KR102316832B1 - A screening method of dna methyltransferase inhibitors - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단분자 FRET 기술과 DNA B-Z 구조전이를 이용하여 DNA 메틸전달효소의 활성을 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것으로, 본 발명의 방법 및 키트를 이용하면 DNA 분자의 구조전이를 정밀하고 민감하게 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 극단적으로 줄일 수 있어 경제적이고, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있게 해주므로 제약 분야에서 신규 약물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.The present invention relates to a method and kit for screening a drug that inhibits the activity of DNA methyltransferase using single-molecule FRET technology and DNA BZ structure transfer. Metastasis can be accurately and sensitively detected, so the amount of sample consumed can be extremely reduced, so it is economical, and the action of methylation enzymes and demethylases, and the effects of various drugs that promote or inhibit the actions of these enzymes, are highly efficient. Since it allows detection, it can be effectively used in the development of new drugs in the pharmaceutical field.

Description

DNA 메틸화 저해 약물 스크리닝 방법{A SCREENING METHOD OF DNA METHYLTRANSFERASE INHIBITORS}DNA methylation inhibitory drug screening method {A SCREENING METHOD OF DNA METHYLTRANSFERASE INHIBITORS}

본 발명은 생체 분자 검출에 의한 생물학적, 의학적 응용에 관한 것으로 구체적으로는 단분자 FRET 기술을 이용하여, DNA 메틸전달효소의 활성을 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.The present invention relates to biological and medical applications by detecting biomolecules, and more particularly, to a method for screening a drug that inhibits the activity of a DNA methyltransferase using single-molecule FRET technology, and a kit for the same.

DNA 메틸화(methylation)는 고등생물의 발달에 매우 중요한 생화학적 프로세스로서, 후성유전학의 중요한 주제 중 하나이다. 메틸기 하나가 시토신 피리미딘 고리의 5번째 위치에 추가되거나 아데닌 퓨린 고리의 6번 질소에 추가되는 것으로, 이 변화는 세포 분화를 통해서 유전될 수 있다. 특히, 게놈의 염기서열에서 C와 G의 두 염기가 나란히 존재하는 것을 CpG 라고 하는데, 그 중 DNA의 프로모터 영역에 CpG가 많이 존재하는 부분을 CpG 아일랜드(island)라고 부른다. 이 배열에서 시토신이 메틸화되는 경향이 많으며, 인간 게놈의 경우 전체 시토신 중 3 내지 4%는 메틸화되어 있다.DNA methylation is a very important biochemical process for the development of higher organisms, and is one of the important topics in epigenetics. By adding a methyl group at the 5th position of the cytosine pyrimidine ring or at the 6th nitrogen of the adenine purine ring, this change can be inherited through cell differentiation. In particular, the presence of two bases C and G side by side in the genome sequence is called CpG, and among them, the portion where CpG is abundant in the promoter region of DNA is called a CpG island. Cytosines tend to be methylated in this arrangement, and in the human genome 3 to 4% of the total cytosines are methylated.

포유동물의 염기서열에는 CpG가 밀집되어 있는 CpG 아일랜드라는 부위가 존재하며, 이 부위는 0.5 내지 0.4kb 정도로 게놈의 유전자와 밀접한 연관성을 가지고 있는 것으로 보고되었다. 또한, 중요하게도, 암을 억제하는 유전자의 기능이 이들 유전자의 CpG 아일랜드의 메틸화로 억제됨으로써, 암이 발생한 것이라는 연구결과도 나오고 있다. 암 억제 유전자의 기능소실은 특히, 다양한 돌연변이, 또는 프로모터 부위의 메틸화로 인하여 일어나게 되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 메틸화된 DNA 탐색 기술은 암의 조기 발견과 관련된 연구 및 항암치료를 위한 표적 유전자로 활용하기 위한 연구에 있어 중요한 부분을 차지한다. 특히, 메틸전달효소 저해제는 잠재적 항암제로서 이의 효과적인 스크리닝 방법의 개발이 필요하다. In the nucleotide sequence of mammals, there is a region called CpG island where CpG is concentrated, and it has been reported that this region is closely related to the genome of about 0.5 to 0.4 kb. Also, importantly, research results are coming out that cancer is caused by suppressing the function of cancer-suppressing genes by methylation of CpG islands of these genes. It is known that the loss of function of cancer suppressor genes is caused by, in particular, various mutations or methylation of promoter regions. Therefore, methylated DNA detection technology occupies an important part in research related to early detection of cancer and research for use as a target gene for chemotherapy. In particular, it is necessary to develop an effective screening method for methyltransferase inhibitors as potential anticancer agents.

지금까지, 연구된 DNA 메틸전달효소 작용의 검출 및 분석은 크게 두 가지 방법을 이용한다. 메틸화에 민감성을 갖는 제한효소를 거의 필수적으로 이용하고, 미량의 반응산물을 PCR로 증폭하여, 신호의 변화를 측정할 수 있다. The detection and analysis of DNA methyltransferase activity studied so far mainly uses two methods. Restriction enzymes sensitive to methylation are almost always used, and a small amount of the reaction product is amplified by PCR to measure the change in signal.

그러나 이들 방법은 제한 효소의 기능에 결정적으로 의존하며, 제한효소, 항체 등 기타 단백질들을 필수로 포함한다. 대부분 미약한 신호를 증폭하는 별도의 메커니즘을 사용하기 때문에 추가적인 항체, 효소, 나노입자 등이 필요하기도 하며, 증폭에 의해 노이즈도 함께 증폭되어, 결과의 불확실성을 높일 수 있고, 측정 방법이 여러 단계를 포함하여 매우 복잡하다는 단점이 있다. 특히, 불충분한 감도의 측정장치를 사용하므로 다양한 신호 증폭 방법을 사용하는데, 특별한 종류의 제한효소, 다수의 프라이머 올리고(primer oligo), 특별한 서열의 DNA 등, 다양한 요구 사항, 분석 과정의 복잡성이 있어서 정량적인 비교가 어렵고, 측정 오차나 시약의 농도 등 많은 요소들에 영향을 받는다. 따라서, 이러한 배경 하에서, DNA 메틸전달효소 작용의 검출 및 분석을 위한 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.However, these methods depend critically on the function of restriction enzymes, and include restriction enzymes and other proteins such as antibodies. Since most of them use a separate mechanism to amplify weak signals, additional antibodies, enzymes, nanoparticles, etc. are required, and noise is also amplified by amplification, which can increase the uncertainty of the results, and the measurement method requires several steps. It has the disadvantage of being very complicated. In particular, since a measuring device with insufficient sensitivity is used, various signal amplification methods are used. There are various requirements, such as a special type of restriction enzyme, a large number of primer oligos, a special sequence of DNA, etc., and the complexity of the analysis process. Quantitative comparison is difficult, and it is affected by many factors, such as measurement error or reagent concentration. Therefore, under this background, the development of a new method for the detection and analysis of the action of DNA methyltransferase is required.

본 발명자들은 보다 간단하고, 광학적 방법을 이용하여 일반 DNA와 메틸화된 DNA를 구별하고 소량이라도 메틸화된 DNA의 정량적 검출 또는 DNA 메틸전달효소 작용의 검출이 가능한 기술을 개발하고자 연구하던 중, B-Z 구조전이 양상이 DNA 메틸화에 큰 영향을 받는다는 점에 착안하여, DNA의 이중가닥 상에 각각 존재하는 형광염료 쌍에서 발생하는 단분자 FRET을 이용하여 DNA의 구조전이를 측정하고, 상기 DNA 구조전이의 정도에 따라 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출, 정량 할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다. The present inventors have been studying to develop a technology that can distinguish normal DNA and methylated DNA using a simpler, optical method and can quantitatively detect methylated DNA or detect DNA methyltransferase action even in a small amount. Paying attention to the fact that the pattern is greatly affected by DNA methylation, the structural transition of DNA is measured using single-molecule FRET generated from a pair of fluorescent dyes present on each double strand of DNA, and the degree of the DNA structural transition is determined. Accordingly, it was confirmed that the action of methylation enzyme and demethylase enzyme and the efficacy of various drugs that promote or inhibit the action of these enzymes can be detected and quantified with high efficiency, thereby completing the present invention.

이러한 측면에서 본 발명의 하나의 목적은 단분자 FRET 기술과 DNA의 B-Z 구조전이를 이용해 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.In this aspect, one object of the present invention is to provide a method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase using single-molecule FRET technology and DNA B-Z structure transfer.

본 발명의 다른 목적은 단분자 FRET 기술과 DNA의 B-Z 구조전이를 이용해 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a methyltransferase using single-molecule FRET technology and DNA B-Z structure transfer.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것;As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a) labeled with a first fluorescent dye, labeled with a first single strand comprising 2 to 40 CpG repeat sequences and a second fluorescent dye, and 2 to 40 treating a double-stranded DNA molecule comprising a second single-stranded DNA molecule including a CpG repeat sequence with a methyltransferase and a candidate drug for methylation;

b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;b) methylation reaction by treating the same double-stranded DNA molecule as in a) as a control with a methyltransferase;

c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것; 및c) single molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the first and second fluorescent dyes by reacting each of the methylated double-stranded DNAs of a) and b) with a monovalent or divalent cationic salt solution By measuring the signal, each independently determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a), and determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of b) thing; and

d) 상기 b)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류하는 것을 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. d) when the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a) is low compared to the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of b), the candidate drug is classified as a methyltransferase inhibitor; Provided is a screening method for drugs that promote or inhibit methyltransferase action, including classifying the candidate drug as a methyltransferase promoter when the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a) is high.

또한, 상기 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공한다.In addition, as another aspect for achieving the above object, the present invention is labeled with biotin and a first fluorescent dye, comprising 2 to 40 CpG repeat sequences, 5 to 50 nt of a first single strand and a second fluorescence a double-stranded DNA molecule consisting of a second single strand of 5 to 50 nt, labeled with a dye and comprising 2 to 40 CpG repeats; methyltransferase; A solution comprising a monovalent or divalent cationic salt, and a substrate coated with avidin, wherein the first fluorescent dye and the second fluorescent dye are paired, one of which is a fluorescent donor, and the other is a fluorescent dye. Provided is a kit for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase that is a receptor.

본 발명의 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법 및 키트는, DNA의 메틸화 정도에 따라, 특정 염이 존재하는 조건에서 DNA의 B-Z 구조전이 양상이 다르게 나타나는 것을 이용하여, 이중가닥 DNA에 각각 부착된 염료 쌍 사이의 FRET 변화를 통해서 DNA 메틸화를 검출할 수 있다. 본 발명의 단분자 FRET을 이용한 분석법은 메틸화 검출을 위해서 시료의 증폭을 별도로 요구하지 않으며, 고감도로 구조전이의 측정이 가능하여 정확성이 우수하다는 장점 뿐만 아니라, 특정 효소를 이용하지 않아 경제적으로도 저렴한 이점을 지니며, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있다는 이점을 가져, 새로운 약을 개발하고 테스트하는 효과적인 방법을 제시한다.The method and kit for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase of the present invention is a double-stranded method using the fact that the BZ structure transfer pattern of DNA is different in the presence of a specific salt depending on the degree of methylation of the DNA. DNA methylation can be detected through FRET changes between each pair of dyes attached to the DNA. The analysis method using single-molecule FRET of the present invention does not require a separate amplification of the sample for methylation detection, and it has the advantage of excellent accuracy because it can measure structure transition with high sensitivity, and it is economically inexpensive because it does not use a specific enzyme. It has the advantage of being able to detect the actions of methylation enzymes and demethylase enzymes and the efficacy of various drugs that promote or inhibit the actions of these enzymes with high efficiency, thereby providing an effective method for developing and testing new drugs. .

이하에서, 보다 상세하게 본 발명의 방법 및 키트를 설명한다. Hereinafter, the method and kit of the present invention will be described in more detail.

본 발명의 스트리닝 방법은 a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열(CpG 반복 서열)을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것; b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;The screening method of the present invention is a) labeled with a first fluorescent dye, labeled with a first single strand comprising 2 to 40 cytosine and guanine repeat sequences (CpG repeat sequence) and a second fluorescent dye, and 2 to treating a double-stranded DNA molecule comprising a second single-stranded DNA molecule comprising 40 CpG repeats with a methyltransferase and a candidate drug for methylation; b) methylation reaction by treating the same double-stranded DNA molecule as in a) as a control with a methyltransferase;

c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것을 포함한다. c) single molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the first and second fluorescent dyes by reacting each of the methylated double-stranded DNAs of a) and b) with a monovalent or divalent cationic salt solution By measuring the signal, each independently determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a), and determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of b) include that

본 발명에서 용어 "DNA 메틸화"란 유전자에 나타나는 화학적 변형 중 하나로, DNA에 메틸기가 부가되는 과정을 의미한다. 구체적으로 DNA의 시토신의 피리미딘 고리 5번째 위치에 메틸기가 부가되는 것을 의미한다. 본 발명의 실시예에서는 CpG반복 서열을 포함하는 DNA 분자를 이용해서, 상기 반복 서열 내 시토신에 메틸기가 부가되는 DNA 메틸화로 확인하였다. As used herein, the term "DNA methylation" refers to a process in which a methyl group is added to DNA as one of chemical modifications appearing in a gene. Specifically, it means that a methyl group is added to the 5th position of the pyrimidine ring of the cytosine of DNA. In the example of the present invention, DNA methylation in which a methyl group is added to a cytosine in the repeating sequence was confirmed by using a DNA molecule including a CpG repeat sequence.

