KR101191993B1 - Ｆｔｓ 유전자의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 FTS 유전자의 신규 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게 암의 진단을 위해 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 발현을 측정하는 방법, FTS 유전자의 발현을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, FTS 유전자 발현 억제제 또는 FTS 단백질 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, FTS 유전자의 발현을 측정함으로써 암의 진단을 대량으로 신속 정확하게 행할 수 있으며, FTS 유전자의 발현 억제제 또는 FTS 단백질의 활성을 억제제는 매우 유용한 암 치료제로 개발될 수 있다.

Description

ＦＴＳ 유전자의 신규 용도{Novel Use of Fused Toes Homologue Gene}

본 발명은 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 신규 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 FTS 유전자의 발현을 측정하는 방법, FTS 유전자에 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 FTS 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, 및 FTS 유전자 발현 억제제 또는 FTS 단백질 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

자궁경부암(uterine cervical cancer)은 선진국에서는 여성 100,000 명당 10명이 걸리며 개발도상국에서 여성 100,000명당 60명이 걸리는 세계적으로 두 번째로 흔한 암이다(1). 개발도상국 및 선진국간의 자궁경부암 발생의 불균일성은 20세기 후반 동안에 많은 선진국 내에서 세포학적 스크리닝(즉, 박리 세포학)을 도입한 것이 주요 원인이다(2). 침투성 자궁경부암은 이의 발생 전에 세포 성숙, 계층화 및 핵 이상성의 위중도 증가와 같은 특징을 갖는 상피의 비전형성 스펙트럼을 형성하는 조직학적 및 세포학적으로 구분되는 병소가 선행된다. 자궁경부암의 병소 등급은 가벼운 증상인 CIN I (cervical intra-epithelial neoplasia grade 1), 중간 증상인 CIN Ⅱ, 및 심각한 증상인 CIN Ⅲ으로 구분하거나 또는 LGSIL (low-grade squamous intra-epithelial neoplasia)(CIN 1 및 2)과 HGSIL(high grade intraepithelial neoplasia HGSIL)(CIN 2 및 3)으로 구분하기도 한다(3, 4).

발암성 HPV 타입의 지속성이 자궁경부이형성(cervical dysplasia)으로부터 침투성 자궁경부암으로의 이행에 있어서 반드시 필요하다(5). 그러나, 잠복성 HPV 감염이 세포학적 및 조직학적 이상성과 반드시 연관되어 있는 것은 아니다. 자궁경부암의 발생 및 진전 과정 동안 상이한 신호전달 경로가 존재한다는 것은 밝혀져 있으나, 자궁경부암의 임상적 산물과 명확하게 연관시킬 수 있는 분자 마커는 아직까지 발견되어 있지 않다. 그러나, 유전학 및 단백질학 기술이 발전에 따라, 암조직의 존재를 예측할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 치료가 기대되는 신규 약물 타겟으로 사용될 수 있는 새로운 분자 바이오마커를 확인할 수 있게 되었다.

FTS (Fused Toes Homologue) 유전자는 최초에 팔 다리의 발생의 결함에 기인한 발가락 접합으로 불리우는 생쥐 변이체내에서 결손된 6개의 유전자중의 하나로서 확인되었고, FT1/FTS으로 명명되었다(6). Ft 생쥐의 변이는 쥐 염색체 8번에 위치하며 수백 kb에 상당하는 염색제가 결손된 것으로 보아 여러 개의 유전자가 Ft 표현형에 관여할 것으로 추정된다(7). 그러나, 현재까지 Ft 생쥐의 표현형과 FTS 유전자가 직접적으로 관련이 있다는 증거는 보고되고 있지 않다. 생쥐의 FTS와 96％ 상동성이 있는 상동 유전자가 사람에서 확인되었고, Akt1과 상호작용하는 것으로 보아 PDK1에 의한 Akt의 인산화를 조절할 것이라는 주장이 제기되기도 하였으나(8), 현재로서 FTS의 기능에 대해 밝혀진 것은 거의 없다. 그러나 FTS의 NH-말단 부위는 Ubc 도메인 컨쥬게이팅 효소와 광범위한 서열 상동성을 나타내지만, 효소 활성에 필수적인 중요한 활성부위에 시스테인(cystein) 잔기가 존재하지 않는 것으로 보아 유비퀴틴(ubiquitin) 매개 단백질 분해의 조절에 FTS가 관여함을 추정할 수 있다(9). 최근의 연구결과에 의하면, FTS가 모노-유비퀴틴화된 단백질을 특이적으로 인지하여 엔도솜(endosome)에서의 운반을 매개한다는 것이 보고되었다(9). 그러나, 현재까지 FTS가 세포의 암성 변화(neoplastic transformation)에 관여한다는 보고는 없었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 FTS 단백질이 정상 세포에서는 발현이 되지 않으나, 암의 초기 단계인 상피내종양에서 암발생 단계의 진전에 따라 FTS 단백질의 발현이 증가하는 것을 처음으로 발견하였으며, 이와 함께 암세포에서 FTS의 발현을 억제하면, p21 단백질의 발현이 증가하면서 세포성장이 억제되고, 세포주기가 정지되며 세포의 아폽토시스가 유도됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 FTS 유전자 및 단백질이 암의 진단 뿐만 아니라 치료에 유용한 타겟으로 활용될 수 있는 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 대상자의 시료에서 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 발현을 측정하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FTS 유전자의 발현을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FTS 유전자 발현 억제제 또는 FTS 단백질 활성 억제제를 포함하는 암의 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FTS 유전자 또는 단백질을 이용하여 암 치료 또는 예방용 물질을 스크리닝하는 방법 및 이 방법에 사용되는 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 대상자(subject)의 시료로부터 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 발현을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 암 조직 또는 세포에서 FTS 유전자의 발현 증가와 암의 발생 또는 진행정도와의 상관성에 기초한다. 즉, FTS 유전자는 정상세포에서는 전혀 또는 거의 발현되지 않으나, 암의 진행에 따라 발현 수준이 증가된다. 따라서, 암으로 의심되는 시료에서의 FTS 유전자의 발현을 측정하면 암의 발생여부 및 진행단계를 진단할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "대상자(subject)"는 암을 겪을 것으로 추정되어 암의 발생 여부를 진단하고자 하는 대상자를 의미하며, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간(human)을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "시료" 는 FTS 유전자의 발현을 측정할 수 있는 대상자의 세포 또는 조직을 의미하며, 예를 들어, 혈액, 조직, 체액, 오줌 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "암"은 특정 종류의 암으로 한정되지 않으며, 예를 들어 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "FTS (Fused Toes Homologue) 단백질"은 Aktip(AKT interacting protein)으로도 명명되는 단백질을 의미하며, 바람직하게는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

