KR101772727B1 - A method for regulation of cellular behaviors by applying electric stimulus based on enzymatic biofuel cell - Google Patents

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Abstract

본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물; 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기; 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용, 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 및 신경질환의 예방 및 치료용 약학 조성물; 및 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포에 관한 것이다.
본 발명에 따른 효소적 생물연료전지를 이용하여 전기자극을 가함으로써 세포거동을 조절하는 방법은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때, 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a method for regulating cell movement, a composition for inducing stem cell differentiation, and a composition for promoting cell migration or proliferation, which comprises the step of applying electrical stimulation to a cell using an enzymatic biofuel cell; A cell culture vessel equipped with an enzymatic biofuel cell and capable of culturing cells while applying electric stimulation thereto; Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of wounds, diseases caused by muscle tissue abnormalities, bone diseases and neurological diseases, including enzymatic biofuel cells; And a muscle cell, osteocyte, neuron, and myocardial cell differentiated by using the stem cell differentiation inducing composition or cell culture container.
The method for controlling cell behavior by applying electrical stimulation using the enzyme biofuel cell according to the present invention is characterized by high biocompatibility and moldability to a desired formulation by using an enzyme as an electric stimulus source, It is possible to generate a wide range of currents and to generate electric stimulation even if both electrodes are not included. Therefore, the present invention is highly likely to be used as a pharmaceutical composition. In addition, when different levels of electrical stimulation are applied at a level that does not induce apoptosis, stem cells can be induced to differentiate into different tissues, so that they can be variously formulated and useful for tissue regeneration.

Description

효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법{A method for regulation of cellular behaviors by applying electric stimulus based on enzymatic biofuel cell}Technical Field [0001] The present invention relates to a method for controlling cell behavior by an electrical stimulation based on an enzymatic biofuel cell,

본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법, 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물; 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기; 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용, 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 및 신경질환의 예방 및 치료용 약학 조성물; 및 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for regulating cell movement, a composition for inducing stem cell differentiation, and a composition for promoting cell migration or proliferation, which comprises the step of applying electrical stimulation to a cell using an enzymatic biofuel cell; A cell culture vessel equipped with an enzymatic biofuel cell and capable of culturing cells while applying electric stimulation thereto; Pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of wounds, diseases caused by muscle tissue abnormalities, bone diseases and neurological diseases, including enzymatic biofuel cells; And a muscle cell, osteocyte, neuron, and myocardial cell differentiated by using the stem cell differentiation inducing composition or cell culture container.

21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.In the 21st century, biotechnology is aiming at human welfare, suggesting the possibility of new solutions to food, environment and health problems. Recently, stem cell utilization technology is emerging as a new field of intractable disease treatment. Until now, organ transplantation and gene therapy have been proposed for the treatment of incurable diseases, but practical use has been limited due to lack of immunity, lack of supply or lack of knowledge about genes.

이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 거의 모든 장기재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.Thus, interest in stem cell research has been heightened, and it has been recognized that all stem cells capable of forming all organs through proliferation and differentiation can solve root diseases as well as treatment of most diseases. In addition, many scientists have proposed a variety of stem cell applications, ranging from treatment of intractable Parkinson's disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury to almost all organ regeneration.

한편 상처와 같은 외상의 치유는 세포가 상처 부위로 이동하고 증식함으로써 달성된다. 따라서, 세포의 이동 및 증식을 촉진시킴으로써 상처치유를 촉진할 수 있다.On the other hand, healing of wounds, such as trauma, is accomplished by moving and propagating the cells to the wound site. Therefore, the wound healing can be promoted by promoting cell migration and proliferation.

이와 같이 상처치유를 위한 세포의 이동 및 증식, 원하는 조직으로의 줄기세포의 분화를 통틀어 세포 거동이라 하며, 이러한 세포의 거동은 물리적 및/또는 화학적 환경에 의해 영향을 받는다. 이는 세포의 거동이 신호전달 체계에 의해 조절되며, 이러한 신호전달 체계는 다양한 물리 화학적 인자에 의해 조절될 수 있기 때문이다.Thus, cell migration and proliferation for wound healing and stem cell differentiation into a desired tissue are collectively referred to as cell behavior, and the behavior of such cells is influenced by physical and / or chemical environment. This is because the behavior of cells is controlled by the signal transduction system, which can be controlled by various physicochemical factors.

상기 물리적 인자 중의 하나는 전기자극으로 이는 골격근의 유지 및 근과형성에 매우 중요한 요소이며, 운동뉴런으로부터의 전기자극의 부재가 탈신경근위축(denervated muscle atrophy) 등을 유발함이 보고되었다.One of the physical factors is electrical stimulation, which is a very important factor in skeletal muscle maintenance and muscle formation, and the absence of electrical stimulation from motor neurons causes denervated muscle atrophy and the like.

관절질환에 저주파를 적용한다던지 간질환자의 뇌에 직접 전기자극을 가한다던지 하는 것은 물리적 자극을 이용한 치료방법의 대표적인 예이다.
Applying low frequency to joint disease or direct electrical stimulation to brain of epileptic patients is a typical example of treatment using physical stimulation.

이에 본 발명자들은 생체적합성이 높고 신체 여러 부위에 적용가능한 형태로 제형화될 수 있는 전기자극원을 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 효소의 산화환원 반응에 의해 작동하는 효소적 생물연료전지를 이용하는 경우 효소의 농도를 조절하는 방법으로 세포의 사멸을 유도하지 않는 세기 범위 내에서 전류를 다양하게 변화시킬 수 있어 세포 독성에 대한 우려가 없으며, 다양한 제형으로 자유롭게 성형될 수 있어 신체 각 부위에 적절하게 제형화하여 적용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have made intensive researches to find an electric stimulation source that can be formulated into a form that is highly biocompatible and applicable to various parts of the body. As a result, when using an enzymatic biofuel cell operated by an oxidation-reduction reaction of an enzyme, The concentration of the cell can be varied within a range of intensity that does not induce cell death, so that there is no concern about cytotoxicity and the cell can be freely molded into various formulations, And the present invention has been completed.

본 발명의 하나의 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method of controlling cell movement comprising applying an electrical stimulus to a cell using an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a composition for inducing differentiation of stem cells, comprising the step of applying electrical stimulation to cells using an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 줄기세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a composition for stimulating migration or proliferation of stem cells, which comprises applying an electrical stimulation to a cell using an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a cell culture container equipped with an enzymatic biofuel cell and capable of culturing cells while applying electrical stimulation.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases due to muscle tissue abnormality including an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurological diseases including an enzymatic biofuel cell.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공하는 것이다.Yet another object of the present invention is to provide a muscle cell in which stem cells are cultured and differentiated by applying electric induction of less than 230 nA / cm 2 of 2 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture container .

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공하는 것이다.A further object of the present invention is to provide a bone cells which differentiate to while the electrical stimulation of less than 230 nA / cm 2 over 300 nA / cm 2 by using a composition or a cell culture vessel for inducing the differentiation culture of stem cells .

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공하는 것이다.A further object of the present invention is to provide a neural cell having differentiation to while the electrical stimulation of less than 300 nA / cm 2 over 500 nA / cm 2 by using a composition or a cell culture vessel for inducing the differentiation culture of stem cells .

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공하는 것이다.
A further object of the present invention is to provide a cardiac cells were differentiated using while the electrical stimulation of less than 500 nA / cm 2 or more 1000 nA / cm 2 using for inducing the differentiation composition or cell culture plate culture of stem cells .

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 이용하여 세포에 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포 거동 조절 방법을 제공한다.In accordance with one aspect of the present invention, there is provided a method for controlling cell movement comprising applying an electrical stimulus to a cell using an enzymatic biofuel cell.

본 발명에서, 용어 “효소적 생물연료전지(enzymatic fuel cell)"는 생물연료의 화학적 에너지를 전기적 에너지로 전환시키는 장치로서, 연료를 산화시키기 위한 촉매로서 효소를 이용하는 특별한 형태의 연료전지이다. 따라서, 종래의 연료전지와는 달리 값비싼 금속촉매를 필요로 하지 않는다.In the present invention, the term " enzymatic fuel cell "is an apparatus for converting the chemical energy of a biofuel into electrical energy, and is a special type of fuel cell using enzymes as a catalyst for oxidizing fuel. , Which does not require a costly metal catalyst, unlike conventional fuel cells.

본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 세포의 이동, 분열 또는 분화와 같은 세포 거동을 조절할 수 있다. 이때, 조절 가능한 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 세포의 종류에 구애되지 않는다.The enzymatic biofuel cell according to the present invention can control cell movement such as cell migration, division or differentiation. Herein, the regulatable cells include stem cells or myocardial cells including adult stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells (iPSCs), muscle precursor cells and neurons Somatic cells containing progenitor cells do not depend on the type of cells.

바람직하게, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 양극(anode)이나 음극(cathode) 중 하나의 전극만을 포함하더라도 전기자극을 발생시킬 수 있으므로, 효소적 생물연료전지의 양극, 음극 또는 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극에 의해 세포 거동을 조절할 수 있다. 바람직하게 상기 효소적 생물연료전지의 양극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 또는 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)일 수 있으며, 음극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 또는 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 상기 양극은 FAD(flavin adenine dinucleotide), PQQ(Pyrrolo quinoline quinone), 헴(heme), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 또는 Mn 등의 보조인자(co-factor)를 추가로 포함할 수 있다.Preferably, the enzymatic biofuel cell according to the present invention can generate electric stimulation even if it contains only one electrode of the anode or the cathode. Therefore, Cellular behavior can be controlled by electrical stimulation by all. Preferably, the anode of the enzymatic biofuel cell is selected from the group consisting of glucose oxidase (Gox), glucose dehydrogenase, lactic acid oxidase (uricase), lactate dehydrogenase, galactose oxidase galactose oxidase, cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, formate dehydrogenase, formate dehydrogenase, Oxalate oxidase, pyruvate dehydrogenase or membrane-bound hydrogenase, and the negative electrode may be a bilirubin oxidase (BOD), a racemic dehydrogenase Laccase, horseradish peroxidase (HRP), catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase ase, microperoxidase, or horseradish peroxidase, but are not limited thereto. Meanwhile, the positive electrode may further include a co-factor such as FAD (flavin adenine dinucleotide), PQQ (pyrrolo quinoline quinone), heme, NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) or Mn.

상기 효소적 생물연료전지의 양극은 산화전극으로 연료를 산화시켜 전자를 방출하며, 음극은 환원전극으로 전자를 소모하여 산화제(oxidant)를 환원시킨다. 상기 효소적 생물연료전지의 연료로는 다양한 당류(sugars) 및 저분자량의 지방족 알콜(low aliphatic alcohols)를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 글루코스, 프락토스, 셀로비오스, 락토즈, 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 파이루베이트, 수소 등을 포함한다. 상기 산화제로는 산소분자 이외에도 과산화수소 또는 큐멘 과산화물(cumene peroxide)을 포함할 수 있다.The anode of the enzymatic biofuel cell oxidizes fuel to an oxidizing electrode to emit electrons, and the anode consumes electrons to a reducing electrode to reduce an oxidant. As the fuel of the enzymatic biofuel cell, various sugars and low molecular weight aliphatic alcohols can be used without limitation. Specific examples include glucose, fructose, cellobiose, lactose, methanol, ethanol, glycerol, pyruvate, hydrogen and the like. The oxidizing agent may include hydrogen peroxide or cumene peroxide in addition to oxygen molecules.