본 발명에서 용어 "이중가닥 DNA 분자"는 두 개의 올리고뉴클레오티드 가닥이 서로 상보적으로 결합된 핵산분자를 의미하는 것이다. 본 발명에서 메틸전달효소 및/또는 후보약물과 함께 반응하여 메틸화되는 기질로서 사용되며, 이후 DNA의 B-Z 구조전이 양상을 통해서 메틸화 여부 및 메틸화된 염기의 양을 정량적으로 검출하여 메틸전달효소의 활성 또는 후보약물의 성질을 결정하기 위한 정보를 제공한다. As used herein, the term "double-stranded DNA molecule" refers to a nucleic acid molecule in which two oligonucleotide strands are complementary to each other. In the present invention, it is used as a substrate to be methylated by reacting with a methyltransferase and/or a candidate drug, and then quantitatively detects whether or not methylation and the amount of methylated base through the BZ structure transfer pattern of DNA to activate the methyltransferase or Provides information for determining the properties of a candidate drug.

구체적인 예로, 본 발명의 스크리닝 방법 또는 키트에서 사용되는 이중가닥 DNA는 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열을 포함하는 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열을 포함하는 제2 단일 가닥으로 이루어진 것일 수 있다. As a specific example, the double-stranded DNA used in the screening method or kit of the present invention is labeled with a first fluorescent dye, and is labeled with a first single-stranded DNA comprising 2 to 40 cytosine and guanine repeat sequences and a second fluorescent dye, , may be composed of a second single strand comprising 2 to 40 cytosine and guanine repeat sequences.

상기 DNA 분자는 5 내지 50nt의 길이일 수 있고, 이중 가닥 DNA 분자 중에서 제1 가닥과 제2가닥의 길이가 상이할 수도 있다. The DNA molecule may have a length of 5 to 50 nt, and lengths of the first strand and the second strand among the double-stranded DNA molecules may be different.

상기 2 내지 40개의 CpG 반복 서열은 제1 또는 제2 단일 가닥 DNA의 중심에 포함될 수 있다. The 2 to 40 CpG repeat sequences may be included in the center of the first or second single-stranded DNA.

상기 DNA 분자의 구체 예로, 상기 이중가닥 DNA는 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제1 단일 가닥과 제2 단일 가닥으로 이루어진 비메틸(UM) DNA; CpG 반복 서열에서 모든 시토신이 메틸화된 제1 단일 가닥과 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제2 단일 가닥으로 이루어진 반-메틸(HM) DNA; 제1 단일 가닥과 제2 단일 가닥의 시토신이 모두 메틸화된 완전-메틸(FM) DNA; CpG 반복 서열에서 1개 이상의 시토신이 메틸화(모두 메틸화된 경우 제외)된 제1 단일 가닥과 메틸화된 시토신을 포함하지 않는 제2 단일 가닥으로 이루어진 일부-메틸(실시예에서 사용한 것은, 메틸화된 시토신이 약 1/4이므로 quarter methylated (QM) DNA) DNA이거나 CpG 반복 서열에서 1개 이상의 시토신이 메틸화(모두 메틸화된 경우 제외)된 제1 단일 가닥과 모든 시토신이 메틸화된 제2 단일 가닥으로 이루어진 일부-메틸(실시예에서 사용한 것은, 메틸화된 시토신이 약 3/4이므로 three-quarter methylated (TM) DNA) DNA일 수 있다. Specific examples of the DNA molecule, the double-stranded DNA may include non-methyl (UM) DNA comprising a first single strand and a second single strand that do not contain methylated cytosine; half-methyl (HM) DNA consisting of a first single strand in which all cytosines are methylated in the CpG repeat sequence and a second single strand that does not contain methylated cytosines; full-methyl (FM) DNA in which both the cytosines of the first single strand and the second single strand are methylated; Partial-methyl in the CpG repeat sequence consisting of a first single strand in which one or more cytosines are methylated (except when all are methylated) and a second single strand that does not contain a methylated cytosine (the examples used were that the methylated cytosine was quarter methylated (QM) DNA because it is about one-quarter methylated (QM) DNA) or part of a CpG repeat consisting of a first single strand in which one or more cytosines are methylated (except when all are methylated) and a second single strand in which all cytosines are methylated - Methyl (the one used in the examples is three-quarter methylated (TM) DNA) DNA as the methylated cytosine is about three-quarters.

상기 제1 단일 가닥 DNA 및 제2 단일 가닥 DNA는 메틸화된 시토신 염기를 포함하지 않거나, 일부 또는 전부 메틸화된 시토신 염기를 포함할 수 있다. The first single-stranded DNA and the second single-stranded DNA may not include methylated cytosine bases, or may include some or all methylated cytosine bases.

본 발명의 일 실시예에서는 DNA의 메틸화 정도, 즉, DNA 분자에 포함된 메틸화된 시토신의 개수에 따라서 동일한 염 농도 조건에서도 DNA 분자의 B-Z 구조전이가 상이하게 나타남을 구체적인 실시예를 통해서 확인한 바, 본 발명에서는 메틸전달효소의 특성, 효소의 양, 후보약물의 농도, 염의 종류, 염농도 조건에 따라서, DNA 분자를 다르게 선택하여 메틸화 반응을 수행할 수 있다.In one embodiment of the present invention, it was confirmed through specific examples that the BZ structure transition of the DNA molecule appears differently even under the same salt concentration condition depending on the degree of methylation of the DNA, that is, the number of methylated cytosines contained in the DNA molecule. In the present invention, the methylation reaction can be performed by selecting different DNA molecules according to the characteristics of the methyltransferase, the amount of the enzyme, the concentration of the candidate drug, the type of salt, and the salt concentration conditions.

상기 DNA 분자는 효소적 방법으로, 즉, 메틸전달효소(methyltransferase)를 이용하여 원하는 특정 서열 상의 시토신에 메틸기를 첨가하는 방법으로 제조할 수 있다. 메틸전달효소를 이용하여 완전히 메틸화시킨 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 분리하고, 상기 분리된 메틸화된 가닥에 메틸화 시토신을 포함하지 않는 다른 단일 가닥 DNA를 혼성화하는 방법으로, 반(hemi)-메틸 DNA도 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 효소적으로 제조된 반-메틸화(HM) DNA 분자는 CpG 코어의 불완전한 메틸화와 염료 표지에 의한 간섭 때문에 그 효율이 낮았으나, 메틸화는 합성된 DNA와 비슷한 경향을 보였다. 효소적으로 제조된 완전-메틸화 코어(FM) DNA 분자 역시, 아주 약간 낮은 효율을 보였을 뿐, 합성 DNA 분자와 유사한 경향을 나타냄을 확인하였는바(실험결과 1), 합성적으로 메틸화된 올리고뉴클레오티드의 높은 비용을 감안할 때, 효소적으로 메틸화된 DNA는 전이 효율이 합성된 DNA와 크게 다르지 않기 때문에, 본 연구에 대한 유용한 옵션이 될 수 있다.The DNA molecule can be prepared by an enzymatic method, that is, by adding a methyl group to a cytosine on a desired specific sequence using a methyltransferase. A method of separating fully methylated double-stranded DNA into a single strand using a methyltransferase and hybridizing another single-stranded DNA that does not contain methylated cytosine to the separated methylated strand. can be manufactured. In one embodiment of the present invention, the enzymatically prepared hemi-methylated (HM) DNA molecule had low efficiency due to incomplete methylation of the CpG core and interference by dye labeling, but the methylation showed a similar tendency to the synthesized DNA. . It was confirmed that the enzymatically prepared fully-methylated core (FM) DNA molecule also showed a very slightly low efficiency, but showed a similar trend to that of the synthetic DNA molecule (Experimental Result 1). Given the high cost, enzymatically methylated DNA could be a useful option for this study, as the transfer efficiency is not significantly different from that of synthesized DNA.

또한, 다른 일 예로 DNA를 인공적으로 합성하는 과정에서 메틸화된 시토신을 삽입하여 제조할 수 있다. 이러한 방법으로 메틸화된 DNA 분자를 제조하는 경우, 원하는 위치에 가장 확실하게 메틸기를 삽입할 수 있는 장점이 있다. Also, as another example, it may be prepared by inserting methylated cytosine in the process of artificially synthesizing DNA. In the case of preparing a methylated DNA molecule in this way, there is an advantage in that a methyl group can be most reliably inserted at a desired position.

본 발명에서 용어 "메틸전달효소"는 메틸로 이루어진 작용기를 전달해주는, 즉 메틸기 전이를 촉매하는 효소를 모두 포함하는 의미이다. 기질을 메틸화하므로 메틸화효소 또는 메틸전이효소라고도 불린다.In the present invention, the term "methyltransferase" is meant to include all enzymes that transfer a functional group consisting of methyl, that is, catalyze methyl group transfer. Because it methylates the substrate, it is also called methylase or methyltransferase.

상기 메틸전달효소는 일 예로 M.SssI 또는 DNMT1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 M.SssI 또는 DNMT1은 효소가 활성된 상태에서 이중가닥 DNA를 기질로 하여 시토신에 메틸기를 전달하여 시토신을 메틸화할 수 있다. 구체적으로 M.SssI는 비메틸 DNA, 반-메틸 DNA 또는 일부 메틸 DNA를 메틸화 할 수 있고, DNMT1은 반-메틸 DNA 또는 일부 메틸 DNA를 메틸화하는 특성을 갖는다. The methyltransferase may be, for example, M.SssI or DNMT1, but is not limited thereto. The M.SssI or DNMT1 can methylate cytosine by transferring a methyl group to cytosine using double-stranded DNA as a substrate in an enzyme-activated state. Specifically, M.SssI can methylate non-methyl DNA, half-methyl DNA, or partial methyl DNA, and DNMT1 has the property of methylating half-methyl DNA or partial methyl DNA.

본 발명에서 용어 "형광 염료"는 가시광이나 자외선광으로 형광을 발하는 염료를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 핵산분자 등을 표지하기 위한 형광 표지 염료를 의미한다. 상기 형광 염료를 이용하여 통상적으로 사용되는 화학반응을 통해 RNA, DNA 등과 같은 핵산 분자를 포함하는 생체 분자에 직접 표지 할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출방법에서는 이러한 형광 염료(분자)가 표지된 핵산 분자를 구입하여 사용할 수 있다. In the present invention, the term "fluorescent dye" refers to a dye that fluoresces with visible or ultraviolet light, and in the present invention, it refers to a fluorescent labeling dye for labeling nucleic acid molecules and the like. Biomolecules including nucleic acid molecules such as RNA and DNA can be directly labeled through a chemical reaction commonly used using the fluorescent dye. In addition, in the detection method of the present invention, a nucleic acid molecule labeled with such a fluorescent dye (molecule) can be purchased and used.

본 발명에 있어서 방법 및 키트는 한 쌍의 형광염료를 포함하며, 상기 한 쌍의 형광염료는 DNA 이중가닥에 대하여 각 가닥에 각각의 형광 염료가 결합된 것 일 수 있다. In the present invention, the method and kit include a pair of fluorescent dyes, and the pair of fluorescent dyes may be a double-stranded DNA in which each fluorescent dye is bound to each strand.

본 발명에서 이중가닥 DNA에 각각 표지된, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터일 수 있다. In the present invention, the first fluorescent dye and the second fluorescent dye, each labeled on the double-stranded DNA, form a pair, one of which may be a fluorescent donor and the other may be a fluorescent acceptor.

상기 형광염료는 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. The fluorescent dye is cyanine-based, fluorescein-based, rhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), coumarin, allophycocyanin, R-phycoerythrin, Alexa Fluor, Allophyco It may include one or more selected from the group consisting of erythrine, Texas Red, and Princeton Red.

상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7일 수 있고, 상기 플루오레세인계 염료는 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 헥산산 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명) 염료, 예를 들면 알렉사플루오르 488(상표명) 또는 알렉사플루오르 594(상표명)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The cyanine-based fluorescent dye may be Cy3, Cy5, Cy5.5 or Cy7, and the fluorescein-based dye is 5-(and 6)-carboxyfluorescein, 5-carboxyfluorescein, 6-carboxy Fluorescein, 6-(Fluorescein)-5-carboxamide hexanoic acid and fluorescein isothiocyanate, AlexaFluor® dyes such as AlexaFluor 488(TM) or AlexaFluor 594 (trade name) may be, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에서는, 이중가닥 DNA 분자에서 도너로 Cy3을 하나의 단일가닥에 표지하고, 억셉터로서 Cy5를 다른 하나의 단일가닥에 표지한, DNA 분자를 기질로, 메틸화 여부를 검출하는 시험을 수행하였다. 이를 통해서, DNA 분자의 B-Z 구조전이를 통해서 나타나는 형광신호의 변화를 통해서, Z-형 DNA의 비율을 결정하고, 이에 따라 DNA의 메틸화 여부를 검출 및 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, in a double-stranded DNA molecule, Cy3 as a donor is labeled on one single strand, and Cy5 as an acceptor is labeled on the other single-stranded, DNA molecule as a substrate to detect methylation. The test was carried out. Through this, it was confirmed that the ratio of Z-type DNA can be determined through the change of the fluorescence signal appearing through the B-Z structure transition of the DNA molecule, and accordingly, whether the DNA is methylated can be detected and quantitatively analyzed.

