCl 완충액)에서 EcoR V 효소 원액을 200 nM 서냉상동결합된 DNA1과 혼합하여 준비했다. 실온에서 인큐베이션 후, 반응 혼합물 30 μl와 60 μg/ml GO 용액 30 μl를 96-well plate에 혼합했다.Two types of restriction enzymes, EcoR V and Hae III were used in the present invention. First, in order to prepare a double-stranded DNA substrate (DNA1) of EcoR V, a short bottom strand DNA (5'-FAM-ACT AT G ATA TC Ca -3 '; 4A) and 50 mM Tris-HCl (pH 5) were mixed with 1.2-fold excess of long-strand DNA (5'-CTA GCT ATG TGC CGA ATT TCA AGG ACA GTT GTA TG G ATA TC A TAC T- And mixed in a buffer solution at pH 8.0 containing 50 mM NaCl. The mixture was then annealed at 90 ° C for 5 minutes and slowly cooled to room temperature for one hour. For the activity analysis of EcoR V, the reaction mixture was diluted with 1X EcoR V reaction buffer (Tris 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.9, containing 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol) , An EcoR V enzyme stock solution was prepared by mixing with 200 nM of slowly co-conjugated DNA 1. After incubation at room temperature, 30 μl of the reaction mixture and 30 μl of 60 μg / ml GO solution were mixed in a 96-well plate.

Hae III의 경우, Hae III의 두가닥 DNA 기질(DNA2)은 100 μM 농도의 형광조영제를 표지한 짧은 바닥가닥 DNA(5'-FAM-ACG AG G GCC ATA-3'; 도 4a) 2.5 μl를 1.2배 과량의 긴 윗가닥 DNA(5'-CTA GCT ATG TGC CGA ATT TCA AGG ACA GTT GTA T GG CC C TCG T-3'; 도 4a)와 50 mM Tris-HCl과 50 mM NaCl을 포함하는 pH 8.0의 완충용액에서 혼합했다. 그리고 나서 혼합물은 90℃로 가열하여 5분간 서냉상동결합(annealed)하고 실온으로 한시간 동안 서서히 냉각했다. Hae III의 활성분석을 위해, 반응 혼합물은 1X Hae III 반응 완충액 (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 10 mM, 디티오트레이톨(dithiothreitol) 1 mM을 포함하는 pH 7.9의 Tris-HCl 완충액)에서 EcoR V 효소 원액을 200 nM 서냉상동결합된 DNA1과 혼합하여 준비했다. 실온에서 인큐베이션 후, 반응 혼합물 30 μl와 20 μg/ml GO 용액 30 μl를 96-well plate에 혼합했다. 형광세기는 520 nm 파장에서 측정했다.
For the Hae III, the two strands of the Hae III DNA substrate (DNA2) is 100 μM concentration of the fluorescent contrast agents to a small ground-stranded DNA (5'-FAM-ACG AG cover of G GCC ATA-3 '; Figure 4a) 2.5 μl to 1.2 fold excess of a long upper-stranded DNA (5'-CTA GCT ATG CGA ATT TGC AGG TCA ACA GTT GTA CC C GG T TCG T-3 '; Figure 4a) and 50 mM Tris-HCl and 50 mM < RTI ID = 0.0 > NaCI. < / RTI > The mixture was then annealed at 90 ° C for 5 minutes and slowly cooled to room temperature for one hour. For the activity analysis of Hae III, the reaction mixture was incubated with 1X Hae III reaction buffer (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, MgCl 2 10 mM, Tris-HCl buffer at pH 7.9 containing 1 mM dithiothreitol) , An EcoR V enzyme stock solution was prepared by mixing with 200 nM of slowly co-conjugated DNA 1. After incubation at room temperature, 30 μl of the reaction mixture and 30 μl of 20 μg / ml GO solution were mixed in a 96-well plate. The fluorescence intensity was measured at a wavelength of 520 nm.