일반적인 연료전지와 마찬가지로, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다. 단, 상기 격리는 단순히 물리적인 거리를 의미하는 것으로 일정 간격 이격되도록 위치시키기만 하면 된다. 따라서, 일반적인 연료전지의 필수적인 구성요소인 분리막을 필요로 하지 않는다. 이에 따라 효소적 생물연료전지는 소형화가 용이하며 고분자막과 같은 이물질을 포함하지 않으므로 체내에 이식하기에 적합하다.Like the general fuel cell, it is preferable that the anode and the cathode of the enzyme biofuel cell are positioned so as to be isolated from each other in order to prevent power failure. In addition, each of the electrodes may further include a redox mediator and a cross-linking agent to prevent the electrode enzyme from being mixed into the medium, so that the redox reaction can be efficiently performed. It should be noted that the above-mentioned isolation means simply a physical distance, and it is only required to be positioned at a predetermined distance. Therefore, a separation membrane which is an essential component of a general fuel cell is not required. Therefore, the enzymatic biofuel cell is easy to be miniaturized and does not contain a foreign substance such as a polymer membrane, so it is suitable for implantation in the body.

본 발명에 따른 구체적인 실시예에서는 양극은 글루코스 산화효소를 포함하여 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키고, 음극은 빌리루빈 산화효소를 포함하여 산소분자를 물로 환원시키면서 전기자극을 발생시킨다(도 1).In a specific example according to the present invention, the anode includes glucose oxidase to oxidize glucose to gluconolactone, and the anode includes bilirubin oxidase to reduce oxygen molecules to water to generate electrical stimulation (FIG. 1).

본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소의 농도를 조절함으로써 발생하는 전류의 세기를 조절할 수 있다.The enzymatic biofuel cell according to the present invention can control the intensity of the electric current generated by adjusting the concentration of the enzyme.

본 발명자들은 효소 농도를 조절하면서 다양한 세기의 전기자극을 세포에 가함으로써 세포 거동에 유효한 효과를 나타내는 최소의 전류세기 및 세포사멸을 유도하는 전류세기를 동정하였으며, 상기 범위 이내에서 전류를 변화시키면서 줄기세포의 분화를 관찰하여, 특정 조직으로의 분화를 유도하기에 적합한 전류 범위를 최초로 동정하였다.The inventors of the present invention identified the minimum current intensity and the current intensity that induce apoptosis which are effective for cell behavior by applying electrical stimulation of various intensities to cells while controlling the enzyme concentration, Cell differentiation was observed and the current range suitable for inducing differentiation into a specific tissue was first identified.

바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 근육세포로의 분화를 유도할 수 있다.Preferably, an electrical stimulation of 2 nA / cm 2 or more and less than 230 nA / cm 2 is added to stem cells using an enzymatic biofuel cell according to the present invention, thereby inducing differentiation into muscle cells.

바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 골세포로의 분화를 유도할 수 있다.Preferably, the electroporation of 230 nA / cm 2 or more and less than 300 nA / cm 2 is added to the stem cells using an enzymatic biofuel cell according to the present invention, thereby inducing differentiation into bone cells.

바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 신경세포로의 분화를 유도할 수 있다.Preferably, the enzymatic biofuel cell according to the present invention can induce differentiation into neural cells by applying electrical stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 to the stem cells.

바람직하게, 본 발명에 따라 효소적 생물연료전지를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 줄기세포에 가함으로써 심근세포로의 분화를 유도할 수 있다.Preferably, an electroporation of 500 nA / cm 2 or more and less than 1000 nA / cm 2 is added to stem cells using an enzymatic biofuel cell according to the present invention, thereby inducing differentiation into myocardial cells.

상기 다양한 조직세포로의 줄기세포의 분화 유도는 각 조직세포에 대해 특이적인 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 포함하는 분화배지를 필요로 하지 않는다. 일반적인 배양배지를 이용하되 상기 범위의 전기자극을 가함으로써 해당 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 이때, 상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성될 수 있다.The induction of differentiation of stem cells into the various tissue cells does not require a differentiation medium containing growth factors, cytokines, proteins and / or other additives specific for each tissue cell. By using a general culture medium and applying electric stimulation in the above range, differentiation into the tissue cell can be induced. At this time, the adjustment of the electrical stimulation can be achieved by controlling the amount of enzyme in the electrode.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 효소의 양을 조절하면서 발생하는 전류세기를 측정하였으며(표 1), 이를 이용하여 다양한 세기의 전기자극을 줄기세포에 가하여 각기 다른 범위의 전기자극에 의해 각기 다른 조직세포로의 분화가 유도됨을 확인하였다(도 7).
In the specific example of the present invention, the current intensity generated while controlling the amount of enzyme was measured (Table 1), and electrical stimulation of various intensities was applied to the stem cells using different ranges, (Fig. 7).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for inducing differentiation of stem cells comprising an enzymatic biofuel cell.

바람직하게는 전기자극의 세기를 조절하여 특정 조직세포로의 분화를 유도할 수 있다. 각 조직세포로의 분화에 적절한 자극의 범위는 전술한 바와 같다.Preferably, the intensity of electrical stimulation can be controlled to induce differentiation into specific tissue cells. The range of stimulation suitable for differentiation into each tissue cell is as described above.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for promoting cell migration or proliferation comprising an enzymatic biofuel cell.

바람직하게는 상처 부위 주변에 상기 효소적 생물연료전지를 포함하는 조성물을 적용함으로써 상기 전기자극을 가하여 상처 부위로의 줄기세포 이동 또는 증식을 촉진시켜 상처치유의 효과를 유도할 수 있다. 바람직하게 상기 세포는 줄기세포 또는 체세포일 수 있다.Preferably, the composition comprising the enzymatic biofuel cell is applied to the wound area around the wound site, thereby enhancing stem cell migration or proliferation to the wound site by applying the electric stimulation, thereby inducing the wound healing effect. Preferably, the cells may be stem cells or somatic cells.

따라서, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 상처치유 및 손상된 조직의 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 보다 구체적인 사항은 후술할 것이다.
Therefore, the enzymatic biofuel cell according to the present invention can be usefully used for wound healing and regeneration of damaged tissues. More specific details will be described later.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는 세포배양용기를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a cell culture container equipped with an enzymatic biofuel cell and capable of culturing cells while applying electrical stimulation.

상기 세포배양용기는 효소적 생물연료전지의 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한없이 이용할 수 있다.The cell culture container may include an anode, a cathode, or both an anode and a cathode of an enzymatic biofuel cell. The above-described various enzymes can be used without limitation in the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell.

나아가, 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지는 효소작용에 의해 기질을 산화 또는 환원시키면서 전자를 발생하거나 소모하는 시스템이므로 효소작용을 위한 기질이 공급되는 한 외부로부터의 전력공급이 없이도 지속적으로 전기자극을 생성할 수 있다. 상기 기질은 연료물질 또는 산화제를 세포배양액에 첨가하는 등의 형식으로 공급될 수 있다.Further, since the enzymatic biofuel cell according to the present invention generates or consumes electrons while oxidizing or reducing the substrate by an enzyme action, it is possible to continuously generate electrical stimulation Can be generated. The substrate may be supplied in a form such as adding a fuel substance or an oxidizing agent to the cell culture liquid.

전술한 바와 같이, 상기 효소적 생물연료전지의 양극과 음극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 예컨대, 일반적인 세포배양용기 내에 양쪽 전극 모두를 포함하는 효소적 생물연료전지를 설치하여 액체 배지를 이용하여 배양하는 세포에 전기자극을 가하고자 하는 경우, 배양용기의 가장자리에 음극과 양극을 각각 가장 멀리 이격되도록 배치할 수 있다. 이때, 전극으로부터 효소가 배지로 확산되어 혼입되는 것을 방지하기 위하여, 각 전극은 OHP 필름과 같은 고체 기재 상에 스크린-프린트된 탄소전극에 양극 및 음극 효소를 각각 함침시켰다. 또한 상기 각 전극은 추가로 산화환원 매개체 및 가교제를 포함하여 전극효소가 배지 내로 혼입되는 것을 방지하고 산화환원 반응이 효율적으로 수행되도록 할 수 있다.
As described above, it is preferable that the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell are positioned so as to be isolated from each other in order to prevent disconnection. For example, when an enzymatic biofuel cell including both electrodes is installed in a general cell culture container and electric stimulation is to be applied to the cells cultured using the liquid culture medium, the cathode and the anode are arranged at the farthest It can be arranged so as to be spaced apart. At this time, in order to prevent the enzyme from diffusing into the medium from the electrode, each electrode was impregnated with a cathode-negative electrode enzyme on a screen-printed carbon electrode on a solid substrate such as an OHP film. In addition, each of the electrodes may further include a redox mediator and a cross-linking agent to prevent the electrode enzyme from being mixed into the medium, so that the redox reaction can be efficiently performed.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an enzymatic biofuel cell.

상기 상처 치료용 약학 조성물은 효소적 생물연료전지로서 양극, 음극, 또는 양극 및 음극 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 효소적 생물연료전지의 양극 및 음극에는 전술한 다양한 효소를 제한없이 이용할 수 있다.The pharmaceutical composition for wound healing may be an enzyme biofuel cell including an anode, a cathode, or both an anode and a cathode. The above-described various enzymes can be used without limitation in the positive electrode and the negative electrode of the enzymatic biofuel cell.

바람직하게 본 발명의 약학 조성물은 경피투여형 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 “경피투여형 제제”는 피부를 통해 약물을 투여하여 효과를 나타내는 제형으로 피부에 바르는 약, 피부에 붙이는 약 등의 형태로 제형화된다. 경피투여시 활성성분의 피부 투과는 화학포텐셜 즉, 농도기울기에 따른 단순확산에 의해 세포 내, 세포간 또는 땀구멍, 털구멍 등의 부속기관을 통과하여 이루어진다. 손상되지 않은 피부를 통과하는 것이 용이하지는 않다는 단점이 있으나, 약물의 효율, 투여속도의 제어, 환부에 직접 적용 가능성 등의 사용상 용이점이 있으며 비교적 일정한 혈중농도 유지, 위장관 독성을 나타내는 물질의 부작용 최소화, 간의 부담 감소 등의 장점이 있다. 활성성분의 피부 투과를 용이하게 하기 위해서는 피부 투여 촉진제를 추가적으로 포함하여 제형화할 수 있다.Preferably, the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into a transdermal preparation. The above " transdermal dosage form " is formulated into a form that is effective by administering a drug through the skin, such as a drug applied to the skin or a drug applied to the skin. In transdermal administration, the skin permeation of the active ingredient is carried out through an intracellular, intracellular, or parenchyma, hairy hole, or the like by simple diffusion according to the chemical potential, that is, the concentration gradient. It is not easy to pass through uninjured skin. However, there are advantages in ease of use such as efficiency of drug, control of administration rate, possibility of direct application to affected part, maintenance of relatively constant blood concentration, minimization of side effects of substances showing gastrointestinal toxicity, And reducing the burden on the liver. In order to facilitate skin permeation of the active ingredient, a skin administration promoter may be additionally formulated.

본 발명의 경피투여형 제제는 피부의 질환부 표면에 유효 성분을 직접 투여할 수 있는 제형이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 연고제, 크림제, 겔제, 로션제, 액제, 유제, 현탁제, 경고제(스틱제), 파스타제, 리니멘트제, 파프제, 테이프제, 에어로졸제 또는 외용산제 등의 제제로 조제하여 사용할 수 있다. 이를 위해 통상의 경피투여형 제제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또는 멸균된 거즈 등에 본 발명의 약학 조성물을 흡수시키고 이를 접착성 밴드에 고정시켜 상처부위에 직접 부착하는 밴드와 같은 방식으로 환부에 직접 적용할 수 있다.The transdermal preparation of the present invention can be used without limitation as long as it is a formulation capable of directly administering the active ingredient to the surface of the diseased part of the skin. For example, preparations such as ointments, creams, gels, lotions, solutions, emulsions, suspensions, warnings (sticks), pastes, liniments, papings, tapes, aerosols or external powders Can be used. To this end, it may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of conventional transdermal dosage forms. Or sterile gauze, and then applied directly to the affected area in the same manner as a band that is directly attached to a wound site.