본 명세서에서 용어 "FTS 유전자"는 상기 FTS 단백질을 코딩하고 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자를 의미하며, 보다 바람직하게는 서열목록 제 2 서열 또는 제 3 서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 FTS 유전자의 발현 측정은 FTS 유전자의 mRNA 또는 FTS 단백질의 발현 측정이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 FTS 유전자의 발현 측정은 FTS 유전자의 mRNA를 RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction)하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 FTS 유전자의 발현 측정은 FTS 유전자의 단백질을 면역분석(immunoassay)하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 FTS 유전자는 정상 시료에서의 발현 수준에 비해 암 시료에서의 발현 수준이 증가되어 있다.

본 발명의 방법에서 FTS 유전자의 발현 수준을 측정하여 암 발생 여부를 판단하는 것은 크게 두 가지의 방법, 즉 유전적 분석(genetic analysis) 방법과 면역 분석(immunoassay)방법으로 실시할 수 있다.

우선, 유전적 분석에 기초하여 본 발명을 설명하면 다음과 같다.

유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, FTS 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다.

프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 FTS 유전자의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 FTS 유전자의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 세포 또는 조직)에서 FTS mRNA 발현양을 조사하여 FTS 유전자의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여, 먼저 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포 내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당 업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면 본 발명에서 증폭 반응에 이용되는 프라이머는 FTS 유전자의 cDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 FTS cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 FTS cDNA 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 것이다.

본 발명의 프라이머는 FTS의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 FTS의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.

이렇게 증폭된 FTS를 적합한 방법으로 분석하여 FTS 유전자의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 FTS 유전자의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, FTS 유전자의 발현이 정상세포에서의 수준 보다 높은 것으로 확인되는 경우에는 암으로 진단된다.

또한, FTS 유전자 또는 FTS의 cDNA에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 암을 진단할 수도 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 이점, 즉 혼성화 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 본 발명의 프로브를 변형할 수 있다. 이들 변형, 즉 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, FTS의 cDNA에 혼성화되는 본 발명의 프로브는 불용성 담체(예컨대, 니트로셀 룰로오스 또는 나일론 필터, 유리판, 실리콘 및 플루오로카본 지지체)에 고정화되어, 마이크로어레이를 제조할 수 있다. 마이크로어레이에 있어서 본 발명의 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 불용성 담체에로의 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 담체에 결합될 수 있다. FTS의 cDNA는 상술한 과정에 의해 얻을 수 있다. 프로브 대신에 FTS의 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다. 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine),ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t- NBT(nitroblue tetrazolium)등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 니트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 상술한 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다.

다음으로, 면역분석(immunoassay) 방법에 기초하여 본 발명을 설명하면 다음과 같다. 즉, 본 발명에서 FTS 단백질의 발현 수준은 면역분석 방법에 따라 측정하여 암을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 FTS 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.

FTS 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. FTS 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al,J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow,E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999;Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 FTS 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차 항체로서 FTS 단백질에 대한 항체와 상기 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine),ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)와 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 FTS 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, FTS 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵ ), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 FTS 단백질의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) FTS (Fused Toes Homologue) 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) FTS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 암 진단용 조성물이 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 조성물은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, 예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소, DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명에서 암 진단용 조성물이 면역분석방법에 적용되는 경우 본 발명의 조성물은 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자 발현 억제제 또는 FTS 단백질 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 확인되는 바와 같이 암 세포에서 FTS 유전자의 발현을 억제하거나 FTS 단백질의 활성을 억제하면 암 세포 성장이 억제되고 암세포의 아폽토시스가 유도되어 암의 치료 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 의하면, 상기 FTS 유전자 발현 억제제는 FTS 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interfering RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA) 이다.

본 명세서에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 트랜스레이션을 저해하는 작용을 한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 2 서열 또는 제 3 서열의 FTS 단백질 코딩 염기서열에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, FTS mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6내지 100 염기이고, 바람직하게는 8내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내 40 염기이다.

상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 한 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명 조성물에서 FTS 유전자 발현 억제제는 FTS 유전자 서열, 바람직하게는 서열목록 제 2 서열 또는 제 3 서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 siRNA일 수 있다.

본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다. 본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(FTS mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(FTS mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 FTS 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

본 발명 조성물에서 FTS 유전자 억제제는 FTS 유전자 서열, 바람직하게는 서열목록 제2서열 또는 제3서열에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있다. shRNA는 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10 개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀(hairpin) 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제20040106567호 및 제20040086884호에는 shRNA를 포함하는 바이러스성 벡터 등 발현 컨스트럭트/벡터에 관한 정보가 개시되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 FTS 유전자의 siRNA 또는 shRNA는 서열목록 제 4 서열, 제 5 서열 또는 제 6 서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명에서 FTS 단백질 활성 억제제는 핵산, 화합물, 천연물, 저분자 화합물, 또는 단백질 등일 수 있다. 바람직하게는 FTS 단백질에 대한 활성 억제제는 FTS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체이다. FTS 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작될 수 있고, 모노클로날 항체 대신에 FTS 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현 예에 의하면, 상기 FTS 단백질 활성 억제제는 저분자량의 화합물이다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 약제학적 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에 상술한 유효성분 이외에, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용 되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏체중이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) FTS (Fused Toes Homologue) 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포 또는 조성물에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 FTS 유전자의 발현량, FTS 단백질의 양 또는 FTS 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 시료에 의해 상기 FTS 유전자의 발현량, FTS 단백질의 양 또는 FTS 단백질의 활성이 하향 조절(down-regulation)되는 경우 상기 시료를 암의 치료 또는 예방물질로 판정하는 단계.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자 또는 단백질을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 용도의 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 FTS 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포 또는 조성물에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료" 는 FTS 유전자의 발현량, FTS 단백질의 양 또는 FTS 단백질의 활성에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interferenceRNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이어, 시료가 처리된 세포에서 FTS 유전자의 발현량, FTS 단백질의 양 또는 FTS 단백질의 활성을 측정한다. 측정 결과, FTS 유전자의 발현량, FTS 단백질의 양 또는 FTS 단백질의 활성이 하향-조절(down-regulation) 되는 것이 측정되면, 상기 시료는 암 치료 또는 예방용 물질로 판정될 수 있다.