상기 DNA 분자는 상기 제1 단일 가닥 DNA와 제2 단일 가닥 DNA 중 어느 하나는 DNA 5' 또는 3' 말단에 비오틴이 결합된 것일 수 있다. 바람직한 예로, 형광염료가 결합된 뉴클레오티드 가닥의 다른 일 말단에 비오틴이 결합될 수 있다. 예를 들어, 제1 단일 가닥의 3' 말단에 제1 형광염료가 결합된 경우, 비오틴은 제1단일가닥의 5' 말단에 결합될 수 있다. In the DNA molecule, any one of the first single-stranded DNA and the second single-stranded DNA may have biotin bound to a 5' or 3' end of the DNA. As a preferred example, biotin may be bound to the other end of the nucleotide strand to which the fluorescent dye is bound. For example, when the first fluorescent dye is bound to the 3' end of the first single strand, biotin may be bound to the 5' end of the first single strand.

비오틴이 결합된 DNA 분자는 메틸화 과정을 거친 후, 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하기 전, 아비딘이 코팅(또는 고정)된 기재에 처리하여 DNA 분자의 비오틴과 아비딘을 결합하여 DNA 분자를 기재에 고정시킬 수 있다. 이후, 상기 기재에 염 용액을 처리하면, DNA 분자에서 구조전이가 일어나, 이에 따른 FRET 신호의 변화를 연속적으로 측정할 수 있고, 그 정확도를 더욱 높일 수 있다는 점에서 유리하다.After biotin-bound DNA molecules undergo methylation, before measuring single molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) signals, avidin-coated (or immobilized) substrates are treated to bind biotin and avidin of DNA molecules. Thus, the DNA molecule can be immobilized on the substrate. Thereafter, when the substrate is treated with a salt solution, it is advantageous in that a structural transition occurs in a DNA molecule, and thus a change in the FRET signal can be continuously measured and the accuracy thereof can be further increased.

본 발명의 메틸화된 DNA 분자를 기재와 반응시킨 후 세척하여 고정되지 않는 DNA 분자를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. The method may further include washing the methylated DNA molecule of the present invention after reacting it with the substrate to remove unimmobilized DNA molecules.

본 발명에서 용어 "고정"이란 기재의 표면에 생체 분자를 부착 또는 결합하는 것을 의미하는 것으로, 일 예로 기재의 표면에 아비딘을 코팅하는 것 또는 기재에 부착된 분자에 DNA를 결합시키는 것일 수 있다. 고정 방법은 본 발명의 기술분야에 공지된 방법을 이용할 수 있고, 일 예로 항원-항체 결합, 클릭 화학 등을 이용하여 생체 분자를 고정할 수 있다. In the present invention, the term "immobilization" refers to attaching or binding a biomolecule to the surface of a substrate, and for example, coating avidin on the surface of the substrate or binding DNA to a molecule attached to the substrate. As the immobilization method, methods known in the art may be used, and for example, biomolecules may be immobilized using antigen-antibody binding, click chemistry, and the like.

본 발명에서 용어 "약물"이란 질병의 치료, 개선 또는 예방을 위하여 사용되는 물질을 모두 포함하는 의미이다. 본 발명에서 "후보약물" 이란 그 효과 또는 DNA 분자를 포함하는 생체분자에 미치는 영향을 규명하기 위하여 시험되는 약물을 의미한다. 또한, 본 발명에서 "후보약물"이란 특정 약물이 목적하는 기전에 효과가 있는지 확인하기 위하여 시험되는 약물을 의미한다. 상기 "약물의 생체분자에 대한 영향"이란, 상기 약물이 생체분자에서 구조전이를 일으키는지 여부 및/또는 유발되는 구조전이의 정도 등을 의미한다. In the present invention, the term "drug" is meant to include all substances used for the treatment, improvement or prevention of diseases. In the present invention, the term "candidate drug" refers to a drug that is tested to determine its effect or its effect on biomolecules including DNA molecules. In addition, in the present invention, "candidate drug" means a drug that is tested to determine whether a specific drug has an effect on a desired mechanism. The "effect of a drug on a biomolecule" means whether or not the drug causes a structural transition in a biomolecule and/or the degree of the induced structural transition.

본 발명에서 용어 "구조전이"란 DNA의 이중 가닥의 구조가 일반적인 조건에서 존재하는 B-형에서 특정 조건에서 나타나는 Z-형으로 이중 가닥 사이의 나선 구조의 형태, 길이 등이 변하는 것을 의미한다. In the present invention, the term "structural transition" refers to a change in the shape, length, etc. of the helical structure between the double strands from the B-type, which exists under general conditions, to the Z-type, which appears under specific conditions, of the double-stranded structure of DNA.

본 발명에서 용어 "B형 DNA(B-DNA)" 및 "Z형 DNA(Z-DNA)"란 DNA는 이중나선의 구조의 형태를 의미하는 것이다. 구체적으로 DNA 이중나선은 오른손 방향의 B형 DNA 이중나선 외에도 다양한 구조를 취할 수 있고, 그 일 예로 왼손 방향 나선구조를 갖는 것을 Z형 DNA 구조라고 한다. In the present invention, the terms "B-type DNA (B-DNA)" and "Z-type DNA (Z-DNA)" refer to DNA in the form of a double helix structure. Specifically, the DNA double helix may have various structures other than the right-handed B-type DNA double helix, and for example, one having a left-handed helix is called a Z-type DNA structure.

어떤 특정 구조 전이에 대해서는 메틸화가 그 구조전이에 필요한 조건을 크게 바꿔준다. 따라서 메틸화되지 않은 DNA는 특정 조건에서는 구조전이가 일어나지 않지만 메틸화된 DNA의 경우 같은 조건에서도 구조전이가 쉽게 발생한다. 개별 분자 수준에서 일어나는 수 나노미터 수준의 DNA 구조전이는 두 개의 가닥 사이의 거리의 변화로 형광 신호의 변화를 나타내고, 단분자 FRET 기술을 통해서 민감하고 정밀하게 측정할 수 있다. 이를 통해, DNA 분자들 상태의 분포를 알 수 있고, 개별 분자의 추적을 통해 한 분자가 다양한 조건 변화에 따라 어떻게 거동이 달라지는지 추적이 가능하며, 시간에 따른 동적 양상의 추적도 가능하다. 또한, 개별 분자를 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 현저히 줄일 수 있다. For any specific structural transition, methylation greatly alters the conditions required for that transition. Therefore, structural transformation does not occur in unmethylated DNA under certain conditions, but in the case of methylated DNA, structural transformation occurs easily under the same conditions. DNA structure transition at the level of several nanometers that occurs at the level of individual molecules represents a change in fluorescence signal due to a change in the distance between two strands, and can be measured sensitively and precisely through single-molecule FRET technology. Through this, the distribution of the states of DNA molecules can be known, and it is possible to track how a molecule changes its behavior according to various conditions through tracking individual molecules, and it is also possible to track dynamic patterns over time. In addition, individual molecules can be detected, significantly reducing the amount of sample consumed.

본 발명에서는 FRET 결과를 통해서 Z형 DNA와 B형 DNA의 분포를 확인하여, Z-DNA가 갖는 비율을 얻을 수 있다. 이때, 동일한 조건이라고 하더라도 DNA 분자가 메틸화 된 경우 및/또는 메틸화된 시토신의 개수가 많을수록, Z-DNA로의 구조전이가 잘 일어나기 때문에, Z-DNA의 비율이 높을수록 DNA의 메틸화 정도를 확인할 수 있다. 또한, 시험에 사용된 DNA 분자의 Z-DNA 비율을 이미 알고 있는 DNA 분자를 이용한 정량 곡선 결과와 비교하여, 시험에 사용된 DNA 분자에서 메틸화된 염기의 개수를 정량적으로 측정하는 것이 가능하다. 또한, 메틸전달효소로 메틸화하나 DNA 분자와 메틸전달효소 및 후보약물로 함께 반응시켜 메틸화한 DNA 분자 사이에, 동일 염농도 조건에서 B-Z 구조전이가 다르게 확인되는 경우, 상기 후보약물이 메틸화에 관여하는 것임을 확인할 수 있다. 즉, B형에서 Z형으로 DNA 구조전이가 일어난 정도를 확인하여, DNA 분자의 메틸화 여부 및 메틸화의 정량을 분석할 수 있고, 이를 통해서, 메틸전달효소의 활성을 촉진 또는 억제하는 후보약물을 스크리닝 할 수 있다. In the present invention, the ratio of Z-DNA can be obtained by checking the distribution of Z-DNA and B-DNA through the FRET result. At this time, even under the same conditions, if the DNA molecule is methylated and/or the number of methylated cytosines increases, the structural transfer to Z-DNA occurs more easily. . In addition, it is possible to quantitatively measure the number of methylated bases in the DNA molecule used in the test by comparing the Z-DNA ratio of the DNA molecule used in the test with the result of a quantitative curve using a known DNA molecule. In addition, when the BZ structure transition is identified differently under the same salt concentration condition between DNA molecules methylated with a methyltransferase but reacted with a DNA molecule with a methyltransferase and a candidate drug, the candidate drug is involved in methylation. can be checked That is, by confirming the degree of DNA structural transfer from type B to type Z, it is possible to analyze whether DNA molecules are methylated and the quantity of methylation, and through this, candidate drugs that promote or inhibit the activity of methyltransferases are screened can do.

본 발명에서 용어 "단분자 FRET"이란 표면에 개별 분자를 고정한 상태에서, 전반사 형광 현미경 기술을 이용하여 개별 분자의 형광 또는 형광 신호의 변화를 관찰할 수 있는 기술을 의미한다. 상기 프렛이란 두 형광염료가 Forster length라고 부르는 수 nm의 특정한 길이로 떨어지면 제1 형광염료(도너, donor) 분자에 레이저 등의 조사에 의해 전달된 에너지가 제2 형광염료(억셉터, acceptor) 분자로 전달되어 대신 형광을 내는 현상을 가리키며 이를 이용하여 나노미터 수준에서 일어나는 분자의 구조 변화 및 분자간 결합을 측정할 수 있는 기술을 의미한다. 본 발명에서는 일반적인 조건에서 B-형 DNA로 존재하나, 특정 염이 존재하는 조건에서 메틸 시토신의 포함 여부에 따라서 DNA가 Z-형으로 구조전이를 일으키는 현상을 통해서, Z-DNA로 구조전이되는 경우 나타나는 FRET 신호의 변화를 확인하여, DNA 메틸화 여부를 도출할 수 있다. In the present invention, the term "unimolecular FRET" refers to a technology capable of observing changes in fluorescence or fluorescence signal of individual molecules using total reflection fluorescence microscopy in a state where individual molecules are fixed on a surface. The fret means that when the two fluorescent dyes fall to a specific length of several nm called the Forster length, the energy transferred to the first fluorescent dye (donor) molecule by irradiation with a laser or the like is converted into a second fluorescent dye (acceptor) molecule. It refers to a phenomenon that fluoresces instead of being transferred to and refers to a technology that can measure molecular structure changes and intermolecular bonds that occur at the nanometer level using this. In the present invention, it exists as B-type DNA under general conditions, but in the presence of a specific salt, the structure is transferred to Z-DNA through a phenomenon in which DNA undergoes structural transfer to Z-type depending on whether or not methyl cytosine is included. By checking the change in the FRET signal that appears, it is possible to derive whether or not DNA methylation is present.

상기 FRET을 측정하는 단계는 고정되지 않은 DNA 분자를 포함하는 시료에서 공초점 방식의 단분자 FRET을 통해 FRET의 변화를 측정할 수 있다. In the step of measuring the FRET, a change in FRET may be measured through a confocal single-molecule FRET in a sample including an unfixed DNA molecule.

또한, 상기 FRET을 측정하는 단계는 기재에 고정된 메틸화 DNA 분자를 이용하여 연속적으로 FRET의 변화를 측정할 수 있다. 또한, 기재에 고정된 메틸화 DNA 분자를 포함하는 샘플 챔버에서 염 용액을 바꾸어 주면, 상기 조건에 따라 DNA의 구조전이가 함께 변화할 것이므로, 염 용액의 조건에 따라서 변화하는 FRET의 변화를 실시간으로 추적할 수 있고, 이러한 결과값으로부터 DNA 메틸화 분석을 할 수 있다. In addition, in the step of measuring FRET, a change in FRET may be continuously measured using a methylated DNA molecule immobilized on a substrate. In addition, if the salt solution is changed in the sample chamber containing the methylated DNA molecule immobilized on the substrate, the structural transition of DNA will change according to the above conditions, so the change in FRET that changes according to the conditions of the salt solution is tracked in real time. and DNA methylation analysis can be performed from these results.

상기 FRET의 측정은 상용 멀티채널 챔버(예. ibidi channel)와 호환성을 갖도록 설계할 수 있고, (micro)fluidics channel 사용을 통한 high-throughput 장치로 개발할 수 있다. 또한, 제안된 분자 디자인과 처리 과정을 spectrophotometer에 적용하여 앙상블 프렛을 측정할 수 있다. 이를 통해서, 간단하고 우수한 감도로 DNA 메틸화 여부와 메틸화 억제 약물 스크리닝을 간단히 수행할 수 있다. The FRET measurement can be designed to be compatible with a commercial multi-channel chamber (eg, ibidi channel), and can be developed as a high-throughput device using a (micro)fluidics channel. In addition, the proposed molecular design and processing process can be applied to a spectrophotometer to measure ensemble frets. Through this, DNA methylation and methylation inhibitory drug screening can be performed simply and with excellent sensitivity.

본 발명에서, DNA의 구조전이를 확인하기 위해서, 구조전이 여부의 확인이 필요한 DNA 분자를 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 구조전이를 유도하는 것을 포함한다. 상기 구조전이 여부의 확인이 필요한 DNA는 메틸전달효소의 기질로 반응시킨, 즉 메틸화 반응을 시킨 DNA 분자이다. In the present invention, in order to confirm the structural transformation of DNA, it includes inducing structural transformation by reacting a DNA molecule that needs to be checked for structural transformation with a monovalent or divalent cationic salt solution. The DNA that needs to be checked for structural transfer is a DNA molecule that has been reacted with a substrate of a methyltransferase, that is, subjected to a methylation reaction.

