KR101284484B1 - Osteogenesis Differentiations of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 골세포는 골 결손부 시술에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts, the method comprising introducing into the adipose derived mesenchymal stem cells Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix genes by electroporation and culturing them. will be. The bone cells produced by the present invention can be usefully used for bone defect procedures.

Description

지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법 {Osteogenesis Differentiations of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells}Differentiation of Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts {Osteogenesis Differentiations of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells}

본 발명은, 지방유래 중간엽 줄기세포에 전기천공법으로 전사인자 유전자를 도입하여 이를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of introducing a transcription factor gene into adipose derived mesenchymal stem cells by electroporation to differentiate them into bone cells.

최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 방법들이 개발되고 있는데, 그 중 제일 각광을 받고 있는 것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 의한 세포치료이다. Recently, the development of tissue engineering and regenerative medicine has been developing different methods to treat damaged tissues and organs, the most popular of which is the treatment of cells by mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells).

줄기세포(Stem cell)는 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기가 성장하는 일종의 모세포로, 간세포라 불리기도 한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 중간엽 줄기세포와 조혈 줄기세포로 존재한다. Stem cells (Stem cells) are a kind of blast cells that grow different cells or organs that make up the human body, also called hepatocytes. Stem cells include adult stem cells, such as embryonic stem cells that can be made from human embryos, and bone marrow cells that constantly make blood cells. Embryonic stem cells can differentiate into all the cells and tissues that make up the human body, but their use is limited for ethical reasons, while adult stem cells are derived from umbilical cord blood or bone marrow and blood of mature adults. It exists as a cell.

성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다.Adult stem cells are cells that have differentiation flexibility that can differentiate into specific tissues and organs after transplantation in vivo, and can metastasize to cells of other tissues different from the characteristics of the original cells. It is widely used in.

이미 인간과 동물을 대상으로 한 연구에서 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein A.J. et al., Transplantation., 6:230-247, 1968), 최근 연구에서는 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48:913-927, 1999). 최근에는 중간엽 줄기세포로부터 골세포를 분화시키는 방법이 주도적으로 연구되고 있는 실정이다.Already in human and animal studies, bone marrow-derived stem cells from adult stem cells have been differentiated into osteogenic cells (Friedenstein AJ et al., Transplantation., 6: 230-247, 1968). Advances in the differentiation and proliferation of stem cells isolated from bone marrow into osteoblasts have increased the possibility of clinical application (Ohgushi H. et al., J. Biomed Mater Res., 48: 913-927, 1999). Recently, a method for differentiating bone cells from mesenchymal stem cells has been actively studied.

그러나, 자가 골이식은 기본적인 신체의 체력 및 면역력이 저하된 환자로부터 골채취를 하여야 하는바 골채취 부위의 감염, 동통, 혈종과 같은 합병증이 발생할 수 있는 문제점이 있었고, 이를 극복하기 위해 이식거부반응이 없는 공여자로부터 골채취를 하는 것을 고려한다 하더라도 이러한 골수 공여자의 수는 제한적일 수밖에 없는 문제점이 존재한다. 따라서 환자의 다른 신체부위로부터 취한 줄기세포를 골세포로 분화시키기는 방법의 개발이 절실히 요구되어 왔다.
However, autologous bone graft has to be collected from patients whose basic physical strength and immunity are deteriorated. Complications such as infection, pain, and hematoma at the bone collection site may occur. Even if we consider collecting bone from a donor who does not have one, there is a problem that the number of such bone marrow donors is limited. Therefore, there is an urgent need to develop a method for differentiating stem cells taken from other parts of the patient into bone cells.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공하고자 한다.
The present invention is to solve the above problems, to provide a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into bone cells.

따라서 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. Therefore, the present invention provides a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteocytes, including the step of introducing Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix genes into electroporation, and culturing the adipose derived mesenchymal stem cells. to provide.

또한 본 발명은, 상기 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a composition for treating bone injury diseases containing osteoblasts differentiated through the above method.

또한 본 발명은, 상기 방법을 통해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 것을 포함하는 인공 뼈의 제조방법을 제공한다. The present invention also provides a method for producing artificial bone comprising culturing osteoblasts differentiated through the above method in a scaffold of any form.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 뼈를 제공한다.
The present invention also provides an artificial bone produced by the above method.

지방세포는 골수와 달리 환자에게 침습적 요소를 줄이며 줄기세포의 채취가 가능한 부위이고, 환자의 신체 전 범위에 막대한 양이 존재한다. 따라서 지방에서 채취한 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법에 관한 본 발명은 종래 골수로부터 채취한 줄기세포를 골세포로 분화 시키는 방법에 따른 문제들을 해결할 수 있다. 또한 전기천공법으로 유전자를 도입하는 바, 종래의 바이러스 벡터를 사용하는 방법에 비해 이식시 면역 거부반응 및 돌연변이 유발을 현저히 감소시킬 수 있다.
Adipose cells, unlike the bone marrow, reduce the invasive factor to patients and are the areas where stem cells can be harvested, and there is a huge amount in the entire body of the patient. Therefore, the present invention regarding a method for differentiating stem cells collected from fat into osteoblasts can solve problems according to a method for differentiating stem cells collected from bone marrow into osteoblasts. In addition, the introduction of the gene by electroporation can significantly reduce immune rejection and mutagenesis at the time of transplantation compared to the method using a conventional viral vector.