그러한 성분으로는 연고제, 크림제, 겔제, 로션제의 경우에 있어서는, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 아디프산디이소프로필, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제 등을 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.Such ingredients include, in the case of ointments, creams, gels and lotions, white petrolatum, yellow petrolatum, lanolin, bleached wax, cetanol, stearyl alcohol, stearic acid, hardened oil, gelled hydrocarbon, polyethylene glycol, Bases such as squalane; Solvents and dissolution aids such as oleic acid, myristic acid isopropyl, triisooctanoic acid glycerin, crotamiton, diethyl sebacate, diisopropyl adipate, hexyl laurate, fatty acid, fatty acid ester, aliphatic alcohol and vegetable oil; Antioxidants such as tocopherol derivatives, L-ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, and butylhydroxyanisole; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid ester; Humectants such as glycerin, propylene glycol and sodium hyaluronate; Surfactants such as polyoxyethylene derivatives, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, and lecithin; Carboxyvinyl polymer, xanthan gum, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose sodium salt, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and the like. In addition, a stabilizer, a preservative, an absorption promoter, a pH adjuster, and other suitable additives may be added as desired.

액제 또는 유제인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등의 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다.In the case of a liquid or an emulsion, the carrier component may be water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan A solvent, a solvent or an emulsifying agent may be used.

현탁제인 경우에는 담체 성분으로서 물 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제; 에톡실화 이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제; 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case of a suspension, a liquid diluent such as water ethanol or propylene glycol as a carrier component; Suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters; Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

경고제인 경우에는 일산화납, 올리브유 및 돈지(lard)를 이용하여, 파스타제인 경우에는 아연화 세말, 살리실산 세말, 전분 및 바셀린을 이용하여, 리니멘트제인 경우에는 장뇌유, 올리브유, 메틸 살리실리레이트, 트라가칸타, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 글리세린 및 산화아연을 이용하여 제제화할 수 있다.In the case of a warning agent, lead monoxide, olive oil and lard are used. In case of pasta starch, zinc sulfate, salicylic acid and starch and petroleum jelly are used. In case of liniment oil, ginger oil, olive oil, methyl salicylate, Sodium carboxymethyl cellulose, glycerin, and zinc oxide.

파프제의 경우에 있어서는, 폴리아크릴산, 폴리아크릴산 공중합체 등의 점착부여제; 황산알루미늄, 황산칼륨알루미늄, 염화알루미늄, 메타규산알루민산마그네슘, 디하이드록시알루미늄아세테이트 등의 가교제; 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 알긴산나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 (마크로골), 프로필렌글리콜, 1,3-부탄디올 등의 다가 알코올류; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제; 1-멘톨 등의 향료; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 정제수 등을 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.In the case of the PAPE agent, a tackifier such as polyacrylic acid and polyacrylic acid copolymer; A crosslinking agent such as aluminum sulfate, aluminum potassium sulfate, aluminum chloride, magnesium metasilicate aluminate, and dihydroxy aluminum acetate; Thickening agents such as sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, gelatin, sodium alginate, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose sodium salts, hydroxypropylcellulose, and hydroxypropylmethylcellulose; Polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol (macrogol), propylene glycol and 1,3-butanediol; Surfactants such as polyoxyethylene derivatives; Fragrances such as 1-menthol; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid ester; And purified water. In addition, a stabilizer, a preservative, an absorption promoter, a pH adjuster, and other suitable additives may be added as desired.

테이프제의 경우에 있어서는, 스티렌, 이소프렌, 스티렌 블록 공중합체 (SIS 블록 공중합체)나 아크릴 수지 등의 점착제; 지환족 포화 탄화수소계 수지, 로진계 수지, 테르펜계 수지 등의 점착 부여 수지; 액상 고무, 유동 파라핀 등의 연화제; 디부틸하이드록시톨루엔 등의 산화 방지제; 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 올레산 등의 흡수 촉진제; 폴리옥시에틸렌 유도체 등의 계면 활성제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 또, 폴리아크릴산나트륨이나 폴리비닐알코올과 같은 함수 가능한 고분자와 소량의 정제수를 첨가하여 함수 테이프제로 할 수도 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, pH 조정제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.In the case of the tape, a pressure-sensitive adhesive such as styrene, isoprene, styrene block copolymer (SIS block copolymer) or acrylic resin; A tackifier resin such as an alicyclic saturated hydrocarbon resin, a rosin resin, and a terpene resin; Softeners such as liquid rubber and liquid paraffin; Antioxidants such as dibutyl hydroxytoluene; Polyhydric alcohols such as propylene glycol; Absorption promoters such as oleic acid; A surfactant such as a polyoxyethylene derivative, and other suitable additives. It is also possible to add a functional polymer such as sodium polyacrylate or polyvinyl alcohol and a small amount of purified water to form a functional tape. In this case as well, a stabilizer, a preservative, an absorption promoter, a pH adjuster, and other suitable additives may be added as desired.

에어로졸제의 경우에 있어서는, 연고제, 크림제, 겔제, 현탁제, 유제, 액제 및 로션제 등의 조제에 사용되는 백색 바셀린, 황색 바셀린, 라놀린, 표백 밀랍, 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 경화유, 겔화 탄화수소, 폴리에틸렌글리콜, 유동 파라핀, 스쿠알란 등의 기제; 올레산, 미리스트산이소프로필, 아디프산디이소프로필, 세바크산이소프로필, 트리이소옥탄산글리세린, 크로타미톤, 세바크산디에틸, 라우르산헥실, 지방산, 지방산 에스테르, 지방족 알코올, 식물유 등의 용제 및 용해 보조제; 토코페롤 유도체, L-아스코르브산, 디부틸하이드록시톨루엔, 부틸하이드록시아니솔 등의 산화 방지제; 파라하이드록시벤조산에스테르 등의 방부제; 글리세린, 프로필렌글리콜, 히알루론산나트륨 등의 보습제; 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌글리콜 지방산 에스테르, 레시틴 등의 계면 활성제; 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염류, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 증점제; 추가로 각종 안정제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 보존제, 용해 보조제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 특히, 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 추가적으로 포함할 수 있다.In the case of the aerosol preparation, the white petrolatum, the yellow petrolatum, the lanolin, the bleached wax, the cetanol, the stearyl alcohol, the stearic acid, the stearic acid, Base oils such as hydrogenated oils, gelled hydrocarbons, polyethylene glycols, liquid paraffin, squalane and the like; Oleic acid, myristic acid isopropyl, diisopropyl adipate, isobutyl sebacate, glycerin triisooctanoate, crotamiton, diethyl sebacate, hexyl laurate, fatty acid esters, aliphatic alcohols and vegetable oils Solvents and dissolution aids; Antioxidants such as tocopherol derivatives, L-ascorbic acid, dibutylhydroxytoluene, and butylhydroxyanisole; Preservatives such as parahydroxybenzoic acid ester; Humectants such as glycerin, propylene glycol and sodium hyaluronate; Surfactants such as polyoxyethylene derivatives, glycerin fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, propylene glycol fatty acid esters, and lecithin; Thickening agents such as carboxyvinyl polymer, xanthan gum, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium salts, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose and the like; In addition, various stabilizers, buffers, mating agents, suspending agents, emulsifiers, fragrances, preservatives, solubilizers, and other suitable additives may be added. In particular, propellants such as chlorofluorohydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether may additionally be included.

외용산제의 경우에 있어서는, 감자 전분, 쌀 전분, 옥수수 전분, 탤크, 산화아연 등의 부형제 또는 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다. 이 경우에 있어서도, 추가로 원하는 바에 따라 각종 안정제, 보존제, 흡수 촉진제, 그 밖의 적당한 첨가제를 배합할 수 있다.In the case of external preparations, excipients such as potato starch, rice starch, corn starch, talc and zinc oxide or other suitable additives may be added. In this case as well, various stabilizers, preservatives, absorption promoters and other suitable additives may be added as desired.

본 발명이 제공하는 경피투여형 제제를 조제하는 수단은 특별히 한정되지 않고, 원하는 제형에 따라 각 성분 및 필요에 따라 기제 성분을 충분히 혼련하는 등의 통상의 경피투여형 제제를 제조하는 방법을 사용하여 제조된다. 또, 파프제 및 테이프제의 조제에 있어서는, 혼련한 혼합물을 이형지 상에 전연(展延), 건조시키고, 추가로 유연한 지지체와 첩합(貼合)시키고, 원하는 크기로 재단함으로써 조제할 수 있다.The means for preparing the transdermal dosage formulations provided by the present invention is not particularly limited, and a method for preparing conventional transdermal dosage forms, such as sufficiently kneading the respective components and the base components as necessary according to a desired formulation, . In the preparation of a papermaking and a tape forming agent, the kneaded mixture can be spread by spreading on a release paper, drying it, further bonding it to a flexible support, and cutting it to a desired size.

본 발명이 제공하는 경피투여형 제제는, 예를 들어 연고제, 액제 (현탁제, 유제, 로션제 등), 에어로졸제 및 외용산제의 경우에는, 피부 환부에 도포 등에 의해 직접 적용하거나, 혹은 천 등의 지지체에 도포 또는 함침시켜 적용하거나 하는 등의 통상의 사용 방법에 의해 사용된다. 또, 파프제 혹은 테이프제의 경우에는, 이들 제제를 피부 환부에 직접 첩부하는 방법에 의해 사용된다.The transdermal dosage form provided by the present invention can be applied directly to the skin affected area by application or the like in the case of ointments, liquid preparations (suspensions, emulsions, lotions and the like), aerosols and external preparations, Is applied or impregnated to a support of a substrate, or the like. In the case of a papermaking or a tape preparation, these preparations are used by directly attaching them to the skin affected portion.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 반응 감응성 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 경피투여형 제제로 사용되는 경우 경피투과속도, 세포 흡수력 등을 고려하여 적용량을 설정할 수 있다.
Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention will vary depending upon the formulation method, the mode of administration, the age, weight, sex, pathology, food, time of administration, route of administration, responsiveness and other factors well known in the medical arts As shown in FIG. When used as a transdermal dosage form, the application amount can be set in consideration of the transdermal permeation rate and the cell absorption capacity.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 치료방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease caused by muscle tissue abnormality including an enzymatic biofuel cell. And administering the pharmaceutical composition to an individual in need thereof. The present invention also provides a method for treating a disease caused by muscle tissue abnormality.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising an enzymatic biofuel cell. And administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

또 다른 양태로서, 본 발명은 효소적 생물연료전지를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 또한 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 치료방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease including an enzymatic biofuel cell. Also provided is a method for treating a neurological disorder comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.

상기 근육조직 이상으로 인한 질환의 비제한적인 예는 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)이다.Non-limiting examples of disorders due to muscle tissue abnormalities include myocardial infarction (MI), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), focal, multifocal, segmental segmental, hemidystonia, or generalized dystonia and muscular dystrophy (MD).

상기 골질환의 비제한적인 예는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)이다.Non-limiting examples of such bone diseases are osteoporosis, osteomalacia, Paget disease, periodontal disease, rheumatoid arthritis, and fracture.

상기 신경질환의 비제한적인 예는 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)이다.Non-limiting examples of such neurological diseases include epilepsy, Alzheimer ' s disease, Parkinson ' s disease, multiple sclerosis, Huntington ' s disease, and Creutzfeldt- Jakob disease )to be.

본 발명에서, 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term " prevention " means any action that inhibits or delays a disease, bone disease or neurological disease caused by muscle tissue abnormality by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, Refers to any action that improves or alters the symptoms of a disease caused by muscle tissue abnormality, bone disease or neurological disease by the administration of the compound.