실시예Example 2-3:  2-3: EcoREcoR V와  V and HaeHae IIIIII 의 시간 의존적 활성분석Time-dependent activity assay

다음으로, EcoR V에 의해 촉진되는 DNA1의 시간 의존적 가수분해를 측정했다. 반응 혼합물은 EcoR V 반응 완충액에 600 nM DNA1과 EcoR V 원액을 최종농도 0.3 또는 0.04 U/μl가 되도록 혼합하여 준비했다. 이후 10분 간격으로 30 μl의 EcoR V 반응 혼합물을 취하여 즉시 96-well plate에서 60 μg/ml GO 용액 30 μl와 혼합하고 형광분광계를 이용하여 각 well의 형광 스펙트럼을 얻었다. 다음의 수식으로 형광세기를 표준화했다.Next, time-dependent hydrolysis of DNA 1 promoted by EcoR V was measured. The reaction mixture was prepared by mixing 600 nM DNA1 and EcoR V stock solution into the EcoR V reaction buffer to a final concentration of 0.3 or 0.04 U / μl. Then, 30 μl of EcoR V reaction mixture was taken at 10-min intervals and immediately mixed with 30 μl of 60 μg / ml GO solution in a 96-well plate. Fluorescence spectra of each well were obtained using a fluorescence spectrometer. Fluorescence intensity was standardized by the following formula.

I'FX=IFX-IB I ' FX = I FX -I B

IB는 바탕형광세기이다.I B is background fluorescence intensity.

그리고 생성물의 상대적인 양은 상대세기를 계산하여 나타냈다.And the relative amount of product was calculated by calculating the relative strength.

MX의 상대적인 양=I'FX/I'FM×100Relative amount of M X = I ' FX / I' FM × 100

I'FM은 모든 기질 DNA를 절단한 후 표준화된 최대 혹은 포화된 형광세기를 나타낸다.I ' FM represents the maximum or saturated fluorescence intensity normalized after cleavage of all substrate DNA.

Hae III의 시간 의존적 활성분석도 위와 같은 방법으로 수행했다. 그러나 반응 혼합액은 600nM의 DNA2와 0.3 또는 0.08 U/μl의 Hae III을 Hae III 반응 완충액으로 준비했으며 10분 간격으로 30 μl의 준비된 반응 혼합물을 20 μg/ml GO 용액 30 μl와 96-well plate에 혼합했다.Time-dependent activity analysis of Hae III was also performed in the same manner. However, the reaction mixture was prepared by adding 600 nM of DNA2 and 0.3 or 0.08 U / μl of Hae III to Hae III reaction buffer, and 30 μl of the prepared reaction mixture was added to 30 μl of 20 μg / ml GO solution and a 96-well plate Mixed.

EcoR V와 Hae III 모두 시간 의존적 효소활성을 보였다. 도 5a와 5b에서 보듯이 EcoR V와 Hae III의 효소반응 생성물의 상대적인 양은 520 nm에서의 형광세기로부터 용이하게 계산될 수 있었다.
Both EcoR V and Hae III showed time - dependent enzymatic activity. As shown in FIGS. 5A and 5B, the relative amounts of the enzymatic reaction products of EcoR V and Hae III could be easily calculated from the fluorescence intensities at 520 nm.

실시예Example 2-4:  2-4: EcoREcoR V와  V and HaeHae IIIIII 의 효소농도 의존적 활성분석Enzyme concentration-dependent activity assay

상기 실시예 2.3과 유사한 방법으로 EcoR V와 Hae III 활성의 농도 의존성을 측정했다. 인큐베이션 시간을 10분 또는 50분으로 하여 다양한 효소농도에서 두 효소의 가수분해 반응을 관찰했고 두 경우 모두 고농도의 ENase에서 높은 활성을 보였다. 이를 도 5c와 5d에 나타냈다.
The concentration dependency of EcoR V and Hae III activity was measured in a manner similar to Example 2.3 above. The incubation time was 10 minutes or 50 minutes, and hydrolysis of the two enzymes was observed at various enzyme concentrations. Both cases showed high activity at high concentration of ENase. This is shown in Figures 5c and 5d.

실시예Example 3:  3: GOGO 기반 플랫폼에 의한  Based platform HaeHae IIIIII 메틸전이효소Methyltransferase 활성분석 Activity analysis

