KR101772428B1 - 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출 센서 및 검출 방법 - Google Patents

감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출 센서 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 감마-글루타밀회로(γ-glutamyl cycle)에서 감마 글루타밀 전이효소가 글루탐산과 반응하는 것을 이용하여 다양한 유도체를 고안함에 따라, 형광 탐침 화합물을 검출 센서로 활용하여 생체 외 또는 생체 내에서 감마 글루타밀 전이효소를 모니터링함으로써 감마-L-글루타밀-L-시스테닐글라이신에 의해 발생되는 질병을 진단하고 세포의 활동 과정을 분자수준에서 밝혀내기 위한 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 생체 외(ex vivo) 혹은 생체 내(in vivo)에서 감마 글루타밀 전이효소와 반응하는 조성물을 제조함으로써, 이를 감마 글루타밀이 발현되는 암의 치료에 있어서 진단 및 치료작용을 시각화할 수 있는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 탐침으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출 센서 및 검출 방법{Composition for detecting γ-glutamyl transferase, detection probe comprising thereof and method of detecting}
본 발명은 감마 글루타밀 전이효소(γ-glutamyl transferase; GGT) 검출용 조성물, 이를 포함하는 검출 센서 및 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글루탐산을 함유하는 유도체 감마 글루타밀 전이효소를 생체 외(ex vivo) 및 생체 내(in vivo)에서 검출하기 위한 검출용 조성물과 그 제조 방법, 검출용 조성물을 포함하는 검출 센서 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.
생체 내에서 산화환원간의 항상성(Redox Homeostasis; T. P. Dalton, H. G. Shertzer and A. Puga, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1999, 39, 67), 세포성장(cellulargrowth; Z. A. Wood, E. Schroeder, J. R. Harris and L. B. Poole, TransBiochem.Sci., 2003, 28, 32) 과정에 관여하며, 또한 암, 에이즈(AIDS) (D. M. Townsend, K. D. Tew and H. Tapiero, Biomed.Pharmacother., 2003, 57, 145) 등의 역할에 관여하는 감마-L-글루타밀-L-시스테닐글라이신은 감마-글루타밀회로(γ-glutamyl cycle)에 의해 생합성된다. 이 생합성 과정 중 감마글루타밀전이효소가 사용된다(C. Schafer, C. Fels, M. Brucke, H-J. Holzhausen, H. Bahn, M. Wellman, A. Visvikis, P. Fischer, ; N.G. Rainov, Acta Oncologica 2001, 40, 529). 이러한 이유로 암 세포에는 다른 정상 세포에 비해 많은 감마 글루타밀 전이효소가 존재한다. 따라서 세포 내 감마 글루타밀 전이효소를 모니터링 하는 것은 감마-L-글루타밀-L-시스테닐글라이신이 생합성 되는 과정 중 하나를 검출하는 것이므로 암 질병의 초기진단 및 세포의 활동 과정을 분자수준에서 밝혀내는데 많은 기여를 할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적에 따라 감마 글루타밀 전이효소를 검출하기 위한 유기화합물을 합성하고, 이를 형광 탐침 화합물로 이용하여 생체 외 및 생체 내에서 감마 글루타밀 전이효소를 검출해낼 수 있는 센서로 활용하며, 이를 활용하는 검출 방법을 제시하였다.
관련 종래기술로는 한국등록특허 제10-1476639호(2014.12.19.) 등이 있다.
본 발명의 목적은, 감마-글루타밀회로(γ-glutamyl cycle)에서 감마 글루타밀 전이효소가 글루탐산과 반응하는 것을 이용하여 다양한 유도체를 고안함에 따라, 형광 탐침 화합물을 검출 센서로 활용하여 생체 외 또는 생체 내에서 감마 글루타밀 전이효소를 모니터링함으로써 감마-L-글루타밀-L-시스테닐글라이신에 의해 발생되는 질병을 진단하고 세포의 활동 과정을 분자수준에서 밝혀내기 위한 검출 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물을 제공한다:
<화학식 1>
Figure 112015031434106-pat00001
식 중, Y는 하기 화학식 2의 기 내지 화학식 5의 기일 수 있다(하기 화학식 2 내지 5의 기에서, X1 내지 X4는 독립적으로 이소프로필리덴, 황 원자 또는 산소 원자 또는 이미노기이고; X5는 산소 원자 또는 이미노기이고; R1 내지 R4는 독립적으로 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 케톤기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 에스테르기, C5 내지 C24의 치환 또는 비치환된 아릴기 또는 C6 내지 C24의 아릴알킬기이고;
Figure 112015031434106-pat00002
은 상기 화학식 1의 화합물에 결합되는 결합(bond)를 나타낸다).