도 1은 제조예 2에 따른 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 제조예 3에 따른 실험 결과 사진이다.
도 3은 제조예 3에 따른 실험 결과 그래프이다.
도 4는 시험예 1에 따른 Runx2 의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 1에 따른 Osterix의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 Runx2 및 Osterix에 대한 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 7은 시험예 2에 따른 ALP의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 시험예 2에 따른 OCN의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9은 시험예 2에 따른 COL1A1의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 시험예 2에 따른 BSP의 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 시험예 3에 따른 OCN, COL1A1, BSP 단백질 발현량에 대한 웨스턴 블랏 결과 사진이다.
도 12는 시험예 3에 따른 ALP 효소 활성을 측정을 위한 알칼리 포스파타아제 염색 결과 사진이다.
도 13은 실험예 4에 따른 알라자린 적색 염색 결과 사진이다.
도 14는 실험예 6에 따른 본 코사 염색 사진이다.
도 15는 실험예 8에 따른 이식 6주 후, 재수거한 이식물에 대한 사진이다.
도 16은 실험예 8에 따른 CT 사진이다.
도 17은 실험예 8에 따른 조직 분석 사진이다. 1 is a schematic diagram of a plasmid according to Preparation Example 2.
2 is a photograph of experimental results according to Preparation Example 3. FIG.
3 is a graph showing experimental results according to Preparation Example 3. FIG.
4 is a graph showing the gene expression level of Runx2 according to Test Example 1.
5 is a graph showing the amount of gene expression of Osterix according to Experimental Example 1.
6 is a Western blot result photograph for Runx2 and Osterix.
7 is a graph showing the amount of gene expression of ALP according to Test Example 2.
8 is a graph showing the gene expression level of OCN according to Test Example 2.
9 is a graph showing the gene expression level of COL1A1 according to Test Example 2.
10 is a graph showing the gene expression level of BSP according to Test Example 2.
11 is a photograph of Western blot results of OCN, COL1A1, BSP protein expression according to Test Example 3.
12 is a photograph of alkaline phosphatase staining results for measuring ALP enzyme activity according to Test Example 3.
FIG. 13 is a photograph of alazarin red staining result of Experimental Example 4. FIG.
14 is a photograph of Cosa stained according to Experimental Example 6. FIG.
FIG. 15 is a photograph of a transplant that was re-collected after 6 weeks of transplantation according to Experimental Example 8. FIG.
16 is a CT photograph according to Experimental Example 8. FIG.
17 is a tissue analysis photograph according to Experimental Example 8. FIG.

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다. The present invention provides a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteocytes, the method comprising introducing the Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix genes into electroporation into the adipose derived mesenchymal stem cells, and culturing them. do.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 지방흡입술 등을 이용해 얻은 지방조직에서, 지방세포, 적혈구, 세포 파쇄물 등을 세척, 여과 등의 방법을 이용하여 분리한 후, 줄기세포 배양용 배지에서 배양함으로써 얻을 수 있다. 상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 분리한 후 2 내지 5 회, 2 내지 4회, 또는 2 내지 3회 계대배양한것을 골형성에 사용하는 것이 분화가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.
In one embodiment of the present invention, the adipose-derived mesenchymal stem cells are isolated from adipose tissue obtained by liposuction, fat cells, erythrocytes, cell debris and the like using a method such as washing, filtration, stem cells It can obtain by culturing in culture medium. Separation of the fat-derived mesenchymal stem cells 2 to 5 times, 2 to 4 times, or 2 to 3 times passaged is preferably used for bone formation in that it differentiates only differentiated stem cells.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 전기천공법으로 유전자를 도입하는 단계에서는, Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자가 도입된 재조합 플라스미드 벡터를 사용하여 이를 마이크로포레이터(Invitrogen)로 1300 내지 1500 볼트, 또는 1350 내지 1430 볼트의 전압을 10 내지 30ms, 또는 15 내지 25ms 로 1 내지 3번, 또는 2번 인가하여 지방유래 중간엽 줄기세포에 원하는 유전자를 도입할 수 있다. In another embodiment of the present invention, in the step of introducing the gene into the electroporation method, Runx2, Osterix, or 1300-1500 volts into the microporator (Invitrogen) using a recombinant plasmid vector into which the Runx2 and Osterix genes are introduced. Alternatively, a desired gene may be introduced into adipose derived mesenchymal stem cells by applying a voltage of 1350 to 1430 volts 1 to 3 times or 10 times to 10 to 30 ms, or 15 to 25 ms.

상기 플라스미드 벡터는 형광물질로 표지되어 이후 유전자 도입 여부를 확인할 수 있도록 하는 것이 좋다. The plasmid vector may be labeled with a fluorescent material so as to confirm whether the gene is introduced thereafter.

Runx2(Runx Domain transcription factor)는 골분화와 깊은 관련이 있으며, 조골세포 분화의 초기 표현형질인 알칼라인포스파테이즈(ALP)와 후기 표현형질인 오스테오칼신(OC)의 발현을 조절하는 중요한 전사인자이다. Runx domain transcription factor (Runx2) is closely related to bone differentiation and is an important transcription factor that regulates the expression of alkaline phosphatase (ALP), an early phenotype of osteoblast differentiation, and osteocalcin (OC), a late phenotype.

Osterix는 Sp7 유전자에 의해 코딩되는 아연집게(zinc finger)구조를 포함하는 전사인자로 이 또한 조골세포 분화에 있어 필수적인 역할을 수행하며, Runx2의 하부 신호전달계에 존재한다. Osterix is a transcription factor that contains a zinc finger structure encoded by the Sp7 gene, which also plays an essential role in osteoblast differentiation and is present in the lower signaling system of Runx2.

이후 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한다. 본 발명에서 상기 형질 도입된 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. Then, the transduced fat-derived mesenchymal stem cells are cultured. As a method for culturing the transgenic fat-derived mesenchymal stem cells in the present invention can be used a known three-dimensional culture method.

이때 배양 배지로는 FBS, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 글리세로포스페이트 및 항생물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 알파-MEM 용액을 사용할 수 있으며, 각각의 양은 FBS 7 내지 12%, 덱사메타손 50 내지 150 nM, 아스코르베이트-2-포스페이트 10 내지 100 mM, 글리세로포스페이트(glycerophosphate) 5 내지 20 mM, 항생물질 0.5 내지 3%가 적당하다. In this case, as a culture medium, an alpha-MEM solution including any one or more substances selected from the group consisting of FBS, dexamethasone, ascorbate-2-phosphate, glycerophosphate, and antibiotics may be used, and the amount of each of FBS 7 to 12%, dexamethasone 50-150 nM, ascorbate-2-phosphate 10-100 mM, glycerophosphate 5-20 mM, antibiotic 0.5-3% are suitable.