본 발명에서는 Hae III MTase의 시간 의존적 효소반응을 측정했다. Hae III MTase 활성을 측정하기 위해, 1X MTase 반응 완충액 (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 디티오트레이톨 10 mM, SAM 1.6 mM을 포함하는 pH 8.5 Tris-HCl 완충액)에 Hae III MTase 효소 원액(10 U/ml)과 600 nM의 서냉상동결합된 DNA2를 혼합하여 혼합하고 37℃에서 인큐베이션했다. 그리고 나서, 10 μl의 반응 혼합물을 Hae III 20 unit을 포함하는 30 μl의 1X Hae III 반응 완충액과 혼합하여 실온에서 10분간 인큐베이션했다. 마지막으로, 반응 혼합물 40 μl와 30 μg/ml GO 용액 20 μl를 혼합하여 GO 농도가 10 μg/ml가 되도록 96-well plate에 혼합했다. 520 nm 파장에서 형광세기를 측정하여 스펙트럼을 얻어 도 5e에 나타내었다. 도 5f는 효소농도 의존적 실험결과를 나타낸 것으로 기질 DNA를 다양한 농도의 Hae III MTase와 인큐베이션하고 Hae III과 GO는 상기 실험들과 같은 방법으로 처리하여 그래프를 얻었다. 시간 및 효소농도 의존적 분석 모두에 대해, DNA 생성물의 상대적 양은 520 nm에서 형광세기를 측정하여 성공적으로 계산되었다.
In the present invention, the time-dependent enzyme reaction of Hae III MTase was measured. Hae III MTase activity was measured by adding Hae III MTase enzyme solution (10 mM) to 1X MTase reaction buffer (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, dithiothreitol 10 mM, and SAM 1.6 mM pH 8.5 Tris-HCl buffer) U / ml) and 600 nM of the annealed homologously coupled DNA2 were mixed and incubated at 37 [deg.] C. Then, 10 μl of the reaction mixture was mixed with 30 μl of 1 × Hae III reaction buffer containing 20 units of Hae III and incubated at room temperature for 10 minutes. Finally, 40 μl of the reaction mixture and 20 μl of the 30 μg / ml GO solution were mixed and mixed in a 96-well plate such that the GO concentration was 10 μg / ml. The fluorescence intensity was measured at a wavelength of 520 nm to obtain a spectrum, which is shown in FIG. 5E. FIG. 5f shows the results of enzyme concentration-dependent experiments. The obtained DNA was incubated with various concentrations of Hae III MTase, Hae III and GO were treated in the same manner as in the above experiments, and a graph was obtained. For both time and enzyme concentration dependent analyzes, the relative amounts of DNA products were successfully calculated by measuring the fluorescence intensity at 520 nm.

실시예Example 4:  4: GOGO 기반 플랫폼에 의한  Based platform ENaseENASE // MTaseMTase 활성억제제의 분석 Analysis of active inhibitors

다음으로, 본 발명에서 제시된 방법이 억제제의 평가에 대해 정량적이며 적용가능한 방법인지 확인하기 위해 그 활성이 잘 알려진 억제제를 사용하여 EcoR V, Hae III 및 Hae III MTase 억제분석을 수행했다. Hae III의 억제제로는 EDTA와 ATA가, EcoR V에 대해서는 ATA가, Hae III MTase에 대해서는 SAH가 사용되었다.Next, the EcoR V, Hae III and Hae III MTase inhibition assays were performed using inhibitors whose activity was well known to confirm that the methods presented in the present invention were quantitative and applicable for the evaluation of inhibitors. EDA and ATA were used as inhibitors of Hae III, ATA was used for EcoR V, and SAH was used for Hae III MTase.

EDTA-Hae III 억제분석을 위해, 다양한 농도의 EDTA 용액을 1X Hae III 반응 완충액에서 200 nM DNA2와 혼합하고, Hae III 10 unit을 가했다. 실온에서 한시간 동안 인큐베이션 후 반응 혼합물 각 30 μl를 20 μg/ml GO 용액 30 μl와 96-well plate에 혼합했다. 520 nm에서의 형광세기를 기반으로 EDTA 용량의존적 억제곡선을 그렸다(도 6a).For EDTA-Hae III inhibition assay, various concentrations of EDTA solution were mixed with 200 nM DNA2 in 1X Hae III reaction buffer and 10 units of Hae III were added. After incubation for one hour at room temperature, 30 μl of each reaction mixture was mixed with 30 μl of 20 μg / ml GO solution and 96-well plate. Dependent EDTA dose-dependent inhibition curves were plotted based on fluorescence intensity at 520 nm (Fig. 6A).

ATA-Hae III의 경우, 다양한 농도의 ATA 용액을 1X Hae III 반응 완충액에서 200 nM DNA2와 혼합하고, Hae III 10 unit을 가했다. 실온에서 한시간 동안 인큐베이션 후 반응 혼합물 각 30 μl를 20 μg/ml GO 용액 30 μl와 96-well plate에 혼합했다.For ATA-Hae III, various concentrations of ATA solution were mixed with 200 nM DNA2 in 1X Hae III reaction buffer and 10 units of Hae III were added. After incubation for one hour at room temperature, 30 μl of each reaction mixture was mixed with 30 μl of 20 μg / ml GO solution and 96-well plate.