본 발명에서, 용어 “개체”란 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 공지의 근육조직 이상으로 인한 질환, 골질환 또는 신경질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.In the present invention, the term " individual " means all animals, including humans, who have developed or are capable of developing a disease, bone disease or neurological disease due to muscle tissue abnormality. By administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject, A bone disease or a neurological disease can be effectively prevented or treated. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in combination with a therapeutic agent for diseases, bone diseases or neurological diseases caused by known muscle tissue abnormalities.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 “약학적으로 유효한 양”이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 전극 구성의 형태(예컨대, 양극효소만을 포함, 음극효소만을 포함 또는 양극 및 음극 효소를 모두 포함) 및 전극 효소의 함유량에 따라 발생하는 전기자극의 수준이 조절되고 각기 다른 전류 범위의 자극에 대해서 각기 다른 조직으로의 분화가 유도되므로, 질환이 발생한 조직의 형태를 고려하여 유효량을 결정할 수 있다. 또한 이외에도 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소를 고려하여 유효 용량 수준을 결정할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not to cause adverse side effects. In particular, the pharmaceutical composition according to the present invention is characterized in that the level of electric stimulation which occurs in accordance with the content of the electrode enzyme (including only the anode enzyme, only the anode enzyme, or both the anode and cathode enzymes) Since stimulation of different current ranges leads to differentiation into different tissues, an effective amount can be determined taking into consideration the type of tissue in which the disease occurs. In addition, other factors including the sex, age, weight, health condition, severity of the disease, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration method, administration time, administration route and emission rate, treatment period, And other well known factors in the medical field.

본 발명에서, 용어 “투여”란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여가 바람직하며, 보다 바람직하게는 병변에 국소 투여할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 성형이 자유롭고 상기한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하여 다양한 제형으로 제제화될 수 있으므로, 적용하고자 하는 조직의 위치 및 형태를 고려하여 적절한 제형으로 투여할 수 있다. 예컨대, 근육에 투여하고자 하는 경우 환부에 따라 상기한 바와 같이 경피투여하거나 주사제의 형태로 환부에 직접 투여할 수 있다. 골조직에 투여하고자 하는 경우 주사제의 형태로 환부에 직접 투여하거나, 당업계에 알려진 조직 재생에 사용되는 공지의 생분해성 물질에 로딩하여 환부에 이식할 수 있다. 또한 신경질환의 경우 주사제로 환부에 직접 투여하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In the present invention, the term " administration " means introducing a predetermined substance into a patient in an appropriate manner, and the administration route of the composition can be administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue. The method of administration is not limited thereto, but parenteral administration is preferable, and local administration to the lesion is more preferable. In particular, the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated into a wide variety of formulations, including a pharmaceutically acceptable carrier, which is free from molding and is pharmaceutically acceptable as described above. Therefore, can do. For example, when it is intended to be administered to muscles, it may be transdermally administered as described above according to the affected part, or may be directly administered to the affected part in the form of an injection. When it is intended to be administered to a bone tissue, it may be directly administered to the affected part in the form of an injection, or may be implanted into a lesion by loading it into a known biodegradable material used for tissue regeneration known in the art. In addition, in the case of neurological diseases, it is preferable to administer it directly to the affected area by injection, but it is not limited thereto.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 근육세포를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a muscle cell in which a stem cell is cultured by applying electrical induction of less than 230 nA / cm < 2 > to not less than 2 nA / cm 2 using the composition for inducing differentiation or a cell culture container .

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 골세포를 제공한다.In still another aspect, the present invention provides that osteogenic differentiation and as an electrical stimulation of less than 230 nA / cm 2 over 300 nA / cm 2 by using a composition or a cell culture vessel for inducing the differentiation culture of stem cells .

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 신경세포를 제공한다.In still another aspect, the present invention provides a nerve cell that differentiate to while the electrical stimulation of less than 300 nA / cm 2 over 500 nA / cm 2 using for inducing the differentiation composition or cell culture plate culture of stem cells .

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하면서 줄기세포를 배양하여 분화시킨 심근세포를 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a myocardial cell in which stem cells are cultured by applying electrical induction of less than 1000 nA / cm < 2 > to 500 nA / cm < 2 > using the composition for inducing differentiation or a cell culture container .

전술한 바와 같이 본 발명의 분화 유도용 조성물 또는 세포배양용기를 이용하여 줄기세포를 분화시키는 방법은 각 조직 분화에 특이적으로 요구되는 성장인자, 사이토카인, 단백질 및/또는 이외 첨가물을 필요로 하지 않고 일반 배양배지에 배양하되 효소의 농도를 조절하여 적절한 범위의 전기자극을 가하면서 배양하는 방법으로 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 외부물질 또는 혈청 사용에 의한 오염가능성이 현저히 낮으므로, 이렇게 분화시킨 근육세포, 골세포, 신경세포 및 심근세포는 세포치료제로 사용되기에 적합하다.
As described above, the method of differentiating stem cells using the composition for inducing differentiation or the cell culture container of the present invention requires growth factors, cytokines, proteins, and / or other additives specifically required for each tissue differentiation But it can induce differentiation by culturing it in a general culture medium while adjusting the concentration of the enzyme and culturing it with an appropriate range of electric stimulation. Therefore, since the possibility of contamination by the use of external substances or serum is remarkably low, the differentiated muscle cells, bone cells, nerve cells and myocardial cells are suitable for use as a cell therapy agent.

본 발명에 따른 효소적 생물연료전지를 이용하여 전기자극을 가함으로써 세포거동을 조절하는 방법은 전기자극원으로서 효소를 사용하므로 생체적합성이 높고, 원하는 제형으로 성형가능하며, 각 전극에 도입되는 효소의 농도를 조절함으로써 다양한 범위의 전류를 생성할 수 있고, 양쪽 전극을 모두 포함하지 않더라도 전기자극을 발생시킬 수 있다는 점에서 약학 조성물로서의 활용 가능성이 높다. 또한 세포사멸을 유도하지 않는 수준에서 각기 다른 수준의 전기자극을 가하였을 때, 줄기세포를 각각 다른 조직으로의 분화되도록 유도할 수 있으므로, 다양하게 제형화하여 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있다.
The method for controlling cell behavior by applying electrical stimulation using the enzyme biofuel cell according to the present invention is characterized by high biocompatibility and moldability to a desired formulation by using an enzyme as an electric stimulus source, It is possible to generate a wide range of currents and to generate electric stimulation even if both electrodes are not included. Therefore, the present invention is highly likely to be used as a pharmaceutical composition. In addition, when different levels of electrical stimulation are applied at a level that does not induce apoptosis, stem cells can be induced to differentiate into different tissues, so that they can be variously formulated and useful for tissue regeneration.

도 1은 전극에서의 효소의 산화환원 반응에 기반한 효소적 생물연료전지의 대표적인 예를 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지의 전극 구성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 세기에 따른 세포의 반응을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 세포 이동 촉진효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 줄기세포 분열촉진효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극의 심근 및 근육세포 분화 유도효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 효소적 생물연료전지에 의한 전기자극 정도에 따른 분화방향을 나타낸 도이다. 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도한다.1 is a schematic diagram showing a representative example of an enzymatic biofuel cell based on an oxidation-reduction reaction of an enzyme at an electrode.
2 is a view showing an electrode configuration of an enzymatic biofuel cell according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the response of a cell according to an electric stimulus intensity by an enzymatic biofuel cell according to the present invention. FIG.
4 is a graph showing the cell migration promoting effect of the electrical stimulation by the enzymatic biofuel cell according to the present invention.
FIG. 5 is a graph showing an effect of stimulation of stem cell division by electrical stimulation by an enzymatic biofuel cell according to the present invention. FIG.
FIG. 6 is a graph showing the induction effect of electrical stimulation on myocardial and muscle cell differentiation by an enzymatic biofuel cell according to the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the direction of differentiation according to the degree of electric stimulation by an enzymatic biofuel cell according to the present invention. FIG. The relatively low electrical stimulation induces differentiation into muscle cells, the medium electrical stimulation leads to differentiation into osteocytes, and the high level of electrical stimulation within the range that does not induce apoptosis leads to differentiation into neurons.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 세포주의 준비 1: preparation of cell line

마우스 근모세포 세포주(mouse myoblast cell line) C2C12를 준비하여 각 배양접시에 2×103 세포/cm2 농도로 분주하였다. 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone, Thermo), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Gibco)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium, LM 001-05, WelGENE, Daegu, Korea) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소를 포함하는 37℃의 습식배양기에서 배양하면서 세포를 유지하였다.
Mouse myoblast cell line C2C12 was prepared and dispensed into each culture dish at a concentration of 2 x 10 < 3 > cells / cm < 2 >.(Dulbecco's modified eagle medium, LM 001-05, WelGENE, Daegu, Korea) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Thermo) and penicillin / streptomycin (Gibco) ) Medium and maintained in a 37 ° C wet incubator containing 5% carbon dioxide.

실시예Example 2:  2: 효소적Enzymatic 생물연료전지( Biofuel cell enzymaticenzymatic biofuelbiofuel cellcell ; ; EBFCEBFC )의 제조, 상기 전지의 전기화학적 특성 및 성능), The electrochemical characteristics and performance of the battery

반자동식의 스크린 프린팅 기기(semi-automatic screen printing machine)를 사용하여 OHP 필름 상에 Electrodag® 423SS(Acheson, Port Hurton, USA)로 스크린-프린트된 탄소전극(screen-printed carbon electrodes; SPCEs)을 준비하였다. 양극효소(anodic enzyme)로는 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 유래의 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOx, 219 U/mg, Amano Enzyme Inc., Japan)를 사용하였다. 음극효소(cathodic enzyme)로는 마이로테시움 베루카리아(Myrothecium verrucaria) 유래의 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD, 10.5 U/mg, Sigma enzyme)을 사용하였다. 상기 양극 및 음극에서의 산화환원 반응을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 폴리에틸렌글리콜 (400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) (400) diglycidyl ether; PEGDGE, Polysciences Inc.)를 가교제(cross-linker)로 사용하였다. 양극 및 음극 전극을 위한 로딩 용액은 효소, 산화환원 매개체(redox mediator) 및 가교제를 포함하도록 구성하였다. 양극 촉매는 0.04 mg/ml의 GOx, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+(PVI-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl]+/2+; PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+) 및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물(cross-linked adduct)로 구성하였다. 음극 촉매는 0.04 mg/ml의 BOD, 0.04 mg/ml의 PVI-[Os(4,4'-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl]+/2+ 및 10 mg/ml의 PEGDGE를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물로 구성하였다. 혼합물 10 μl를 SPCE 상에 도포하고 데시케이터 내에서 24시간 동안 실온(25℃±1)에서 건조하였다.
As Electrodag ® 423SS (Acheson, Port Hurton , USA) on the OHP film by using the screen-printing machine (semi-automatic screen printing machine) of the semi-automatic screen-printed carbon electrode, preparing a (screen-printed carbon electrodes SPCEs) Respectively. As an anodic enzyme, Aspergillus ( Aspergillus) was used for GOx, 219 U / mg, Amano Enzyme Inc., Japan); niger) glucose oxidase (glucose oxidase derived. As the cathodic enzyme, bilirubin oxidase (BOD, 10.5 U / mg, Sigma enzyme) derived from Myrothecium verrucaria was used. The redox reaction in the positive electrode and the negative electrode is schematically shown in FIG. Polyethylene glycol (400) diglycidyl ether (PEGDGE, Polysciences Inc.) was used as a cross-linker. The loading solution for the anode and cathode electrodes was configured to include an enzyme, a redox mediator, and a crosslinker. Cathode catalyst is 0.04 mg / ml of GOx, 0.04 mg / ml PVI- [ Os (4,4'- dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2 Cl] + / 2 + (PVI- [Os (4 , 4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine ) 2 Cl] + / 2 +; PVI- [Os (dmo-bpy) 2 Cl] + / 2 +) and the PEGDGE of 10 mg / ml 4: 4: 1 in a volume ratio to constitute cross-linked adducts. Cathode catalyst is 0.04 mg / ml of BOD, 0.04 mg / ml of PVI- [Os (4,4'- dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2 Cl] + / 2 + and 10 mg / ml of PEGDGE Were mixed at a volume ratio of 4: 4: 1 to form crosslinked adducts. 10 μl of the mixture was applied on SPCE and dried in a desiccator for 24 hours at room temperature (25 ° C ± 1).