이러한 배지는 2~4일 주기로 교체되는 것이 바람직하며, 이때 온도는 36 내지 38℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양하는 것이 좋다. 이러한 조건으로 2주간 배양 후 임의의 형태의 스캐폴드 등에 분주하여 추가 배양을 실시할 수 있다.
This medium is preferably replaced every 2 to 4 days, the temperature is 36 to 38 ℃, it is preferable to culture in the presence of 5% carbon dioxide. Under these conditions, further culture may be performed by dispensing any type of scaffold or the like after the culture for 2 weeks.

본 발명은 또한 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 골손상 질환 치료용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteocytes, the method comprising introducing into the adipose derived mesenchymal stem cells Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix genes by electroporation and culturing them. Provided is a composition for treating bone injury diseases containing osteoblasts differentiated through.

본 발명에 따른 방법으로 생산되는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 골세포는 골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 생산된 골세포를 이용하여 치료할 수 있는 골손상 질환으로는 골절, 골관절염, 골괴사, 외상으로 인한 골 결손 등이 있으나, 이에 한정되지 아니한다. Osteoblasts differentiated from adipose derived mesenchymal stem cells produced by the method according to the present invention can be used as an active ingredient of a cell composition for cell replacement therapy for treating bone damage and the like. Bone injury diseases that can be treated using bone cells produced by the method according to the present invention include, but are not limited to, bone defects due to fracture, osteoarthritis, bone necrosis, trauma.

본 발명에 따른 방법으로 생산된 골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 환부 내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.
The therapeutic composition comprising the osteocytes produced by the method according to the present invention as an active ingredient may be directly injected into the affected part of the patient according to a known method, or may be transplanted with a scaffold after three-dimensional culture. It is desirable to adjust the number of cells to be administered in consideration of various factors such as the severity of the disease, the route of administration, the weight, age and sex of the patient.

또한 본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 것을 포함하는 인공관절의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 인공 뼈를 제공한다.
In another aspect, the present invention provides a method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts, comprising introducing into the adipocyte-derived mesenchymal stem cells Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix gene by electroporation and culturing them. It provides a method for producing artificial joints and artificial bone prepared by the method comprising continuing to culture the osteoblasts differentiated through any type of scaffold (scaffold).

본 발명에 따른 제조방법에 의해 분화된 골세포를 임의의 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공 뼈를 얻을 수 있으며, 이를 이용하여 인공 뼈 또는 골 손상부위나 결손부의 성형에 사용되는 인공 뼈를 제조할 수 있다.
Artificial bones of a certain type can be obtained by using a conventional method of culturing bone cells differentiated by the production method according to the present invention in any type of scaffold, and artificial bones or bone injuries using the same. Or artificial bones used for shaping defects.

[실시예][Example]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

<< 제조예Manufacturing example 1> 지방기원  1> Local origin 중간엽Intermediate lobe 줄기세포의 분리  Isolation of Stem Cells

지방흡입술을 이용해 32세에서 48세 사이의 환자에게서 지방조직을 얻고, 이를 PBS 완충액으로 세척한 후, 1.5 ㎎/㎖ 콜라게나제로 처리하여 눈금 100㎛의 나일론 망으로 걸러냈다. 그 걸러낸 액을 적혈구 용혈 완충액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. Adipose tissue was used to obtain adipose tissue from patients aged between 32 and 48 years, washed with PBS buffer, and then treated with 1.5 mg / ml collagenase to filter out a nylon mesh with a scale of 100 μm. The filtered solution was removed using red blood cell hemolysis buffer.

이를 10% 우태혈청과 1% 항생물질(100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 0.25mg/ml 암포테리신 B; Gibco BRL, Green Island, NY)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)/F-12 배지(Invitrogen/Gibco, Green Island, NY)에서 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후 비접착물질을 제거하기 위해 세포를 PBS로 세척하였다. It is a DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing 10% fetal calf serum and 1% antibiotics (100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin, 0.25 mg / ml amphotericin B; Gibco BRL, Green Island, NY). Incubated in / F-12 medium (Invitrogen / Gibco, Green Island, NY) for 48 hours in the presence of 37 ℃, 5% carbon dioxide. The cells were then washed with PBS to remove nonadhesives.

배양기간 동안, 배지는 한주에 두번 교체되었고, 세포들이 바닥의 80%를 덮을 때 (80% confluence), 1mM EDTA를 포함하는 0.25% 트립신을 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였고, PBS로 세척 후 다시 배양하였다. During the incubation period, the medium was changed twice a week, and when cells covered 80% of the bottom (80% confluence), the cells attached to the bottom were separated using 0.25% trypsin containing 1 mM EDTA and washed with PBS. After culturing again.

2회 계대배양한 후 세포는 90% FBS와 10% DMSO를 포함하는 냉동 보존 배지에서 보관되었다. After two passages the cells were stored in cryopreservation medium containing 90% FBS and 10% DMSO.

<< 제조예Manufacturing example 2> 플라스미드 및 분자  2> plasmids and molecules 클로닝Cloning

사람 Runx2 및 Osterix의 코딩 부위는 TrueORF cDNA Clones(Origene, Rockville, MD) PCR로 각각 증폭되었다. 증폭된 절편은 pECFP(enhanced green fluorescent protein, 녹색형광단백질)-C1 백터(Clontech, Palo Alto, CA)로 클로닝되었다. Coding sites of human Runx2 and Osterix were amplified by TrueORF cDNA Clones (Origene, Rockville, MD) PCR, respectively. The amplified fragment was cloned into pECFP (enhanced green fluorescent protein) -C1 vector (Clontech, Palo Alto, Calif.).

Runx2 의 구조를 만들기 위해, PCR 산물은 pGEM-T 이지 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클로닝되었고, 그 후 pECFP-C1 벡터의 BglⅡ-Pstl 부위에 클로닝되었다. To make the structure of Runx2, PCR products were subcloned into the pGEM-T easy vector (Promega, Madison, Wis.) And then cloned into the BglII-Pstl site of the pECFP-C1 vector.