<화학식 2>
Figure 112015031434106-pat00003
<화학식 3>
Figure 112015031434106-pat00004
<화학식 4>
Figure 112015031434106-pat00005
<화학식 5>
Figure 112015031434106-pat00006
상기 화학식 1은
2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨;
(S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄;
(S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨;
(S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨; 및
(S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서와 진단 대상인 세포 또는 조직을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 접촉된 검출 센서와 진단 대상의 반응으로부터 발현되는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 생체 외(ex vivo) 혹은 생체 내(in vivo)에서 감마 글루타밀 전이효소와 반응하는 조성물을 제조함으로써, 이를 감마 글루타밀이 발현되는 암세포의 치료에 있어서 진단 및 치료작용을 시각화할 수 있는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 탐침으로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시예 15의 표제화합물과 GGT와의 생체 외 결합특성을 UV 데이터 변화를 통하여 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 화합물과 각기 다른 양의 GGT와의 결합 특성을 형광 반응으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 화합물이 GGT와 반응하여 얻어지는 화합물에 대하여 다양한 pH에서 안정성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 참조예 1에서 제조된 표제화합물의 UV 데이터를 측정하여 시험예 1에서 측정된 UV 데이터와 대조한 결과이다.
도 5는 GGT 검출반응 메커니즘의 모식도이다.
도 6은 본 발명에 따른 화합물과 GGT와의 결합 특성을 실제 쥐의 대장에서 분석한 결과를 나타낸다((A) AOM/DSS 쥐 모델의 대장; (B) 정상 쥐의 대장).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되며 Y를 하기 화학식 2의 기 내지 화학식 5의 기인 것으로 하는 화합물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물을 제공한다(하기 화학식 2 내지 5의 기에서, X1 내지 X4는 독립적으로 이소프로필리덴, 황 원자 또는 산소 원자 또는 이미노기이고; X5는 산소 원자 또는 이미노기이고; R1 내지 R4는 독립적으로 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 케톤기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 에스테르기, C5 내지 C24의 치환 또는 비치환된 아릴기 또는 C6 내지 C24의 아릴알킬기이고;
Figure 112015031434106-pat00007
은 상기 화학식 1의 화합물에 결합되는 결합(bond)를 나타낸다).
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨;
(S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄;
(S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨;
(S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨; 및
(S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서와 진단 대상인 세포 또는 조직을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 접촉된 검출 센서와 진단 대상의 반응으로부터 발현되는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
상기 화학식 1로 표시되며 Y를 화학식 2의 기인 것으로 하는 화합물은 공지의 방법(T. Gorecki, G. Patonay and L. Strekowski, J. Heterocyclic. Chem., 1996, 33: 1871.)에 따라 제조될 수 있으며, 하기 화학식 6의 구조를 갖는 2-((E)-2-((E)-2-크로로-3-((Z)-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리덴)에틸덴)싸이클로헥-1-에닐)비닐-1,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 아이오다이드와 대응하여 치환된-티올과 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
<화학식 6>
Figure 112015031434106-pat00008
상기 화학식 1로 표시되며 Y를 화학식 3의 기인 것으로 하는 화합물은 하기 화학식 7의 구조를 갖는 2-(2-메틸-4H-크로멘-4-이리덴)말로노니트릴과 알돌 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
<화학식 7>
Figure 112015031434106-pat00009
상기 화학식 1로 표시되며 Y를 화학식 5의 기인 것으로 하는 화합물은 공지의 방법(W. Sun, J. Fan, C. Hu, J. Cao, H. Zhang, X. Xiong, J. Wang, S. Cui, S. Sun, X. Peng, Chem. Commun 2013, 49: 3890.)에 따라 제조될 수 있다.
상기 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서는 (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-2,2,2-트리플루오로아세테이트인 것이 가장 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. (S)-1-tert-부틸 5-(2,5-다이옥쏘피롤리딘-1-일-) 2-(tert-부토옥시카보닐아미노)펜탄다이에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00010
둥근바닥 플라스크에 1(S)-5-tert-부톡시-4-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-옥쏘펜타노익 엑시드 0.05g과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이마이드 0.035g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 0 ℃에서 1-하이드로시피롤리딘2,5-다이온 0.021g을 넣고, 4시간동안 같은 온도에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥센 = 1/2, v/v)로 정제하여 2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S)-1-tert-부틸 5-(2,5-다이옥쏘피롤리딘-1-일-) 2-(tert-부토옥시카보닐아미노)펜탄다이에이트를 제조하였다.
수율: 60 %
1H NMR (CDCl3,400MHz): δ 5.17 (s, 1H), 4.27 (s, 1H), 2.86 (s, 4H), 2.82-2.64 (m, 2H), 2.35-2.26 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.50 (s, 9H), 1.47 (s, 9H).
실시예 2. (S)-tert-부틸 2-(털트-부토시카보닐아미노)-5-(2-멀캅토에틸아미노)-5-옥쏘펜타노에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00011
둥근바닥 플라스크에 시스테아민 0.013g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시키고 트리에틸아민 13 μL를 넣어주었다. 상기 용액에 0 ℃에서 (S)-1-tert-부틸 5-(2,5-다이옥쏘피롤리딘-1-일-) 2-(tert-부토옥시카보닐아미노)펜탄다이에이트 0.03g을 넣고, 3시간 동안 같은 온도에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥센 = 1/1, v/v)로 정제하여 2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S)-tert-부틸 2-(털트-부토시카보닐아미노)-5-(2-멀캅토에틸아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다.