FTS 유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던 블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

FTS 단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, FTS 단백질의 양의 변화는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 FTS 유전자의 신규 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게 암의 진단을 위해 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 발현을 측정하는 방법, FTS 유전자의 발현을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물, FTS 유전자 발현 억제제 또는 FTS 단백질 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 FTS 유전자 또는 단백질을 이용하여 암 치료 또는 예바용 물질을 스크리닝하는 방법 및 이 방법에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, FTS 유전자의 발현을 측정함으로써 암의 진단을 대량으로 신속 정확하게 행할 수 있으며, FTS 유전자의 발현 억제제 또는 FTS 단백질의 활성을 억제제는 매우 유용한 암 치료제로 개발될 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 인간 자궁경부암 샘플내에서 FTS의 발현수준을 보여준다.
도 1a는 정상 자궁경부조직으로서 FTS 발현이 전혀 나타나지 않으며, CIN I에서는 FTS가 약하게 발현되는 것을 보여준다.
도 1b는 CIN Ⅰ에서 FTS의 약한 발현과 CIN Ⅱ에서 FTS의 발현이 증가하는 것을 보여준다.
도 1c는 CIN Ⅱ에서의 FTS의 중간 정도의 발현이 CIN Ⅲ에서 더욱 증가하는 것을 보여준다.
도 1d는 CIN Ⅲ에서의 FTS의 강한 강도의 면역염색이 암 조직에서 약간 감소함을 보여준다 (Bar = 50μm).
도 2a는 자궁경부암세포에서 FTS가 과발현되는 것과 FTS 억제에 의해 자궁경부암세포의 콜로니 형성과 성장이 저해되는 것을 보여준다.
도 2a의 패널 a는 각 세포주내에서 FTS의 발현을 분석한 것을 보여준다. β-액틴의 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 2a의 패널 b는 HeLa 세포내에서 FTS의 핵 세포질의 발현을 보여준다. 도 2a의 패널 c 내지 e는 각각 ME180, CaSki 및 SiHa에서의 FTS의 발현을 보여준다.
도 2b는 HeLa-siFTS 세포내에서 FTS의 발현이 단백질 수준에서 억제되는 것을 웨스턴 블로팅에 의해 확인한 것을 보여준다. β-액틴의 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2c는 HeLa-siV 세포와 비교하여 HeLa-siFTS 세포의 성장의 억제를 보여준다.
도 2d는 FTS 유전자의 억제에 의해, HeLa-siV 세포와 비교하여 HeLa-siFTS 세포에서의 콜로니 형성능이 감소하는 결과를 보여준다.
도 3a 및 도 3b는 FTS 유전자의 녹다운이 세포 주기 및 세포 주기의 성분들을 변화시킨다는 것으 보여준다.
도 3a는 HeLa-siV 세포와 비교할 때, HeLa-siFTS 세포내에서 G0/G1에서 세포주기가 정지되고 아폽토시스가 유도되는 증거를 보여준다. S phase에서의 세포수의 감소와 동등한 것을 해석되는 GO에서의 세포 축적의 증가가 관찰되었다.
도 3b는 초기 G1 사이클린 D1, D3, CDK4, CDK6 및 이들의 억제자인 p21, p27, p16 및 p15의 단백질 발현을 웨스턴 블로팅으로 분석하고, FTS 발현 억제에 의한 영향을 측정하였다. 사이클린 D1 및 D3의 발현은 FTS 녹다운에서 극적으로 감소하였다(패널 2 및 3). CDK6 및 초기 G1의 중요한 조절자 발현은 CDK4의 약간의 변화 또는 거의 변화하지 않는 것과 함께 감소하였다(패널 4 및 5). 중요하게도, FTS 녹다운은 p21 및 p27의 발현을 상향조절하였고(패널 6 및 7), 다른 CDK 억제자인 p16의 발현은 약간 증가하였으나, p15는 변화가 거의 관찰되지 않았다(패널 8 및 9). β-액틴의 발현을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 4a 내지 도 4d는 FTS에 의한 p21의 전사적 억제(transcriptional repression)의 결과를 보여준다.
도 4a는 HeLa-siV 및 HeLa-siFTS 세포내에서 p21 루시퍼라아제 활성의 분석결과를 보여준다.
도 4b는 Myc-FTS이 일시적 과발현이 p21 루시퍼라아제 활성을 효과적으로 억제하는 결과를 보여준다.
도 4c 및 도 4d는 FTS 및 p21이 자궁경부의 상피내종양(CIN)에서 서로 상반되게 발현됨을 보여준다. FTS 발현 위치(붉은색 점)에서는 p21의 발현이 없는 반면, p21 발현 위치(녹색 점)은 FTS의 발현이 거의 발현되지 않았다(Bar = 100μm).
도 5는 FTS 녹다운이 자궁경부암세포내에서 아폽토시스를 촉진시킨다는 결과를 보여준다.
도 5a는 Annexin V 염색 및 유세포분석에 의해 HeLa-siV 세포와 비교할 때, FTS 녹다운 HeLa-siFTS 세포내에서 아폽토시스가 증가되는 결과를 보여준다. Y-축은 PI 표지된 세포군집을 보여주고, X-축은 FITC-표지된 Annexin V 양성세포들을 보여준다.
도 5b는 친아폽토시스 (Bax) 및 항 아폽토시스 (Bcl-2, XIAP, Survivin) 경로 단백질을 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과를 보여준다. 이들 단백질들에 대해서는 Bax 수준이 약간 변화가 있는 것을 제외하고는 거의 변화가 없었다.
도 5c는 HeLa-siV 및 HeLa-siFTS 세포내에서 카스파아제-3(caspase-3)의 활성을 측정한 결과를 보여준다. 카스파아제-3의 활성은 FTS 녹다운 세포내에서만 4배 증가한 것으로 확인되었다.
도 6a 내지 도 6d는 자궁경부암 또는 CIN (cervical intra-epithelial neoplasia) 환자의 조직에서 FTS 단백질의 차별적 발현 수준을 보여준다. 도 6a는 FTS 단백질이 정상세포, CINⅠ, CINⅡ으로 이행되면서 발현되는 수준을 보여준다. 도 6b는 CINⅠ 및 CINⅡ 조직에서의 FTS 단백질의 발현 수준을 보여준다. 도 6c는 CIN 등급 Ⅰ 내지 Ⅲ 에서의 FTS 단백질의 발현 수준을 보여준다. 도 6d는 자궁경부암 및 CIN Ⅲ에서의 FTS 단백질의 발현 수준을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

1. 환자 샘플

포르말린-고정한 파라핀-봉매된 인간 자궁경부 상피내종양(CIN) 및 암 조직의 샘플을 충북대학교 병원 병리학 교실에 보관된 파일로부터 선별하였다. 모든 실험은 충북대학교 병원의 연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)의 승인을 얻어 시행하였다.

