KR101801697B1 - 알레르기성 질환의 개선 활성을 갖는 와이셀라 코리엔시스 wikim54 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents
알레르기성 질환의 개선 활성을 갖는 와이셀라 코리엔시스 wikim54 및 이를 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리된 신규한 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 혈중 IgE 생성 억제 활성을 갖는 프로바이오틱스로서, 사람 또는 동물의 알레르기성 질환 예방 및 개선, 정장 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 와이셀라 코리엔시스 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 주로 유아기 및 소아기에 시작되는 만성적인 재발성, 염증성 피부질환으로, 정상인에게는 해가 되지 않은 유발인자들에 피부가 과민반응상태를 보임으로써 염증이 생기는 질병이다. 즉, 아토피 피부염은 세균, 바이러스, 곰팡이 등에 의한 감염, 꽃가루 등과 같은 특정 물질, 음식물, 인공적 화학물질 등에 면역 체계가 과민반응하여 발생하는 것으로 알려져 있다.
이러한 면역반응에는 T세포가 관여하는데, 현재 대부분의 연구는 수지상세포가 T세포를 활성화시키는 것에 초점을 맞추고 있으나, 수지상세포는 외부 항원에 대해 면역반응을 유발할 뿐만 아니라 T세포가 자가 항원을 관용하는 것과 유사하게 T세포의 면역내성(immune tolerance)을 초래하기도 한다. 따라서, T세포의 활성을 유도하는 수지상세포의 성숙과 이의 활성화가 면역증진에 절대적으로 필요한 요소이다. 특히, IL-10과 IL-12는 수지상세포의 기능적인 성숙을 측정하는데, 중요한 자료가 되는 것으로 알려져 있다.
현재 소아의 20% 이상이 아토피 피부염 환자라는 보고가 있을 정도로 세계적으로 급증 추세를 보이고 있지만 아직까지 정확한 발병 원인조차 규명되지 않은 상태로 알려져 있다.
아토피 피부염의 치료제로는 항히스타민제나 스테로이드제가 주로 사용되는데, 이들은 모두 대증요법적으로 이용되는 약제로, 발증의 주요 인자인 혈청 면역글로불린 IgE의 양을 직접적으로 감소시키는 기능은 없다. 또한, 항히스타민제는 졸음이나 심한 갈증을 유발하고, 스테로이드제는 면역계 전반을 억제하는 등 부작용이 있는 것으로 지적되어 왔다.
이러한 배경 하에서 수지상세포의 성숙을 통해 면역활성을 증강시키며, IgE의 생성을 억제하는 기능을 갖는 유산균이 아토피 피부염의 유용한 보충제로서 주목되고 있다. 유산균의 아토피 피부염 치료 작용은 균주에 특이적인데, 현재 식품 또는 약품으로 이용되고 있는 제품들의 아토피 개선 효과가 우수한 유산균 관련 기술은 출현하지 않고 있는 바, 효과가 우수한 유산균을 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 치료에 유용한 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 아토피 피부염의 개선 활성이 우수한 신규한 와이셀라 속 유산균 균주를 제공하고자 한다.
이에, 본 발명자들은 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내면서 아토피 피부염의 개선 효과를 나타내는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 와이셀라 속 유산균 균주인 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54)을 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54)은 김치 유래의 와이셀라 코리엔시스 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54을 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 전통발효식품으로부터 프로바이오틱스로서 우수한 효과를 나타내면서도 아토피 피부염의 개선 효과를 나타내는 유산균 균주는 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rDNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2016년 11월 30일자로 기탁하였다 (수탁번호 KCCM11952P).
본 발명의 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 그람양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultative anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 간균의 형태를 취하고 있다.
본 발명의 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 와이셀라 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
하기 실시예에서는, 본 발명의 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54이 수지상세포가 분비하는 사이토카인의 분비량을 증가시키고, 혈중 IgE의 생성을 억제시킴으로써 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주의 아토피 피부염의 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 알레르기성 질환의 개선, 면역강화 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다.
이에 본 발명의 한 구체예에서는 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물을 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 한 구체예에서는 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1,000억마리를 투여할 수 있다.