증폭된 Osterix 부위 또한 pGEM-T 이지 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클로닝되었고, 그 후 pECFP-C1 벡터의 Xhol-Xbal 위치에 클로닝되었다. The amplified Osterix site was also subcloned into the pGEM-T easy vector (Promega, Madison, Wis.) And then cloned into the Xhol-Xbal position of the pECFP-C1 vector.

그 후 DNA 서열분석을 통해 제조된 플라스미드를 검증하였다. Thereafter, the prepared plasmid was verified through DNA sequencing.

제조된 플라스미드의 모식도는 도 1과 같다.
A schematic diagram of the prepared plasmid is as shown in FIG.

<< 제조예Manufacturing example 3>  3> 마이크로포레이터Microporator (( MicroporatorMicroporator ) 이용 지방기원 Use of local origin 중간엽줄기세포에On mesenchymal stem cells 비 바이러스성 형질 주입  Non viral transfection

제조된 지방기원 중간엽줄기세포를 회수하고 이를 PBS로 세척하였다. 상기 세포를 3*105 세포/ml로 재분주 버퍼 R(Invitrogen)에 분주하고 각 유전자 0.5μg와 혼합하였다. 그 후 마이크로포레이터(Invitrogen)를 사용하여 전기천공법을 실시하였다(1400voltage, 20ms, 두번 인가). 전기천공법 실시 후, 상기 세포는 12-웰 플레이트에 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 배양되었다. The resulting fatty origin mesenchymal stem cells were recovered and washed with PBS. The cells were dispensed at 3 * 10 5 cells / ml in redistribution buffer R (Invitrogen) and mixed with 0.5 μg of each gene. Thereafter, electroporation was performed using a microporator (Invitrogen) (1400 voltage, 20 ms, applied twice). After electroporation, the cells were cultured in 12-well plates in the presence of 37 ° C., 5% carbon dioxide.

EGFP-C1의 녹색 형광은 leica DMI 6000B 현미경(Leica Microsystem, Wetzlar, Germany)을 사용하여 시각화되었다. Green fluorescence of EGFP-C1 was visualized using a leica DMI 6000B microscope (Leica Microsystem, Wetzlar, Germany).

형질주입 효율을 정량화하기 위해, 형질 주입 48시간 후 상기 세포는 0.2% 트립신에 회수되고, PBS로 세번 세척되었다. 세척 후, 세포는 차가운 PBS에 재분주되었고, 형질 주입된 세포의 비율이 유동세포계수법(Cytomics FC 500; Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)으로 측정되었다. 네개의 실험군은 다음과 같다. To quantify transfection efficiency, 48 hours after transfection the cells were harvested in 0.2% trypsin and washed three times with PBS. After washing, cells were redistributed into cold PBS and the percentage of transfected cells was measured by flow cytometry (Cytomics FC 500; Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). The four experimental groups are as follows.

실험군 1) 전사인자가 도입되지 않은 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(비교예). Experimental group 1) EGFP-C1 transduced adipose derived mesenchymal stem cells without a transcription factor (Comparative Example).

실험군 2) Runx2 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 1). Experimental group 2) Runx2 gene-induced EGFP-C1 transduced adipose derived mesenchymal stem cells (Example 1).

실험군 3) Osterix 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 2).Experimental group 3) Osterix gene-induced EGFP-C1 transduced adipose derived mesenchymal stem cells (Example 2).

실험군 4) Runx2 및 Osterix 유전자 도입된 EGFP-C1 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포(실시예 3).Experimental group 4) Runx2 and Osterix gene-induced EGFP-C1 transduced adipose derived mesenchymal stem cells (Example 3).

이의 실험 결과를 아래 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2는 유전자 도입의 표지인 녹색 형광을 나타내는 사진이고 도 3은 유전자 도입 비율을 정량화한 그래프이다.
Its experimental results are shown in Figures 2 and 3 below. FIG. 2 is a photograph showing green fluorescence as a marker of gene introduction, and FIG. 3 is a graph quantifying the rate of gene introduction.

<< 제조예Manufacturing example 4> 골세포 분화 4> osteoblast differentiation

골세포로의 분화를 촉진시키기 위해 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포는 특이 유도 배지(10% FBS, 100nM 덱사메타손, 50μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 10mM 글리세로포스페이트 및 1% 항생물질을 포함하는 알파-MEM 용액으로 구성된 골형성 배지, osteogenic medium(OM)) 에서 배양되었다. 상기 세포는 OM에서 최대 2주간 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하에서 12-웰 플레이트에 웰당 3*105 밀도로 배양되었다. 배지는 3일마다 교체되었고, 7일 및 14일 후에 골분화 분석이 수행되었다.
Adipose-derived mesenchymal stem cells transduced to promote differentiation into bone cells were characterized by specific induction medium (10% FBS, 100 nM dexamethasone, 50 μM L-ascorbate-2-phosphate, 10 mM glycerophosphate and 1% antibiotics). It was cultured in osteogenic medium (OM), a bone formation medium consisting of alpha-MEM solution containing. The cells were incubated at 12 * well 5 densities per well in 12-well plates in 37 mM, 5% carbon dioxide in the OM for up to 2 weeks. Medium was changed every 3 days and bone differentiation assays were performed after 7 and 14 days.

<< 실험예Experimental Example 1>  1> RTRT -- PCRPCR

RNA는 RNeasy 키트(Qiagen, Dusseldorf, Germany)를 사용하여 분리되었고, 분리된 RNA 샘플은 cRNA로 역전사 효소와 올리고(dT)프라이머를 사용하여 전환되었다. 모든 PCR은 LightCycler 480 system®(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 및 LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster Mix (Roche Diagnostics)로 수행되었고, 3번씩 반복하였다. RNA was isolated using the RNeasy kit (Qiagen, Dusseldorf, Germany) and the isolated RNA samples were converted to cRNA using reverse transcriptase and oligo (dT) primers. All PCRs were performed with LightCycler 480 system® (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) and LightCycler 480 SYBR Green IMaster Mix (Roche Diagnostics) and repeated three times.