상기 제조한 효소적 생물연료전지의 전기화학적 특성을 확인하기 위하여, 두 개의 SPCE를 배양접시(직경 35 mm)의 가장자리에 부착하였다(도 2). 본 발명에서는 양극 또는 음극 전극으로서 길이 15 mm, 너비 2 mm의 총 30 mm2 활성면적을 갖는 전극을 사용하였다. 개방회로전위(open circuit potential; OCP) 및 i-t 기법(technique)을 위하여 CHI 600B potentiostat(Austin, TX, USA)과 결합된 이중전극 전기화학 전지를 사용하였다. 유연한 폴리에스테르 필름 상의 3.5 mm 직경의 작업전극을 이용하여 개질된 PVI-[Os(dmo-bpy)2Cl]+/2+의 전기화학적 특성을 연구하였다. 0.5 mm 직경의 백금선 상대전극 및 Ag/AgCl 마이크로-기준전극(AgCl로 포화된 3.0 M KCl, Cypress, Lawrence, KS, USA)을 이용하였다. 각 배양접시에 전기적 흐름을 위한 전도체로서 배양배지를 채웠다. 실험 하루 전에 동일한 수의 세포를 배양접시에 분주하였다.
To confirm the electrochemical characteristics of the prepared biofuel cell, two SPCEs were attached to the edge of a culture dish (diameter 35 mm) (Fig. 2). In the present invention, an electrode having a total area of 30 mm 2 with a length of 15 mm and a width of 2 mm was used as the anode or cathode electrode. A double electrode electrochemical cell coupled with CHI 600B potentiostat (Austin, TX, USA) was used for open circuit potential (OCP) and it technique. The electrochemical properties of modified PVI- [Os (dmo-bpy) 2 Cl] + / 2 + were studied using a 3.5 mm diameter working electrode on a flexible polyester film. A 0.5 mm diameter platinum counter electrode and Ag / AgCl micro-reference electrode (3.0 M KCl saturated with AgCl, Cypress, Lawrence, KS, USA) were used. Each culture dish was filled with the culture medium as a conductor for electrical flow. The same number of cells were dispensed into the culture dish one day before the experiment.

EBFC로부터 전기적 신호를 생성하기 위하여 전술한 방법으로 단순한 EBFC를 제조하였다. 전류 흐름 방향에 따라, EBFC를 양극단독, 음극단독 및 양극/음극 조건으로 분류하였으며, 각 전극 조건에서 세포에 대한 전자의 흐름을 개략적으로 나타내었다(도 2). 대조군으로는 전극을 포함하지 않는 용기를 사용하였다. GOX는 글루코스를 글루코노락토(gluconolactone)으로 산화시켜 전자를 방출하며, 따라서 양극 부근은 살아있는 세포에 영향을 주는 전자가 풍부한 조건이 된다. BOD는 산소분자를 물로 환원시키면서 전자를 소모하여 음극 부근은 주변 세포에 영향을 주는 전자-부족 상태로 변한다. 양극 및 음극을 모두 포함하는 전극 시스템(양극/음극 시스템)에서는 각 전극에서의 반응으로 인해 전자의 흐름이 발생하며 이에 따른 구배가 형성되었다. 본 발명자들은 배양접시에 각각 전자가 풍부한 조건과 전자가 부족한 조건을 확립하였다. 각 전극은 40 μl GOX 또는 BOD 및 40 μl 폴리(N-비닐이미다졸)-[Os(4,4-디메톡시-2,2'-비피리딘)2Cl])+/2+(poly(N-vinylimidazole)-[Os(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine)2Cl])+/2+; PVI-dmo-Os, E0'=-38.5 mV vs. Ag/AgCl), 10 μl 폴리에틸렌글리콜 (400) 디글리시딜에테르(poly(ethylene glycol) (400) diglycidyl ether; PEGDGE)의 가교결합 부산물(cross-linked adduct)로 구성되었다. 배양접시 내부에 전극을 위치시킨 후, Ag/AgCl에 대해 -38.5 mV의 전압을 가하여 EBFC 실험을 수행하고 전기 전류 출력을 얻었다. 본 발명자들은 효소 및 산화환원 매개체의 농도를 조절함으로써 EBFC의 최상의 전기 자극을 성취하였다. 양극/음극 시스템 생물연료전지에 고농도로 효소를 로딩한 산화환원 매개체에서 한계 전류 밀도는 10867±549 nA/cm2(N=3)이었다. 양극단독, 음극단독 및 낮은 농도로 효소를 로딩한 양극/음극 시스템 EBFC의 산화환원 매개체에서 한계 전류는 각각 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3), 8.676±1.17 nA/cm2(N=3) 및 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)이었다. 양극/음극 시스템에서 효소농도에 대한 전류 밀도를 하기 표 1에 나타내었다.
In order to generate electrical signals from EBFC, a simple EBFC was fabricated by the method described above. According to the current flow direction, the EBFC was classified into a cathode alone, a cathode alone, and an anode / cathode condition, and the flow of electrons to the cells was schematically shown in each electrode condition (FIG. 2). As a control group, a container containing no electrode was used. GOX oxidizes glucose to gluconolactone to release electrons, so the vicinity of the anode becomes an electron-rich condition that affects living cells. BOD consumes electrons while reducing oxygen molecules to water, and the vicinity of the cathode changes to an electron-deficient state that affects nearby cells. In the electrode system (anode / cathode system) including both the anode and the cathode, a flow of electrons was generated due to the reaction at each electrode, and a gradient was formed. The inventors of the present invention have established a condition in which an electron-rich condition and an electron-deficient condition are respectively observed in a culture dish. Each electrode 40 μl GOX or BOD and 40 μl poly (N- vinyl imidazole) - [Os (4,4- dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2 Cl]) + / 2 + (poly ( N-vinylimidazole) - [Os ( 4,4'-dimethoxy-2,2'-bipyridine) 2 Cl]) + / 2 +; PVI-DMO-Os, E0 ' = -38.5 mV vs. Ag / AgCl) and cross-linked adduct of 10 μl polyethylene glycol (400) diglycidyl ether (PEGDGE). After the electrode was placed in the culture dish, EBFC experiment was performed by applying a voltage of -38.5 mV to Ag / AgCl and the electric current output was obtained. The present inventors have achieved the best electric stimulation of EBFC by controlling the concentration of the enzyme and the redox mediator. The limiting current density was 10867 ± 549 nA / cm 2 (N = 3) in the redox medium loaded with high concentration of enzyme in the anode / cathode system biofuel cell. The limit currents in the redox medium of EBFC with positive, negative and enzyme loaded anode / cathode systems were -1.878 ± 0.35 nA / cm 2 (N = 3) and 8.676 ± 1.17 nA / cm 2 = 3) and 14.07 ± 1.63 nA / cm 2 (N = 3). The current density for the enzyme concentration in the anode / cathode system is shown in Table 1 below.

Figure 112013051404934-pat00001
Figure 112013051404934-pat00001

실시예Example 3:  3: 세포거동연구를Study of cell behavior 위한  for EBFCEBFC 의 최적조건 탐색Optimal condition search

본 발명자들은 C2C12 세포거동연구를 위한 최적의 EBFC 조건을 먼저 탐색하였다. 효소농도를 조절함으로써 EBFC의 전류와 전압을 조절하였다. 세포배양배지에서 각 효소농도에 대한 전력용량(electric power capacity)을 계산하였다. 구체적으로 효소농도를 조절하여 C2C12 세포에 2 nA, 40 nA 및 120 nA의 3가지 EBFC 조건을 적용하여 배양하였다. 이후, 항-병소부착단백질 항체(anti-focal adhesion protein antibody) 및 세포골격 염색 염료를 포함하는 면역세포화학 및 팍실린-RFP 및 그린-액틴(paxillin-RFP Green-actin)을 함께 전달감염(co-transfection)하여 공초점 라이브 이미지로 세포거동을 관찰하였다.The inventors first searched for optimal EBFC conditions for C2C12 cell behavior studies. The current and voltage of the EBFC were controlled by adjusting the enzyme concentration. The electric power capacity for each enzyme concentration in the cell culture medium was calculated. Specifically, the enzyme concentration was adjusted and C2C12 cells were cultured with 3 EBFC conditions of 2 nA, 40 nA and 120 nA. Subsequently, immunocytochemistry, including anti-focal adhesion protein antibody and cytoskeletal staining dye, together with paxillin-RFP Green-actin, -transfection) to observe cell behavior in a confocal live image.

C2C12에 팍실린-RFP 및 그린-액틴을 동시에 일시 전달감염(co-transient transfection)시켜 라이브 이미징하였다. 팍실린-RFP 플라스미드는 Xiong 박사(Georgia Health Science University)로부터 제공되었다. 그린-액틴 플라스미드(Green FP vector-actin: 558721, BD Pharmingen™, USA)는 상용화된 것을 구입하여 사용하였다. 네온 전달감염 시스템(Neon transfection system, Invitrogen life science, USA)을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 부유시킨 C2C12 세포에 대한 전기천공조건(electroporation condition)을 최적화(1100 V, 30 ms 1 펄스)하였다. 배양 3일 후, 팍실린-RFP/GFP-액틴을 동시에 전달감염시킨 세포를 트립신으로 처리하여 단일 부유 세포 용액(single suspended cell solution, 1×104 세포/ml)을 준비하였다. 라이브 이미징을 위하여 부유 C2C12를 공초점 배양접시(SPL Korea)에 분주하여 배양하였다. 적색 및 녹색 양성 세포를 선택하여 매 2.5분 마다 20사이클 반복하여 총 50분간 라이브 이미지를 기록하였다.
Live-imaging was performed by simultaneously co-transient transfection of the Paxilin-RFP and Green-Actin in C2C12. The Paxilin-RFP plasmid was provided by Dr. Xiong (Georgia Health Science University). Green-actin plasmid (Green FP vector-actin: 558721, BD Pharmingen (TM), USA) was purchased and used. The electroporation condition was optimized (1100 V, 30 ms 1 pulse) for C2C12 cells suspended according to the manufacturer's instructions using a neon transfection system (Invitrogen life science, USA). Three days after the incubation, the cells transfected with paxilin-RFP / GFP-actin were simultaneously treated with trypsin to prepare a single suspended cell solution (1 x 10 4 cells / ml). For live imaging, floating C2C12 was cultured in a confocal culture dish (SPL Korea). Red and green positive cells were selected and repeated 20 times every 2.5 minutes to record a live image for a total of 50 minutes.