본 발명은 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 와이셀라 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명은 또한 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 및 개선용 조성물을 제공한다. 상기 알레르기성 질환은 혈중 내 면역글로불린E(IgE)의 생성이 증가되어 유발되는 질환으로, 예컨대 알레르기성 비염(Allergic rhinitis), 아토피 피부염(Atopic dermatitis), 천식(Asthma), 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 지루성 피부염(Seborrheic dermatitis), 접촉성 피부염(Contact dermatitis), 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus) 및 구진상 두드러기(popular urticarial)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 상기 알레르기성 질환은 아토피 피부염일 수 있다.
본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 이러한 유리한 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 화장료 조성물 내에 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 또한 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 알레르기성 질환의 예방 및 개선용 식품일 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료, 바 등의 형태를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종식물추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 사료첨가제 또는 사료로서 이용될 수 있다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명에 따른 조성물은 알레르기성 피부 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서 이용될 수 있다.
상기 알레르기성 피부 질환은 위에서 기술한 알레르기성 질환 중 피부에서 증상이 나타나는 질환을 의미하며, 예컨대 아토피 피부염, 건선, 습진, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 홍반성 루푸스 또는 구진상 두드러기일 수 있으며, 보다 바람직하게는 아토피 피부염일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 화장료 제조시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 담체 등을 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형으로 제조될 수 있으며, 예컨대, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우, 담체 성분으로 동물성 오일, 식물성 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 제형이 용액 또는 유탁액인 경우 담체 성분으로 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우 담체 성분으로 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54은 혈중 IgE 생성 억제 활성을 나타내므로, 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화, 위장 질환 및 알레르기성 질환의 예방 또는 개선 등의 용도를 위해 다양하게 활용될 수 있다. 나아가, 발효용 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 수지상세포로부터 분비되는 IL-10의 양을 나타낸 것이다.
도 2는 수지상세포로부터 분비되는 IL-12의 양을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 균주를 경구 투여한 마우스 모델의 아토피 피부염 양상을 육안으로 관찰한 것이다.
도 4는 아토피 피부염 지수를 측정한 결과이다.
도 5는 혈중 IgE의 생성량을 측정한 결과이다.
도 2는 수지상세포로부터 분비되는 IL-12의 양을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 균주를 경구 투여한 마우스 모델의 아토피 피부염 양상을 육안으로 관찰한 것이다.
도 4는 아토피 피부염 지수를 측정한 결과이다.
도 5는 혈중 IgE의 생성량을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 균주의 분리 및 동정
양파 김치 추출물의 원액을 MRS 배지에 도말하여 얻은 균단일집락을 루프로 수거하여 MRS agar 배지(Difco)에 계대하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양을 통해 얻은 균단일집락은 마크로젠(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 세균의 동정은 16S rRNA 서열을 National Center for Biotechnology Information(NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 검색엔진의 유사도 분석을 통해 수행하였다.
본 발명의 실시예를 통해 분리된 균주는 미생물의 동정을 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다.
이에, 본 발명의 미생물을 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54)으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2016년 11월 30일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM11952P).
실시예 2: 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54의 아토피 저감화 효능 확인
1) 수지상세포의 IL-10 및 IL-12 분비량 확인
수지상세포로부터 생산되는 IL-12와 IL-10의 양을 측정하기 위하여 Balb/c 마우스로부터 유도된 수지상세포를 분리하여 1x106 cells/dish 세포를 분주한 후, 각각 20 ng/ml농도로 GM-CSF를 첨가하여 10일간 배양하였다. 96웰 플레이트에 5×105 cells/well 세포로 준비하였다. 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54) 균주는 MRS 배지에서 30℃, 24시간 동안 배양한 후, 균체를 8,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 헹궈서 남아있는 배지 성분을 제거하였다. 유산균 5×106 CFU를 수지상세포에 처리하여 24시간 배양한 뒤 세포배양액을 회수하여 수지상세포가 분비하는 사이토카인(IL-12과 IL-10)을 분석하여 도 1 및 2에 나타내었다. 이때, 음성 대조군으로는 PBS를 처리한 수지상세포를 이용하였으며, 양성 대조군은 염증유도인자인 LPS 100ng/ml를 처리한 수지상세포를 이용하였다. 도 1은 수지상세포로부터 분비되는 IL-10의 양을 나타낸 것이고, 도 2는 수지상세포로부터 분비되는 IL-12의 양을 나타낸 것이다.