DNA는 메틸화/비메틸화 여부, 또는 메틸화된 염기의 수에 따라서, 양이온성 염이 존재하는 조건에서 Z형 DNA로 구조전이를 일으키는 양상이 다르게 나타난다, 본 발명의 실시예 1 내지 3에서 이를 실험적으로 확인하였고, 각각 상이한 개수의 메틸화 염기를 표준 DNA 샘플들의 Z-DNA 분포값을 통해 정량곡선을 구하고, 이를 기초로, 시험에 사용된 DNA 분자에서 메틸화를 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였다. Depending on whether DNA is methylated/unmethylated, or the number of methylated bases, the pattern of causing a structural transition to Z-DNA in the presence of a cationic salt appears differently. In Examples 1 to 3 of the present invention, It was confirmed that a quantitative curve was obtained from the Z-DNA distribution values of standard DNA samples for each different number of methylated bases, and based on this, it was confirmed that methylation in the DNA molecule used in the test could be quantitatively analyzed.

보다 구체적으로, DNA 구조전이는 FRET을 측정한 히스토그램에서 FRET 반응 전 형광에서 최고값(pick)과 FRET 반응 후 형광에서 최고값(pick)의 면적을 측정하여 B-Z 구조전이를 일으킨 집단의 수를 확인할 수 있다. More specifically, the DNA structure transition can be determined by measuring the area of the peak value (pick) in the fluorescence before FRET reaction and the peak value (pick) in the fluorescence after the FRET reaction in the histogram measuring FRET to determine the number of groups that caused the BZ structure transition. can

본 발명의 일 실시예에서는 FRET 시험을 통해서 얻어진 FE 히스토그램에서 B-DNA(0.5 pick)와 Z-DNA(0.15 내지 0.2 pick)의 면적을 각각 계산하여, B-DNA 집단의 수와 Z-DNA 집단의 수를 각각 계산하여 Z형 DNA 비율을 결정하였다. 상기 히스토그램에서 원하는 구간의 면적은 본 발명 기술분야에서 통상적인 방법에 따라서 계산될 수 있다. In an embodiment of the present invention, the areas of B-DNA (0.5 pick) and Z-DNA (0.15 to 0.2 pick) are calculated respectively in the FE histogram obtained through the FRET test, and the number of B-DNA groups and Z-DNA groups The number of Z-type DNA was determined by calculating the number of each. The area of a desired section in the histogram may be calculated according to a method conventional in the art.

상기 양이온성 염은 1 가 또는 2가의 염 일 수 있고, 일 예로, Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The cationic salt may be a monovalent or divalent salt, and for example, may be one or more selected from the group consisting of Mg 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ and Fe 2+ .

상기 염 용액은 0.1mM 내지 800mM의 염 용액을 사용할 수 있다. 상기 범위 보다 낮은 염 용액에서는 DNA의 구조전이가 유효하게 일어나지 않고, 상기 범위를 초과하는 경우, 높은 염 농도에 의하여 핵산분자가 오히려 멜팅(melting, denaturation)되거나, 핵산 구조가 뭉쳐, 구조전이에 따른 변화를 관찰할 수 없다.The salt solution may be a salt solution of 0.1 mM to 800 mM. In a salt solution lower than the above range, structural transition of DNA does not occur effectively. change cannot be observed.

바람직하게, 본 발명에서는 30 내지 100mM의 염 용액을 사용할 수 있다. 이 경우, DNA의 메틸화 여부/개수에 따라서 Z-DNA 분포 양상이 다르게 나타나는바, 즉, 비-메틸화된 DNA 분자는 상기 범위에서 B-형태로 유지되고, 완전-메틸화된 DNA 분자는 거의 Z-형태로 전환되며, 부분-메틸화된 또는 일부-메틸화된 DNA 분자는 B-DNA와 Z-DNA 상태의 중간 정도의 상대집단 분포를 나타내기 때문이다.Preferably, in the present invention, a salt solution of 30 to 100 mM may be used. In this case, the Z-DNA distribution pattern appears differently depending on the presence/number of methylation of DNA, that is, non-methylated DNA molecules are maintained in B-form within the above range, and fully-methylated DNA molecules are almost Z- This is because DNA molecules that are converted to conformation and partially-methylated or partially-methylated show a relative population distribution intermediate between the B-DNA and Z-DNA states.

본 발명에 메틸화 반응이 수행된 DNA 분자와 반응시키는 염의 종류 또는 염의 농도는 DNA 분자의 종류에 따라서 달리 선택할 수 있다. 즉, DNA 분자 내 포함된 메틸화된 염기의 수에 따라서, 구조전이를 일으키는 염의 농도 및 염의 농도별 구조전이 정도가 다르게 나타나므로, DNA의 종류에 따라서, 염의 종류와 농도를 다르게 처리할 수 있다. In the present invention, the type of salt or salt concentration to be reacted with the DNA molecule subjected to the methylation reaction may be selected differently depending on the type of the DNA molecule. That is, depending on the number of methylated bases included in the DNA molecule, the concentration of the salt causing the structural transition and the degree of structural transition according to the concentration of the salt appear differently, so the type and concentration of the salt can be treated differently depending on the type of DNA.

일 예로, 1가의 이온을 사용하는 경우, DNA 분자에 미치는 영향을 고려하여, 2가의 이온보다 높은 농도의 염 용액을 이용할 수 있다.For example, when monovalent ions are used, a salt solution having a higher concentration than divalent ions may be used in consideration of the effect on DNA molecules.

다른 일 예로, 본 발명 스크리닝 방법에서 비메틸 DNA 분자를 이용하는 경우, 40 mM 내지 800mM 범위의 염 용액을 이용할 수 있고, 반-메틸 DNA 또는 일부-메틸 DNA를 이용하는 경우, 10mM 내지 500mM 범위의 염 용액, 완전-메틸 DNA를 이용하는 경우 0.1mM 내지 50mM 범위의 염 용액을 이용할 수 있다.As another example, when a non-methyl DNA molecule is used in the screening method of the present invention, a salt solution in the range of 40 mM to 800 mM may be used, and when half-methyl DNA or partially-methyl DNA is used, a salt solution in the range of 10 mM to 500 mM , when using full-methyl DNA, a salt solution in the range of 0.1 mM to 50 mM can be used.

본 발명의 스크리닝 방법은 상기한 FRET 결과를 통해서, 후보약물을 분류하는 단계를 더 포함한다. 구체적으로, 메틸전달효소만으로 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, 메틸전달효소와 후보약물을 함께 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; 메틸전달효소와 후보약물을 함께 반응시킨 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류할 수 있다. The screening method of the present invention further includes the step of classifying the candidate drug through the above-described FRET results. Specifically, when the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule reacted with the methyltransferase and the candidate drug is low compared to the ratio of Z-DNA in the double-stranded DNA molecule reacted with only the methyltransferase, the candidate drug is methyl classified as a transferase inhibitor; When the ratio of Z-type DNA is high in the double-stranded DNA molecule in which the methyltransferase and the candidate drug are reacted together, the candidate drug may be classified as a methyltransferase promoter.

구체적으로, 후보약물에 의하여 메틸전달효소의 활성이 억제되는 경우, DNA 분자의 CpG 반복 서열에서 메틸화가 일어나지 않거나, 메틸화의 정도가 후보약물을 처리하지 않은 경우보다 낮게 나타날 것이므로, 메틸화 반응된 DNA 분자에서 Z-DNA 구조전이가 발생하지 않거나 미미한 수준으로 발행하거나, Z-DNA의 분포가 낮게 나타날 것이므로, 상기 후보약물은 메틸전달효소를 저해하는 효과가 있다고 분류될 수 있다. 반대로, 메틸전달효소 활성을 촉진시키는 후보약물의 경우, 메틸전달효소에 의한 DNA 분자에서 메틸화가 더욱 많이 일어나도록 할 것이므로, 동일한 조건에서 메틸전달효소만으로 반응시킨 DNA 분자와 비교해서 더 많은 메틸 염기를 포함할 것인바, Z-DNA의 분포가 더 높아져, 상기 후보약물은 메틸전달효소를 촉진하는 효과를 갖는다고 분류될 수 있다.Specifically, when the activity of the methyltransferase is inhibited by the candidate drug, methylation does not occur in the CpG repeat sequence of the DNA molecule, or the degree of methylation is lower than that in the case where the candidate drug is not treated. Since the Z-DNA structure transfer does not occur or occurs at an insignificant level, or the Z-DNA distribution will appear low, the candidate drug can be classified as having an effect of inhibiting the methyltransferase. Conversely, in the case of a candidate drug that promotes methyltransferase activity, it will cause more methylation in the DNA molecule by the methyltransferase. As will be included, the distribution of Z-DNA is higher, so that the candidate drug can be classified as having an effect of promoting methyltransferase.

시험에 사용된 메틸전달효소의 저해 정도(DOI), 즉 활성 억제되는 정도는 다음 식으로 계산할 수 있다. The degree of inhibition (DOI) of the methyltransferase used in the test, that is, the degree of inhibition of activity, can be calculated by the following formula.

[식 1][Equation 1]

Figure 112020009006810-pat00001
Figure 112020009006810-pat00001

상기 식 1에서, P(Z;0)은 억제제와 메틸화효소가 없을 때의 Z-DNA 형성 확률이고, P(Z;MTase) 메틸전달효소(MTase)와 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률, P(Z;MTase&drug)은 메틸전달효소(MTase) 및 저해제 약물과 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률이다(상기 확률은 전체 히스토그램 면적에서 Z에 해당하는 부분의 면적의 비율을 의미한다). In Equation 1, P ( Z; 0 ) is the Z-DNA formation probability in the absence of inhibitor and methylase, P ( Z; MTase ) Z-DNA formation probability after incubation with methyl transferase (MTase), P ( Z;MTase&drug ) is the probability of Z-DNA formation after incubation with methyltransferase (MTase) and an inhibitor drug (the probability refers to the ratio of the area of the portion corresponding to Z to the total histogram area).

따라서, 약물이 아무런 효과가 없어서 P(Z; MTase & drug) = P(Z; MTase)이면, 상기 식에서 해당 약물은 0의 저해도를 갖는다(DOI=0). 반면에, P(Z)가 메틸전달효소가 없을 때 관찰되는 P(Z;0) 수준으로 완전하게 감소한다면, 저해는 완벽할 것이다(DOI=1). Therefore, if the drug has no effect and thus P (Z; MTase & drug) = P (Z; MTase), in the above formula, the drug has a degree of inhibition of 0 (DOI=0). On the other hand, if P (Z) was completely reduced to the level of P (Z;0) observed in the absence of methyltransferase, inhibition would be complete (DOI=1).

본 발명은 또한, 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트를 제공한다. The present invention also relates to a first single strand of 5 to 50 nt, labeled with biotin and a first fluorescent dye, comprising 2 to 40 CpG repeats, and labeled with a second fluorescent dye, and 2 to 40 CpG repeats. A double-stranded DNA molecule consisting of a second single strand of 5 to 50 nt; methyltransferase; A solution comprising a monovalent or divalent cationic salt, and a substrate coated with avidin, wherein the first fluorescent dye and the second fluorescent dye are paired, one of which is a fluorescent donor, and the other is a fluorescent dye. It provides a kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a sceptor, a methyltransferase.

상기 스크리닝 방법에 대한 내용은 본 발명 키트에도 그대로 준용된다.The contents of the screening method are applied mutatis mutandis to the kit of the present invention.

본 발명을 이용하면 DNA 분자의 구조전이를 정밀하고 민감하게 검출할 수 있어, 소비되는 샘플의 양을 극단적으로 줄일 수 있어 경제적이고, 메틸화효소 및 탈메틸화효소의 작용, 이들 효소의 작용을 촉진하거나 억제하는 각종 약의 효능을 고효율로 검출할 수 있게 해주므로 제약 분야에서 신규 약물의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.By using the present invention, it is possible to precisely and sensitively detect the structural transition of a DNA molecule, and it is economical because the amount of sample consumed can be extremely reduced, and the action of methylation enzymes and demethylase enzymes, the actions of these enzymes, or Since the efficacy of various inhibitory drugs can be detected with high efficiency, it can be effectively used in the development of new drugs in the pharmaceutical field.