사용된 프라이머 세트는 다음과 같다. The primer set used was as follows.

RUNX2 forward, 5'-TTA CTT ACA CCC CGC CAGTC-3'; reverse, 5'-TAT GGA GTG CTG CTG GTC TG-3'; Osterix forward, 5'-CCC ACC TCA GGC TAT GCT AA-3'; reverse, 5'-CAC TGG GCA GAC AGT CAG AA-3'; BSP forward, 5'-AGA ACC ACT TCC CCA CCT TT-3'; reverse, 5'-AGG TTC CCC GTT CTC ACT TT-3'; ALP forward, 5'-GAC AAG AAG CCC TTC ACT GC-3'; reverse, 5'-AGA CTG CGC CTG GTA GTT GT-3'; OCN forward, 5'-GGC GCT ACC TGT ATC AAT GG-3'; reverse, 5'-TCA GCC AAC TCG TCA CAG TC-3'; COL1A1 forward, 5'-CCC CTG GAA AGA ATG GAG ATG-3'; reverse, 5'-TCC AAA CCA CTG AAA CCT CTG-3'; GAPDH forward, 5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT G-3'; reverse, 5'-TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG G-3'.
RUNX2 forward, 5'-TTA CTT ACA CCC CGC CAGTC-3 '; reverse, 5'-TAT GGA GTG CTG CTG GTC TG-3 '; Osterix forward, 5'-CCC ACC TCA GGC TAT GCT AA-3 '; reverse, 5'-CAC TGG GCA GAC AGT CAG AA-3 '; BSP forward, 5'-AGA ACC ACT TCC CCA CCT TT-3 '; reverse, 5'-AGG TTC CCC GTT CTC ACT TT-3 '; ALP forward, 5'-GAC AAG AAG CCC TTC ACT GC-3 '; reverse, 5'-AGA CTG CGC CTG GTA GTT GT-3 '; OCN forward, 5'-GGC GCT ACC TGT ATC AAT GG-3 '; reverse, 5'-TCA GCC AAC TCG TCA CAG TC-3 '; COL1A1 forward, 5'-CCC CTG GAA AGA ATG GAG ATG-3 '; reverse, 5'-TCC AAA CCA CTG AAA CCT CTG-3 '; GAPDH forward, 5'-ACA TCG CTC AGA CAC CAT G-3 '; reverse, 5'-TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG G-3 '.

<< 실험예Experimental Example 2>  2> 웨스턴Western 블랏Blat

총 단백질을 추출하기 위해서, 세포를 차가운 인산염 완충용액으로 세 번 세척하고, 단백질 분해효소 억제제(Pierce, Rockford, IL)를 포함하는 RIPA(radioimmuno precipitation assay) 완충용액에 용해시켰다. To extract total protein, cells were washed three times with cold phosphate buffer and dissolved in RIPA (radioimmuno precipitation assay) buffer containing protease inhibitors (Pierce, Rockford, IL).

용해물은 15,000g로 10분간 4℃에서 원심분리되고, 그 후 상등액을 0.5M 베타-머캅토에탄올을 포함하는 소듐 도데실 설페이트(SDS) 샘플 완충용액에서 끓였다. 상기 샘플은 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동로 분리되고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨졌으며, 이는 상온에서 5% 무지방 가루우유(BioRad, Hercules, CA)를 함유하고 있는 TBS-T로 처리되었다.The lysate was centrifuged at 15,000 g for 10 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was boiled in sodium dodecyl sulfate (SDS) sample buffer containing 0.5M beta-mercaptoethanol. The samples were separated by 10% sodium dodecyl sulfate (Polyacrylamide) gel electrophoresis and transferred to nitrocellulose membrane, which contained TBS containing 5% nonfat dry milk (BioRad, Hercules, CA) at room temperature. Treated with -T.

상기 막은 Runx2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Osterix(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), BSP(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), OCN(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 및 1형 콜라겐(Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 항체와 함께 0.05% TBS-T(tween-20)를 함유하고 있는 트리스 완충 용액(TBS)에서 하룻밤 동안 배양되었다. GAPDH가 검출 마커로 사용되었다.The membranes include Runx2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), Osterix (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), BSP (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), OCN (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) and type 1 collagen (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) incubated overnight in Tris buffer solution (TBS) containing 0.05% TBS-T (tween-20). GAPDH was used as a detection marker.

2차 항체로, 양고추냉이 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)결합된 쥐 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 토끼 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 염소 IgG에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)가 사용되었다. 막을 TBST로 두번 씻고 2시간동안 적합한 HRP-결합된 이차 항체와 함께 배양하였다. 마지막으로 씻은 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 웨스턴 블롯 분석 검출시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 시각화하였다.As a secondary antibody, horseradish peroxidase (HRP) bound mouse IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), rabbit IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), goat IgG antibody Antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) was used. Membranes were washed twice with TBST and incubated with suitable HRP-bound secondary antibody for 2 hours. After the last wash, visualization was performed with an enhanced chemiluminescence (ECL) western blot assay reagent (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

단백질 띠는 LAS-3000 (version2.1; Fujifilm, Tokyo)을 사용하여 분석하였다. Protein bands were analyzed using LAS-3000 (version2.1; Fujifilm, Tokyo).

결과를 도 6 및 11에 나타내었고, 시험예 1 및 3에서 분석하였다.
The results are shown in FIGS. 6 and 11 and analyzed in Test Examples 1 and 3.