C2C12 세포의 생존을 위한 최적의 전하 및 전기 전류 조건을 연구하였다. 낮은 농도의 GOX를 로딩한 경우 한계 양극 전류 밀도는 -1.878±0.35 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 BOD 로딩의 경우 한계 음극 전류 밀도는 8.676±1.17 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 낮은 농도의 효소를 로딩한 경우 양극/음극 시스템 EBFC 조건의 한계 음극 전류 밀도는 배양접시 상에서 14.07±1.63 nA/cm2(N=3)을 나타내었다. 높은 농도의 효소 로딩의 경우 음극 전류 밀도는 최대 10867±549 nA/cm2(N=3) 을 나타내었다. 각각 14 nA/cm2 및 10867 nA/cm2의 전류밀도로 세포를 자극하고 그 결과를 비교하여 도 3에 나타내었다. 그 결과 1000 nA를 초과하는 전류를 적용한 경우 대조군 및 낮은 전류를 적용한 세포와 비교하여 눈에 띠는 세포 형태 변화를 나타내었으며, 이는 과도한 전기자극으로 인해 세포사멸에 이르렀음을 나타내었다(도 3). 즉, 1000 nA의 강한 전기 자극에 의해 세포골격 네트워크가 완전히 파괴되었다(도 3 하단 우측). 그러나, 2 nA 수준의 낮은 전류는 세포에서 강한 횡단 호(transverse arc) 및 등쪽 응력 섬유(dorsal stress fiber)와 같은 액틴-세포골격 경향을 현저하게 변화시켰다(도 3 하단 좌측). 따라서, 세포 형태의 변화를 유도하는 낮은 수준의 전류인 2 nA와 세포 사멸이 시작되는 1000 nA를 세포사멸을 유도하지 않으면서 세포거동에 유효한 영향을 나타내는 C2C12 세포에 적용가능한 전류 범위로 결정하였다.
Optimal charge and electric current conditions for the survival of C2C12 cells were studied. When low concentrations of GOX were loaded, the limiting anodic current density was -1.878 ± 0.35 nA / cm 2 (N = 3). For low BOD loading, the critical cathode current density was 8.676 ± 1.17 nA / cm 2 (N = 3). When low concentrations of enzyme were loaded, the critical cathode current density of the EBFC condition in the anode / cathode system was 14.07 ± 1.63 nA / cm 2 (N = 3) on the culture dish. In the case of high concentration of enzyme loading, the cathode current density was 10867 ± 549 nA / cm 2 (N = 3) at the maximum. Cells were stimulated with current densities of 14 nA / cm 2 and 10867 nA / cm 2 , respectively, and the results were compared and shown in FIG. As a result, when the current exceeding 1000 nA was applied, it showed a noticeable cell morphological change as compared with the control and low current applied cells, indicating that cell death was caused by excessive electrical stimulation (FIG. 3) . That is, the cytoskeletal network was completely destroyed by strong electrical stimulation of 1000 nA (lower right of FIG. 3). However, a low current of the order of 2 nA significantly changed the actin-cytoskeleton tendencies such as the transverse arc and dorsal stress fibers in the cells (lower left in Fig. 3). Thus, a low current level of 2 nA, which induces changes in cell morphology, and 1000 nA of apoptosis initiation were determined as the current range applicable to C2C12 cells, which do not induce apoptosis but have an effect on cell behavior.

실시예Example 4:  4: EBFCEBFC 에 의한 전기장 상에서 시험관 내 세포이동In vitro cell migration on the electric field by

시험관 내 세포이동 연구를 위하여, 3 내지 7×105/ml 농도의 C2C12 세포 부유 용액을 준비하였다. 세포 용액 75 μl를 각 웰에 적용하였다. Well-defined 세포 분주 시스템(cell seeding system), 80206, ibiTreat, ibidi, Germany)인 배양-삽입 기구를 이용하여 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 제조하였다. 각 웰에서 세포를 포함하지 않는 간극의 폭은 500 μm±50 μm로 하였다. 세포 분주 후 배양-삽입을 배양접시로부터 조심스럽게 제거하였다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 수회 세척하였다. 세척 후 EBFC의 효소 반응을 위하여 5 ml의 신선한 배지를 채웠다. EBFC 전류 시스템으로는 직경 60 mm의 배양접시를 사용하였다. 세포-세포 간극의 서로 가장 먼 가장자리(cross edge)에 전극을 부착하였다. 배양-삽입 기구를 제거한 후, 16시간 및 24시간 째에 관찰하고 간극 내로 이동한 세포를 계수하였다. 각각의 EBFC 조건에 대해 세포를 포함하지 않았던 간극에서 세포의 수를 계수하여 비교하였다.
For in vitro cell migration study, a C2C12 cell suspension solution at a concentration of 3 to 7 x 10 5 / ml was prepared. 75 μl of the cell solution was applied to each well. Well-defined cell seeding system, 80206, ibiTreat, ibidi, Germany) using a culture-insertion apparatus. In each well, the width of the gap containing no cells was set to 500 μm ± 50 μm. After cell division, the culture-insert was carefully removed from the culture dish. And washed several times to remove unattached cells. After washing, 5 ml of fresh medium was filled in for EBFC enzyme reaction. A 60 mm diameter culture dish was used as the EBFC current system. The electrodes were attached to the farthest edges of the cell-cell gap. After removal of the culture-insertion device, cells were observed at 16 hours and 24 hours, and the cells migrated into the gap were counted. For each EBFC condition, the number of cells in the gaps that did not contain cells was counted and compared.

세포-세포 간극에 전기 자극 시스템을 장치하였다: 양극만을 포함하는 배양접시, 음극만을 포함하는 배양접시 및 양극, 음극을 모두 포함하는 배양접시 및 대조군으로서 전극 미포함 배양접시. 500 μm의 세포를 포함하지 않는 간극을 갖도록 배양접시에 세포를 분주하고 각각의 전기 자극 하에서 배양하여 상기 간극으로 이동하는 세포의 수를 계산하고 상처 치료율을 측정하였다. 세포-세포 간극으로의 이동을 3개 다른 영역에서 현미경(Nikon Instruments)에 장착된 디지털 카메라를 이용하여 자극을 가하기 전과, 자극을 가하면서 각각 16시간 및 24시간이 지난 후에 사진으로 기록하였다. 세포-세포 간극 폐쇄율을 결정하기 위하여 최상의 현미경 이미지를 이용하여 각각의 이동에 대한 평균 세포 수를 측정하였다. 도 4는 전기 자극을 적용하지 않은 대조군에 비해 전기 자극군에서 세포의 이동률이 현저히 증가함을 나타내었다. EBFC에 의한 모든 형태의 전기 자극에 대해 세포 이동 수는 대조군에 비해 16시간에서 2배 이상인 것을 확인하였다. 특히 음극만을 포함하는 배양접시에서의 전기 자극은 24시간 후 다른 전기 자극군과 비교하여 가장자리로부터 중심으로 이동한 세포의 수가 현저히 증가되었음을 나타내었다(도 4; 좌측으로부터 3번째 컬럼). 시간에 대해 스튜던트 t-테스트를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 본 발명에서는 양극 및 음극만에 의한 C2C12 근모세포에 대한 자극이 대조군에 비해 세포 이동률을 2배 이상 향상시켰음을 최초로 확인하였다.
The cell-cell gap was equipped with an electric stimulation system: a culture dish containing only an anode, a culture dish containing only a cathode, a culture dish containing both an anode and a cathode, and an electrode-less culture dish as a control. Cells were placed in a culture dish so as to have a gap not including 500 mu m cells, and the number of cells migrating to the gap was calculated by measuring the wound healing rate by culturing under electric stimulation. Cell-to-cell migration was photographed 16 hours and 24 hours after stimulation with a digital camera mounted on a microscope (Nikon Instruments) in three different areas, with stimulation, respectively. The mean cell number for each migration was determined using the best microscope image to determine the cell-cell gap closure rate. FIG. 4 shows that the cell migration rate in the electrical stimulation group was significantly increased as compared with the control group without electrical stimulation. The cell migration rate of all types of electric stimulation by EBFC was confirmed to be more than twice as much as that of the control group at 16 hours. In particular, electrical stimulation in a culture dish containing only a cathode showed a significant increase in the number of cells migrating from the edge to the center compared with the other electrical stimulation group after 24 hours (Fig. 4, the third column from the left). Statistical analysis was performed using the Student's t-test for time. In the present invention, it was confirmed for the first time that the stimulation of C2C12 myoblasts by only the positive electrode and the negative electrode improved the cell migration rate by more than two times as compared with the control group.

실시예Example 5:  5: EBFCEBFC 시스템 상에서On the system C2C12C2C12 세포 증식 Cell proliferation

C2C12 세포를 1×105/ml 농도로 전극을 포함하는 배양접시(직경 35 mm) 상에 분주하였다. 본 발명에서는 대조군과 3가지 전극조건을 이용하였다(도 2): 대조군(control, electrodeless; 무전극), 양극단독(anodic only), 음극단독(cathodic only) 및 전체 시스템(full set); 양극/음극. 상기 대조군 및 실험군에 대하여 전기자극에 대한 부착성 세포의 반응을 확인하였다. 따라서, 전극과 배양접시 간에 3 mm 간격을 갖는 배양접시를 제작하였다. 초기 배양조건은 2 ml의 배양배지를 이용하여 세포를 덮되 전기적 교점(electrical node)에 닿지 않도록 하였다. 16시간 후, 3 ml의 배양배지를 첨가하여 효소 반응을 위한 전기적 교점을 완전히 덮도록 하였다. 이후 2일, 4일 및 6일에 세포 증식률 분석을 위해 세포를 회수하고 계수하였다.
C2C12 cells were plated at a concentration of 1x10 < 5 > / ml on a culture dish (diameter 35 mm) containing an electrode. In the present invention, a control group and three electrode conditions were used (FIG. 2): control (electrodeless), anodic only, cathodic only and full set; Anode / cathode. The control and experimental groups were tested for adherent cell response to electrical stimulation. Thus, a culture dish having an interval of 3 mm between the electrode and the culture dish was prepared. The initial culture conditions were covered with 2 ml of the culture medium so that they did not touch the electrical nodes. After 16 hours, 3 ml of culture medium was added to completely cover the electrical junction for the enzyme reaction. Cells were then recovered and counted for cell proliferation analysis on days 2, 4, and 6.

EBFC의 다른 조건에 대한 세포 증식 분석을 수행하였다. 배양접시 상에 세포를 1×104/ml 밀도로 분주하고 각기 다른 세기의 전기장을 가하면서 세포를 배양하고 6일까지 매 2일마다 세포 수를 확인하였다. 효소 기반 생물연료 전지 조건의 전기장은 대조군과 비교하여 현저한 세포증식률의 증가를 나타내었다(도 5).
Cell proliferation assays were performed for different conditions of EBFC. Cells were plated on a Petri dish at a density of 1 × 10 4 / ml and the cells were cultured under an electric field of different intensities and the number of cells was checked every 2 days until day 6. The electric field of the enzyme-based biofuel cell condition showed a significant increase in cell proliferation compared to the control (Fig. 5).

실시예Example 6:  6: EBFCEBFC 시스템 상에서On the system 다양한 조직세포로의 분화 Differentiation into various tissue cells

정상 배양배지를 분화배지로 교환하였다. 배지 중의 글루코스를 이용한 전기 화학적 반응을 위하여 분화배지로서 AIM/무혈청 DMEM 2:1 혼합물을 전기적 교점까지 채웠다. 5 내지 6일 후, 배양된 세포를 회수하여 세포 증식 및 분화를 분석하였다. C2C12 세포 분화를 마우스 단클론 항-마이오게닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA) 및 래빗 다클론 항-알파 액티닌 항체(1:100, Santa Cruz Ins., USA)와 같은 특이적 성숙 근육마커(specific mature muscle marker)로 염색하여 공-형광 면역세포화학으로 분석하였다. PCL 나노섬유막 상에 위치한 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 0.5% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 이후 시료를 일차 항체로 4℃에서 밤새도록 표지한 후 10% 고트 혈청으로 30분간 차단하였다. 시료를 PBS로 3회 세척하고 항-알파 액티닌 항체에 대해 알렉사 플루오르 555가 결합된 동키(donkey) 항-래빗 이차 항체(A31572, Alexa Fluor, 1:5000, Invitrogen Biotechnology, USA)와 항-마이오게닌 항체에 대해 FITC가 결합된 고트 항-마우스 이차 항체(SC2012, 1:500, Santa Cruz biotechnology, USA)와 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 형광 발색하도록 하였다. 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하였다. 공초점 현미경(M700 ZESS, Germany)을 사용하여 염색된 세포의 세포 형태를 이미징하였다.
The normal culture medium was replaced with the differentiation medium. AEM / serum-free DMEM 2: 1 mixture was filled to the electrical point of intersection for the electrochemical reaction using glucose in the medium. After 5 to 6 days, the cultured cells were recovered and analyzed for cell proliferation and differentiation. C2C12 cell differentiation was induced by specific antibodies such as mouse monoclonal anti-myogenin antibody (1: 100, Santa Cruz Ins., USA) and rabbit polyclonal anti-alpha actinin antibody (1: 100, Santa Cruz Ins., USA) Were stained with specific mature muscle markers and analyzed by co-fluorescence immunocytochemistry. The cells located on the PCL nanofibrous membrane were fixed with 4% paraformaldehyde and treated with 0.5% Triton X-100 for 10 minutes to have permeability. The samples were then labeled with primary antibody overnight at 4 ° C and blocked with 10% goat serum for 30 minutes. Samples were washed 3 times with PBS and incubated with a donkey anti-rabbit secondary antibody (A31572, Alexa Fluor, 1: 5000, Invitrogen Biotechnology, USA) with Alexa Fluor 555 conjugated to anti- The oogenin antibody was incubated for 1 hour at room temperature with a FITC-conjugated Goat anti-mouse secondary antibody (SC2012, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology, USA) to allow fluorescence color development. The nuclei were stained with DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Confocal microscopy (M700 ZESS, Germany) was used to image the cell morphology of the stained cells.