수율: 63 %
1H NMR (CDCl3,400MHz): δ 6.73 (s, 1H), 5.28 (d, 1H, J=7.6), 4.21-4.15 (m, 1H), 3.53-3.00 (m, 2H), 2.72-2.66 (m, 2H), 2.29 (t, 2H, J=8), 2.21-2.13 (m, 1H), 1.91-1.81 (m, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.45 (s, 9H).
실시예 3. 2-((E)-2-((S)-5-tert-부톡시-4-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H)-인덴-2(3H)-이리덴)에틸리덴)싸이클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 아오디드의 제조
Figure 112015031434106-pat00012
둥근바닥 플라스크에 2-((E)-2-((E)-2-크로로-3-((Z)-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리덴)에틸덴)싸이클로헥-1-에닐)비닐-1,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 아이오다이드 0.30g와 (S)-tert-부틸 2-(털트-부토시카보닐아미노)-5-(2-멀캅토에틸아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.23g을 넣고, 에탄올 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 트리에틸아민 0.1ml를 넣고, 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 용액의 색이 청색이 된 후 TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 디클로로메탄/메탄올 = 10/1, v/v)로 정제하여 2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 2-((E)-2-((S)-5-tert-부톡시-4-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H)-인덴-2(3H)-이리덴)에틸리덴)싸이클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 아오디드를 제조하였다.
수율: 86 %
1H NMR (CDCl3,400MHz): δ 8.86 (d, 2H, J= 14 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.42-7.38 (m, 4H), 7.25 (t, 2H, J= 7.6 Hz), 7.10 (d, 2H, J= 7.6 Hz), 6.17 (d, 2H, J= 14 Hz), 5.63 (d, 1H, J= 8.0 Hz), 4.10-4.05 (m, 1H), 3.67 (s, 6H), 3.46-3.40 (m, 2H), 3.10-3.05 (m, 2H), 2.70 (t, 4H, J= 5.6 Hz), 2.41-2.27 (m, 2H), 2.10-1.86 (m, 4H), 1.78 (s, 12H), 1.43 (s, 9H), 1.41 (s, 9H).
실시예 4. 2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00013
둥근바닥 플라스크에 2-((E)-2-((S)-5-tert-부톡시-4-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H)-인덴-2(3H)-이리덴)에틸리덴)싸이클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 아오디드 0.05g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 아니졸 1mL, 트리플루오로아세트산 1mL를 넣고, 4시간 동안 상온에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 다이에틸에테르로 재결정하여 정제하여 표제화합물인 2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트를 제조하였다.
수율: 84 %
1H NMR (DMSO-d 6,400MHz): δ 8.73 (d, 2H, J= 14 Hz), 8.16 (s, 1H), 7.85 (s, 3H), 7.64 (d, 2H, J= 7.2 Hz), 7.47-7.40 (m, 4H), 7.28 (t, 2H, J= 7.6 Hz) 6.29 (d, 2H, J= 14 Hz), 3.68 (s, 6H), 3.28-3.23 (m, 3H), 2.86 (t, 2H, J= 7.2 Hz), 2.70-2.66 (m, 4H), 2.30-2.16 (m, 2H), 1.99-1.78 (m, 4H), 1.70 (s, 12H).
실시예 5. (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(하이드로시메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00014
둥근바닥 플라스크에 1(S)-5-tert-부톡시-4-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-옥쏘펜타노익 엑시드 3.034g과 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이마이드 1.92g 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 25mL를 가하여 0 ℃에서 용해시키고 1 시간 동안 같은 온도에서 반응시켰다. 상기 용액에 4-아미노벤질 알코올 1.21g을 넣고, 12시간 동안 0 ℃에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥센/메탄올 = 1/2:0.5, v/v)로 정제하여 (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄 2,2,2,-트리플루오로아세테이트, (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트, (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 및 (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(하이드로시메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다.
수율: 81 %
1H NMR (CDCl3,400MHz): δ 7.54 (d, 2H, J= 8.4 Hz), 7.31 (d, 2H, J= 8.4 Hz), 4.57 (d ,2H), 4.05 (dd, 1H, J=8.8,4.8), 2.46 (t, 2H, J=7.6), 2.23-2.15 (m, 1H), 2.03-1.94 (m,1H), 1.49 (s, 9H), 1.45 (s, 9H).
13C NMR (100MHz, CD3OD) : δ 171.84, 171.75, 156.71, 137.61, 137.09, 127.18, 119.79 ,81.40, 79.18, 63.48, 54.13, 32.79, 27.34, 27.04, 26.89.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M+Na]+ 341.2154, found 431.2133.