<< 실험예Experimental Example 3> 알칼리 포스파타아제 염색  3> alkaline phosphatase staining

ALP 효소 활성을 정량화하기 위해, 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포는 12-웰 조직배양 플레이트에 분주되고 7일동안 배양된 후, PBS로 두 번 세척되고 10% 포르말린 용액에 10분동안 고정되었다. PBS로 세 번 세척한 후 분화된 세포는 30분 동안 0.1% TritonX-100를 포함하는 PBS에서 투과율이 조절되었다. 그 후 세포는 니트로 블루 테트라졸리움(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트(Sigma Aldrich)로 염색되었다. 결과를 도 12에 나타내었고, 이를 시험예 3에서 분석하였다.
To quantify ALP enzyme activity, transduced adipose derived mesenchymal stem cells were dispensed into 12-well tissue culture plates and incubated for 7 days, then washed twice with PBS and fixed in 10% formalin solution for 10 minutes. . After washing three times with PBS, differentiated cells were controlled in permeability in PBS containing 0.1% TritonX-100 for 30 minutes. Cells were then stained with nitro blue tetrazolium (Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.) and 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate (Sigma Aldrich). The results are shown in FIG. 12, which was analyzed in Test Example 3.

<< 실험예Experimental Example 4>  4> 알리자린alizarin 적색 염색  Red dyeing

세포외부 기질의 칼슘 적층량을 조사하기 위해, 형질 도입된 지방유래 중간엽줄기세포가 12-웰 세포 배양 플레이트에 분주되고 14일 동안 OM에서 배양되었다. 분화된 세포는 PBS로 두번 세척한 후 10% 포르말린 용액에 10분동안 고정되었다. PBS로 세 번 세척한 후 세포는 2% 알리자린 레드 용액 (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)으로 10분간 염색되었다. 결과를 도 13에 나타내었다. 이를 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3 모두 비교예보다 칼슘 적층량이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
To investigate calcium deposits of extracellular matrix, transduced adipose derived mesenchymal stem cells were dispensed into 12-well cell culture plates and incubated in OM for 14 days. Differentiated cells were washed twice with PBS and then fixed in 10% formalin solution for 10 minutes. After washing three times with PBS, cells were stained with 2% alizarin red solution (Junsei Chemical, Tokyo, Japan) for 10 minutes. The results are shown in Fig. Referring to this, it could be confirmed that the amount of calcium lamination was increased in all of Examples 1 to 3 than the comparative example.

<< 실험예Experimental Example 5>  5> PLGAPLGA 스캐폴드Scaffold 제조 및 인 비트로 배양  Manufacture and in vitro culture

다공성의 폴리-락틱-코-글리콜릭산(PLGA) 스캐폴드를 제조하기 위해, PLGA(1g)을 메틸렌 클로라이드에 10%(w/v) 농도로 용해시킨 후, 염화나트륨 입자 (19g, 직경= 150 내지 300 μm; Sigma Aldrich)를 폴리머 용액에 가하였다. 상기 혼합액을 테플론 몰드에 가하여 스캐폴드를 제조하였다. To prepare a porous poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA) scaffold, PLGA (1 g) was dissolved in methylene chloride at a concentration of 10% (w / v), followed by sodium chloride particles (19 g, diameter = 150 to 300 μm; Sigma Aldrich) was added to the polymer solution. The mixed solution was added to a Teflon mold to prepare a scaffold.

형질 도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포는 알파-MEM에 1*106 세포의 농도로 분주되고 1ml 시린지를 사용하여 상기 PLGA 스캐폴드(5mm 내부 직경, 2mm 높이)에 도입되었다. 상기 세포는 4시간 동안 37℃에서 배양되어 스캐폴드에의 접착이 유도되었고, 스캐폴드에 접착된 세포는 14일동안 OM에서 배양되었다. Transduced adipocyte-derived mesenchymal stem cells were dispensed at a concentration of 1 * 10 6 cells in alpha-MEM and introduced into the PLGA scaffold (5 mm inner diameter, 2 mm height) using a 1 ml syringe. The cells were incubated at 37 ° C. for 4 hours to induce adhesion to the scaffold, and cells adhered to the scaffold were incubated in OM for 14 days.

14일 후, 샘플은 4% 파라포름알데하이드로 고정되었고, 칼슘 손실 없이 4μm 두께로 가로 분획된 파라핀에 끼워 본 코사(von Kossa) 염색으로 분석하였다.
After 14 days, samples were fixed with 4% paraformaldehyde and analyzed by von Kossa staining on paraffin transversely partitioned to 4 μm thickness without calcium loss.

<< 실험예Experimental Example 6> 본  6> Pattern 코사Cosa (( vonvon KossaKossa ) 염색) dyeing

상기 분획은 증류수로 파라핀이 제거되고, 수화되고, 헹궈졌다. 그 후 분획은 1% 은 니트레이트 용액(SigmaeAldrich)에 배양되었고, 이에 20분간 자외선을 조사하였다. The fraction was distilled off with paraffin, hydrated and rinsed. The fractions were then incubated in 1% silver nitrate solution (SigmaeAldrich), which was irradiated with ultraviolet light for 20 minutes.

증류수로 수 회 씻은 후, 고정화되지 않은 은은 5% 소듐 티오설페이트(SigmaeAldrich)로 5분간 제거되었다. 헹군 후, 상기 분획은 5분간 nuclear fast red로 대조염색되었다. After washing several times with distilled water, the unimmobilized silver was removed for 5 minutes with 5% sodium thiosulfate (SigmaeAldrich). After rinsing, the fractions were counterstained with nuclear fast red for 5 minutes.

결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 3 모두 비교예보다 무기물화(mineralization)가 증가된 것을 확인할 수 있었다.
The results are shown in FIG. Referring to FIG. 14, in Examples 1 to 3, it was confirmed that mineralization was increased compared to the comparative example.

<< 실험예Experimental Example 7>  7> ASCASC -- PLGAPLGA 스캐폴드Scaffold 접합  join InIn vivovivo 이식  transplantation

Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix로 형질도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포는 1*10-6 밀도로 PLGA 스캐폴드에 분주되었다. 세가지 대조군이 사용되었는데, 이는 다음과 같다. Runx2, Osterix, or Runx2 and transduced into Osterix fat cell-derived mesenchymal stem cells were dispensed in PLGA scaffolds to 1 * 10-6 density. Three controls were used, as follows.