도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단분자 FRET을 이용한 DNA 메틸화 검출시험을 위한 단분자 설계(도 1a)와 B-Z 구조전이에 따른 FRET의 변화 양상(1b)을 보여준다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 단분자로서 반-메틸화 DNA를 제조하기 위한 합성 모식도이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 염 농도에서 다양한 메틸화 정도를 갖는 DNA 분자의 Z-DNA로의 전이 양상을 확인한 결과이다. 도2a는 Mg2+의 농도에 따른 비메틸화 DNA(UM)에 대한 CpG 코어의 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(100 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2b는 Mg2+의 농도에 따른 반-메틸화 DNA(HM)에 대한 CpG 코어에서 FE 히스토그램이다(아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2c는 Mg2+의 농도에 따른 완전-메틸화 DNA(FM)에 대한 CpG 코어에서 FE 히스토그램(아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(100 mM Na+ 포함), 0.5 mM, 5 mM, 10 mM, 500 mM)과 스크램블 DNA 코어의 Mg2+ 500 mM에서 FE 히스토그램을 보여준다(가장 아래 그래프).
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 Mg2+의 농도에 따른 Z-DNA 집단의 변이를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 낮은 Mg2+의 농도에 따른 Z-DNA 집단의 전이를 확대한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 메틸화를 갖는 뉴클레오타이드 분자에서 [Mg2+]=50mM에서 Z-DNA 양상 및 중점을 보여주는 결과이다. Z-DNA 집단은 DNA의 메틸화 정도에 따라 선형적으로 증가한다.
도 2g는 본 발명의 일 실시예에 따른 한 개의 가닥에 5개의 메틸화된 시토신을 포함하는 CpG 코어(QM)의 Mg2+의 농도에 따른 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM). 도 2h는 본 발명의 일 실시예에 따른 한 개의 가닥에 5개의 메틸화된 시토신을 포함하고, 나머지 한 개의 가닥에는 11개의 메틸화된 시토신을 포함하는 CpG 코어(TM)의 Mg2+의 농도에 따른 FE 히스토그램이다 (아래에서 위로 Mg2+의 농도: Mg2+ 없음(50 mM Na+ 포함), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 M.SssI 농도(1 내지 200U/mL)에서 비메틸화(UM) 코어를 메틸화하는 경우 Z-DNA의 분포를 확인한 결과를 보여준다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 DNMT1 농도(20 내지 400U/mL)에서 반-메틸화(HM) 코어를 메틸화하는 경우 Z-DNA의 분포를 확인한 결과를 보여준다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 M.SssI 농도에서 비메틸화(UM) 코어를 메틸화하는 경우 FE 히스토그램을 보여준다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 DNMT1 농도(20 내지 400U/mL)에서 반-메틸화(HM) 코어를 메틸화하는 경우 FE 히스토그램을 보여준다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 메틸전달효소 저해제의 다양한 농도에서 메틸화 저해률을 확인한 결과(도 4)와, 상기 저해율을 위한 FE 히스토그램 결과이다:
도 4a 및 도 5a는 다양한 농도의 커큐민(0.5, 1, 5, 10, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 도 4b 및 도 5b는 다양한 농도의 커큐민(0.25, 1, 5, 10, 40, 100, 200 uM)의 DNA 메틸화효소 DNMT1의 메틸화 활성의 대한 저해 정도를 확인한 결과; 도 4c 및 도 5c는 다양한 농도의 EGCG(5, 10, 50, 100, 200, 400, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 도 4d 및 도 5d는 다양한 농도의 제니스테인(200, 400, 600, 800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 M.SssI의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과; 그리고 도 4e 및 도 5e는 다양한 농도의 제니스테인(50, 200, 500, 1000, 1800 uM)에 의한 DNA 메틸화효소 DNMT1의 메틸화 활성 저해 정도를 확인한 결과를 보여준다.1a and 1b show a single molecule design (FIG. 1a) for a DNA methylation detection test using a single molecule FRET according to an embodiment of the present invention, and a change pattern of FRET according to the BZ structure transition (1b).
1c is a synthetic schematic diagram for preparing semi-methylated DNA as a single molecule according to an embodiment of the present invention.
2A to 2C are results of confirming the transition pattern of DNA molecules having various methylation degrees to Z-DNA at various salt concentrations according to an embodiment of the present invention. Figure 2a is a histogram of the FE CpG core for non-methylated DNA (UM) of the concentration of Mg 2+ (Mg 2+ concentrations from bottom to the top of: Mg 2+ N (containing 100 mM Na +), 10 mM , 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). Figure 2b is a half of the concentration of Mg 2+ - FE is a histogram in CpG core for methylated DNA (HM) (below the top of the Mg 2+ concentration: Mg 2+ N (containing 50 mM Na +), 10 mM , 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM). Figure 2c is completely in accordance with the concentration of Mg 2+ - concentration of FE histogram (down up Mg 2+ in the core of the CpG methylated DNA (FM): Mg 2+ N (containing 100 mM Na +), 0.5 mM , 5 mM, 10 mM, 500 mM) and Mg 2+ 500 mM of the scrambled DNA core (lowest graph).
2D is a graph showing the results of confirming the variation of the Z-DNA population according to the concentration of Mg 2+ in nucleotide molecules having various methylations according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2E is a graph showing the results of expanding the transition of the Z-DNA population according to the low concentration of Mg 2+ in nucleotide molecules having various methylations according to an embodiment of the present invention.
Figure 2f is a result showing the Z-DNA pattern and center at [Mg 2+ ] = 50 mM in a nucleotide molecule having various methylations according to an embodiment of the present invention. The Z-DNA population increases linearly with the degree of DNA methylation.
2G is an FE histogram according to the concentration of Mg 2+ in a CpG core (QM) comprising five methylated cytosines in one strand according to an embodiment of the present invention (from bottom to top, Mg 2+ concentration: Mg 2+ None (with 50 mM Na + ), 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM). Figure 2h shows the concentration of Mg 2+ of the CpG core (TM) including 5 methylated cytosines in one strand and 11 methylated cytosines in the other strand according to an embodiment of the present invention; a FE histogram (below the top of the Mg 2+ concentration: Mg 2+ N (containing 50 mM Na +), 10 mM , 50 mM, 100 mM, 300 mM, 500 mM).
Figure 3a shows the results of confirming the distribution of Z-DNA when the unmethylated (UM) core is methylated at various M.SssI concentrations (1 to 200 U/mL) according to an embodiment of the present invention.
Figure 3b shows the results of confirming the distribution of Z-DNA when the hemi-methylated (HM) core is methylated at various DNMT1 concentrations (20 to 400 U/mL) according to an embodiment of the present invention.
Figure 3c shows the FE histogram for methylation of an unmethylated (UM) core at various M.SssI concentrations according to an embodiment of the present invention.
3D shows FE histograms for methylating hemi-methylated (HM) cores at various DNMT1 concentrations (20 to 400 U/mL) according to an embodiment of the present invention.
4 and 5 are the results of confirming the methylation inhibition rate at various concentrations of the methyltransferase inhibitor according to an embodiment of the present invention (FIG. 4), and the FE histogram results for the inhibition rate:
4a and 5a show the results of confirming the degree of inhibition of the methylation activity of the DNA methylase M.SssI by various concentrations of curcumin (0.5, 1, 5, 10, 800 uM); 4b and 5b show the results of confirming the degree of inhibition of the methylation activity of the DNA methylase DNMT1 of various concentrations of curcumin (0.25, 1, 5, 10, 40, 100, 200 uM); 4c and 5c show the results of confirming the degree of inhibition of the methylation activity of the DNA methylase M.SssI by various concentrations of EGCG (5, 10, 50, 100, 200, 400, 800 uM); 4d and 5d show the results of confirming the degree of inhibition of the methylation activity of the DNA methylase M.SssI by various concentrations of genistein (200, 400, 600, 800 uM); And Figures 4e and 5e show the results of confirming the degree of inhibition of the methylation activity of the DNA methylase DNMT1 by various concentrations of genistein (50, 200, 500, 1000, 1800 uM).

이하, 구체적인 실시예를 통해서 본 발명을 설명할 수 있다. 다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, the present invention can be described by way of specific examples. However, since the present invention can have various changes and can have various forms, the specific examples and descriptions described below are only for helping the understanding of the present invention, and are intended to limit the present invention to specific disclosed forms. it is not It should be understood that the scope of the present invention includes all modifications, equivalents and substitutes included in the spirit and scope of the present invention.

[실시예][Example]

[시험 준비 및 시험 방법][Test Preparation and Test Method]

1. DNA 샘플, DNA 메틸전달효소 및 DNMT1 저해제 준비1. DNA sample, DNA methyltransferase and DNMT1 inhibitor preparation

염료-표지 DNA 및 비표지 DNA 올리고뉴클레오티드는 모두 IDT, Inc.(Coralville, IA, USA)로부터 구입하였다. 또한, IDT로부터 CG 반복 서열에서 시토신-메틸화된 DNA 올리고뉴클레오티드를 구입하였다. 듀플렉스(duplex) 중 하나의 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 비오틴을 포함하여, 뉴트라비딘-코팅된 유리 기판에 고정화되도록 설계하였다. 실험에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열정보(CG1 및 CG2, m5CG1, m11CG1 및 m11CG2)는 표 1에 나타내었다. 테더(tether) 분자는 표준절차(Kim,S.H., Lim,S.-H., Lee,A.-R., Kwon,D.H., Song,H.K., Lee,J.-H., Cho,M., Johner,A., Lee,N.-K. and Hong,S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced B-Z transition. Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137 참고)에 따라, T50 완충액(10 mM Tris, 및 50 mM NaCl, pH 8.0)에서 두 상보적인 올리고뉴클레오티드(각각 약 1 μM)를 혼성화하여 준비하였다.Both dye-labeled DNA and unlabeled DNA oligonucleotides were purchased from IDT, Inc. (Coralville, IA, USA). In addition, cytosine-methylated DNA oligonucleotides in CG repeat sequences were purchased from IDT. One oligonucleotide of the duplex was designed to be immobilized on a neutravidin-coated glass substrate by including biotin at the 3' end. The sequence information (CG1 and CG2, m 5 CG1, m 11 CG1 and m 11 CG2) of the oligonucleotides used in the experiment is shown in Table 1. Tether molecules are prepared by standard procedures (Kim, SH, Lim, S.-H., Lee, A.-R., Kwon, DH, Song, HK, Lee, J.-H., Cho, M., Johner, A., Lee, N.-K. and Hong, S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced BZ transition. See Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137) As described above, it was prepared by hybridizing two complementary oligonucleotides (approximately 1 μM each) in T50 buffer (10 mM Tris, and 50 mM NaCl, pH 8.0).

상이한 메틸화 정도를 갖는 DNA 듀플렉스는 조합 방식으로 제조하였다. 비메틸화 코어(UM)의 경우, 2개의 비-메틸화 가닥(CG1 및 CG2)이 혼성화되고; 반- 메틸화 코어(HM)의 경우, 전부-메틸화 가닥(m11CG1) 및 비-메틸화 가닥(CG2)이 혼성화되며; 완전-메틸화 코어(FM)의 경우, 2개의 전부-메틸화 가닥(m11CG1 및 m11CG2)이 혼성화된다. DNA duplexes with different degrees of methylation were prepared combinatorially. For the unmethylated core (UM), the two non-methylated strands (CG1 and CG2) are hybridized; for the semi-methylated core (HM), the fully-methylated strand (m 11 CG1) and the non-methylated strand (CG2) are hybridized; For the fully-methylated core (FM), the two fully-methylated strands (m 11 CG1 and m 11 CG2) hybridize.

반-메틸화된 것보다 더 적게 메틸화된 분자를 갖기 위해, 총 5개의 시토신이 메틸화된 CG1-타입 가닥을 사용하였다(m5CG1). 반-메틸화 가닥(m5CG1)과 비메틸화 가닥(CG2)을 혼성화함으로써, 한 가닥에 5개의 메틸화 시토신을 갖는 코어분자(쿼터 메틸화(QM), m5-m0)를 제조하였다. 메틸화도가 반-메틸화와 완전-메틸화 사이의 분자(3/4 메틸화(TM), m5-m11)를 제조하기 위해서, 반-메틸화 가닥(m5CG1)과 전부-메틸화 가닥(m11CG2)을 사용하였다.To have less methylated molecules than semi-methylated ones, a total of 5 cytosine methylated CG1-type strands were used (m 5 CG1). By hybridizing the semi-methylated strand (m 5 CG1) and the non-methylated strand (CG2), a core molecule (quarter methylated (QM), m5-m0) having 5 methylated cytosines per strand was prepared. To produce a molecule with a degree of methylation between half-methylation and full-methylation (3/4 methylation (TM), m5-m11), the semi-methylated strand (m 5 CG1) and the fully-methylated strand (m 11 CG2) was used.

서열번호 SEQ ID NO: 이름name 서열order 서열번호 1SEQ ID NO: 1 CG1(Cy5)CG1 (Cy5) 5'PhosGATCCTGGTACGCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy5/CGCGATCGAC 3'5'PhosGATCCTGGTACGCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy5/CGCGATCGAC 3' 서열번호 2SEQ ID NO: 2 CG2(Biotin,Cy3)CG2 (Biotin, Cy3) 5'PhosTGCCGTCGATCGCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy3/CGCGTACC AG-Biotin 3'5'PhosTGCCGTCGATCGCGCGCGCGCGCGCG/iCy3/CCGGTACC AG-Biotin 3' 서열번호 3SEQ ID NO: 3 m5CG1m 5 CG1 5'/5Phos/ GAT CCT GGT ACG /iMe-dC/ GCG CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G /iCy5/ CG /iMe-dC/ G ATC GAC3'5'/5Phos/ GAT CCT GGT ACG /iMe-dC/ GCG CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G CG /iMe-dC/ G /iCy5/ CG /iMe-dC/ G ATC GAC3' 서열번호 4SEQ ID NO: 4 m11CG1(Cy5)m 11 CG1 (Cy5) /5Phos/GATCCTGGTA/iMe-dC/G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC /G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC/G/iMe- dC/G /iMe-dC/G/iCy5//iMe-dC/G/iMe-dC/GATCGAC 3'/5Phos/GATCCTGGTA/iMe-dC/G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC /G/iMe-dC/G /iMe-dC/G /iMe-dC/G/iMe- dC /G /iMe-dC/G/iCy5//iMe-dC/G/iMe-dC/GATCGAC 3' 서열번호 5SEQ ID NO: 5 m11CG2(Cy3)m 11 CG2 (Cy3) 5'/5Phos/ TGCC GTC GAT /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iCy3/ /iMe-dC/ G /iMe-dC/ GT ACC AG 3'5'/5Phos/ TGCC GTC GAT /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iMe-dC/ G /iCy3/ /iMe-dC/ G /iMe-dC/ GT ACC AG 3'

또한, 효소적 방식으로 불완전한 메틸화 정도를 갖는 DNA 분자를 준비했다(도 1c 참조). 효소적으로 제조된 분자를 B-Z 전이를 위해 구매된 합성 분자와 비교함으로써, 이들이 유사한 거동을 가지고, 효소적으로 메틸화된 분자의 메틸화의 불완전성 수준을 결정할 수 있음을 확인하였다. In addition, DNA molecules with an incomplete degree of methylation were prepared in an enzymatic manner (see Fig. 1c). By comparing enzymatically prepared molecules with synthetic molecules purchased for B-Z transition, it was confirmed that they have similar behavior and can determine the level of methylation incompleteness of enzymatically methylated molecules.