실시예 6. (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-포밀페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00015
둥근바닥 플라스크에 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(하이드로시메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.409g을 디메틸크로라이드 8.0 mL에 녹여 넣고, 피리디늄 크로로메이트 0.3233g을 넣어준 후 2시간 상온에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥센 = 1/1, v/v)로 정제하여 (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄 2,2,2,-트리플루오로아세테이트, (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 및 (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-포밀페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다.
수율: 95 %
1H NMR (CDCl3,400MHz): δ 9.84 (s, 1H), 9.50 (s, 1H), 7.79-7.74 (m, 4H), 5.44 (s, 1H), 4.18-4.11 (M, 1H), 2.49 (t, 2H,J= 6.0 Hz), 2.21-2.20 (m, 1H), 1.88-1.80 (m, 1H), 1.34 (s, 18H).
실시예 7. (S,E)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(2-(4-(다이싸이아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00016
둥근바닥 플라스크에 2-(2-methyl-4H-크로멘-4-이리덴)말로노니트릴 0.046g와 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-포밀페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.081g을 넣고, 톨루엔 3mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 피페리딘과 아세틱 산을 각각 150μL씩 넣고, 14시간 동안 110 ℃에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥센 = 1/1, v/v)로 정제하여 (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄 2,2,2,-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S,E)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(2-(4-(다이싸이아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다.
수율: 23%.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 9.28 (s, 1H), 8.85 (d, 1H,J= 8.0 Hz), 7.72-7.68 (m, 3), 7.57-7.51 (m, 4H), 7.41 (t, 1H,J= 7.6 Hz), 6.70 (s, 1H), 6.68 (d, 1H,J= 16 Hz), 5.39 (s, 1H), 4.25-4.15 (m, 1H), 2.45 (t, 2H,J= 6.0 Hz), 2.30-2.20 (m, 1H), 1.91-1.80 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.44 (s, 9H).
실시예 8. (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄 2,2,2,-트리플루오로아세테이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00017
둥근바닥 플라스크에 (S,E)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(2-(4-(다이싸이아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.03g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 아니졸 1mL, 트리플루오로아세트산 1mL 넣고, 4시간 동안 상온에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 다이에틸에테르로 재결정하여 정제하여 표제화합물인 (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄 2,2,2,-트리플루오로아세테이트를 제조하였다.
수율: 54%.
1H NMR (DMSO, 400MHz): δ 10.52 (s, 1H), 8.73 (d, 1H,J= 6.8 Hz), 7.94-7.61 (m, 8), 7.38 (d, 1H,J= 15 Hz), 6.99 (s, 1H), 4.85-4.70 (m, 1H), 1.70-1.63 (m, 1H).
실시예 9. (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드의 제조
Figure 112015031434106-pat00018
둥근바닥 플라스크에 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-포밀페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.203g과 1-(5-카보시페닐)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.155g을 넣고 에탄올 0.2 mL와 톨루엔 2 mL를 가하여 용해시키 후, 12시간 동안 80 oC에서 반응시켰다. TLC로 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 다이크로로메탄/메탄올 = 1/10, v/v)로 정제하여 (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 중간화합물인 (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드를 제조하였다.
수율: 70%.
1H NMR (CD3OD, 400MHz): δ 8.46 (d, J = 16.0, 1H), 8.13 (d, J = 5.6, 2H), 7.88-7.86 (m, 3H), 7.81-7.78 (m, 1H), 7.68-7.59 (m, 3H), 4.74 (t, J=6.8, 2H), 4.09-4.06 (m, 1H), 2.75 (t, J=7.2, 2H), 2.32 (t, J=7.2), 2.25-2.16 (m, 2H), 2.08-1.95 (m, 2H), 1.88 (s, 6H), 1.75-1.68 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.44 (s, 9H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.15, 176.42, 172.18, 171.82, 156.69, 154.53, 144.33, 143.72, 140.83, 131.94, 129.53, 129.46, 129.25, 122.80, 119.58, 114.76, 110.16, 81.42, 79.17, 54.01, 52.48, 46.59, 33.57, 32.92, 28.12, 27.43, 26.98, 26.68, 25.70, 25.55, 24.33.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 662.3802, found 662.3809.
실시예 10. (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00019
둥근바닥 플라스크에 (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.025g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 아니졸 37uL, 트리플루오로아세트산 0.60mL 넣고, 36시간 동안 상온에서 반응시켰다. TLC로 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 아세톤과 에테르로 재결정하여 정제하여 표제화합물인 (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트를 제조하였다.
수율: 46%.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 8.46 (d, J = 16.4, 1H), 8.09 (d, J = 8.8, 2H), 7.88-7.78(m, 4H), 7.67-7.65 (m, 2H), 7.53 (d,J=16.4,1H), 4.71 (t, J = 7.2, 2H),3.91 (t, J = 5.2, 1H), 2.75 (t, J = 7.2, 2H), 2.34 (t, J= 7.2), 2.29-2.24 (m, 2H), 2.05-1.98 (m, 2H), 1.87 (s, 6H), 1.75-1.73 (m, 2H), 1.69-1.61 (m, 2H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.19, 175.79, 171.91, 154.52, 154.46, 144.20, 143.70, 140.81, 131.73, 129.61, 129.48, 129.23, 122.74, 119.59, 114.64, 110.09, 53.06, 52.47, 46.35, 33.03, 32.27, 29.29, 28.01, 25.77, 25.70, 25.33, 24.12, 22.83.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 506.2651, found 506.2650.