마우스 마이오게닌, 마이오D(myoD), sarcomeric actin 및 알파 액틴을 이용한 qRT-PCR를 수행하였다. 하기 유전자 번호에 기초하여 각 프라이머를 고안하였다: 마이오게닌(NM_031189.2), 마이오D(NM_010866.2), 골격근(skeletal muscle; NM_009606.2) 및 알파 액틴(NM_033268.4). 각각의 세포 펠렛으로부터 RNA 분리 키트(RNeasy mini kit 74104, Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 토탈 RNA를 분리하였다. Quantitect RT kit(#205311, Qiagen, CA, USA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 40 μl 반응에서 RNA 시료(1 μg)을 cDNA로 역전사하였다. 반응은 95℃에서 5분간 수행하였다. 역전사효소를 포함하지 않는 유사 반응 혼합물을 준비하여 유전체 DNA(genomic DNA) 오염의 부재를 나타내기 위한 주형(template)으로 사용하였다. 선-혼합 PCR 키트(pre-mixed PCR kit, Bioneer, Daejeon, Korea)와 함께 각각 특이적 유전자 프라이머를 사용하여 1 μl cDNA로 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 이후 75℃에서 60초간 35 사이클 수행하였으며, 각 cDNA에 대해 3회 반복하여 수행하였다. PCR 생산물을 2% 아가로스젤 상에 100V로 25분간 전기영동하였다. 소프트웨어 프로그램 Gene tools를 사용하여 시료의 띠세기(band intensity)를 정량하고 내인성 글리세르알데하이드 3-포스페이트 디하이드로게나제(endogenous Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH) 전사물(transcript, GU214026.1)에 대해 정상화하였다.QRT-PCR was performed using mouse myogenin, myoD, sarcomeric actin and alpha actin. Each primer was designed based on the following gene numbers: myogenin (NM_031189.2), myoD (NM_010866.2), skeletal muscle (NM_009606.2) and alpha actin (NM_033268.4). Total RNA was isolated from each cell pellet using an RNA isolation kit (RNeasy mini kit 74104, Qiagen, Valencia, Calif., USA). RNA samples (1 μg) were reverse transcribed with cDNA using a Quantitect RT kit (# 205311, Qiagen, CA, USA) according to the manufacturer's instructions in a 40 μl reaction. The reaction was carried out at 95 ° C for 5 minutes. A similar reaction mixture without reverse transcriptase was prepared and used as a template to indicate the absence of genomic DNA contamination. PCR amplification was carried out with 1 μl cDNA using a specific gene primer together with a pre-mixed PCR kit (Bioneer, Daejeon, Korea). The PCR reaction was carried out for 35 cycles at 95 ° C for 30 seconds, at 60 ° C for 30 seconds, and then at 75 ° C for 60 seconds, and repeated three times for each cDNA. The PCR product was electrophoresed on 2% agarose gel at 100 V for 25 minutes. The band intensities of the samples were quantitated using a software program Gene tools and the endogenous Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) transcript (GU214026.1) Normalized.

항-마이오게닌(5FD; SC52903, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 및 알파-액티닌 항체(SC-15335, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 성숙 골격근마커로서 마이오게닌 및 액티닌 단백질에 대해 웨스턴블롯을 수행하였다. 각기 다른 조건에서 배양한 세포를 회수하고 상용화되는 용해 완충액(lysis buffer, iNtron Biotechnology)로 용해시켰다. 시료 용액을 20 μl 5× 로딩 완충액과 5분간 비등시켰다. 3개의 5 μl 비등시킨 시료를 8% SDS PAGE 젤의 각 웰에 전개시키고, 350 mA에서 2시간 반 동안 니트로셀룰로스(nitrocellulose; NC) 막에 옮겼다. 옮겨진 막을 5% 탈지유(fat free milk) TBST(tris buffer with 0.5% tween-20)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 일차항체를 2% 탈지유 TBST 용액으로 희석하고 이동막(transfer membrane)과 함께 냉장실에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 블롯된 막은 0.5% TBST로 세척하고 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합 항 마우스 이차 IgG와 함께 인큐베이션하고 면역반응성 띠(immunoreactive band)는 ECL 검출 시약(Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop, CA)을 이용하여 검출하였다. 띠 이미징 및 세기 분석은 ImageQuant LAS4000 mini(GE Healthcare, USA)를 이용하여 수행하였다. 웨스턴블롯 분석은 3회 수행하였으며, 측정된 세기는 평균±표준편차(mean±S.D.)로 표기하였다.
Myelogenin (5FD; SC52903, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) and alpha-actinin antibody (SC-15335, 1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, USA) Western blot was performed on nin and actinin proteins. Cells cultured under different conditions were harvested and lysed with lysis buffer (iNtron Biotechnology), which was commercialized. The sample solution was boiled for 5 minutes with 20 μl 5 × loading buffer. Three 5 μl aliquots were developed in each well of an 8% SDS PAGE gel and transferred to a nitrocellulose (NC) membrane at 350 mA for 2.5 hours. The transferred membrane was blocked with 5% fat free milk TBST (tris buffer with 0.5% tween-20) for 1 hour at room temperature. The primary antibody was diluted with 2% skim milk TBST solution and incubated overnight in a refrigerated room with a transfer membrane. The blotted membrane was washed with 0.5% TBST and incubated with horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse secondary IgG and the immunoreactive band was detected with ECL detection reagent (Western Bright ECL, K-12045, Advansta Cop , CA). Band imaging and intensity analysis were performed using an ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare, USA). Western blot analysis was performed 3 times and the measured intensity was expressed as mean ± standard deviation (mean ± SD).

EBFC에 의한 전기장 상에서 성숙 근육 특이적 유전자 및 단백질을 분석하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 먼저, EBFC의 전기자극 상에서 C2C12의 근육분화를 확인하기 위하여 5일 배양 후 성숙 근관형성 및 성숙 근육 특이적 단백질 발현을 분석하였다. 세포를 항-마이오게닌과 알파-액티닌 항체로 동시에 면역염색하여 단백질 국부화 및 근관형성을 형광이미징으로 가시화하여 도 6에 나타내었다. 음극만에 의한 전기자극 및 양극/음극 시스템에 의한 전기자극은 근육성숙마커 단백질로서 마이오게닌 및 알파 액티닌의 강한 발현을 유발하였다. 특히 양극 및 음극 모두에 의한 전기자극은 PCL-겔 나노섬유막 상에서 완전한 근관형성을 나타내었다. 배양 5일에 성숙 근육분화의 모든 마커(MyoD 및 알파 액티닌)은 전기자극 없이 배양한 경우와 비교하여 전기자극을 적용한 경우 PCL-나노섬유막 상에서 보다 강하게 표지되었다(도 6a). 전기자극 없이 동일한 조건 하에서 배양한 경우 막 상에는 양성 염색 세포가 전혀 존재하지 않았다. 모든 마커에 대한 형광세기 수준을 정량하여 양극 자극만을 가하여 배양한 세포에서 보다 음극 자극만을 가한 막 상의 세포에서 현저히 더 강한 형광신호를 나타냄을 확인하였다(도 6a). 나아가 양극 및 음극 자극을 종합적으로 가한 세포는 완전한 근관형성을 나타내었다. 음극만을 가한 그룹은 양극만을 가한 그룹과 대조군에 비해 근관형성이 현저히 증가하였다. 이에 본 발명자들은 EFBC을 이용한 전기자극에 의한 분화를 정량적으로 분석하였다. EBFC를 이용한 전기자극에 의한 마이오게닌, myoD, 골격근육 액티닌 및 알파-액티닌과 같은 성숙 골격근육 특이적 마커의 유전자 발현을 분석하였다. 5일간 스캐폴드 상에서 배양한 C2C12의 mRNA 수준을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. GAPDH 콘트롤에 대해 정규화하여, 음극자극만 및 음극/양극 종합자극에서 모든 유전자 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하였다(도 6b). 특히, 골격 알파 액티닌 유전자 발현은 다른 군에 비해 현저히 더 높았다(약 3배). 음극자극만을 가한 시료에서 골격근육 액티닌의 강한 발현이 나타났다.RT-PCR and Western blotting were performed to analyze mature muscle-specific genes and proteins in the electric field by EBFC. First, in order to confirm the muscle differentiation of C2C12 on the electrical stimulation of EBFC, mature root canal formation and mature muscle specific protein expression were analyzed after 5 days of culture. Cells were immunostained simultaneously with anti-myogenin and alpha-actinin antibodies to visualize protein localization and root canal formation by fluorescence imaging and are shown in FIG. Electrical stimulation only by the cathode and electrical stimulation by the anode / cathode system induced strong expression of myogenin and alpha actinin as muscle maturation marker proteins. In particular, electrical stimulation by both the anode and the cathode showed complete canal formation on the PCL-gel nanofiber membrane. All of the markers of mature muscle differentiation (MyoD and alpha actinin) on day 5 of culture were more strongly labeled on the PCL-nanofibrous membrane when electrical stimulation was applied than when cultured without electrical stimulation (FIG. 6A). When cultured under the same conditions without electric stimulation, no positive staining cells were present on the membrane. The fluorescence intensity level for all the markers was quantified, and it was confirmed that the cells on the membrane with the negative pole stimulus only showed a stronger fluorescence signal than the cells cultured with only the positive pole stimulus (FIG. 6A). Furthermore, the cells with total stimulation of both anodic and cathodic stimuli showed complete root canal formation. Root formation was significantly increased in the negative electrode group compared to the positive electrode group and the control group. Therefore, the present inventors quantitatively analyzed the electrical stimulation using EFBC. We analyzed gene expression of mature skeletal muscle - specific markers such as myogenin, myoD, skeletal muscle actinin and alpha - actinin by electrical stimulation using EBFC. C2C12 mRNA levels cultured on a 5 day scaffold were analyzed using RT-PCR. Normalization for GAPDH control resulted in a significant increase in expression of all genes in negative pole stimulation only and negative pole / positive pole stimulation compared to the control (Fig. 6b). In particular, skeletal alpha-actinin gene expression was significantly higher (about 3-fold) than the other groups. Strong expression of skeletal muscle actinin was observed in the sample with only negative stimulus.