메틸전달효소로서, MSssI와 인간 DNA methyltransferase 1(DNMT1)는 NEB로부터 구입하여 사용하였다. S-아데노실 메티오닌(S-Adenosyl methionine, SAM, AdoMet)은 보관 기간이 매우 제한되기 때문에, NEB로부터 정기적으로 구입하여 사용하였다. 한 번 열면 2주 동안 활성 상태로 유지되므로, 개봉 후 1~2 일 이내에 SAM을 사용했습니다. 또한 알려진 메틸화효소(MethylTransferase: MTase) 저해제, 커큐민(curcumin), EGCG 및 제니스테인(genistein)을 Sigma-Aldrich로부터 구입하여 실험에 이용하였다. As methyltransferases, MSssI and human DNA methyltransferase 1 (DNMT1) were purchased from NEB and used. Since S-Adenosyl methionine (SAM, AdoMet) has a very limited storage period, it was purchased from NEB regularly and used. Once opened, it remains active for two weeks, so the SAM was used within 1-2 days of opening. In addition, known methylation enzyme (MethylTransferase: MTase) inhibitors, curcumin, EGCG and genistein were purchased from Sigma-Aldrich and used in the experiment.

형광염료 쌍으로 Cy3(도너)와 Cy5(억셉터)를 사용하였다. 3' 말단에 Cy3(도너)와 비오틴 각각 표지된 제1 단일가닥과 3' 말단에 Cy5(억셉터)가 표지된 제2 단일가닥이 혼성화된 이중가닥 DNA 분자를 이용하였다. Cy3 (donor) and Cy5 (acceptor) were used as a pair of fluorescent dyes. A double-stranded DNA molecule in which a first single-stranded 3' end labeled with Cy3 (donor) and biotin, respectively, and a second single-stranded, 3' end labeled with Cy5 (acceptor) were hybridized was used.

2. DNA 메틸화 반응2. DNA methylation reaction

메틸전달효소 및 메틸전달효소의 저해제를 이용하여 DNA 메틸화 반응을 수행하였다. 구체적으로, DNMT1 억제제(커큐민, EGCG 또는 제니스테인)의 존재 또는 부재하에 DNA MTase (M.SssI 또는 DNMT1)로 DNA 메틸화 분석을 수행하였다. DNA methylation reaction was performed using methyltransferase and an inhibitor of methyltransferase. Specifically, DNA methylation analysis was performed with a DNA MTase (M.SssI or DNMT1) in the presence or absence of a DNMT1 inhibitor (curcumin, EGCG or genistein).

억제제-프리 분석에서, SAM, 10x완충액, DNA 및 M.SssI 또는 DNMT1의 순서로 시약을 물(또는 물에서 최대 1.75% DMSO(2.5% DMSO-커큐민))에 첨가하였다. 억제제-프리 DNMT1 분석을 위해서, 20㎕의 반응 혼합물은 반응 완충액(1x DNMT1 완충액(200 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 % Glycerol, pH 7.5) 중 160μM SAM 및 100μg/ml BSA)에 25nM DNA 듀플렉스와 100U/ml DNMT1 (20~400 U/ml)을 포함하였다. 억제제-프리 M.SssI 분석을 위해서, 20㎕의 반응 혼합물은 반응 완충액(1x NEB 완충액 2(50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.9) 중 160μM SAM)에 25 nM DNA 듀플렉스와 80U/ml (10~200) M.SssI를 포함하였다. In the inhibitor-free assay, reagents were added to water (or up to 1.75% DMSO in water (2.5% DMSO-curcumin)) in the following order: SAM, 10x buffer, DNA and M.SssI or DNMT1. For inhibitor-free DNMT1 assays, 20 μl of the reaction mixture was prepared by mixing 160 μM SAM and 100 μg/ml BSA) contained 25 nM DNA duplex and 100 U/ml DNMT1 (20-400 U/ml). For inhibitor-free M.SssI assays, 20 μl of the reaction mixture was mixed with reaction buffer ( 160 μM SAM in 1x NEB buffer 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, pH 7.9)) 25 nM DNA duplex and 80 U/ml (10-200) M.SssI were included.

혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 다양한 인큐베이션 시간(전형적으로 2 시간) 이후, 메틸화 반응은 65℃에서 20분 동안 효소의 열 불활성화에 의해 중단되었고, 반응 혼합물은 이후 smFRET 측정 전까지 -20℃에서 저장되었다.The mixture was incubated at 37°C, after various incubation times (typically 2 hours), the methylation reaction was stopped by thermal inactivation of the enzyme at 65°C for 20 min, and the reaction mixture was then stored at -20°C until smFRET measurement. became

또한, 메틸화 반응에서 DMSO가 DNMT1 저해제의 용매로 사용되기 때문에 그 자체의 효과도 테스트하였다. 2.5% DMSO는 DNA 메틸화에 눈에 띄는 영향을 미치지 않지만 10%를 초과하는 DMSO는 효소 활성을 억제할 수 있음을 확인하여, 이후 실험에서는 10% 농도 미만으로 설정하여 메틸화 반응을 수행하였다.In addition, since DMSO is used as a solvent for the DNMT1 inhibitor in the methylation reaction, its effect was also tested. 2.5% DMSO did not have a noticeable effect on DNA methylation, but it was confirmed that DMSO in excess of 10% can inhibit the enzyme activity. In subsequent experiments, the methylation reaction was performed by setting the concentration to less than 10%.

MTase 억제 분석에서, 다양한 농도의 MTase 저해제를 M.SssI 또는 DNMT1과 함께 첨가되었다. 저해제의 첨가를 제외하고는 반응 및 분석은 완전히 동일하게 수행하였다. In the MTase inhibition assay, various concentrations of MTase inhibitor were added together with either M.SssI or DNMT1. Except for the addition of the inhibitor, the reaction and analysis were performed exactly the same.

3. 단일 분자 FRET을 이용한 DNA 메틸화 분석3. DNA Methylation Analysis Using Single Molecule FRET

단일 분자 FRET 기술은 수많은 논문에서 검토되었으며, 본 발명에서는 Nucleic Acids Res., 46, 2018(Kim,S.H., Lim,S.-H., Lee,A.-R., Kwon,D.H., Song,H.K., Lee,J.-H., Cho,M., Johner,A., Lee,N.-K. and Hong,S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced B-Z transition. Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137)에 개시된 바에 따라 분석을 수행하였다. 실험 과정 및 자세한 내용은 Ann. Rev. Biochem., 77, 51, 2008 (Joo C., Balci H., Ishitsuka Y., Buranachai C., Ha T. (2008) Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology의 기재를 함께 참고하여 수행하였다. Single molecule FRET technology has been reviewed in numerous papers, and in the present invention, Nucleic Acids Res., 46, 2018 (Kim, SH, Lim, S.-H., Lee, A.-R., Kwon, DH, Song, HK) , Lee, J.-H., Cho, M., Johner, A., Lee, N.-K. and Hong, S.-C. (2018) Unveiling the pathway to Z-DNA in the protein-induced BZ Transition. Nucleic Acids Res., 46, 4129-4137). The experimental process and more details can be found in Ann. Rev. Biochem., 77, 51, 2008 (Joo C., Balci H., Ishitsuka Y., Buranachai C., Ha T. (2008) Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology .

커버 슬립 및 슬라이드 글라스는 아세톤으로 초음파 처리하고 플라즈마 세정을 수행하였다. 그 다음, 챔버에 장착하였다. 챔버는 1mg/ml 비오틴 표지된 BSA 및 0.2mg/ml 뉴트라비딘으로 코팅되었다. 이어서, 이 메틸화 반응 수행된 DNA를 포함하는 샘플 용액을 상기 챔버에 도입하고, 10 분 동안 DNA 테더의 고정화를 위해 인큐베이션 하였다. 이어서, 샘플 챔버를 다양한 농도의 Mg2+를 함유하는 4x챔버 부피의 완충 용액으로 세척한 다음 30분 동안 인큐베이트 하였다. 30분 후, 전이는 평형 상태에 도달한다. 형광 측정을 위해, 챔버를 5~500mM MgCl2가 첨가된 산소 제거 용액(2mM Trolox, 2.6mM PCA(Protocatechuaic acid, Sigma), 1unit/ml의 rPCO(Protocatechuate 3,4-dioxygenase, OYC Japan))으로 세척하였다. The coverslips and slide glasses were sonicated with acetone and plasma cleaned. Then, it was mounted in the chamber. The chamber was coated with 1 mg/ml biotin-labeled BSA and 0.2 mg/ml neutravidin. Then, a sample solution containing the DNA subjected to this methylation reaction was introduced into the chamber, and incubated for 10 minutes to immobilize the DNA tether. The sample chambers were then washed with 4x chamber volumes of buffer solutions containing various concentrations of Mg 2+ and then incubated for 30 min. After 30 minutes, the transition reaches equilibrium. For fluorescence measurement, the chamber was incubated with an oxygen scavenging solution (2 mM Trolox, 2.6 mM PCA (Protocatechuaic acid, Sigma), 1 unit/ml rPCO (Protocatechuate 3,4-dioxygenase, OYC Japan)) supplemented with 5~500 mM MgCl 2 ). washed.

　메틸화 정도를 결정하거나 메틸화 수준을 비교하기 위한 분석에서, [Mg2+] = 50mM을 사용하였다. In assays to determine the degree of methylation or to compare methylation levels, [Mg 2+ ] = 50 mM was used.

[실험 결과][Experiment result]

1. DNA 메틸화와 CG 반복 서열에서 B-Z 구조전이 효율의 관계 확인 1. Confirmation of the relationship between DNA methylation and B-Z structure transfer efficiency in CG repeat sequences

DNA 메틸화가 B-Z 구조전이를 강화하는지 확인하기 위해서, 비메틸화 코어(UM), 반-메틸화 코어(HM), 완전-메틸화 코어(FM) CG 반복 서열과 중간 정도의 메틸화를 갖는 다른 CG 반복 서열(QM, TM)을 이용하여, 일련의 마그네슘 농도 하에서 B-Z 전이가 일어나는지 여부를 단분자 프렛(smFRET)을 이용하여 확인하였다. 모든 서열은 14bp로 떨어진 FRET 염료 쌍을 포함하도록 하였다. To determine whether DNA methylation enhances the BZ conformational transition, unmethylated core (UM), semi-methylated core (HM), fully-methylated core (FM) CG repeats and other CG repeats with moderate methylation ( QM, TM), whether the BZ transition occurred under a series of magnesium concentrations was confirmed using a monomolecular fret (smFRET). All sequences were intended to contain pairs of FRET dyes separated by 14 bp.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 비메틸화 코어(UM, m=0)는 매우 높은 [Mg2+] 농도에서 B-Z 구조전이를 보였다. 비메틸화 코어(UM) DNA의 경우, 0.5M 보다 높은 마그네슘 이온[Mg2+]의 농도에서 B-Z 전이의 중점(B상태와 Z상태가 50:50으로 존재)이 나타나는 것을 알 수 있다. 그러나, 도 2b의 반-메틸화 코어(HM, m=11)는 더 낮은 [Mg2+] 농도에서 B-Z 구조전이를 보였다. B-Z 구조전이에 대한 Mg2+ 중점 농도는 0.1 M MgCl2 였고, 300mM 이상의 [Mg2+] 농도에서 반-메틸화 코어(HM)는 주로 Z-형태로 존재하였다. 또한, 도 2c의 완전-메틸화 코어(FM)는 0.5mM의 마그네슘 이온 ([Mg2+]) 중점을 보였고, 이는 Mg2+의 생리학적 농도 범위 내에 포함된다(Cell Biology by the Numbers by Ron Milo & Rob Phillips). 이 중간 농도는 반-메틸화 코어(HM)에 대한 농도보다 50 내지 100배 낮은 농도이다. 쿼터 메틸화 코어(QM, 0-5)는 비메틸화 코어(UM)과 반-메틸화 코어(HM) 사이의 중간적인 과도기적 거동을 보였다(도 2g). 또한, 3/4 메틸화(TM) 코어는 반-메틸화(HM)와 완전-메틸화(FM) 사이의 중간형태의 거동을 보였다(도 2h). 효소적으로 제조된 반-메틸화(HM) DNA 분자는 CG 코어의 불완전한 메틸화와 염료 표지에 의한 간섭 때문에 그 효율이 낮았으나, 메틸화는 합성된 DNA와 비슷한 경향을 보였다. 효소적으로 제조된 완전-메틸화 코어(FM) DNA 분자 역시, 아주 약간 낮은 효율을 보였을 뿐, 합성 DNA 분자와 유사한 경향을 나타냈다. As shown in Fig. 2a, the unmethylated core (UM, m=0) showed a BZ structural transition at a very high [Mg 2+ ] concentration. In the case of unmethylated core (UM) DNA, it can be seen that at a concentration of magnesium ion [Mg 2+ ] higher than 0.5 M, the midpoint of the BZ transition (the B state and the Z state exist in a 50:50 ratio) appears. However, the semi-methylated core (HM, m=11) of FIG. 2b showed a BZ structural transition at a lower [Mg 2+ ] concentration. The Mg 2+ central concentration for the BZ structure transition was 0.1 M MgCl 2 , and the semi-methylated core (HM) was mainly in the Z-form at the [Mg 2+ ] concentration above 300 mM. In addition, the fully-methylated core (FM) of FIG. 2c showed a magnesium ion ([Mg 2+ ]) concentration of 0.5 mM, which is within the physiological concentration range of Mg 2+ (Cell Biology by the Numbers by Ron Milo). & Rob Phillips). This intermediate concentration is 50 to 100 times lower than the concentration for the semi-methylated core (HM). The quarter methylated core (QM, 0-5) showed an intermediate transitional behavior between the unmethylated core (UM) and the semi-methylated core (HM) (Fig. 2g). In addition, the 3/4 methylated (TM) core showed an intermediate behavior between semi-methylated (HM) and full-methylated (FM) (Fig. 2h). The enzymatically prepared hemi-methylated (HM) DNA molecule had low efficiency due to incomplete methylation of the CG core and interference by dye labeling, but methylation showed a similar trend to that of synthesized DNA. Enzymatically prepared fully methylated core (FM) DNA molecules also showed similar trends to synthetic DNA molecules, with only slightly lower efficiencies.