도 6a와 6b에서 보듯이 EDTA와 ATA의 IC50 값은 각각 1.48 mM과 3.71 μM로 추정되었다.As shown in FIGS. 6A and 6B, the IC 50 values of EDTA and ATA were estimated to be 1.48 mM and 3.71 μM, respectively.

ATA-EcoR V 억제분석에 대해, 다양한 농도의 ATA 용액을 200 nM DNA1을 포함한 1X EcoR V 반응 완충액에서 혼합하고, EcoR V 2.5 unit을 가했다. 실온에서 한시간 동안 인큐베이션 후 반응 혼합물 각 30 μl를 60 μg/ml GO 용액 30 μl와 96-well plate에 혼합했다.For the ATA-EcoR V inhibition assay, various concentrations of ATA solution were mixed in 1X EcoR V reaction buffer containing 200 nM DNA1 and 2.5 units of EcoR V were added. After incubation for one hour at room temperature, 30 μl of each reaction mixture was mixed with 30 μl of 60 μg / ml GO solution and 96-well plate.

SAH-Hae III MTase 억제분석에 대해서는, 다양한 농도의 SAH 용액을 1X Hae III MTase 반응 완충액에서 600 nM DNA2와 혼합하고, Hae III MTase 5 unit을 가했다. 37℃에서 한시간 동안 인큐베이션 후 10 μl의 반응 혼합물을 Hae III 20 unit을 포함한 1X Hae III 반응 완충액 30 μl와 섞고 실온에서 10분간 인큐베이션했다. 마지막으로, 40 μl의 반응 혼합물과 30 μg/ml GO 용액 20 μl와 96-well plate에 혼합했다. 형광세기는 520 nm 파장에서 측정했다.For the SAH-Hae III MTase inhibition assay, various concentrations of SAH solution were mixed with 600 nM DNA2 in 1X Hae III MTase reaction buffer and 5 units of Hae III MTase were added. After incubation at 37 ° C for one hour, 10 μl of the reaction mixture was mixed with 30 μl of 1 × Hae III reaction buffer containing 20 units of Hae III and incubated at room temperature for 10 minutes. Finally, 40 μl of the reaction mixture, 20 μl of 30 μg / ml GO solution and 96-well plate were mixed. The fluorescence intensity was measured at a wavelength of 520 nm.

Hae III 억제제에 대해서와 같은 방법으로 용량의존적 억제곡선을 얻었고, 도 6c와 6d에 보인 것과 같이, ATA의 EcoR V 억제와 SAH의 Hae III MTase 억제에 대한 IC50 값은 각각 3.6 μM과 10.1 mM로 결정되었다.
A dose-dependent inhibition curve was obtained in the same manner as for the Hae III inhibitor, and the IC 50 values for the EcoR V inhibition of ATA and Hae III MTase inhibition of SAH were 3.6 μM and 10.1 mM, respectively, as shown in FIGS. 6C and 6D It was decided.

실시예Example 5: 기존의 분석방법(겔 전기영동법)과의 비교 5: Comparison with existing analytical methods (gel electrophoresis)

본 발명에서 제시한 GO 기반 플랫폼을 이용한 효소활성 분석방법을 기존의 겔 전기영동법과 비교하기 위한 실험을 수행했다. 이를 위해 Hae III의 농도 의존적 활성을 겔 전기영동법과 GO 기반 플랫폼을 이용한 형광분광법으로 측정하고, 형광영상으로 시각화했다. 전형적인 방법에서 절단된 DNA 및 완전한 DNA를 우레아-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(Urea-PAGE)으로 분리했다. 도 7a와 7b는 각각 기존의 겔 전기영동법과 GO 기반 플랫폼으로 Hae III의 농도 의존적 효소활성을 측정한 결과이다. 본 발명의 GO 기반 분석법에서 GO의 첨가는 효소 활성을 저해시키고 다른 핵산분해효소 활성을 포함한 혼합 용액에서 형광세기에서의 차이를 유도하는 반면, 기존의 겔 기반 분석법은 EDTA 첨가에 의한 효소활성 억제와 이어지는 긴 기질 DNA와 짧은 절단된 DNA를 분리하기 위한 겔 러닝과 관련된 두 단계의 과정이 요구된다.
Experiments were performed to compare the enzyme activity assay method using the GO-based platform proposed in the present invention with the conventional gel electrophoresis method. For this, the concentration - dependent activity of Hae III was measured by gel electrophoresis and fluorescence spectroscopy using a GO - based platform and visualized by fluorescence imaging. In a typical method, cleaved DNA and complete DNA were separated by urea-polyacrylamide gel electrophoresis (Urea-PAGE). FIGS. 7A and 7B show the result of measuring the concentration-dependent enzyme activity of Hae III using a conventional gel electrophoresis method and a GO-based platform, respectively. In the GO-based assay of the present invention, the addition of GO inhibits enzyme activity and induces a difference in fluorescence intensity in a mixed solution containing other nucleic acid degrading enzyme activity, whereas the conventional gel-based assay is effective in inhibiting enzyme activity by EDTA addition Two steps involved in gel running to separate the subsequent long substrate DNA and short cut DNA are required.