실시예 11. (S,E)-2-(4-(5- 부토시 -4-( tert - 부토시카보닐아미노 )-5- 옥쏘펜탄아미도 ) 스티릴 )-1-(4- 에토시 -4- 오쏘부틸 )-3,3- 다이메틸 -3H- 인돌륨 브로마이드의 제조
Figure 112015031434106-pat00020
둥근바닥 플라스크에 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-포밀페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.102g과 1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.078g을 넣고 에탄올 0.1 mL와 톨루엔 1 mL를 가하여 용해시키 후, 10시간 동안 80 oC에서 반응시켰다. TLC로 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 다이크로로메탄/메탄올 = 1/10, v/v)로 정제하여 (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 중간화합물인 (S,E)-2-(4-(5-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드를 제조하였다.
수율: 69%.
1H NMR (CD3OD, 400MHz): δ 8.47 (d, J = 16.0, 1H), 8.18 (d, J=8.8, 2H), 7.96 (d, J = 7.6, 1H), 7.87 (d, J = 8.4, 2H), 7.808-7.73 (m, 2H), 7.67-7.61 (m, 2H), 4.75 (t, J=7.6, 2H), 4.15 (q, J = 7.2 ,2H), 4.09-4.06 (m, 1H), 2.73 (t, J=6.4, 2H), 2.57 (t, J=7.2, 2H), 2.33-2.16 (m, 3H), 2.04-1.95 (m, 1H), 1.88 (s, 6H), 1.49 (s, 9H), 1.44 (s, 9H), 1.23 (t, J = 7.2, 3H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.24, 173. 20, 172.13, 171.81, 156.66, 154.71, 144.42, 143.71, 140.85, 131.11, 129.60, 129.43, 129.24, 122.81, 119.52, 114.67, 110.25, 81.39, 79.14, 60.63, 54.02, 52.44, 45.95, 32.94, 29.90, 27.48, 27.03, 26.68, 25.56, 23.14, 13.28.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 662.3802, found 662.3809.
실시예 12. (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00021
둥근바닥 플라스크에 (S,E)-2-(4-(5-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.06g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 아니졸 87uL, 트리플루오로아세트산 0.65mL 넣고, 36시간 동안 상온에서 반응시켰다. TLC로 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 아세톤과 에테르로 재결정하여 정제하여 표제화합물인 (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트를 제조하였다.
수율: 48%.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 8.47 (d, J = 16.4, 1H), 8.18 (d, J=8.8, 2H), 7.93 (d, J = 8.4, 1H), 7.88 (d, J = 8.4, 2H), 7.80-7.77 (m, 2H), 7.73-7.65 (m, 2H), 4.70 (t, J=8.0, 2H), 4.15 (q, J = 7.2 ,2H), 4.05-3.98 (m, 1H), 2.78 (t, J=6.4, 2H), 2.70 (t, J=6.4, 2H), 2.35-2.22 (m, 4H), 1.88 (s, 6H), 1.25 (t, J = 7.2, 3H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.32, 182. 27, 173.20, 171.76, 154.67, 154.61, 144.25, 143.70, 140.85, 131.89, 129.72, 129.43, 129.20, 122.75, 119.57, 114.52, 110.27, 60.61, 52.74, 52.43, 52.40, 45.76, 32.22, 29.72, 25.66, 25.33, 23.00, 13.12.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 506.2651, found 506.2654.
실시예 13. (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-((4-포밀펜토시)메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00022
둥근바닥 플라스크에 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(하이드로시메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 1.808g과 트리에틸아민 1.24 mL, 4-다이메틸아미노피리딘 0.109g을 넣고, 다이크로로메탄 (DCM) 5mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 토질크로라이드 2.534g을 다이크로로메탄에 녹여 넣고, 3시간 동안 0 ℃에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥산 = 1/2, v/v)로 정제하여 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(크로로메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다. 제조한 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-(크로로메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.6g 과 4-하이드로시벤잘데하이드 1.172g, 포타슘 카보네이트 0.974g 소듐 아이오다이드 0.063g을 아세토나이트릴 (ACN) 10mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액을 17시간 동안 85 ℃에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 에틸아세테이트/헥산 = 1/2, v/v)로 정제하여 (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-((4-포밀펜토시)메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트를 제조하였다.
수율: 92%.