또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 스크램블 시퀀스로부터 Mg2+ 농도에 상관없이 FRET에 대한 영향이 없으며 Z-DNA가 생기지 않음을 확인하였다. 따라서, FRET 구조전이는 서열 특이적이고, CG 반복 서열에 B-Z 구조전이가 기인한다는 것을 명확하게 알 수 있다.In addition, as shown in FIG. 2c , it was confirmed from the scramble sequence that there was no effect on FRET and no Z-DNA was generated regardless of the Mg 2+ concentration. Therefore, it can be clearly seen that the FRET shift is sequence-specific and that the BZ shift is due to the CG repeat sequence.

또한, 도 2d에 나타낸 바에 따라, 메틸화된 시토신 수의 증가는 B-Z 구조전이에서 Mg2+의 필요 농도를 극적으로 낮출 수 있음을 알 수 있다. 또한, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 상기에서 얻어진 실험 결과로부터 메틸화된 시토신의 수와 Z-DNA 상태가 선형관계에 있음을 확인하였다. 이에 따라, DNA 메틸화 정도와 그에 따른 Z-DNA의 형성 확률은 기존 연구 방법과는 달리 정량적인 정보를 제공할 수 있음을 알 수 있다. In addition, as shown in FIG. 2D , it can be seen that the increase in the number of methylated cytosines can dramatically lower the required concentration of Mg 2+ in the BZ structure transition. In addition, as shown in FIG. 2E , it was confirmed that the number of methylated cytosines and the Z-DNA state had a linear relationship from the experimental results obtained above. Accordingly, it can be seen that the degree of DNA methylation and the resulting Z-DNA formation probability can provide quantitative information unlike the existing research methods.

2. 메틸화전달효소를 이용한 CG 코어의 메틸화2. Methylation of CG core using methylation transferase

상업적으로 이용 가능한 CpG DNA 메틸화전달효소인 M.SssI는 비메틸화 DNA에서 완전 메틸화 DNA로 de novo 메틸화를 유도할 수 있다. 이는 DNMT1 보다 더 강력하고 활성이 강한 효소이다. M.SssI의 DNA 메틸화 활성을 테스트하기 위해 비메틸화 DNA(UM)를 이용해서, 반응 개시 후 0.5, 1, 2, 3 및 4 시간이 각각 경과한 시점에 열에 의한 불활성화를 통해 메틸화 반응을 중단시켰다. 2시간의 인큐베이션 후 효소 활성이 감소함을 확인하였다. M.SssI, a commercially available CpG DNA methylation transferase, can induce de novo methylation from unmethylated DNA to fully methylated DNA. It is a more potent and active enzyme than DNMT1. Using unmethylated DNA (UM) to test the DNA methylation activity of M.SssI, the methylation reaction was stopped through thermal inactivation at 0.5, 1, 2, 3 and 4 hours after the initiation of the reaction, respectively. did it It was confirmed that the enzyme activity decreased after incubation for 2 hours.

DNMT1 효소의 1 단위(1U)는 37℃에서 30분 동안 25μL의 총 반응 부피에서 1pmol의 메틸기를 폴리 dI.dC 기질로 전이를 촉매하는 데 필요한 효소의 양으로 정의된다. 폴리 dI.dC에 대한 메틸화 효율은 폴리 dG.dC의 메틸화 효율과 비교해서 21배 높고, 반-메틸화 dG.dC의 메틸화 효율과 비교해서 4.6배 높다. One unit (1 U) of DNMT1 enzyme is defined as the amount of enzyme required to catalyze the transfer of 1 pmol of methyl groups to poly dI.dC substrate in a total reaction volume of 25 μL for 30 min at 37°C. Methylation efficiency for poly dI.dC is 21 times higher compared to the efficiency of methylation poly dG.dC, half-high 4.6 times compared to the efficiency of methylation methylation dG.dC.

따라서, 메틸-수용 부위(사용된 DNA에서 메틸화될 수 있는 시토신의 총 수)는 다음과 같다: 25nMx11x20μL ~ 5pmol. 400U/mL(= 8U/20μL)와 2시간 인큐베이션을 사용하고, 폴리 dI.dC의 메틸화 속도를 폴리 dG.dC의 메틸화 속도로 변환하면 이론적으로 DNMT1의 1단위는 1pmol x 8(U) x 4(t)/4.6(seq) ~ 7pmol을 메틸화할 수 있다고 추정할 수 있다. 또는 200U/mL의 효소로 1pmolx4(U)x 4(t)/4.6(seq) ~ 3.5pmol을 메틸화할 수 있다고 추정할 수 있다. 이러한 단순화된 추정은 [DNMT1] = 400U/mL (또는 200U/mL)에서 80%(또는 70% 미만)의 Z-상태를 주는 약간 불완전한 시토신 메틸화에 잘 부합된다고 할 수 있고, 이 효소가 우리의 DNA 분자에 대해 잘 작용함을 보여준다. Thus, the methyl-accepting sites (total number of cytosines that can be methylated in the DNA used) are: 25 nMx11x20 μL to 5 pmol. Using 400 U/mL (= 8 U/20 μL) and 2 h incubation, converting the methylation rate of poly dI.dC to the methylation rate of poly dG.dC, theoretically 1 unit of DNMT1 is 1 pmol x 8 (U) x 4 It can be estimated that (t)/4.6(seq) to 7 pmol can be methylated. Alternatively, it can be estimated that 1 pmol x 4 (U) x 4 (t)/4.6 (seq) to 3.5 pmol can be methylated with 200 U/mL of enzyme. This simplified estimate can be said to be in good agreement with slightly incomplete cytosine methylation giving a Z-state of 80% (or less than 70%) at [DNMT1] = 400 U/mL (or 200 U/mL), and that this enzyme is in our It has been shown to work well on DNA molecules.

본 발명의 시험에서 메틸-수용 부위 계산에 사용된 조건은 DNA 분자의 농도는 20μL 용액 중 25nM이고, 인큐베이션 시간은 2시간이었다. 메틸화 시토신(반-메틸화 코어(HM))에서 메틸화된 시토신의 수는 11이었다.The conditions used for the calculation of the methyl-accepting site in the test of the present invention were that the concentration of DNA molecules was 25 nM in 20 μL solution, and the incubation time was 2 hours. The number of methylated cytosines in the methylated cytosines (semi-methylated core (HM)) was 11.

메틸화 활성에 대한 효소의 농도의 효과를 도 3a에 나타낸 바와 같이 확인하였다. 본 실험에서는 상기한 결과를 기초로, 2시간 인큐베이션 한 후 반응을 중단시켰다. 시토신 메틸화 정도를 나타내는 Z-DNA 집단은, M.SssI의 농도에 따라 증가하였고, 100U/ml의 농도 이상에서 Z-DNA는 점차적으로 수평을 유지하였다. M.SssI의 검출 한계 최소 농도는 약 6.3U/ml 정도로 기존 센서보다 높게 측정되었는데, 이는 본 실험에서 11개의 CpG 서열(양쪽 22개)을 메틸화할 수 있어, 기존 방법보다 높은 단백질 농도를 요구하는 것으로 확인된다. 그러나, B-Z 전이에 따른 Z-DNA 형성 확률이 메틸화된 사이토신의 개수에 민감하므로, 단분자 프렛은 DNA 분자 하나에 붙은 형광을 측정할 수 있으며 나노 단위의 DNA 구조변화를 관측할 수 있기 때문에 본 기술은 메틸화 DNA를 검출하는 데 높은 민감성과 다양한 장점을 갖는다. The effect of the concentration of the enzyme on the methylation activity was confirmed as shown in Fig. 3a. In this experiment, based on the above results, the reaction was stopped after incubation for 2 hours. The Z-DNA population showing the degree of cytosine methylation increased with the concentration of M.SssI, and the Z-DNA level was gradually maintained at a concentration of 100 U/ml or higher. The minimum detection limit of M.SssI was measured to be about 6.3 U/ml, which is higher than that of the existing sensor, which can methylate 11 CpG sequences (22 on both sides) in this experiment, which requires a higher protein concentration than the existing method. confirmed to be However, since the probability of Z-DNA formation following BZ transition is sensitive to the number of methylated cytosines, the single-molecule fret can measure fluorescence attached to one DNA molecule and observe nano-scale DNA structural changes. has high sensitivity and various advantages in detecting methylated DNA.

도 2d에서 얻은 메틸화 시토신의 수와 Z-상태 집단의 관계를 이용해서, DNA에서 메틸화된 시토신의 유효수를 추정하였다. [M.SssI] = 200U/mL의 농도에서, M.SssI는 염료 분자 근처의 시토신을 제외하고, 코어 시퀀스에서 거의 모든 시토신을 메틸화 할 수 있었다. Using the relationship between the number of methylated cytosines and the Z-state population obtained in FIG. 2D , the effective number of methylated cytosines in DNA was estimated. At a concentration of [M.SssI] = 200 U/mL, M.SssI was able to methylate almost all cytosines in the core sequence, except for cytosines near the dye molecule.

유사하게, 농도-의존적 방법으로 DNMT1의 효소 활성을 확인하였다. DNMT1이 반-메틸화 CG 반복 서열에 작용한다고 알려져 있기 때문에, 본 실험에서는 반-메틸화 CG 서열(HM)을 이용하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 반-메틸화 코어(HM)의 [Mg2+] 중점은 약 100mM이고, [Mg2+]=50mM에서 39%의 분자가 Z-상태에 있고, 나머지는 B-상태에 있었다. Similarly, the enzymatic activity of DNMT1 was confirmed in a concentration-dependent manner. Since DNMT1 is known to act on semi-methylated CG repeats, a semi-methylated CG sequence (HM) was used in this experiment. As shown in Figure 3b, the [Mg 2+ ] midpoint of the hemi-methylated core (HM) is about 100 mM, and at [Mg 2+ ] = 50 mM, 39% of the molecules are in the Z-state, and the rest are in the B-state. was in

그 다음, 반-메틸화 코어(HM)를 다양한 농도(0, 20, 50, 100, 200, 및 400U/mL)의 DNMT1과 인큐베이션하여 DNMT1이 반-메틸화 코어(HM)에서 비메틸화 가닥(CG2)을 메틸화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, DNMT1 처리 후 Z-상태의 집단은 반-메틸화 코어와 비교해서 눈에 띄게 증가하였다. 이는 DNMT1이 반-메틸화 DNA 기질을 완전히 메틸화 할 수 있음을 뒷받침한다. The semi-methylated core (HM) was then incubated with DNMT1 at various concentrations (0, 20, 50, 100, 200, and 400 U/mL) so that DNMT1 was transferred from the semi-methylated core (HM) to the unmethylated strand (CG2). It was confirmed that it can be methylated. As a result, the population of Z-state after DNMT1 treatment was significantly increased compared with the semi-methylated core. This supports that DNMT1 can fully methylate semi-methylated DNA substrates.

3. 메틸전달효소 저해제 약물의 메틸전달효소 저해 활성 측정3. Measurement of methyltransferase inhibitory activity of methyltransferase inhibitor drugs

본 발명의 분석법을 통해서 메틸전달효소 저해제의 효소 저해 활성을 측정할 수 있는지 확인하기 위해, 다양한 종류의 메틸전달효소 저해제에 대해서 다양한 농도에서 효과를 확인하였다. In order to confirm whether the enzyme inhibitory activity of the methyltransferase inhibitors can be measured through the assay of the present invention, the effects of various types of methyltransferase inhibitors were confirmed at various concentrations.

공지된 메틸전달효소 저해제로서 커큐민을 2.5% DMSO를 포함하는 물에 준비하였다. 다른 메틸전달효소 저해제로 제니스테인을 이용하였다. M.SssI 및 DNMT1의 기질로서 각각 비메틸화 분자와 반-메틸화 분자를 이용하였고, 메틸화 저해 정도를 확인하였다. 80U/mL M.SssI와 100U/mL DNMT1를 각각 사용하였고, 시험 시 사용된 마그네슘 이온의 농도는 50mM Mg2+이었다.Curcumin as a known methyltransferase inhibitor was prepared in water containing 2.5% DMSO. As another methyltransferase inhibitor, genistein was used. As substrates of M.SssI and DNMT1, an unmethylated molecule and a semi-methylated molecule were used, respectively, and the degree of methylation inhibition was confirmed. 80 U/mL M.SssI and 100 U/mL DNMT1 were used, respectively, and the concentration of magnesium ions used in the test was 50 mM Mg 2+ .

