JP6295322B2 - hCTOを利用するPTO切断及び延長分析による固相におけるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents
hCTOを利用するPTO切断及び延長分析による固相におけるターゲット核酸配列の検出 Download PDFInfo
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Description
本発明の一様態において、以下の段階を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する:
(a)ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列(hybridizing nucleotide sequence)を含み、前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記PTOの3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置する)と、
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階(前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導して、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する)と、
(c)前記PTOから放出された前記断片をhCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記hCTOは、(i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位(hybridizing portion)を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる)と、
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階(前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片の配列及び/または長さ、(ii)前記hCTOの配列及び/または長さ、または(iii)前記断片の配列及び/または長さと前記hCTOの配列及び/または長さにより調節可能なTm値を有して、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する)と、
(e)前記一本鎖状態のhCTOのIO−ハイブリダイジング部位を前記IOとハイブリダイズさせる段階(前記固相基質上に固定された前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片及び/または前記hCTOに連結された少なくとも一つの標識、(ii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、(iii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び/または前記hCTOに連結された標識、または(iv)前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記IOに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する)と、
(f)前記延長デュープレックス及び前記IOデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相で前記延長デュープレックスを検出する段階(前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す)。
(a)本発明は、まずPTOをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせて、人為的に選択した配列を有するhCTOを鋳型として使用することにより、ターゲット−依存的な方式で延長デュープレックスを形成させて、最後に、前記延長鎖を固相に固定されたIOとハイブリダイズさせる。即ち、本発明は、PTOハイブリダイゼーション及び切断、hCTOハイブリダイゼーション及び延長並びにIOハイブリダイゼーションを含む一連の反応を利用し、本発明の特異性を非常に向上させる。
(b)固相は、制限された反応環境を提供することがあるため、固相基質上に固定されたオリゴヌクレオチド上で延長反応を実施する従来の接近法は、反応結果物を効率的に生成するとは限らない。本発明によると、延長デュープレックスは、ターゲット依存的方式で液相で生成されて、その存在が固相で検出される。hCTOは、固相に固定されていないため、前記延長デュープレックスは、液相でより効率的に形成される。
(c)延長デュープレックスの存在または不存在は、延長デュープレックス及び固相に固定されたIO間のハイブリダイゼーションを利用して固相で検出される。したがって、本発明は、単一類型のシグナリングシステムを利用するとしても、複数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。
(d)延長デュープレックスのある一本の鎖に相補的な配列を含むIOを利用する場合、IO及び延長デュープレックス間のハイブリダイゼーションは、前記延長デュープレックスの他の鎖の存在により邪魔されえる。本発明の方法は、延長デュープレックスにおいて、一本鎖部位を持つことのできるhCTOを利用することにより、このような問題点を完全に克服し、より効率的にIO及び延長デュープレックス間のハイブリダイゼーションを可能にする。
(e)本発明において、延長デュープレックスとIOとのハイブリダイゼーションまたは専らhCTOとIOとのハイブリダイゼーションは、固相に提供されるシグナルの生成、消滅または変化(減少または増加)を測定することにより決定される。前記シグナルは、断片、hCTOまたはIOに連結された標識及び/または延長−依存的挿入標識により提供できる。
(f)本発明は、(i)断片の配列及び/または長さ、(ii)hCTOの配列及び/または長さ、または(iii)断片の配列及び/または長さとhCTOの配列及び/または長さにより調節可能な、予め指定されたTm値を有するターゲット依存的延長デュープレックスを提供する。また、IO及びhCTOのIO−ハイブリダイジング部位間のハイブリダイゼーションにより形成されたIOデュープレックスのTm値は、多様に調節できる。
(g)PTOの5’−タギング部位の配列、hCTOの配列及びIOの配列が、ターゲット核酸配列を考慮するなく選択できるということは、注目すべきことである。これは、PTOの5’−タギング部位、hCTO及びIOのための配列プール(pool)を予めデザインすることを可能にする。PTOの3’−ターゲッティング部位は、必ずターゲット核酸配列を考慮して準備しなければならないが、hCTO及びIOは、ターゲット核酸配列に対する考慮や知識無しに、予め制作された方式で準備することができる。
本発明によると、まずターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる。
次いで、PTOの切断のための条件下で前記段階(a)の結果物を5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたPTOは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断されて、PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。
前記PTOから放出された断片は、hCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)とハイブリダイズされる。
前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を実施する。(前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて、前記hCTOのテンプレーティング部位に相補的な延長鎖を形成し、これにより延長デュープレックスを形成する。前記IO−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態に維持される。結果的に、一本鎖部位を含む延長デュープレックスが形成される。
次いで、段階(d)の結果物は、固相基質上の固定化オリゴヌクレオチド(Immobilized Oligonucleotide; IO)とハイブリダイズされる。
特定具現例において、前記ターゲットシグナルは、断片及び/またはhCTOに連結された少なくとも一つの標識により提供される。延長デュープレックスは、PTO断片及びhCTO間に形成されて、断片及び/またはhCTOに連結された標識は、延長デュープレックスに存在し、ターゲットシグナルを提供する。