EBFC 전기자극은 PCL-나노검유막 상에서 배양된 C2C12의 유도를 5일간 배양하여 단백질 수준으로 평가하였다. 근육생성 및 알파-액티닌 단백질에 대한 근육세포의 정량을 웨스턴 블롯으로 재확인하였다. 전기자극을 포함하는 PCL 나노섬유막 상에서 배양한 세포는 전기자극 없이 배양한 경우에 비해 현저히 더 높은 단백질 발현을 나타내었다. 양극/음극의 종합적인 전기자극을 가한 경우 MyoD 및 알파-액티닌에 대해 통계적으로 현저한 차이가 관찰되었다. 음극만의 자극은 대조군에 비해 약간의 증가된 근육생성단백질 발현수준을 나타내었다. 알파-액티닌 단백질은 양극자극만 및 음극자극만을 가한 그룹과 대조군 간의 차이가 나타나지 않았다.EBFC electrical stimulation was assessed at the protein level by culturing the induction of C2C12 cultured on PCL-nanogram oil film for 5 days. Muscle production and quantification of muscle cells for alpha-actinin protein were reaffirmed by western blotting. Cells cultured on PCL nanofiber membranes containing electrical stimulation showed significantly higher protein expression than those cultured without electrical stimulation. A statistically significant difference was observed for MyoD and alpha-actinin when a comprehensive electrical stimulation of the anode / cathode was applied. The stimulation of only the negative electrode showed slightly increased level of muscle protein expression compared to the control group. The alpha-actinin protein did not show any difference between the control group and the group that only received the bipolar stimulation and the negative stimulus.

마지막으로, 실시간 PCR을 이용하여 각 조직세포 특이적 유전자의 발현정도를 상대정량하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 전기자극은 전술한 바와 같이 세포사멸을 유도하지 않는 1000 nA 수준에서 변화(0.01 EF, 0.02 EF 및 0.05 EF)시키면서 가하였다. 0.01 EF의 낮은 전기자극에서는 근육세포 특이적인 마이오게닌 및 마이오 D의 발현이 현저하게 향상되었으며, 0.02 EF의 전기자극에서는 골세포 특이적인 OPN 및 ALP의 발현이 현저하게 향상되었다. 한편, 0.02 내지 0.05 EF의 전기자극에서는 신경세포 특이적인 신경미세섬유의 발현이 현저하게 향상되었다. 이로부터, 전술한 바와 일치하게, 상대적으로 낮은 전기자극은 근육세포로의 분화를, 중간정도의 전기자극은 골세포로의 분화를, 세포사멸을 유발하지 않는 범위 내의 중간 내지 높은 수준의 전기자극은 신경세포로의 분화를 유도하는 것을 확인하였다.Finally, the degree of expression of each tissue cell-specific gene was quantitatively determined using real-time PCR, and the result is shown in FIG. Electrical stimulation was applied at a level of 1000 nA (0.01 EF, 0.02 EF, and 0.05 EF) that did not induce apoptosis as described above. In the low electrical stimulation of 0.01 EF, the expression of myogenin and myo D specific to muscle cells was remarkably improved, and the expression of osteoclast - specific OPN and ALP was remarkably improved by electrical stimulation of 0.02 EF. On the other hand, in the electrical stimulation of 0.02 to 0.05 EF, the expression of nerve cell specific nerve microfibrils was remarkably improved. From this, it can be seen from the above that, in accordance with the foregoing, the relatively low electrical stimulation leads to differentiation into muscle cells, the intermediate electrical stimulation leads to differentiation into osteocytes, a medium to high level electrical stimulation Induced differentiation into neurons.

Claims (30)

효소적 생물연료전지의 양극(산화전극, anode), 음극(환원전극, cathode), 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 이용하여 외부로부터 전력공급 없이 세포에 2 nA/cm2 내지 1000 nA/cm2의 전기자극을 가하는 단계를 포함하는 세포의 이동, 분열 또는 분화 조절 방법.
Cm < 2 > to 1000 (g / cm < 2 >) to the cells without external power supply using both the anode (oxidizing electrode, anode), cathode (cathode) nA / cm < 2 > of the cell.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
The cells may be stem cells or myocardial cells, muscle precursor cells and neural progenitor cells including adult stem cells, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells (iPSCs) ≪ RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI >
제1항에 있어서,
상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; Gox), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase), 젖산 산화효소(uricase), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase, HRP), 카탈라아제(catalase), 시토크롬 c(cytochrome c), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase), 마이크로과산화효소(microperoxidase) 및 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
The oxidizing electrode of the enzymatic biofuel cell is composed of glucose oxidase (Gox), glucose dehydrogenase, lactic acid oxidase (uricase), lactate dehydrogenase, galactose oxidase oxidase, cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, formate dehydrogenase, formate dehydrogenase, An enzyme selected from the group consisting of oxalate oxidase, pyruvate dehydrogenase, and membrane-bound hydrogenase,
The reducing electrode of the enzymatic biofuel cell may be selected from the group consisting of bilirubin oxidase (BOD), Laccase, horseradish peroxidase (HRP), catalase, cytochrome c, Wherein the enzyme comprises an enzyme selected from the group consisting of cytochrome oxidase, microperoxidase, and horseradish peroxidase.
제1항에 있어서,
2 nA/cm2 이상 230 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 근육세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Cm < 2 > and less than 230 nA / cm < 2 > to induce differentiation into muscle cells.
제1항에 있어서,
230 nA/cm2 이상 300 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 골세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Cm < 2 > to less than 300 nA / cm < 2 > to induce differentiation into osteocytes.
제1항에 있어서,
300 nA/cm2 이상 500 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 신경세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein an electrical stimulation of 300 nA / cm 2 or more and less than 500 nA / cm 2 is applied to induce differentiation into neural cells.
제1항에 있어서,
500 nA/cm2 이상 1000 nA/cm2 미만의 전기자극을 가하여 심근세포로의 분화를 유도하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Cm < 2 > to less than 1000 nA / cm < 2 > to induce differentiation into cardiomyocytes.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전기자극의 조절은 전극의 효소양을 조절함으로써 달성되는 것인 방법.
9. The method according to any one of claims 5 to 8,
Wherein adjustment of the electrical stimulus is achieved by controlling the amount of enzyme in the electrode.
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 줄기세포의 분화 유도용 조성물.
A composition for inducing differentiation of stem cells comprising an oxidizing electrode of an enzymatic biofuel cell, a reducing electrode, or both an oxidizing electrode and a reducing electrode not connected to each other.
제10항에 있어서,
상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 조성물.
11. The method of claim 10,
The oxidizing electrode of the enzyme biofuel cell may be selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, galactose oxidase, cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, An enzyme selected from the group consisting of dehydrogenase, formate dehydrogenase, oxalate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, and membrane-bound hydrogenation enzyme,
Wherein the reducing electrode of said enzymatic biofuel cell comprises an enzyme selected from the group consisting of bilirubin oxidase, laCase, peroxidase, catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase, microperoxidase and horseradish peroxidase ≪ / RTI >
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는, 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 세포의 이동 또는 증식 촉진용 조성물.
A composition for promoting migration or proliferation of cells, which does not require an external electric power source, including an oxidizing electrode of an enzymatic biofuel cell, a reducing electrode, or both an oxidizing electrode and a reducing electrode not connected to each other.
제12항에 있어서,
상처 부위 주변에 적용하여 상처 부위로의 세포 이동 또는 증식을 촉진시키는 것이 특징인 조성물.
13. The method of claim 12,
Wherein the composition is applied around the wound site to promote cell migration or proliferation to the wound site.
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 구비하여 세포에 전기자극을 가하면서 배양할 수 있는, 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 세포배양용기.
A cell culture vessel that does not require an external electric power source, which is equipped with an oxidizing electrode, an oxidizing electrode, or an oxidizing electrode and a reducing electrode which are not connected to each other and which can be cultivated while applying electrical stimulation to the cell.
제14항에 있어서,
상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 세포배양용기.
15. The method of claim 14,
The oxidizing electrode of the enzyme biofuel cell may be selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, galactose oxidase, cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, An enzyme selected from the group consisting of dehydrogenase, formate dehydrogenase, oxalate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, and membrane-bound hydrogenation enzyme,
Wherein the reducing electrode of the enzymatic biofuel cell comprises an enzyme selected from the group consisting of bilirubin oxidase, laCase, peroxidase, catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase, microperoxidase and horseradish peroxidase Lt; / RTI >
삭제delete 효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 상처 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for treating wounds, comprising an oxidation electrode of an enzymatic biofuel cell, a reduction electrode, or both an oxidation electrode and a reduction electrode not connected to each other.
제17항에 있어서,
상기 효소적 생물연료전지의 산화전극은 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소화효소, 젖산 산화효소, 젖산 탈수소화효소, 갈락토오스 산화효소, 셀로비오스 탈수소화효소, 프락토스 탈수소화효소, 알콜 탈수소화효소, 알데하이드 탈수소화효소, 포름산 탈수소화효소, 옥살산 탈수소화효소, 파이루베이트 탈수소화효소 및 막결합 수소화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하고,
상기 효소적 생물연료전지의 환원전극은 빌리루빈 산화효소, 라케이즈, 퍼록시다이제, 카탈라아제, 시토크롬 c, 시토크롬 산화효소, 마이크로과산화효소 및 호스래디쉬 과산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 효소를 포함하는 것인 약학 조성물.
18. The method of claim 17,
The oxidizing electrode of the enzyme biofuel cell may be selected from the group consisting of glucose oxidase, glucose dehydrogenase, lactate oxidase, lactate dehydrogenase, galactose oxidase, cellobiose dehydrogenase, fructose dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, An enzyme selected from the group consisting of dehydrogenase, formate dehydrogenase, oxalate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, and membrane-bound hydrogenation enzyme,
Wherein the reducing electrode of said enzymatic biofuel cell comprises an enzyme selected from the group consisting of bilirubin oxidase, laCase, peroxidase, catalase, cytochrome c, cytochrome oxidase, microperoxidase and horseradish peroxidase ≪ / RTI >
제17항에 있어서,
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
18. The method of claim 17,
Wherein the composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
제17항에 있어서,
상기 조성물은 경피투여형 제제로 제형화되는 것인 약학 조성물.
18. The method of claim 17,
Wherein the composition is formulated into a transdermal dosage form.
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 근육조직 이상으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating diseases caused by muscle tissue abnormality including both an oxidizing electrode of an enzymatic biofuel cell, a reducing electrode, or both an oxidizing electrode and a reducing electrode not connected to each other.
제21항에 있어서,
상기 근육조직 이상으로 인한 질환은 심근경색(myocardial infarction; MI), 루게릭병(또는 근위축성측삭경화증; amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 국소성(focal), 다소성(multifocal), 분절성(segmental), 반신성(hemidystonia) 또는 전신성(generalized) 근육긴장이상(Dystonia) 및 근이영양증(muscular dystrophy; MD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
22. The method of claim 21,
The diseases caused by the muscle tissue abnormality are myocardial infarction (MI), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), focal, multifocal, segmental, semi-amyotrophic lateral sclerosis Wherein the composition is selected from the group consisting of hemidystonia or generalized dystonia and muscular dystrophy (MD).
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases, which comprises both an oxidizing electrode, an oxidizing electrode, and a reducing electrode of an enzymatic biofuel cell, which are not connected to each other.
제23항에 있어서,
상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 파제트병(Paget disease), 치주질환(periodontal disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 및 골절(fracture)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
24. The method of claim 23,
Wherein said bone disease is selected from the group consisting of osteoporosis, osteomalacia, Paget disease, periodontal disease, rheumatoid arthritis and fracture. Composition.
효소적 생물연료전지의 산화전극, 환원전극 또는 서로 연결되지 않은 산화전극 및 환원전극 모두를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease, comprising an oxidation electrode of an enzymatic biofuel cell, a reduction electrode, or both an oxidation electrode and a reduction electrode not connected to each other.
제25항에 있어서,
상기 신경질환은 간질(epilepsy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 헌팅턴병(Huntington's disease) 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
26. The method of claim 25,
The neurological diseases are selected from the group consisting of epilepsy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, Huntington's disease and Creutzfeldt-Jakob disease. ≪ / RTI >
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