1) 분주된 세포 없는 PLGA 스캐폴드 1) PLGA scaffold without aliquoted cells

2) 지방세포 유래 중간엽줄기세포 분주된 PLGA2) Adipocyte derived mesenchymal stem cells divided PLGA

3) EGFP-C1 형질도입된 지방세포 유래 중간엽줄기세포 분주된 PLGA
3) EGFP-C1 transduced adipocyte derived mesenchymal stem cells dispensed PLGA

따라서 총 3개의 실시예[Runx2(실시예 1), Osterix(실시예 2), 또는 Runx2 및 Osterix(실시예 3)]과 상기 3개의 대조군을 대상으로 실험이 수행되었다.
Therefore, a total of three examples (Runx2 (Example 1), Osterix (Example 2), or Runx2 and Osterix (Example 3)) and the three controls were performed.

30마리의 누드 마우스(7주령, 암컷, 오리엔트바이오, 한국), 120-150g가 zoletile(50 mg/kg)과 xylazine (4.5 mg/kg)로 마취되었고 상기 지방세포 유래 간엽줄기세포가 분주된 스캐폴드가 등 피하조직에 이식되었다.
Thirty nude mice (7 weeks old, female, Orient Bio, Korea), 120-150 g were anesthetized with zoletile (50 mg / kg) and xylazine (4.5 mg / kg), and the adipocyte-derived mesenchymal stem cells were divided. Folds were implanted into the dorsal subcutaneous tissue.

<< 실험예Experimental Example 8> 뼈 형성 분석 8> Bone Formation Analysis

이식 6주 후, 이식물이 재수거되었고, 이를 10% 포스페이트-완충용액- 포름알데하이드 용액에 고정하였다. 뼈 형성은 CT(computed tomography) 및 조직 분석법으로 분석되었다. After 6 weeks of implantation, the implants were re-collected and fixed in 10% phosphate-buffer-formaldehyde solution. Bone formation was analyzed by computed tomography (CT) and tissue analysis.

CT 영상은 마이크로 CT시스템(SkyScan-1172; Skyscan, Kontich, Belgium)으로 획득되었고, 뼈 형성 면적은 광학 현미경과 이미지 분석 시스템(KS400; Zeiss, Munich, Germany) 을 사용하여 측정하였다. CT images were acquired with a micro CT system (SkyScan-1172; Skyscan, Kontich, Belgium), and bone formation areas were measured using an optical microscope and an image analysis system (KS400; Zeiss, Munich, Germany).

상기 영상 획득 후, 샘플은 포르말린에 고정되었고, 4μm 두께로 가로 분획된 파라핀에 끼워 헤마토자일린 및 에오신(HE) 및 Masson's trichrome 염색으로 조직 분석을 수행하였다. After the image acquisition, the sample was fixed in formalin, and the tissue was analyzed by hematoxylin and eosin (HE) and Masson's trichrome staining by inserting into 4 μm-thick paraffin.

결과를 도 15 내지 17에 나타내었다. The results are shown in FIGS. 15 to 17.

도 15는 이식 6주 후, 재수거한 이식물에 대한 사진이며, 도 16은 이의 CT 사진, 도 17은 조직 분석 사진이다. FIG. 15 is a photograph of the transplant that was re-collected after 6 weeks of transplantation, FIG. 16 is a CT photograph thereof, and FIG. 17 is a tissue analysis photograph.

도 16을 참조하면, 대조군 1은 무기물 침적을 거의 관측할 수 없었으며, 대조군 2 및 대조군 3도 단지 산발적인 무기물 침적을 보였다. 그러나 실시예 1 내지 실시예 3에서는 다량의 무기물 침적을 관측할 수 있었다. Referring to FIG. 16, the control group 1 could hardly observe the mineral deposition, and the control group 2 and the control group 3 also showed only sporadic mineral deposition. However, in Examples 1 to 3, a large amount of inorganic deposits could be observed.

도 17을 참조하면, 대조군 1에서는 염증 세포와 혈관의 침입을 관측할 수 있었고, 대조군 2 및 대조군 3에서는 부분적인 뼈 형성을 관측할 수 있었다. 그러나 실시예 1 내지 3에서는 뼈 기질이 형성된 것을 뚜렷하게 관측할 수 있었다.
Referring to FIG. 17, invasion of inflammatory cells and blood vessels was observed in the control group 1, and partial bone formation was observed in the control group 2 and the control group 3. However, in Examples 1 to 3, it was clearly observed that the bone matrix was formed.

<< 시험예Test Example 1>  1> Runx2Runx2 및  And OsterixOsterix 유전자 발현량 및 단백질 발현량 조사  Investigation of gene expression and protein expression

RT-PCR을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포(비교예, 실시예 1 내지 실시예 3)의 배양시작 7일 14일 후 Runx2 및 Osterix 유전자 발현량을 조사한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. The results of examining the expression levels of Runx2 and Osterix genes 7 days and 14 days after the start of culture of adipose derived mesenchymal stem cells (Comparative Examples, Examples 1 to 3) through RT-PCR are shown in FIGS. 4 and 5.

도 4를 참조하면, Runx2의 mRNA는 배양 7일 후에 Runx2 유전자 도입에 의해 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 Runx2 유전자만을 도입한 실시예 1에서 대조군의 660 배 이상으로 현저한 효과가 나타났다. 이러한 효과는 배양 14일 후까지 지속되었으며, Osterix 만을 도입한 군에서도 Runx2 의 유전자 발현 증가가 관찰되었다. Referring to FIG. 4, it was found that the mRNA of Runx2 was significantly increased compared to the control by the introduction of Runx2 gene after 7 days of culture. In particular, in Example 1 where only the Runx2 gene was introduced, the effect was more than 660 times of the control. Appeared. This effect lasted up to 14 days after culture, and increased expression of Runx2 was observed even in the Osterix-only group.

도 5를 참조하면, Osterix의 mRNA는 배양 7일 후에 Osterix 유전자 도입에 의해 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하는 것을 알 수 있었고, 특히 Osterix 유전자만을 도입한 실시예 2에서 대조군의 7500 배 이상으로 현저한 효과가 나타났다.
Referring to FIG. 5, it can be seen that the mRNA of Osterix is significantly increased compared to the control by the introduction of the Osterix gene after 7 days of culture. Appeared.

웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현량을 조사한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6을 참조하면, 배양 후 7일째에 Runx2 와 Osterix 단백질 발현은 Runx2, Osterix 유전자 도입에 의해 현저하게 증가한 것을 알 수 있었다. 특히, Osterix 단백질은 Runx2 유전자만을 도입한 경우에도 현저히 발현이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
The result of examining the amount of protein expression through Western blot is shown in FIG. 6. Referring to FIG. 6, it was found that the expression of Runx2 and Osterix proteins was significantly increased by the introduction of Runx2 and Osterix genes at 7 days after culture. In particular, Osterix protein was found to significantly increase expression even when only the Runx2 gene was introduced.

<< 시험예Test Example 2> 2> 골형성Osteogenesis 표지자인Marker ALPALP , , OCNOCN , , COL1A1COL1A1 , , BSPBSP 유전자 발현량 조사 Gene expression level investigation

RT-PCR을 통해 지방유래 중간엽 줄기세포(비교예, 실시예 1 내지 실시예 3)의 배양시작 7일 14일 후 골형성 표지자인 ALP, OCN, COL1A1 및 BSP 유전자 발현량을 조사한 결과를 도 7 내지 도 10에 나타내었다. The results of investigating the expression levels of ALP, OCN, COL1A1 and BSP genes, which are bone formation markers, 7 days and 14 days after initiation of adipose derived mesenchymal stem cells (Comparative Examples, Examples 1 to 3) through RT-PCR 7 to 10 are shown.

도 7은 ALP에 대한 배양 7일, 배양 14일 후의 mRNA 발현량 조사 결과이다. 배양 7일에는 유전자 도입에 따라 ALP유전자 발현이 증가되는 것으로 나타났으나, 이러한 효과는 배양 14일 후까지 유지되지 않았다. Figure 7 shows the result of mRNA expression level after 7 days of culture and 14 days of culture for ALP. At 7 days of culture, the expression of ALP gene was increased with the introduction of the gene, but this effect was not maintained until 14 days after the culture.

도 8은 OCN, 도 9는 COL1A1, 도 10은 BSP에 대한 배양 7일, 배양 14일 후의 mRNA 발현량 조사 결과이다. 각각 배양 7일에는 유전자 도입에 따라 유전자 발현이 증가되었고, 이러한 효과는 배양 14일 후까지 유지되는 것으로 나타났다.
FIG. 8 shows OCN, FIG. 9 shows COL1A1, and FIG. 10 shows the result of mRNA expression levels after 7 days of culture and 14 days of culture for BSP. On the 7th day of each culture, gene expression increased with the introduction of the gene, and this effect was shown to be maintained until 14 days after the culture.

<< 시험예Test Example 3> 3> ALPALP , , OCNOCN , , COL1A1COL1A1 , , BSPBSP 의 단백질 발현량 조사 Protein expression levels

OCN, COL1A1, BSP의 단백질 발현량 조사를 위해 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다. Western blot was performed to investigate protein expression levels of OCN, COL1A1, and BSP, and the results are shown in FIG. 11.

도 11을 참조하면, 배양 7일 후 실시예 1 내지 실시예 3의 지방유래 중간엽 줄기세포의 OCN, COL1A1, BSP 단백질 발현량은 대조군에 비해 증가되었고, 이러한 현상이 배양 14일 후까지 유지됨을 알 수 있었으며, 특히 실시예 3의 경우 OCN 단백질 발현량이 배양 14일 후 현저히 증가됨을 알 수 있었다.
Referring to FIG. 11, after 7 days of culture, OCN, COL1A1, and BSP protein expression levels of the adipose-derived mesenchymal stem cells of Examples 1 to 3 were increased compared to the control group, and this phenomenon was maintained until 14 days after the culture. In particular, in the case of Example 3, the amount of OCN protein expression was significantly increased after 14 days of culture.

ALP 효소 활성을 측정을 위해 배양후 7일 경과한 세포에 대해 알칼리 포스파타아제 염색을 수행하였고 그 결과를 도 12에 나타내었다. Alkaline phosphatase staining was performed on cells 7 days after culture to measure ALP enzyme activity, and the results are shown in FIG. 12.

도 12를 참조하면, 실시예 1 내지 3 모두 비교예보다 ALP활성이 증가되었고, 특히 실시예 1 및 실시예 3의 경우 더 우수하게 나타남을 알 수 있었다.
Referring to FIG. 12, ALP activity was increased in all of Examples 1 to 3 than in Comparative Examples, and in particular, Examples 1 and 3 showed better results.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Having described the specific parts of the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. will be. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (6)

지방유래 중간엽 줄기세포에 Runx2, Osterix, 또는 Runx2 및 Osterix 유전자를 전기천공법으로 도입하는 단계 및 이를 배양하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
A method of differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteocytes, the method comprising introducing into the adipocyte-derived mesenchymal stem cells Runx2, Osterix, or Runx2 and Osterix genes by electroporation and culturing them.
제1항에 있어서, 상기 전기천공법으로 도입하는 단계는,
1300 내지 1500 볼트의 전압을 10 내지 30ms 로 1 내지 3번 인가하는 단계를 포함하는 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
According to claim 1, The step of introducing into the electroporation method,
A method for differentiating adipose derived mesenchymal stem cells into osteoblasts, comprising applying a voltage of 1300 to 1500 volts 1 to 3 times in 10 to 30 ms.
제1항에 있어서, 배양 배지는 FBS, 덱사메타손, 아스코르베이트-2-포스페이트, 글리세로포스페이트 및 항생물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 포함하는 알파-MEM 용액인 것인 지방유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 방법.
2. The fat-derived mesenchyme of claim 1, wherein the culture medium is an alpha-MEM solution comprising any one or more substances selected from the group consisting of FBS, dexamethasone, ascorbate-2-phosphate, glycerophosphate and antibiotics. How to differentiate stem cells into bone cells.
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