相互作用的標識システムの代表的例として、FRET(fluorescence resonance energy transfer)標識システムは、蛍光レポーター分子(供与体分子)及びクエンチング分子(受容体分子)を含む。FRETにおいてエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非−蛍光性である。相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団(chromophore)であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性(luminescent)、例えば、生物発光性、化学発光性、電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。前記供与体分子及び受容体分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子として表現できる。相互作用的標識システムは、接触媒介クエンチング(contact−mediated quenching)に基いて検出可能なシグナルを提供する標識対を含む(Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson et al., J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950−6956)。本発明において、相互作用的標識システムは、少なくとも二つの分子(例えば、染料)間の相互作用によりシグナル変化を誘導する、あらゆる標識システムを含む。
単一標識の一具現例において、hCTOは、単一標識を有して、前記段階(d)において、断片の延長は、単一標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。一具現例において、hCTO上の単一標識は、前記段階(d)において、断片の延長により単一標識からのシグナルの変化が誘導されるサイトに位置する。一具現例において、単一標識は、hCTOのテンプレーティング部位に位置する。一具現例において、本発明は、hCTOがIOとハイブリダイズすることを含むため、二本鎖に存在するか一本鎖に存在するかによって相異なるシグナルを提供できる単一標識が、本発明で有用である。上記のような特性を有する限り、どんな単一標識でも使用できる。上記特性の単一蛍光標識の例は、単一蛍光標識の種類及び好ましい結合一を記述する文献[米国特許第7,537,886号及び第7,348,141号]に開示されている。一具現例において、前記単一蛍光標識は、JOE、FAM、TAMRA、ROX及びフルオレセインベースの標識を含む。一具現例において、標識されるヌクレオチドの残基は、5’−末端または3’−末端よりは、オリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
本発明は、延長デュープレックスの存在を示すターゲットシグナルを提供するために、延長デュープレックス内に挿入された標識を利用することができる。
延長反応の間に挿入された標識と断片及び/またはhCTOに連結された標識を利用する一具現例において、ターゲットシグナルは、延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識と断片及び/またはhCTOに連結された標識により提供されて、前記挿入された標識は、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であって、前記段階(d)における断片の延長は、相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、ターゲットシグナルを提供する。
断片に連結された標識または延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識及びIOに連結された標識を利用する一具現例において、ターゲットシグナルは、断片に連結された標識または延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識及びIOに連結された標識により提供されて、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に延長デュープレックス内に挿入された標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記IOは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記段階(e)において、前記延長デュープレックスとIOのハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供する。
最終的に、延長デュープレックスは、ターゲットシグナルを測定することにより固相で検出されて、前記延長デュープレックスの存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の他の様態において、本発明は、以下の段階を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み、前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記PTOは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置して、前記PTOは、その延長が防止されるように、その3’−末端がブロッキングされている)と、
(b)前記プライマーの延長及び前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階(前記PTOが前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされると、前記アップストリームプライマーは、延長されて、前記延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記PTOの切断を誘導して、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する)と、
(c)前記PTOから放出された前記断片をhCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記hCTOは、(i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる)と、
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階(前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片の配列及び/または長さ、(ii)前記hCTOの配列及び/または長さ、または(iii)前記断片の配列及び/または長さと前記hCTOの配列及び/または長さにより調節可能なTm値を有して、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する)と、
(e)前記一本鎖状態のhCTOのIO−ハイブリダイジング部位を前記IOとハイブリダイズさせる段階(前記固相基質上に固定された前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片及び/または前記hCTOに連結された少なくとも一つの標識、(ii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、(iii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び/または前記hCTOに連結された標識、または(iv)前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記IOに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する)と、
(f)前記延長デュープレックス及び前記IOデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相基質上で前記延長デュープレックスを検出する段階(前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す)。
本発明のまた他の様態において、本発明は、以下の段階を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列をPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない)と、
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階(前記PTOは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記PTOは、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素により切断され、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する)と、
(c)前記PTOから放出された前記断片をhCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階(前記hCTOは、(i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる)と、
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階(前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片の配列及び/または長さ、(ii)前記hCTOの配列及び/または長さ、または(iii)前記断片の配列及び/または長さと前記hCTOの配列及び/または長さにより調節可能なTm値を有して、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する)と、