실시예Example 6: 다중 반응 혼합물의 병렬분석 6: Parallel analysis of multiple reaction mixtures

마지막으로, 다중 반응 혼합물의 형광영상을 관찰함으로서 GO 기반 플랫폼을 사용한 효소활성 병렬분석 실행가능성을 보였다. 시료는 96-well plate에 EcoR V 또는 Hae III 기질 DNA 용액을 준비하고, 효소와 억제제의 존재 유무에 따른 활성분석을 동시에 진행하였다. 도 7c는 그 결과를 형광영상으로 보여준다. 예상대로, 두가지 DNA 절단효소에 대해서는 억제제를 처리하지 않은 효소처리 시료에서 다른 시료들에 비해 가장 높은 형광을 보였다. 반대로, Hae III MTase의 경우는 억제제인 SAH를 처리하지 않았을 때 가장 낮은 형광을 보였다. 이는 기존의 겔을 이용한 분석보다 본 발명의 GO 기반 플랫폼을 이용한 효소활성 분석방법이 억제제 선별과 같은 병렬 효소분석 형식에 보다 적합함을 보여준다.
Finally, by observing the fluorescence images of multiple reaction mixtures, we demonstrated the feasibility of enzyme active parallel analysis using a GO-based platform. Samples were prepared with EcoR V or Hae III substrate DNA solution in a 96-well plate and assayed for the presence or absence of enzymes and inhibitors. Figure 7c shows the result as a fluorescence image. As expected, the two DNA-cleaved enzymes showed the highest fluorescence compared to the other samples in the enzyme-treated samples without the inhibitor. Conversely, Hae III MTase showed the lowest fluorescence when the inhibitor, SAH, was not treated. This shows that the enzyme activity assay method using the GO-based platform of the present invention is more suitable for the parallel enzyme analysis format such as the inhibitor screening than the conventional gel analysis.

Claims (18)