1H NMR (CD3OD, 400MHz): δ 9.85 (s,1H), 7.88 (d, 2H, J=8.8), 7.60 (d, 2H, J=8.4), 7.42 (d, 2H, J=8.4), 7.17 (d, 2H, J=8.8), 5.17 (s, 2H), 4.05 (dd, 1H, J=9.2,4.8), 2.50 (t, 2H, J=7.6), 2.24-2.15 (m, 1H), 2.05-1.91 (m, 1H), 1.49(s, 9H), 1.44(s, 9H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 191.42, 171.82, 164.05, 156.67, 138.49, 131.93, 131.71, 130.07, 128.04, 119.82, 115.03, 81.42, 79.19, 69.65, 54.21, 54.12, 32.85, 27.39, 27.04, 26.94.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M+Na]+ 535.242, found 535.266.
실시예 14. (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)-벤질옥실)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드의 제조
Figure 112015031434106-pat00023
둥근바닥 플라스크에 (S)-tert-부틸 2-(tert-부톡시카보닐아미노)-5-(4-((4-포밀펜토시)메틸)페닐아미노)-5-옥쏘펜타노에이트 0.538g과 1-(5-카보시페닐)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.852g을 넣고 에탄올 10mL를 가하여 용해시킨 후, 17시간 동안 80 ℃에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 다이크로로메탄/메탄올 = 1/10, v/v)로 정제하여 (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트 합성의 중간화합물인 (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)-벤질옥실)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드를 제조하였다.
수율: 82%.
1H NMR (CD3OD, 400MHz): δ 8.46 (d, 1H, J = 16.0), 8.09 (d, 2H, J=8.8), 7.82-7.77 (m, 2H), 7.66-7.61 (m, 4H), 7.51 (d, 1H, J=16.0), 7.44 (d, 2H, J=8.4), 7.22 (d, 2H, J=8.8), 5.23 (s, 2H), 4.66 (t, 2H, J=7.2), 4.06 (dd, 1H, J=8.4,4.4), 2.50 (t, 2H, J=7.2), 2.29 (t, 2H, J=7.2), 2.24-2.16 (m, 1H), 2.05-1.94 (m, 3H), 1.67 (s, 2H), 1.77-1.70 (m, 2H), 1.61-1.53 (m, 2H), 1.49 (s, 9H), 1.44(s, 9H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.09, 171.86, 164.12, 156.75, 156.71, 155.20, 143.58, 140.84, 138.56, 132.27, 131.83, 129.27, 129.18, 128.10, 127.38, 122.73, 119.86, 115.86, 114.52, 109.17, 81.41, 79.18, 69.86, 54.09, 52.34, 46.34, 34.45, 32.79, 28.04, 27.35, 27.17, 26.97, 26.90, 25.93, 25.52, 24.65.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 768.422, found 768.431.
실시예 15. (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트의 제조
Figure 112015031434106-pat00024
둥근바닥 플라스크에 (S,E)-2-(4-(4-(5-tert-부토시-4-(tert-부토시카보닐아미노)-5-옥쏘펜탄아미도)-벤질옥실)스티릴)-1-(-5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.085g을 넣고, 다이크로로메탄(DCM) 1mL를 가하여 용해시켰다. 상기 용액에 아니졸 1mL, 트리플루오로아세트산 0.11mL 넣고, 4시간 동안 상온에서 반응시켰다. TLC로 확인 결과 출발물질이 사라졌을 때, 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 아세톤으로 재결정하여 정제하여 표제화합물인 (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 2,2,2-트리플루오로아세테이트를 제조하였다.
수율: 13%.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ 8.46 (d, 1H, J = 16.0), 8.08 (d, 2H, J=8.8), 7.83-7.77 (m, 2H), 7.66-7.62 (m, 4H), 7.51 (d, 1H, J=16.0), 7.45 (d, 2H, J=8.4), 7.22 (d, 2H, J=8.8), 5.23 (s, 2H), 4.66 (t, 2H, J=7.2), 2.66 (t, 2H, J=7.2), 2.33 (t, 2H, J=7.2), 2.23-2.17 (m, 3H), 2.05-1.97 (m, 2H), 1.87 (s, 2H), 1.77-1.70 (m, 2H), 1.60-1.53 (m, 2H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.09, 171.99, 164.12, 155.03, 143.56, 140.83, 138.44, 132.87, 131.96, 129.37, 129.27, 129.18, 128.69, 128.11, 127.37, 122.70, 120.05, 119.84, 115.86, 114.46, 113.45, 109.11, 69.82, 54.26, 54.07, 52.33, 46.19, 39.93, 33.36, 32.48, 27.94, 26.33, 25.74, 25.43, 24.24.
MS (MALDI+,DHB) : calcd. For [M]+ 612.307, found 612.325.