2. 세포배양 및 트랜스펙션(transfection)

HeLa, ME180, SiHa 및 CaSki 세포주는 서울대학교 KCLB/KCLRF 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 얻었다. 모든 실험에 대해 세포는 10％ (v/v) FCS(fetal calf serum)(Serum Source International, Charlotte, USA), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 또는 DMEM 배지(WelGENE, 대구, 한국)를 사용하여 37℃ 및 5％ CO₂ 존재 하에서 습한 배양기내에서 배양하였다. HeLa 세포의 shRNA 플라스미드 DNA 트랜스펙션은 제조사에 의해 제공되는 지시에 따라 Enhancer-QTM Reagent 및 WelFect-ExTM plus Reagent (WelGENE, 대구, 한국)을 사용하여 수행하였다. 트랜스펙션한 후 24 시간에서 트랜스펙션된 컨스트럭트의 발현을 웨스턴 블로팅으로 비교하여 확인하였다.

3. FTS shRNA 컨스트럭트 및 안정한 녹다운(stable knockdown)

FTS 녹다운(knockdown)은 shRNA 접근법에 기초한 벡터를 사용하여 RNA 간섭(RNAi)에 의해 행하였다: 5'-CCUUGGUUGUGAAGCAGAA-3'(서열목록 제4서열); 5'-GUUCGAUAUUCCUGUCUUU-3'(서열목록 제5서열); 5'- GUCUUAGGGUGGUUAUCUA-3'(서열목록 제6서열)를 코딩하는 FTS 단백질 중 3 가지의 상이한 부분을 타겟팅하는 클론된 shRNA 컨스트럭트를 Santacruz Biotechnology (California, USA)로부터 구입하였다. 안정하게 하향 조절되는 클론을 RPMI 1640 배지내에서 푸로마이신(puromycin) 3μg/㎖을 사용하여 선별하였다.

4. 항체 및 시약

FTS 단백질에 대한 항체(ab56407)는 Abcam (Cambridge, UK)으로부터 구입하였고, 항 p-AKT, 항-p21, 항-p27, 항-p16, 항-p15, 항-CDK4, 항-CDK6, 항-Cyclin D1 및 D3 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)으로부터 구입하였다. 항-β-actin, 항-AKT, 항-PARP, 항-Bcl2, 항-Bax 항체 및 2차 항체 항-마우스, 항-고우트(goat), 항-래빗은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, U.S.A.)으로부터 구입하였다. 요오드화 프로피디엄(Propidium iodide), RNase A, DTT(dithiothreitol), Aprotinin, 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드는 Sigma (St.Louis, MO, USA)으로부터 구입하였다. 폴리비닐리덴 디플루오라이드막은 Bio-Rad (CA, USA)으로부터 구입하였다.

5. 세포 성장 곡선

야생형의 정상 세포 및 안정화 세포를 트립신 처리하고 6웰 플레이트내에서 웰당 1 X 10³의 비율로 접종하였다. 이어서, 세포들을 트립신 처리하고 플레이팅한 후에 각각의 날짜에 맞추어 계수하였다. 계수된 세포 수는 성장 곡선을 그리기 위해 기록하였다. 성장곡선은 2회에 걸쳐 각각 3회 반복하여 수행하였다.

6. 콜로니 형성 분석 (Colony formation assay)

콜로니 형성 분석은 공지된 방법에 따라 행하였다. 간략하게 설명하면, 세포들을 트랜스펙션하고 안정한 클론을 푸로마이신(puromycin) 처리에 의해 선별하고, 트립신 처리한 후, 계수기로 계수하였다. 이어서, 60-mm 조직 배양 플레이트내에 클론 밀도로 플레이팅한 후 1주에 1회씩 배지를 교환 공급하면서 2 주간 배양하였다. 접종 밀도는 60mm² 디쉬당 1000 세포가 유지되도록 하였다. 배양 14일 째날에 세포들을 메탄올:아세트산 = 7:1에서 고정시키고 0.5％ 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니는 50개 이상의 세포를 포함하게 되면 계수하였다. 실험은 적어도 3번의 실험을 3회 반복하여 행하였다.

7. 젤 전기영동 및 면역블로팅

세포들을 회수하고 펠릿을 400 ㎕의 용해 완충액 [20 mM Hepes (pH 7.4), 2 mM EGTA, 50 mM 글리세롤포스페이트, 1％ Triton X-100, 10％ 글리세롤, 1 mM PMSF, 10μg/㎖ leupeptin, 10μg/㎖ aprotinin 및 10μg/㎖ pepstatin) 내에서 현탁하고, 얼음에 30 분간 두었다. 4 ℃에서 15,000 rpm으로 15 분간 원심분리한 후에 Laemmli's 샘플 완충액[0.625 M Tris-HCl (pH 6.8), 10％ β-머캅토에탄올, 20％ SDS, 20％ 글리세롤, 0.004％ 브로모페놀 블루) 3배 부피의 양을 상등액에 첨가하고 5분간 끓였다. 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리한 후 폴리비닐리덴디플루오라이드막(Bio-Rad, CA, USA)으로 옮겼다. 막은 5％ 탈지유를 포함하는 TBST 완충액(10mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 0.1％ Tween 20, pH 7.4)내에서 각각의 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 항체들은 HRP-컨쥬게이트된 항-래빗, 항-마우스, 또는 항-고우트 IgG 항체를 사용하여 Intron, WestSolTM, Chemiluminescence Reagent Plus.과 함께 검출하였다.