(e)前記一本鎖状態のhCTOのIO−ハイブリダイジング部位を前記IOとハイブリダイズさせる段階(前記固相基質上に固定された前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片及び/または前記hCTOに連結された少なくとも一つの標識、(ii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、(iii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び/または前記hCTOに連結された標識、または(iv)前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記IOに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する)と、
(f)前記延長デュープレックス及び前記IOデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相基質上で前記延長デュープレックスを検出する段階(前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す)。
本発明の追加的な様態において、本発明は、以下を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出するためのキットを提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチドと、
(b)PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)(前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記PTOの3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導して、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する)と、
(c)hCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)(前記hCTOは、 (i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、鋳型−依存的核酸重合酵素により延長されて延長デュープレックスを形成する)と
(d)前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む前記固相基質上に固定されたIO(前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成する)。
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)、hCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)及び固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)を利用したPCE−hCTO分析が、ターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。
NG_F 5’−TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG−3’(配列番号:1)
NG_R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC−3’(配列番号:2)
PTO 5’−[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]−3’(配列番号:3)
hCTO−1 5’−TCCTGCTCGTCCTCGTGCTCTTAGGT[Spacer 18]AGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]−3’(配列番号:4)
IO−1 5’−ACCTAAGAGCACGAGGACGAGCAGGATTTTTTTTTT[AminoC7]−3’(配列番号:5)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(配列番号:6)
(I: デオキシイノシン)
(下線を引いた文字は、PTO−NVの5’−タギング部位を示す)
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたPTO、3’末端にIO−ハイブリダイジング部位を有するhCTO及びIOを利用したPCE−hCTO分析が、ターゲット核酸配列を検出できるかどうかを実験した。
NG_F 5’−TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG−3’(配列番号:1)
NG_R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC−3’(配列番号:2)
PTO 5’−[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]−3’(配列番号:3)
hCTO−2 5’−AGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGTTTTTCCTGCTCGTCCTCGTGCTCTTAGGT[C3 spacer]−3’(配列番号:7)
IO−2 5’−[AminoC6]TTTTTTTTTTACCTAAGAGCACGAGGACGAGCAGGA[C3 spacer]−3’(配列番号:8)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(配列番号:6)
(I: デオキシイノシン)
(下線を引いた文字は、PTO−NVの5’−タギング部位を示す)
Claims (24)
- (a)ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びPTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み、前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記PTOの3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置する、と、
(b)前記PTOの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階;前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導して、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する、と、
(c)前記PTOから放出された前記断片をhCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide)とハイブリダイズさせる段階;前記hCTOは、(i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる、と、
(d)前記段階(c)の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階;前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成し、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片の配列及び/または長さ、(ii)前記hCTOの配列及び/または長さ、または(iii)前記断片の配列及び/または長さと前記hCTOの配列及び/または長さにより調節可能なTm値を有して、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位は、一本鎖状態を維持する、と、
(e)前記一本鎖状態のhCTOのIO−ハイブリダイジング部位を前記IOとハイブリダイズさせる段階;前記固相基質上に固定された前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、(i)前記断片及び/または前記hCTOに連結された少なくとも一つの標識、(ii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、(iii)前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記断片及び/または前記hCTOに連結された標識、または(iv)前記断片に連結された標識、または前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された標識、及び前記IOに連結された標識によりターゲットシグナルを提供する、と、
(f)前記延長デュープレックス及び前記IOデュープレックスの両方とも二本鎖状態を維持する指定温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、固相で前記延長デュープレックスを検出する段階;前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す、と、