효소의 저해 정도(DOI)는 다음 식으로 계산할 수 있다. The degree of inhibition (DOI) of the enzyme can be calculated by the following equation.

[식 1][Equation 1]

Figure 112020009006810-pat00002
Figure 112020009006810-pat00002

상기 식 1에서, P(Z;0)은 억제제와 메틸화효소가 없을 때의 Z-DNA 형성 확률이고, P(Z;MTase) 메틸전달효소(MTase)와 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률, P(Z;MTase&drug)은 메틸전달효소(MTase) 및 저해제 약물과 인큐베이션한 이후 Z-DNA 형성 확률이다(상기 확률은 전체 히스토그램 면적에서 Z에 해당하는 부분의 면적의 비율을 의미한다). In Equation 1, P ( Z; 0 ) is the Z-DNA formation probability in the absence of inhibitor and methylase, P ( Z; MTase ) Z-DNA formation probability after incubation with methyl transferase (MTase), P ( Z;MTase&drug ) is the probability of Z-DNA formation after incubation with methyltransferase (MTase) and an inhibitor drug (the probability refers to the ratio of the area of the portion corresponding to Z to the total histogram area).

따라서, 약물이 아무런 효과가 없어서 P(Z; MTase & drug) = P(Z; MTase)이면, 상기 식에서 해당 약물은 0의 저해도를 갖는다(DOI=0). 반면에, P(Z)가 메틸전달효소가 없을 때 관찰되는 P(Z;0) 수준으로 완전하게 감소한다면, 저해는 완벽할 것이다(DOI=1). Therefore, if the drug has no effect and thus P (Z; MTase & drug) = P (Z; MTase), in the above formula, the drug has a degree of inhibition of 0 (DOI=0). On the other hand, if P (Z) was completely reduced to the level of P (Z;0) observed in the absence of methyltransferase, inhibition would be complete (DOI=1).

도 4a 및 4b는 커큐민의 농도에 따른 M.SssI 및 DNMT1에 대한 저해 정도(DOI)를 나타내며, 농도 의존적으로 효소의 저해 정도가 증가하는 것을 알 수 있다. M.SssI에 대한 커큐민의 IC50값은 4μM이었고(도 4a), DNMT1에 대한 커큐민의 IC50값은 10μM이었다(도 4b). 도 5a 및 도 5d는 각각 M.SssI 및 DNMT1에 대하여 커큐민의 메틸화 저해에 따른 구조변이의 양상이 상이해짐을 보여준다. 즉, 커큐민의 농도가 높아짐에 따라 메틸화가 억제되어, DNA 분자에서 Z-DNA로 구조전이가 적어지는 분포를 나타냄을 보여준다, 4a and 4b show the degree of inhibition (DOI) for M.SssI and DNMT1 according to the concentration of curcumin, and it can be seen that the degree of inhibition of the enzyme increases in a concentration-dependent manner. IC 50 values of curcumin on M.SssI has IC 50 values of curcumin was about 4μM (Figure 4a), DNMT1 was 10μM (Fig. 4b). 5a and 5d show that the pattern of structural variation according to curcumin methylation inhibition is different for M.SssI and DNMT1, respectively. That is, as the concentration of curcumin increases, methylation is suppressed, indicating a distribution in which the structural transition from DNA molecules to Z-DNA is reduced.

또한, 메틸전달효소에 의한 DNA 메틸화에 대한 EGCG와 제니스테인의 효과를 확인하였다. 탈 이온수에 EGCG를 용해하여 준비하고, 2% DMSO를 포함하는 물에 제니스테인을 포함시켜 준비하였다. In addition, the effects of EGCG and genistein on DNA methylation by methyltransferase were confirmed. Prepared by dissolving EGCG in deionized water, and prepared by including genistein in water containing 2% DMSO.

도 4c, 4d 및 4e에 나타낸 바와 같이, M.SssI 및 DNMT1에 대한 EGCG와 제니스테인의 저해도(DOI)는 해당 약물의 농도 의존적으로 증가하였다. M.SssI 효소에 대한 제니스테인의 IC50값이 약 600μM이었고(도 4d), DNMT1의 경우, IC50값이 약 300μM이었다(도 4e).As shown in Figures 4c, 4d and 4e, the degree of inhibition (DOI) of EGCG and genistein on M.SssI and DNMT1 was increased in a concentration-dependent manner of the corresponding drug. The IC 50 value of genistein for the M.SssI enzyme was about 600 μM ( FIG. 4D ), and for DNMT1, the IC 50 value was about 300 μM ( FIG. 4E ).

Claims (18)

a) 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 시토신과 구아닌의 반복 서열(CG 반복 서열)을 포함하는 5 내지 50nt 길이의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CpG 반복 서열을 포함하는 5 내지 50nt 길이의 제2 단일 가닥으로 이루어지고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 제1 형광염료와 제2 형광염료 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소 및 후보약물을 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
b) 대조군으로서 상기 a)와 동일한 이중가닥 DNA 분자에 메틸전달효소를 처리하여 메틸화 반응시키는 것;
c) 상기 a) 와 b)의 메틸화된 이중가닥 DNA 각각을 1가 또는 2가의 양이온성 염 용액과 반응시켜 제1 형광염료와 제2 형광염료 사이의 단분자 FRET(single molecule fluorescence resonance energy transfer) 신호를 측정하여, 각각 독립적으로 상기 a)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하고, b)의 이중가닥 DNA 분자에서 B형 DNA와 Z형 DNA의 비율을 결정하는 것; 및
d) 상기 b)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율과 비교해서, a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 낮은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 저해제로 분류하고; a)의 이중가닥 DNA 분자에서 Z형 DNA 비율이 높은 경우, 상기 후보약물은 메틸전달효소 촉진제로 분류하는 것을 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.a) labeled with a first fluorescent dye, and labeled with a first single strand of 5 to 50 nt in length including 2 to 40 cytosine and guanine repeat sequences (CG repeat sequence) and a second fluorescent dye, 2 to 40 Consists of a second single strand of 5 to 50 nt in length including a CpG repeat sequence, the first fluorescent dye and the second fluorescent dye are paired, one of the first fluorescent dye and the second fluorescent dye is a fluorescent donor, the other One is a methylation reaction by treating a double-stranded DNA molecule that is a fluorescent acceptor with a methyltransferase and a candidate drug;
b) methylation reaction by treating the same double-stranded DNA molecule as in a) as a control with a methyltransferase;
c) single molecule fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the first and second fluorescent dyes by reacting each of the methylated double-stranded DNAs of a) and b) with a monovalent or divalent cationic salt solution By measuring the signal, each independently determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a), and determines the ratio of B-type DNA and Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of b) thing; and
d) when the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a) is low compared to the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of b), the candidate drug is classified as a methyltransferase inhibitor; A method for screening a drug that promotes or inhibits methyltransferase action, comprising classifying the candidate drug as a methyltransferase promoter when the ratio of Z-type DNA in the double-stranded DNA molecule of a) is high. 제1항에 있어서,
상기 단계 c)에서 Z-DNA의 비율을 DNA 정량곡선과 비교하여 Z-DNA를 정량을 분석하는 것을 더 포함하는, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
Comparing the ratio of Z-DNA in step c) with the DNA quantification curve, the method of screening for a drug that promotes or inhibits methyltransferase action, further comprising analyzing the quantification of Z-DNA. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
The fluorescent dye is cyanine-based, fluorescein-based, rhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), coumarin, allophycocyanin, R-phycoerythrin, Alexa Fluor, allophycoerythrin, At least one selected from the group consisting of Texas Red and Princeton Red, a method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제4항에 있어서,
상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법. 5. The method of claim 4,
The cyanine-based fluorescent dye is Cy3, Cy5, Cy5.5 or Cy7, a method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제4항에 있어서,
상기 플루오레세인계 염료는 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 헥산산, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 및 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법. 5. The method of claim 4,
The fluorescein-based dye is 5-(and 6)-carboxyfluorescein, 5-carboxyfluorescein, 6-carboxyfluorescein, 6-(fluorescein)-5-carboxamide hexanoic acid, fluorescein A method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase, which is selected from the group consisting of phosphorus isothiocyanate, and AlexaFluor (trade name). 제1항에 있어서,
상기 제1 단일 가닥 DNA와 제2 단일 가닥 DNA 중 어느 하나는 DNA 5' 또는 3' 말단에 비오틴이 결합된 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법. According to claim 1,
Any one of the first single-stranded DNA and the second single-stranded DNA is a method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase, wherein biotin is bound to the 5' or 3' end of the DNA. 제1항에 있어서,
상기 1가 또는 2가의 양이온성 이온은 Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
The monovalent or divalent cationic ion is at least one selected from the group consisting of Mg 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ and Fe 2+ , a method for screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제1항에 있어서,
상기 염용액의 농도는 0.1mM 내지 800mM인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
The concentration of the salt solution is 0.1mM to 800mM, a method of screening a drug that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제7항에 있어서,
상기 c)의 FRET 신호의 측정 전에 메틸화된 이중가닥 DNA을 아비딘이 코팅된 기재에 처리하여 DNA 가닥의 비오틴과 아비딘을 결합하여 DNA 분자를 기재에 고정시키는 것을 더 포함하는 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.8. The method of claim 7,
Prior to the measurement of the FRET signal of c) above, treating the methylated double-stranded DNA to the avidin-coated substrate to bind biotin and avidin of the DNA strand to immobilize the DNA molecule to the substrate Promotes methyltransferase action or How to screen for inhibitory drugs. 제1항에 있어서,
2 내지 40개의 CG 반복 서열은 제1 또는 제2 단일 가닥 DNA의 중심에 포함되는 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
2 to 40 CG repeat sequences are included in the center of the first or second single-stranded DNA, A method for screening a drug that promotes or inhibits methyltransferase action. 제1항에 있어서,
상기 제1 단일 가닥 DNA 및 제2 단일 가닥 DNA는 메틸화된 시토신(C) 염기를 포함하지 않거나, 일부 또는 전부 메틸화된 시토신(C) 염기를 포함하는 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물을 스크리닝하는 방법.According to claim 1,
The first single-stranded DNA and the second single-stranded DNA do not contain methylated cytosine (C) bases, or contain some or all methylated cytosine (C) bases, which promotes or inhibits methyltransferase action How to screen for drugs. 비오틴 및 제1 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제1 단일 가닥과 제2 형광염료로 표지되고, 2 내지 40개의 CG 반복 서열을 포함하는, 5 내지 50nt의 제2 단일 가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA 분자; 메틸전달효소; 1가 또는 2가의 양이온성 염을 포함하는 용액, 및 아비딘으로 코팅된 기재를 포함하고, 상기 제1 형광염료와 제2 형광염료는 쌍을 이루며, 둘 중 하나는 형광 도너, 나머지 하나는 형광 억셉터인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.5, labeled with biotin and a first fluorescent dye, comprising 2 to 40 CG repeats, labeled with a first single strand of 5 to 50 nt and a second fluorescent dye, comprising 2 to 40 CG repeats a double-stranded DNA molecule consisting of a second single strand of 50 nt; methyltransferase; A solution comprising a monovalent or divalent cationic salt, and a substrate coated with avidin, wherein the first fluorescent dye and the second fluorescent dye are paired, one of which is a fluorescent donor, and the other is a fluorescent dye. A kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a sceptor, a methyltransferase. 제13항에 있어서,
상기 형광염료는 시아닌(cyanine)계, 플루오레세인계, 로다민, 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 쿠마린, 알로피코시아닌, R-피코에리트린, 알렉사 플루오르, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.14. The method of claim 13,
The fluorescent dye is cyanine-based, fluorescein-based, rhodamine, tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), coumarin, allophycocyanin, R-phycoerythrin, Alexa Fluor, allophycoerythrin, At least one selected from the group consisting of Texas Red (Texas Red) and Princeton Red (Princeton Red), a kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제14항에 있어서,
상기 시아닌(cyanine) 계 형광염료는 Cy3, Cy5, Cy5.5 또는 Cy7인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.15. The method of claim 14,
The cyanine-based fluorescent dye is Cy3, Cy5, Cy5.5 or Cy7, a kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제14항에 있어서,
상기 플루오레세인계 염료는 5-카복시플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-카복사미드 헥산산, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 및 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.15. The method of claim 14,
The fluorescein-based dye is 5-carboxyfluorescein, 6-carboxyfluorescein, 6-(fluorescein)-5-carboxamide hexanoic acid, fluorescein isothiocyanate, and AlexaFluor (AlexaFluor: A kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a methyltransferase, which is selected from the group consisting of trade name). 제13항에 있어서,
상기 1가 또는 2가의 양이온성 이온은 Mg2+, Ca2+, Ni2+ 및 Fe2+로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.14. The method of claim 13,
The monovalent or divalent cationic ion is at least one selected from the group consisting of Mg 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ and Fe 2+ , a kit for drug screening that promotes or inhibits the action of a methyltransferase. 제13항에 있어서,
상기 염용액의 농도는 0.1mM 내지 800mM인, 메틸전달효소 작용을 촉진 또는 억제하는 약물 스크리닝용 키트.14. The method of claim 13,
The concentration of the salt solution is 0.1mM to 800mM, a drug screening kit for promoting or inhibiting the action of methyltransferase.
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