8. 세포 주기 분석 (Cell cycle analysis)

HeLa 세포를 0.25％ (v/v) 트립신 처리하고 1000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 회수하였다. 세포들을 1:1 PBS (13.7mM NaCl, 0.27mM KCl, 0.43mM NaH₂PO₄7H₂O, 0.14mM KH₂PO₄ (pH 7.5)) 및 에탄올(100％) 용액으로 고정하였다. 세포들을 PBS로 2회 세정하고 40 ㎍/㎖의 요오드화 프로피디움과 함께 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 아폽토시스 세포는 FACScaliburTM cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용한 유세포분석에 의해 평가하였다. 세포들을 15mW 아르곤 레이저를 사용하여 488 nm에서 여기시킨 후, 형광은 585/42nm에서의 디폴트 필터와 함께 형광채널 FL2 옐로우에 의해 모니터링 하였다. 세포 덩어리를 배제하기 위해서 만개의 이벤트가 FSC (forward side scatter) 신호에 의해 유도되고, FL2-W/FL2-A (W는 너비이고, A는 면적이다)에 대해 전자적으로 게이트화되었다. 이어서, 데이터를 ModiFit LTTM program을 사용하여 분석하였다.

9. 요오드화 프로피디움 염색 및 annexin V를 사용한 유세포분석에 의한 아폽토시스 세포 검출

포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS) 노출은 annexin V-FITC 결합을 측정하여 평가하였다. 간략하게 설명하면, 약 4 X 10⁵ 세포를 회수하고, 1 ㎖의 차가운 PBS(pH 7.4)에서 2회 세정하였다. 이어서, 세포를 200 ㎕의 결합 완충액(pH 7.4)내에서 재현탁하고, 10 ㎕의 annexin V-FITC 및 5 ㎕의 PI를 첨가하였다. 상온의 암 조건에서 15 분간 인큐베이션한 후에, 각 샘플에 300 ㎕의 결합 완충액을 첨가하여 유세포 분석기(Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)로 1시간 이내에 즉시 분석하였다.

10. 카스파아제 -3 활성 분석

세포 용해액내에서 카스파아제-3-유사 프로테아제의 활성은 제조자의 프로토콜에 따라 약간의 변형을 가하여 비색형 카스파아제-3 분석 키트(Sigma)를 사용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면, 반응혼합액(총 부피, 1000 ㎕)은 완충액내에서 100 ㎕의 세포 용해액과 10 ㎕의 카스파아제-3 기질, 아세틸-Asp-Glu-Val-Asp-p-니트로아닐라이드(최종 농도, 200μM)를 포함하였다. 기질의 비특이적 가수분해를 설명하기 위해 대조군 반응 혼합액을 분석 완충액내에 100 ㎕의 세포 용해액, 10 ㎕의 기질 및 10 ㎕(최종 농도, 20 μM)의 특이적 카스파아제-3 억제자, 아세틸-DEVD-CHO를 포함시켰다. 양쪽 혼합물을 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하고 405 nm에서 Evolution 5000 UV Visible spectrophotometer (Thermo Electron Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 카스파아제-3 억제자를 사용하여 얻은 흡광도 데이터는 카스파아제-3 억제자 없이 측정한 것으로부터 차감하여 비특이적 가수분해에 대해 보정하였다. 용기 대조군과 블랭크(blank)를 고려하여, 카스파아제-3 단백질을 양성 대조군으로 사용하였다.

11. p21 프로모터 리포터 분석

p21의 전사조절에 대한 FTS의 영향은 p21 프로모터(루시퍼라아제)-리포터 컨스트럭트으로 일시적 트랜스펙션을 행하여 검사하였다. 전장의 p21 프로모터 cDNA를 표준방법을 사용하여 pGL3안으로 서브클로닝하였다. 다음의 플라스미드를 사용하였다: pGL3-p21 (firefly 루시퍼라아제 리포터 유전자에 연결된 인간 p21 프로모터를 포함함), pRLTK (항상적으로 활성인 Renilla 루시퍼라아제 리포터 유전자에 연결된 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한 내부 대조군 플라스미드), 및 pGL3 (음성대조군으로서 플라스미드 벡터 자체). HeLa-siV 또는 HeLa-siFTS 세포(1.0 X 10⁶)를 24-웰 플레이트안으로 접종하고, pRLTK 및 pGL3-p21 컨스트럭트를 제조자의 지시에 따라 WelFect-ExTM plus Reagent (WelGENE, 대구, 한국)를 사용하여 세포안으로 공동트랜스펙션하였다. HEK293 세포의 경우 Myc-FTS를 pGL3-p21P, pRLTK와 함께 공동 트랜스펙션하였다. 세포를 트랜스펙션 배지내에서 3 시간 동안 인큐베이션한 후에 배지를 혈청 배지로 교환하였다. 24 시간 인큐베이션한 후에, 세포들을 수동 용해 완충액(Dual-Luciferase Reporter Assay System, Promega)으로 수집하고, 루시퍼라아제 활성을 제조자의 프로토콜에 따라 단일 샘플 광도측정기를 사용하여 측정하였다.

12. 면역형광 ( Immunofluorescence )

HeLa, ME180, SiHa 및 CaSki 세포주를 커버 슬립상에서 70％ 컨플루언스에 도달할 때 까지 배양하고, 4％ 파라포름알데히드로 고정하였다. 간단하게 세정한 후 PBST내에서 10％의 FBS로 블로킹하고, 블로킹된 세포를 항-FTS 1차 항체를 사용하여 1 시간 동안 처리하였다. 발현은 Alexa-488 컨쥬게이트된 고우트 항-마우스 2차 항체를 사용하여 Confocal microscope Leica DM IRB (Germany)를 사용하여 측정하였다.

13. 면역염색 ( Immunohistochemistry )

면역조직화학 염색은 항원을 회수한 후 제조자의 지시에 따라 Immunohistochemistry Accessory Kit (Bethyl Laboratories Montgomery, TX, USA)를 사용하여 파라핀-봉매된 조직 섹션에 대해서 행하였다. 간략하게 설명하면, 파라핀을 제거한 섹션을 시트레이트 완충액 pH 6.0을 사용하여 마이크로파 오븐내에서 6 분간 인큐베이션 하여 항원을 회수하였다. 내재성 퍼옥시다아제는 메탄올 내에서 0.6％ 과산화수소를 사용하여 20분간 블로킹하였다. 조직 섹션을 단백질 블로킹 용액을 사용하여 30 분간 처리하였다. 1차 항체 (희석율 FTS 1:100, p21 1:50)를 슬라이드에 가하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBST내에서 세정한 후, 섹션을 적합한 2차 항체와 함께 60 분간 인큐베이션하였다. 색깔 반응은 Liquid DAB substrate Pack (Bethyl Laboratory, Montgomery, TX, USA)를 사용하여 전개하였다. 섹션을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색하였다.