(i) 그라핀 산화물(graphene oxide); 및
(ii) 제1말단에는 그라핀 산화물과 결합 가능한 단일가닥 DNA 꼬리(tail)를 갖고, 제2말단 쪽에는 그라핀 산화물과 인접하면 소광되는 발광 표지물질이 표지되고, 제1말단과 제2말단 사이에 효소 절단 부위를 포함하는 이중가닥 DNA 기질(substrate)
을 포함하는, DNA 절단효소 또는 메틸전이효소 활성 분석용 키트.
(i) graphene oxide; And
(ii) a single-stranded DNA tail that is capable of binding to a graphene oxide at the first end thereof, and a luminescent labeling substance which is extinguished when adjacent to the graphene oxide at the second end thereof, A double-stranded DNA substrate containing an enzyme cleavage site between the < RTI ID = 0.0 >
A kit for assaying a DNA-cleaving enzyme or a methyltransferase activity.
제1항에 있어서, 상기 DNA 기질은 효소 인식 부위를 더 포함하는 것인 키트.
2. The kit of claim 1, wherein the DNA substrate further comprises an enzyme recognition site.
제1항에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질인 것인 키트.
The kit according to claim 1, wherein the labeling substance is a fluorescent substance.
제1항에 있어서, 효소반응용 완충용액을 추가로 포함하는 것인 키트.
The kit according to claim 1, further comprising a buffer solution for enzyme reaction.
제1항에 있어서, DNA 절단효소를 추가로 포함하는 것인 키트.
2. The kit of claim 1, further comprising a DNA cleavage enzyme.
제1항에 있어서, DNA 메틸전이효소를 추가로 포함하는 것인 키트.
2. The kit of claim 1, further comprising a DNA methyltransferase.
(i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계;
(iii) 상기 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제3단계; 및
(iv) 제3단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제4단계를 포함하고,
이때, 제3단계에서, DNA 기질은 분석 효소에 의해 효소 절단 부위가 절단되거나 절단되지 아니할 수 있고,
절단된 경우 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제4단계에서 발광이 검출되면 분석 효소가 DNA 절단효소인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 스크리닝 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 4;
(ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2;
(iii) a third step of treating the DNA substrate with an analytical enzyme; And
(iv) a fourth step of confirming whether or not the result of the treatment in the third step is emitted or emitted,
At this time, in the third step, the enzyme substrate may not be cleaved or cleaved by the enzymatic cleavage site,
When cleaved, the second terminal portion labeled with the labeling substance separates from the first terminal portion having the single-stranded DNA tail and emits light,
Wherein the analyzing enzyme is determined to be a DNA cleavage enzyme when luminescence is detected in the fourth step.
(i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제2단계;
(iii) 제2단계의 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제3단계; 및
(iv) 제3단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제4단계를 포함하고,
이때, 제2단계에서, DNA 기질은 분석 효소에 의해 효소 절단 부위가 절단되거나 절단되지 아니할 수 있고, 절단된 경우 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되고,
제3단계에서 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있으면 소광되고, 표지물질이 분석 효소에 의해 절단되어 분리되면 발광하고,
제4단계에서 발광이 검출되면 분석 효소가 DNA 절단효소인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 스크리닝 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 4;
(ii) a second step of treating the DNA substrate contained in the kit with an analyte enzyme;
(iii) a third step of treating the resultant of the second step with the graphene oxide; And
(iv) a fourth step of confirming whether or not the result of the treatment in the third step is emitted or emitted,
In this case, in the second step, the DNA substrate may not be cleaved or cleaved by the enzymatic cleavage site, and in the case of cleavage, the second terminal region labeled with the labeling substance may have a first terminal side Lt; / RTI >
In the third step, a DNA substrate having a single-stranded DNA tail is bound to the graphene oxide. At this time, if the labeling substance is bound to the DNA substrate bound to the graphene oxide, the DNA substrate is extinguished and the labeling substance is cleaved Emitting,
Wherein the analyzing enzyme is determined to be a DNA cleavage enzyme when luminescence is detected in the fourth step.
제7항에 있어서, 제4단계에서, 발광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 절단 활성 정도를 측정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 스크리닝 방법.
8. The DNA cleavage enzyme screening method according to claim 7, wherein in the fourth step, the degree of luminescence is measured to measure the degree of DNA cleavage activity of the analyte enzyme.
(i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계;
(iii) 상기 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제3단계;
(iv) 제3단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제4단계;
(v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하고,
이때, 제3단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화된 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고,
제3단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화되지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제5단계에서 소광이 검출되면 분석 효소가 DNA 메틸전이효소인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 5;
(ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2;
(iii) a third step of treating the DNA substrate with an analytical enzyme;
(iv) a fourth step of treating the resultant product of the third step with a DNA-cleaving enzyme;
(v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted,
In this case, when the DNA substrate is methylated by the analyzing enzyme in the third step, the DNA substrate may not cleave the enzyme cleavage site in the fourth step,
When the DNA substrate is not methylated by the analysis enzyme in the third step, the DNA substrate cleaves the enzyme cleavage site in the fourth step, and the second terminal side labeled with the labeling substance has a first end with a single-stranded DNA tail Emitting portion,