참조예 1. (E)-1-(5-카보시펜틸)-2-(4-하이드시스티릴)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드의 제조
Figure 112015031434106-pat00025
둥근바닥 플라스크에 4-하이드로시벤잘알데하이드 0.14g과 1-(5-카보시페닐)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌륨 브로마이드 0.42g을 넣고, 에탄올 2mL를 가하여 용해시켰다. 14시간 동안 80 oC에서 반응시킨 후 용액의 색이 붉은색이 되었을 때, TLC로 출발물질이 사라졌음을 확인하고 감압 농축하였다. 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(용리액: 디클로로메탄/메탄올 = 10/1, v/v)로 정제하여 표제화합물인 (E)-1-(5-카보시펜틸)-2-(4-하이드시스티릴)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨 브로마이드를 제조하였다.
수율: 52 %
1H NMR (DMSO-d6, 200MHz) : δ 8.40 (d, J = 16.0, 1H), 8.09 (d, J=8.8,2H),7.76-7.73(m,2H),7.64-7.56(m,2H),7.39(d,J=16.0,1H),6.95(d,J=8.8,2H),4.59(t,J=7.2),2.27(t,J=7.2,2H),2.02-1.93(m,2H),1.85(s,6H),1.76-1.68(m,2H),1.60-1.52(m,2H).
13C NMR (CD3OD, 100MHz): δ 182.76, 180.50, 166.89, 156.68, 144.63, 142.29, 135.16, 130.45, 130.12, 127.06, 124.02, 118.31, 115.50, 108.78, 53.31, 47.43, 36.69, 29.30, 27.37, 27.16, 26.36.
시험예 1. 생체외 GGT와의 결합에 따른 UV 데이터 변화관찰
실시예 15에서 얻어진 화합물(AP-GGT) 0.0069 g을 다이메틸설폭사이드 1 mL에 용해시켜 10 mM이 되도록 준비하였다. 이 중 4 μL를 PBS 완충용액(pH 7.4, 1X) 2 mL에 혼합하여 실시예 15의 표제화합물이 20 μM의 농도가 되도록 준비하였다. 또한 GGT(γ-glutamyl transferase) (10 unit/mg) 0.0010 g을 PBS 완충용액 (pH 7.4, 1X) 1 mL에 용해시켜 10 U/mL이 되도록 준비하였다. 이 중 10 μL를 앞서 준비된 AP-GGT 포함 화합물 20 μM에 혼합하여 GGT가 50 U/L가 되도록 투입하였다. 이후, UV 비저블 스펙트로포토미터(UV-Visible Spectrophotometer)를 사용하여 12시간 동안 UV 데이터의 변화를 관찰하였다(도 1).
이와 같은 결과로부터 4시간만에 GGT와의 반응이 종결되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 GGT 검출을 위한 탐침으로써 사용될 수 있다.
시험예 2. 생체외 GGT 검출한계 평가
상기 시험예 1과 동일한 방법으로 AP-GGT 포함 화합물을 준비하여 8개의 큐벳에 투입하였다. 이 후, 각각의 큐벳에 GGT가 0, 1, 3, 5, 10, 20, 30 및 50 U/L이 되도록 넣고 4시간 후 형광 분광기를 이용하여 형광 반응(Ratiometric fluorescence responses)을 측정하였다(도 2).
상기의 결과로부터, 검출한계(The detection limit) = 3 X S.D. / k의 식에 적용하여 본 발명에 의한 화합물의 GGT 검출한계가 0.15 U/L임을 확인하였다.
위 식에서 S.D.는 GGT의 양이 0 U/L일때 세 번의 형광 측정을 통해 얻은 형광 최대값의 표준편차이고, k는 위 실험에서 0, 1, 3 및 5 U/L의 GGT가 있을 때 형광값을 측정하여 557 nm에서 갖는 형광의 최대값들을 연결하여 도출한 직선의 기울기를 의미한다.
시험예 3. 다양한 pH 환경에서의 안정성조사
AP-GGT 0.0069 g을 다이메틸설폭사이드 1 mL에 용해시켜 10 mM이 되도록 준비하였다. 이 중 4 μL를 pH 3, 4, 5, 6, 7, 7.4, 8, 9 및 10의 PBS 완충용액 2 mL에 혼합하여 AP-GGT가 20 μM의 농도가 되도록 9개의 큐벳에 투입하였다. 또한 참조예 1에서 제조된 표제화합물(AP)을 0.0046 g을 다이메틸설폭사이드 1 mL에 용해시켜 10 mM이 되도록 준비하고, 상기 AP-GGT를 포함하는 화합물과 동일한 조건으로 제조된 AP를 포함하는 화합물을 9개의 큐벳에 투입하였다. 4시간 후, 형광 분광기를 이용하여 형광 반응을 측정하였다(도 3).
도 3의 결과로부터, AP-GGT와 GGT가 반응하여 생성되는 AP가 생체내의 환경인 pH 7.4에서 형광 발현함을 확인할 수 있었다. 이러한 이유로 생체 실험에서 보이는 형광은 AP-GGT와 반응하여 생성된 AP의 형광임을 증명할 수 있다.