도 1 및 2에서 보는 것과 같이, 수지상세포에 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주를 처리한 경우, 균주를 처리하지 않은 수지상세포(대조군)와 IL-10 및 IL-12 분비량을 비교했을 때, IL-10 및 IL-12이 현저하게 많이 분비되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, IL-10은 PBS 처리군이 22.5 pg/㎖, WIKIM54 균주 처리군이 3146.5 pg/㎖를 나타내었고, IL-12는 PBS 처리군이 0 pg/㎖, WIKIM54 균주 처리군이 50 pg/㎖를 나타내었다. 이를 통해, 본 발명에 따른 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주가 수지상세포의 기능적인 성숙을 유도하는 것을 간접적으로 설명할 수 있을 것으로 판단하였다.
2) 마우스 모델에서 아토피 피부염의 저감 효능 확인
<2-1> 아토피 피부염 유도 및 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 처리
실험동물로는 실험동물인 수컷 5주령의 Balb/c 마우스(오리엔트바이오, 한국)를 공급받았고, 실내 온도 20±2℃, 습도 55±15%가 유지되는 SPF 환경의 동물 사육실에서 1주일의 안정화 기간을 거쳐 실험기간 동안 사육하였다. 사료는 항생제가 첨가되지 않은 일반적인 팰렛 사료를 공급하였고, 물은 수시로 섭취할 수 있게 하였다.
아토피 피부염의 유도를 위하여 실험동물에 대하여 자극물질인 2,4-디니트로클로로벤젠(DNCB)를 도포하기 하루 전에 실험동물의 등에서부터 골반 쪽으로 2×4cm의 면적으로 제모를 실시하였다. 1% DNCB를 용매물질(아세톤:올리브 오일 = 4:1 혼합)에 녹여 제조하여 1일과 3일에 제모된 등 부위에 도포하여 감작시키고, 7일과 10일에 0.2% DNCB를 다시 도포하였다. 이후 0.2% DNCB를 주 1회씩 실험기간동안 감작하여 면역기전성 아토피성 피부염을 유발하였다(Kim SR. 등, Oral administration of herbal mixture extract inhibits 2,4-dinitrochlorobenzene-induced atopic dermatitis in BALB/c mice. Mediators Inflamm 2014; 2014: 319438).
와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54) 균주는 MRS 배지에서 30℃, 24시간 동안 배양한 후, 균체를 8,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 PBS로 헹궈서 남아있는 배지 성분을 제거하였다. PBS를 이용하여 1×1010 CFU/mL 균수로 정량하여 0.2 ㎖(2×109 CFU)씩 존대를 이용하여 주 5회 경구 투여하고, naive(정상군) 및 DNCB(대조군) 그룹은 멸균 PBS를 투여하였다.
본 발명의 유산균 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54의 경구투여 4주 후 아토피 피부염의 양상을 임상적인 육안 평가법을 이용하여 관능평가를 실시하였고(도 3), 아토피 피부염 지수를 평가하였다(도 4).
도 3 내지 4에서 볼 수 있듯이, 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주의 처리에 따라 정상군에 비해 DNCB를 처리한 대조군에서 관능 평가시 기준이 되는 홍반, 발적, 가피가 형성됨을 확인할 수 있었으며, 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주를 투여하였을 때 홍반을 나타내는 면적과 피부 가피 형성이 완화되는 것을 확인하였다.
<2-1> 혈중 IgE 측정
IgE는 비만세포(mast cell) 또는 호산성 세포(eosinophil)등과 반응하여 히스타민과 같은 염증물질 분비를 촉진시키는 역할로 아토피와 같은 알러지성 염증질환에서 그 수치가 정상보다 훨씬 증가해 있다고 알려져 있으므로 흔히 아토피성 피부염의 마커로 사용된다.