Wherein the analyzing enzyme is determined to be a DNA methyltransferase when quenching is detected in the fifth step.
(i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 분석 효소를 처리하는 제2단계;
(iii) 제2단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제3단계;
(iv) 제3단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제4단계; 및
(v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하고,
이때, 제2단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화된 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고,
제2단계에서 DNA 기질이 분석 효소에 의해 메틸화되지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되고,
제4단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있으면 소광되고, 표지물질이 제2단계의 효소에 의해 절단되어 분리되면 발광하고,
제5단계에서 소광이 검출되면 분석 효소가 DNA 메틸전이효소인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 5;
(ii) a second step of treating the DNA substrate contained in the kit with an analyte enzyme;
(iii) a third step of treating the resultant product of the second step with a DNA-cleaving enzyme;
(iv) a fourth step of treating the resultant of the third step with graphene oxide; And
(v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted,
In this case, if the DNA substrate is methylated by the analyzing enzyme in the second step, the DNA substrate in the third step may not cleave the enzyme cleavage site,
When the DNA substrate is not methylated by the analyzing enzyme in the second step, the DNA substrate is cleaved in the third step, and the second terminal portion labeled with the labeling substance is cleaved at the first end with a single-stranded DNA tail Side portion,
In a fourth step, a DNA substrate with a single-stranded DNA tail is bound to the graphene oxide, where it is extinguished if the labeled substrate is bound to a DNA substrate bound to the graphene oxide and the labeling substance is cleaved by the second- When cut off and separated,
Wherein the analyzing enzyme is determined to be a DNA methyltransferase when quenching is detected in the fifth step.
제10항에 있어서, 제5단계에서, 소광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 메틸전이 활성 정도를 측정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소 스크리닝 방법.
The DNA methyltransferase screening method according to claim 10, wherein in step 5, the degree of extinction is measured to measure the degree of DNA methyltransferase activity of the assay enzyme.
(i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계;
(iii) DNA 절단효소에 분석물질을 처리하는 제3단계;
(iv) 상기 DNA 기질에 제3단계 처리 결과물을 처리하는 제4단계; 및
(v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하고,
이때, 제3단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광을 유지하고,
제3단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제5단계에서 소광이 유지되면 분석물질이 DNA 절단효소 억제제인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 억제제를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 5;
(ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2;
(iii) a third step of treating the DNA-cleaving enzyme with the analyte;
(iv) a fourth step of processing the result of the third step treatment on the DNA substrate; And
(v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted,
In this case, if the analyte inhibits the activity of the DNA cleavage enzyme in the third step, the DNA cleavage site of the DNA substrate may not be cleaved in the fourth step, and the labeling substance may be ligated to the DNA substrate bound to the graphene oxide To keep the extinction,
In the case where the analyte does not inhibit the activity of the DNA cleavage enzyme in the third step, the DNA cleavage site of the DNA substrate is cleaved in the fourth step, and the second terminal region labeled with the labeling substance has a single stranded DNA tail 1 terminal portion,
Wherein the analyte is determined to be a DNA cleavage enzyme inhibitor when the quenching is maintained in the fifth step.
(i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) DNA 절단효소에 분석물질을 처리하는 제2단계;
(iii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 제2단계 처리 결과물을 처리하는 제3단계;
(iv) 제3단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제4단계; 및
(v) 제4단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제5단계를 포함하고,
이때, 제2단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 제4단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광되고,
제2단계에서 분석물질이 DNA 절단효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제5단계에서 소광이 검출되면 분석물질이 DNA 절단효소 억제제인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 억제제를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 5;
(ii) a second step of treating the DNA-cleaving enzyme with the analyte;
(iii) treating the DNA substrate contained in the kit with a second-stage treatment product;
(iv) a fourth step of treating the resultant of the third step with graphene oxide; And
(v) a fifth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fourth step is emitted or emitted,
In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA cleavage enzyme in the second stage, the DNA substrate in the third stage may not be cleaved in the enzyme cleavage site, and in the fourth stage, a DNA substrate having a single stranded DNA tail Wherein the DNA is bound to a graphene oxide, wherein a labeling substance is linked to the DNA substrate bound to the graphene oxide,
In the case where the analyte does not inhibit the activity of the DNA cleavage enzyme in the second step, the DNA cleavage site of the DNA substrate is cleaved in the third step, and the second terminal side labeled with the labeling substance is a single stranded DNA tail 1 terminal portion,