14. 면역반응성의 평가

FTS의 면역반응성은 갈색 DAB 컬러 전개의 강도와 양성을 나타내는 세포에 기초하여 등급을 정하였다. 양성을 보이는 필드에서 적어도 10％ 세포는 의미있는 FTS 발현을 하는 것으로 간주되고, 10-25％의 세포는 약한 발현을 보이고, 26-50％는 중간의 발현을 나타내며, 51％ 이상은 강한 발현을 나타내는 것으로 하였다.

15. 통계학적 분석

FTS의 상관성을 확인하기 위해 SPSS 소프트웨어 시스템을 사용하여 조직병리학적 등급과 p21 상태와 함께 스피어만의 순위상관(Spearman rank correlation) 및 χ² 분석을 사용하였다.

실험결과

1. FTS 는 자궁경부암에서 과발현되었다.

인간 자궁경부암에서의 FTS의 역할을 규명하기 위해, 7개의 정상상피, 8개의 CIN I, 10개의 CIN Ⅱ, 11개의 CIN Ⅲ 및 13개의 암 조직을 포함하는 다양한 병리적 상태에 있는 자궁경부조직을 면역조직화학을 이용하여 분석하였다. 흥미롭게도, 7개의 정상 상피조직내에서는 FTS 면역염색이 거의 관찰되지 않았다(도 1a 내지 도 1d 및 표 1). 반면에, 상당한 정도의 FTS 염색이 자궁경부 내부 암성 상피조직 및 암 샘플에서 관찰되었다. FTS 발현은 주로 세포질에서 검출되었다. 암성 상피조직중에서 오직 하나의 샘플에서만 FTS 음성을 보였고 나머지 41/42 (97.6％)에서 질환의 등급에 상관되는 다양한 수준의 FTS 발현을 나타냈다(표 1). 표 1에는 정상조직 및 자궁경부암의 상이한 등급의 조직에 대해 항-FTS 항체를 사용하여 면역염색한 결과를 정리한 것을 보여준다.

FTS 발현은 CIN 등급 (CIN I - CIN Ⅲ)의 진전에 따라 점진적으로 증가하였다(도 1a 내지 도 1c, 도 6a 내지 도 6d). FTS 면역염색은 CIN Ⅲ 샘플과 비교할 때 암조직에서 감소하였다(도 1d 및 도 6a 내지 도 6d). FTS 발현과 CIN 등급 사이의 연관성의 강도를 평가하기 위해, χ² 테스트를 행하였다.

상기 표 1에 나타나는 바와 같이 χ² 테스트에 따라 관련성에 대한 가정은 매우 큰 의미를 나타내었다(p 값 < 0.0001). 또한, 스피어만 순위 상관을 사용하여 FTS 발현 및 CIN 등급에 적용하였다. FTS 발현과 CIN 등급과는 스피어만 순위 상관계수 0.69 및 P 값 < 0.0001으로 상당한 상관관계가 나타났다.

2. 자궁경부 암세포내에서 FTS의 차별적 발현 및 인 비트로에서 FTS의 억제에 의한 HeLa 세포의 성장 및 생존 저해

상기 조직 샘플에서 확인된 실험결과가 자궁경부암세포주, HeLa, ME180, CaSki 및 SiHa 세포에서도 나타나는 지 확인하였다. FTS의 발현을 웨스턴 블로팅 및 면역형광을 이용하여 분석하였다. 분석된 모든 세포주 중에서 HeLa는 FTS를 고도의 수준으로 발현하는 반면, CaSki는 매우 낮은 발현수준을 보였다(도 2a의 패널 a). FTS 단백질은 3가지 세포주, ME180, SiHa 및 CaSki 세포주의 경우 주로 핵에 위치한 반면, HeLa 세포주의 경우 명확하게 핵/세포주 분포를 보였다(도 2a의 패널 b-e).

렌티바이러스 매개 트랜스펙션 및 푸로마이신 선별을 사용하여 안정하게 FTS-발현억제된 HeLa 세포주 (HeLa-siFTS)를 확립하였다. 모 HeLa 세포가 다른 자궁경부암 세포주 보다 더 높은 수준으로 FTS를 발현하였기 때문에(도 2a), 빈 벡터를 갖는 HeLa 세포(HeLa-siV)를 대조군으로 하였다.

HeLa-siFTS 세포내에서 단백질 수준에서의 FTS의 발현 감소는 HeLa-siV 세포와 비교하여 볼 때 확인되었다(도 2b). HeLa-siFTS 세포내에서 FTS의 감소는 세포 증식 및 성장의 감소와 상관되어 있었다(도 2c). 콜로니 형성 분석에서 콜로니 형성 효율은 HeLa-siV 세포와 비교하여 HeLa-siFTS 세포의 경우 현저하게 감소하였다(도 2d).

3. FTS 억제에 의해 세포가 G0/G1에 정지되었다.

HeLa-siFTS를 사용하여 세포주기 분석 실험을 행하였다. HeLa-siFTS 세포에서 FTS를 억제한 결과 HeLa-siV 세포와 비교하여 S phase에서의 세포군집을 감소시키고 G0/G1 phase에서의 세포 군집은 축적시켰다. HeLa-siFTS 세포는 G0/G1, S 및 G2/M phases에서의 세포 비율이 각각 67.18％, 17.44％ 및 15.38％ 이었고, 이에 비해, HeLa-siV 세포는 59.86％, 34.08％ 및 6.06％이었다(도 3a). 흥미롭게도 G0에서의 세포 축적은 증가된 아폽토시스가 HeLa 세포에서의 FTS의 억제와 관련이 있었다.