본 발명의 유산균 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54의 경구투여 4주 후 혈중 IgE의 생성량을 측정하였다. 실험동물로부터 미정맥 채혈을 통해 혈액을 채취하고, 혈액에서 분리된 혈장은 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다. 혈장 내 존재하는 IgE 수준을 비교 분석하기 위해 ELISA 방법에 의해 혈중 IgE를 정량하였다. Immulon 2 플레이트(Dynex, Chantilly, VA)에 마우스 IgE 항체(BD Pharmingen, San Diego, CA) 2 ㎍/㎖(각 웰당 100㎕)을 첨가한 다음 냉장상태에서 24시간 정치시키고, 1% BSAPBS로 비특이적 반응을 차단한 다음, 희석된 혈장 및 표준 IgE 스탠다드 (BD Pharmingen)를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시킨다. 그리고 바이오틴화된(Biotinylated) 항-마우스 IgE와 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP(1㎍/㎖ 1% BSA-PBS, BD Pharmingen)을 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 검출 항체가 부착하게 한다. 이후 발색 반응은 기질인 TMB(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine)에 의해 유도하였으며, 발색 반응이 진행된 후, 발색 반응을 멈추기 위해 3M HCl을 플레이트에 첨가하였다. 이 때 발색 반응은 파란색에서 노란색으로 변화되며, 발색 반응이 멈춘 후 ELISA 리더(Molecular device, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
정상군에 비해 DNCB를 처리하여 아토피 피부염을 유발한 대조군에서 3,639 ng/㎖로 IgE의 생성이 촉진되는 것을 확인할 수 있으며, 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54 균주를 투여하였을 때 IgE의 생성량이 2,312 ng/㎖로, 대조군에 비해 약 36% 정도 IgE의 생성을 유의적으로 억제시키는 것을 확인하였다.
<110> Korea Food Research Institute
<120> Weissella koreensis WIKIM54 having anti-allergic disease activity
and composition for comprising the same
<130> P16R10C2018
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> Weissella koreensis WIKIM54
<400> 1
gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gcattgtggt tgaaatgata 60
tgaagaactt gttcagattt gattttcaac attgcaatga gtggcgaacg ggtgagtaac 120
acgtgggaaa cctacctctt agcaggggat aacatttgga aacaaatgct aataccgtat 180
aataattaaa accgcatggt tttagtttaa aagatggtct tgctatcact aagagatggt 240
cccgcggtgt attagttagt tggtgaggta atggctcacc aagacaatga tacatagccg 300
agttgagaga ctgaccggcc acaatgggac tgagacacgg cccatactcc tacgggaggc 360
agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg cgtgtgtgat 420
gaagggtttc ggctcgtaaa acactgttgt aagagaagaa tgacattgag agtaactgtt 480
caatgtgtga cggtatctta ccagaaagga acggctaaat acgtgccagc agccgcggta 540
atacgtatgt tccaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc agacggttat 600
ttaagtctga agtgaaagcc ctcggctcaa ccgaggaatt gctttggaaa ctggataact 660
tgagtgcagt agaggaaagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga 720
agaacaccag tggcgaaggc ggctttctgg actgtaactg acgttgaggc tcgaaagtgt 780
gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccacactg taaacgatga gtgctagttg 840
ttcgagggtt tccgcccttg agtgacgaag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt 900
acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg 960
tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt tgaccactcc 1020
agagatggag ctttcccttc ggggacaaag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1080
gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattgt tagttgccag 1140
catttagttg ggcactctag caagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg cggggatgac 1200
gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg caagtacaac 1260
gagtcgccaa cccgcgaggg tgcgcaaatc tcttaaagct tgtctcagtt cggactgtag 1320
gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggg 1380
tgaatacgtt ccccgggtct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgaagag tttgtaacac 1440
ccaaagtcgg tgaggtaacc ttttattagg agccagccgc ctaaggtggg acagatgatt 1500
agggtg 1506
Claims (15)
- 수탁번호 KCCM11952P의 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54{Weissella koreensis WIKIM54}.
- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 및 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제2항에 있어서,
상기 식품은 건강기능식품인, 식품 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 식품은 음료, 바 또는 발효유인, 식품 조성물. - 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 면역증강용 조성물.
- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 정장제 조성물.
- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물로 이루어지는 것인 발효용 유산균 스타터.
- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.
- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
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- 와이셀라 코리엔시스 WIKIM54(Weissella koreensis WIKIM54; KCCM11952P) 또는 이의 배양물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
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