を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出する方法。 - 前記IO−ハイブリダイジング部位が前記CTOの5’−末端に位置する場合、前記hCTOは、前記CTOと前記IO−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットシグナルは、前記断片及び/または前記hCTOに連結された少なくとも一つの標識により提供されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記hCTOは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階(d)において、前記断片の延長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導して、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記hCTOは、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階(c)において、前記hCTOと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識を有して、前記段階(c)において、前記hCTOと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記断片は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記hCTOは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有して、前記段階(c)において、前記hCTOと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記hCTOは、単一標識を有して、前記段階(d)において、前記断片の延長は、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導して、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記hCTOは、単一標識を有して、前記段階(c)において、前記hCTOと前記断片のハイブリダイゼーションは、前記単一標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供して、前記延長デュープレックスは、前記ターゲットシグナルを維持することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記断片は、単一標識を有することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記ターゲットシグナルは、前記延長反応の間、前記延長デュープレックス内に挿入された単一標識により提供されて、前記挿入された単一標識は、前記延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットシグナルは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識と前記断片及び/または前記hCTOに連結された標識により提供されて、前記挿入された標識は、前記延長反応の間に挿入されたヌクレオチドに連結されており、前記二つの標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的二重標識であって、段階(d)において、前記断片の延長は、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲットシグナルは、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識及び前記IOに連結された標識により提供されて、前記断片に連結された標識または前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的二重標識の一つを有して、前記IOは、前記相互作用的二重標識の他の一つを有し、前記段階(e)において、前記延長デュープレックスと前記IOのハイブリダイゼーションは、前記相互作用的二重標識からのシグナルの変化を誘導し、前記ターゲットシグナルを提供することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階(a)−(f)の全てまたは一部を繰り返すことを追加的に含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記段階(a)−(f)は、一つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で行うことを特徴とする請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から15のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
(a)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチドと、
(b)PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide);前記PTOは、(i)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む3’−ターゲッティング部位及び(ii)前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む5’−タギング部位を含み、前記PTOの3’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされて、前記5’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記PTOのアップストリームに位置して、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記PTOの切断を誘導して、このような前記切断は、前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部を含む断片を放出する、と、
(c)hCTO(hybridizing−Capturing and Templating Oligonucleotide);前記hCTOは、(i)3’→5’方向に前記PTOの5’−タギング部位または5’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び前記PTOの5’−タギング部位及び3’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含むCTO、及び(ii)固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド(immobilized oligonucleotide; IO)に相補的なヌクレオチド配列を含むIO−ハイブリダイジング部位を前記CTOの3’−または5’−末端に含み、前記PTOから放出された断片は、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされて、前記hCTOのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、鋳型−依存的核酸重合酵素により延長されて延長デュープレックスを形成する、と、
(d)前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位に相補的なヌクレオチド配列を含む前記固相基質上に固定されたIO;前記IOは、前記hCTOのIO−ハイブリダイジング部位とハイブリダイズしてIOデュープレックスを形成する、と、
を含む、hCTOを利用するPTO切断及び延長(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE−hCTO)分析によりDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を固相で検出するキット。 - 前記IO−ハイブリダイジング部位が前記CTOの5’−末端に位置する場合、前記hCTOは、前記CTOと前記IO−ハイブリダイジング部位間に前記断片の延長反応を防止するブロッカー部位をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載のキット。
- 前記断片及び/または前記hCTOは、少なくとも一つの標識を有することを特徴とする請求項17に記載のキット。
- 前記標識は、単一標識または相互作用的二重標識であることを特徴とする請求項19に記載のキット。
- 前記キットは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含むことを特徴とする請求項17に記載のキット。
- 前記キットは、前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記断片及び/または前記hCTOは、少なくとも一つの標識を有することを特徴とする請求項17に記載のキット。
- 前記断片が標識を有するか、あるいは前記キットが前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入される標識をさらに含み、前記IOは、標識を有することを特徴とする請求項17に記載のキット。
- 前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項17から23のいずれかに記載のキット。
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