시험예 4. 반응메커니즘 증명을 위한 UV 데이터 비교
참조예 1에서 제조된 표제화합물(AP)을 0.0046 g을 다이메틸설폭사이드 1 mL에 용해시켜 10 mM이 되도록 준비하고, 실험예 1에서 AP-GGT를 포함하는 화합물과 동일한 조건인 PBS 완충용액 2 mL에 AP가 20 μM의 농도가 되도록 혼합하여 UV 데이터를 측정하였다. 이를 시험예 1의 결과와 대조하여, AP-GGT와 GGT를 반응시켜 얻은 생성물(AP-GGT+GGT)의 UV 데이터와 유사함을 증명하였다(도 4). 또한 이러한 결과로부터 도출되는 반응 메커니즘을 제시하였다(도 5).
시험예 5. 세포 내 실제 쥐의 장기에서의 GGT 결합 특성.
대장암 세포는 공개된 기술에 근거한 절차(1. Greten,F.R. et al. (2004) IKKbeta links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell, 118, 285-296; 2. Ishikawa,T.O. et al. (2010) Tumor formation in a mouse model of colitis associated colon cancer does not require COX-1 or COX-2 expression. Carcinogenesis, 31, 729-736)에 따라 두 가지 약물 azoxymethane(AOM), dextran sulfate sodium salt(DDS)을 이용하여 쥐의 대장에서 배양되었다. PBS 완충용액에 묽힌 AOM 10mg/kg을 복강주사로 쥐에게 주사하였다. 쥐에게 AOM 복강주사 일주일후, 2 % DDS를 마시는 물에 포함하여 7일간 주었다. AOM 복강주사 12주후 AOM/DSS 쥐 모델(도 6A)과 정상 쥐의 대장(도 6B)을 각각 추출한 후 일정한 크기로 준비하였다. AOM/DSS 쥐 모델의 대장에서 많은 선종폴립을 관찰할 수 있었지만 아무런 처리를 하지 않은 일반 쥐의 대장에서는 선종폴립들이 관찰되지 않았다. 두 대장 표면에 AP-GGT(0.1 mM in PBS)를 마이크로피펩을 사용하여 처리한 후 배양하였다. 이렇게 배양된 대장조직은 반응시점으로부터 10분 후, 60분 후의 샘플에 대하여 각각 eXplore Optix MX3를 통해 450 nm의 빛을 쪼여 550 내지 580 nm의 형광을 검출하였다(도 6).
도 6의 결과로부터, AP-GGT는 대장암에 걸린 쥐의 대장 세포에서 GGT와 반응하여 형광을 검출하는 것을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물:
    <화학식 1>
    Figure 112017013656801-pat00026

    식 중, Y는 하기 화학식 2 내지 화학식 5 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 기이다. (하기 화학식 2 내지 5의 기에서, X1 내지 X4는 독립적으로 이소프로필리덴, 황 원자, 산소 원자 또는 이미노기이고; X5는 산소 원자 또는 이미노기이고; R1 내지 R4는 독립적으로 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 케톤기, 선형 또는 비선형의 C1 내지 C20의 알킬기를 갖는 에스테르기, C5 내지 C24의 치환 또는 비치환된 아릴기 또는 C6 내지 C24의 아릴알킬기이고;
    Figure 112017013656801-pat00027
    은 상기 화학식 1의 화합물에 결합되는 결합(bond)를 나타낸다).

    <화학식 2>
    Figure 112017013656801-pat00028

    <화학식 3>
    Figure 112017013656801-pat00029

    <화학식 4>
    Figure 112017013656801-pat00030

    <화학식 5>
    Figure 112017013656801-pat00031

  2. 제 1 항에 있어서,
    하기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    2-((E)-2-((E)-2-((S)-4-암모니오-4-카복시부탄아미도)에틸티오)-3-((Z)-2-(1,1,3-트리메틸-1H-인덴-2(3H)-이리딘)에틸리덴)시클로헥-1-에닐)비닐)-1,3,3,-트리메틸-3H-인돌륨;
    (S,E)-1-카복시-4-(4-(2-(4-(다이시아노메틸렌)-4H-크로멘-2-일)비닐)페닐아미노)-4-옥쏘부탄-1-아미늄;
    (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(5-카복시페닐)-3,3-다이메틸-3H-인도륨;
    (S,E)-2-(4-(4-암모니오-4-카보시부탄아미도)스티릴)-1-(4-에토시-4-오쏘부틸)-3,3-다이메틸-3H-인도륨; 및
    (S,E)-2-(4-(4-(4-암모니오-4-카복시부탄아미도)벤질옥시)스티릴)-1-(5-카보시펜틸)-3,3-다이메틸-3H-인돌륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112017013656801-pat00038

  3. 제 1 항에 따른 감마 글루타밀 전이효소 검출용 조성물을 포함하는 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서.
  4. (a) 제 3 항에 따른 감마 글루타밀 전이효소 검출 센서와 진단 대상인 인간을 제외한 동물의 세포 또는 인간을 제외한 동물의 조직을 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 접촉된 검출 센서와 진단 대상의 반응으로부터 발현되는 형광을 측정하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
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