4. FTS 억제는 세포주기 조절 및 억제에 영향을 미친다.

FTS 녹다운 매개 세포주기 정지 및 G0/G1에서의 축적에 대한 분자 메카니즘을 확인하기 위해, 세포주기 전개 및 세포 생존을 조절하는데 관련된 단백질들의 패널을 체크하였다. 세포주기에서 가장 중요한 체크 포인트 중에 하나는 D 타입 사이클린, CDK4 및 CDK6에 의해서 조절되는 G1 phase이다. FTS 억제에 의해 HeLa-siFTS 세포내에서 초기 G1 phase D 타입 사이클린 및 CDKs 모두의 단백질 발현이 극적으로 변화하였다(도 3b). HeLa-siFTS 세포는 사이클린 D1 및 D3 단백질의 발현이 현저하게 감소함을 보여준다(도 3b, 패널 2 및 3). 사이클린의 데이터와 일치하게 G1/S phase 전이를 조절하는 초기 G1 CDK, CDK6의 단백질 발현이 현저하게 감소하였다. 반면, 다른 조절자인 G1, CDK4은 약간 변화하였다(도 3b, 패널 4 및 5). 이러한 결과는 FTS 녹다운이 HeLa 세포를 GO/G1 초기에서 정지시킨다는 것을 의미한다. CDKs는 p16, p21 및 P27와 같은 CDK 억제자의 조절 범위내에 있으며, 상기 CDK 억제자들의 임상적 의미는 이미 공지되어 있다(10-12).

FTS 녹다운 세포 및 대조군 세포에서 CDK 억제자의 발현은 웨스턴 블로팅 분석을 통해 측정하였다(도 3b). FTS 억제는 p21, p27 및 p16의 발현을 현저하게 증가시켰다. 3 가지의 억제자 중에서 p21은 FTS 녹다운에 의해 가장 크게 증가한 반면, 다른 억제자 p15는 변화가 없었다(도 3b, 패널 6 내지 9).

상기 실험 결과를 종합하여 보면, FTS 녹다운이 p21의 발현을 상향조절시키면서 G0/G1에서 세포를 정지시킨다는 것을 알 수 있다. 또한, 아폽토시스를 의미하는 세포의 sub-G1 세포군집에서의 축적이 크게 증가하였다.

5. FTS 및 p21 사이의 인과관계

HeLa-siFTS 세포내에서 p21의 증가된 발현에 대해 더욱 상세히 조사하기 위해, p21 프로모터의 전사 조절하에 있는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 갖는 p21P 플라스미드 컨스트럭트를 HeLa-siFTS 세포 및 HeLa-siV 세포안으로 트랜스펙션하였다. 루시퍼라아제 활성은 HeLa-siFTS 세포내에서 매우 크게 증가하였다(도 4a). 이 실험결과를 보다 더 자세히 확인하기 위해, HEK293 세포를 농도를 증가시키면서 Myc-FTS 및 p21P 플라스미드로 공동-트랜스펙션하였고, 루시퍼라아제 활성은 듀얼 루시퍼라아제 분석을 사용하여 측정하였다.

도 4b에서 나타난 바와 같이, mock-트랜스펙션된 세포와 비교하여, FTS의 일시적 발현은 p21 프로모터 활성을 효과적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 FTS가 p21의 발현을 전사적(transcriptionally)으로 억제한다는 것을 신빙성 있게 제시하는 결과이다.

자궁경부암세포에서 FTS 및 p21 사이의 인과적 관계가 확인되었으므로, 인간 조직에서 이 단백질들의 발현 패턴이 동일하게 나타나는 지 분석하였다. 앞선 실험결과로부터 면역염색 데이터에 의해 CIN 및 암의 등급의 발전에 따라 FTS 및 p21의 발현이 상호관련성이 있다는 것을 알 수 있었다. FTS 고발현 foci은 p21의 발현이 적거나 매우 낮았으나, 반면에 p21을 발현하는 정상 foci은 FTS가 발현이 없거나 거의 발현되지 않았다(도 4c). 스피어만 순위상관 분석에 의하면 FTS 및 p21이 -0.546 및 p 값 < 0.001으로 현저하게 상관성을 보였다. 또한, FTS 및 p21 사이의 결합을 평가하기 위한 테스트를 행하였다. 실험결과, FTS는 p21와 현저하게 결합(association)하였다. 이들 결과를 종합하면, 인간 자궁경부암에서 FTS 및 p21 간의 현저한 네가티브 상관관계가 있다는 것을 뒷받침한다.

6. FTS 억제는 HeLa 세포내에서 아폽토시스를 촉진한다.

세포 주기 동안에 HeLa 세포내에서의 FTS 녹다운에 의해 세포들이 G0에 축적된다는 결과를 바탕으로, AnexinV 염색 및 유세포 분석을 사용하여 이들 녹다운 세포들의 아폽토시스의 양을 분석하였다. HeLa-siV 세포와 비교하여 FTS 녹다운 HeLa-siFTS 세포에서만 매우 현저한 정도로 아톱토시스가 발생되는 것이 관찰되었다(도 5a). 이러한 아폽토시스 효과의 배경 경로를 알아보기 위해, HeLa-siFTS 세포 및 HeLa-siV 세포내에서 친-아폽토시스 단백질(Bax)와 생존 단백질 (Bcl-2, XIAP, Survivin)을 분석하였다. HeLa-siFTS에서 Bax만이 약간 증가한 것을 제외하고는 이들 단백질 수준의 변화는 없었다(도 5b). 이와 함께, 이들 세포내에서 카스파아제-3(caspase-3) 활성화를 분석하였다. 놀랍게도 FTS 녹다운 HeLa-siFTS 세포내에서 카스파아제-3의 활성이 4 배나 증가하였다(도 5c). 이 실험결과는 FTS 녹다운에 의해 자궁경부암에서 아폽토시스가 촉진된다는 것을 의미하며, FTS는 자궁경부암 치료의 적합한 드럭 타겟이 될 수 있다는 것을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Wentzensen N, Klug SJ. Early detection of cervical carcinomas: finding an overall approach. Dtsch Arztebl Int 2008;105: 617-22.

2. Gustafsson L, Ponten J, Zack M, Adami HO. International incidence rates of invasive cervical cancer after introduction of cytological screening. Cancer Causes Control 1997;8: 755-63.

3. Buckley CH, Butler EB, Fox H. Cervical intraepithelial neoplasia. J Clin Pathol 1982;35: 1-13.

4. Tabbara S, Saleh AD, Andersen WA, Barber SR, Taylor PT, Crum CP. The Bethesda classification for squamous intraepithelial lesions: histologic, cytologic, and viral correlates. Obstet Gynecol 1992;79: 338-46.

5. Bosch FX, Manos MM, Munoz N, et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC) Study Group. J Natl Cancer Inst 1995;87: 796-802.