Wherein the analyte is determined to be a DNA cleavage enzyme inhibitor when quenching is detected in the fifth step.
(i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) 상기 키트에서 단일가닥 DNA 꼬리(tail)을 통해 DNA 기질(substrate)을 그라핀 산화물에 연결시키는 단계로서, 이로 인해 DNA 기질에 표지된 발광 표지물질이 인접한 그라핀 산화물에 의해 소광된 제2단계;
(iii) DNA 메틸전이효소에 분석물질을 처리하는 제3단계;
(iv) 상기 DNA 기질에 제3단계 처리 결과물을 처리하는 제4단계;
(v) 제4단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제5단계; 및
(vi) 제5단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제6단계를 포함하고,
이때, 제3단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되지 아니하여, 제5단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제3단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제4단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되어, 제5단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니하여 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광을 유지하고,
제6단계에서 발광이 검출되면 분석물질이 DNA 메틸전이효소 억제제인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소 억제제를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 6;
(ii) linking a DNA substrate to the graphene oxide through a single stranded DNA tail in the kit, whereby the luminescent labeling substance labeled on the DNA substrate is conjugated to a graphene oxide- Step 2;
(iii) a third step of treating the DNA methyltransferase with an analyte;
(iv) a fourth step of processing the result of the third step treatment on the DNA substrate;
(v) a fifth step of treating the DNA cleavage enzyme with the resultant product of the fourth step; And
(vi) a sixth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fifth step is emitted or emitted,
In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA methyltransferase in the third step, the DNA substrate is not methylated by the DNA methyltransferase in the fourth step, and in the fifth step, the DNA substrate cleaves the enzyme cleavage site The second terminal side portion labeled with the labeling substance is separated from the first terminal side portion having the single-stranded DNA tail and emits light,
If the analyte does not inhibit the activity of the DNA methyltransferase in the third step, the DNA substrate is methylated by the DNA methyltransferase in the fourth step, and the DNA substrate is not cleaved for the enzyme cleavage site in the fifth step The labeling substance is connected to the DNA substrate bound to the graphene oxide to maintain extinction,
Wherein the analyte is determined to be a DNA methyltransferase inhibitor when luminescence is detected in the sixth step.
(i) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 키트를 준비하는 제1단계;
(ii) DNA 메틸전이효소에 분석물질을 처리하는 제2단계;
(iii) 상기 키트에 포함된 DNA 기질에 제2단계 처리 결과물을 처리하는 제3단계;
(iv) 제3단계 처리 결과물에 DNA 절단효소를 처리하는 제4단계;
(v) 제4단계의 처리 결과물에 그라핀 산화물을 처리하는 제5단계; 및
(vi) 제5단계의 처리 결과물의 발광여부 또는 발광정도를 확인하는 제6단계를 포함하고,
이때, 제2단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되지 아니하여, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되며, 표지물질로 표지된 제2말단쪽 부분이 단일가닥 DNA 꼬리를 갖는 제1말단쪽 부분으로부터 분리되어 발광하고,
제2단계에서 분석물질이 DNA 메틸전이효소의 활성을 억제하지 않는 경우, 제3단계에서 DNA 기질은 DNA 메틸전이효소에 의해 메틸화되어, 제4단계에서 DNA 기질은 효소 절단 부위가 절단되지 아니할 수 있고, 제5단계에서, 단일가닥 DNA 꼬리를 가진 DNA 기질이 그라핀 산화물에 결합되고, 이때 그라핀 산화물에 결합된 DNA 기질에 표지물질이 연결되어 있어서 소광되고,
제6단계에서 발광이 검출되면 분석물질이 DNA 메틸전이효소 억제제인 것으로 판정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소 억제제를 스크리닝하는 방법.
(i) a first step of preparing the kit according to any one of claims 1 to 6;
(ii) a second step of treating the DNA methyltransferase with the analyte;
(iii) treating the DNA substrate contained in the kit with a second-stage treatment product;
(iv) a fourth step of treating the resultant product of the third step with a DNA-cleaving enzyme;
(v) a fifth step of treating the resultant of the fourth step with the graphene oxide; And
(vi) a sixth step of confirming whether or not the result of the treatment in the fifth step is emitted or emitted,
In this case, when the analyte inhibits the activity of the DNA methyltransferase in the second step, the DNA substrate is not methylated by the DNA methyltransferase in the third step, and in the fourth step, the DNA substrate cleaves the enzyme cleavage site The second terminal side portion labeled with the labeling substance is separated from the first terminal side portion having the single-stranded DNA tail and emits light,
If the analyte does not inhibit the activity of the DNA methyltransferase in the second step, the DNA substrate is methylated by the DNA methyltransferase in the third step, and the DNA substrate in the fourth step may not cleave the enzyme cleavage site In a fifth step, a DNA substrate having a single stranded DNA tail is bound to a graphene oxide, wherein the DNA substrate bound to the graphene oxide has a label attached thereto,
Wherein the analyte is determined to be a DNA methyltransferase inhibitor when luminescence is detected in the sixth step.
제8항에 있어서, 제4단계에서, 발광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 절단 활성 정도를 측정하는 것이 특징인 DNA 절단효소 스크리닝 방법.
9. The method according to claim 8, wherein in the fourth step, the degree of luminescence is measured and the degree of DNA cleavage activity of the analyte is measured.
제11항에 있어서, 제5단계에서, 소광 정도를 측정하여 분석 효소의 DNA 메틸전이 활성 정도를 측정하는 것이 특징인 DNA 메틸전이효소 스크리닝 방법.12. The DNA methyltransferase screening method according to claim 11, wherein, in the fifth step, the extent of extinction is measured to measure the degree of DNA methyltransferase activity of the analyte enzyme.
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