6. Lesche R, Peetz A, van der Hoeven F, Ruther U. Ft1, a novel gene related to ubiquitin-conjugating enzymes, is deleted in the Fused toes mouse mutation. Mamm Genome 1997;8: 879-83.

7. Peters T, Ausmeier K, Dildrop R, Ruther U. The mouse Fused toes (Ft) mutation is the result of a 1.6-Mb deletion including the entire Iroquois B gene cluster. Mamm Genome 2002;13: 186-8.

8. Remy I, Michnick SW. Regulation of apoptosis by the Ft1 protein, a new modulator of protein kinase B/Akt. Mol Cell Biol 2004;24: 1493-504.

9. Xu L, Sowa ME, Chen J, Li X, Gygi SP, Harper JW. An FTS/Hook/p107(FHIP) complex interacts with and promotes endosomal clustering by the homotypic vacuolar protein sorting complex. Mol Biol Cell 2008;19: 5059-71.

10. Santopietro R, Shabalova I, Petrovichev N, et al. Cell cycle regulators p105, p107, Rb2/p130, E2F4, p21CIP1/WAF1, cyclin A in predicting cervical intraepithelial neoplasia, high-risk human papillomavirus infections and their outcome in women screened in three new independent states of the former Soviet Union. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006;15: 1250-6.

11. Troncone G, Vetrani A, de Rosa G, Gerbasio D, Palombini L. Cyclin dependent kinase inhibitor p27Kip1 expression in normal and neoplastic cervical epithelium. J Clin Pathol 1999;52: 880-7.

12. Clarke B, Chetty R. Cell cycle aberrations in the pathogenesis of squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Gynecol Oncol 2001;82: 238-46.

13. el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993;75: 817-25.

14. Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 1993;75: 805-16.

15. Sheikh MS, Li XS, Chen JC, Shao ZM, Ordonez JV, Fontana JA. Mechanisms of regulation of WAF1/Cip1 gene expression in human breast carcinoma: role of p53-dependent and independent signal transduction pathways. Oncogene 1994;9: 3407-15.

16. Zhang W, Grasso L, McClain CD, et al. p53-independent induction of WAF1/CIP1 in human leukemia cells is correlated with growth arrest accompanying monocyte/macrophage differentiation. Cancer Res 1995;55: 668-74.

17. Elbendary A, Berchuck A, Davis P, et al. Transforming growth factor beta 1 can induce CIP1/WAF1 expression independent of the p53 pathway in ovarian cancer cells. Cell Growth Differ 1994;5: 1301-7.

18. Lodygin D, Menssen A, Hermeking H. Induction of the Cdk inhibitor p21 by LY83583 inhibits tumor cell proliferation in a p53-independent manner. J Clin Invest 2002;110: 1717-27.

19. Michieli P, Chedid M, Lin D, Pierce JH, Mercer WE, Givol D. Induction of WAF1/CIP1 by a p53-independent pathway. Cancer Res 1994;54: 3391-5.

20. Grana X, Garriga J, Mayol X. Role of the retinoblastoma protein family, pRB, p107 and p130 in the negative control of cell growth. Oncogene 1998;17: 3365-83.

21. zur Hausen H. Oncogenic DNA viruses. Oncogene 2001;20: 7820-3.

22. Horowitz JM, Park SH, Bogenmann E, et al. Frequent inactivation of the retinoblastoma anti-oncogene is restricted to a subset of human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87: 2775-9.

23. Wang X, Gorospe M, Huang Y, Holbrook NJ. p27Kip1 overexpression causes apoptotic death of mammalian cells. Oncogene 1997;15: 2991-7.

24. Katner AL, Gootam P, Hoang QB, Gnarra JR, Rayford W. A recombinant adenovirus expressing p7(Kip1) induces cell cycle arrest and apoptosis in human 786-0 renal carcinoma cells. J Urol 2002;168: 766-73.

25. Katayose Y, Kim M, Rakkar AN, Li Z, Cowan KH, Seth P. Promoting apoptosis: a novel activity associated with the cyclin-dependent kinase inhibitor p27. Cancer Res 1997;57: 5441-5.

26. Jin YH, Yoo KJ, Lee YH, Lee SK. Caspase 3-mediated cleavage of p21WAF1/CIP1 associated with the cyclin A-cyclin-dependent kinase 2 complex is a prerequisite for apoptosis in SK-HEP-1 cells. J Biol Chem 2000;275: 30256-63.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

1. 대상자(subject)의 시료로부터 FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 mRNA 또는 FTS 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
   상기 FTS 유전자의 mRNA의 발현 수준의 측정은 (a) 대상자의 시료로부터 상기 FTS 유전자의 mRNA를 분리하고 이 mRNA에 대한 cDNA를 합성하는 단계; 및 (b) 상기 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 또는 혼성화(hybridization) 반응을 행하는 단계를 포함하고,
   상기 FTS 단백질의 발현 수준의 측정은 (a)' 대상자의 시료에 검출가능한 신호(signal)을 발생시킬 수 있는 표지(label)가 결합된 FTS 단백질에 대한 항체를 접촉시키는 단계; 및 (b)' 상기 FTS 단백질에 결합된 항체의 표지로부터 발생되는 신호(signal)을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 FTS 유전자의 mRNA의 발현 수준의 측정은 RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction)에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 삭제
5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 FTS 유전자의 mRNA 또는 FTS 단백질의 발현 수준이 정상 시료에 비해 자궁경부암 시료에서 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. (a) FTS (Fused Toes Homologue) 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 (b) FTS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물.
   
7. FTS (Fused Toes Homologue) 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (small interference RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA)를 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 치료용 조성물.
   
8. 삭제
9. 제 7 항에 있어서, 상기 FTS 유전자의 shRNA는 서열목록 제 4 서열, 제 5 서열 또는 제 6 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료용 조성물.
   
10. 삭제
11. 다음의 단계를 포함하는 자궁경부암의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) FTS (Fused Toes Homologue) 유전자를 포함하는 세포 또는 조성물에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 FTS 유전자의 발현량, 또는 FTS 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 시료에 의해 상기 FTS 유전자의 발현량, 또는 FTS 단백질의 양이 하향조절(down-regulation)되는 경우 상기 시료를 자궁경부암의 치료 또는 예방 물질로 판정하는 단계.
    
12. FTS (Fused Toes Homologue) 유전자를 포함하는 자궁경부암의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 용도의 조성물.
    

Images