CN101942037A - 一种制备低分子量透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型制备低分子量透明质酸的方法，该方法以透明质酸(Mw2.8×106)为原料，通过机械研磨方法可以有效降级透明质酸的相对分子量，得到不同低分子量的透明质酸，其中研磨温度为室温，研磨时间为0.5-12h，振荡频率为10-30Hz。本发明通过机械研磨方法制备含有不同相对分子量的透明质酸。可以将其平均分子量降低到一万以下。研磨时间越长，振荡频率越高，得到的透明质酸的平均分子量越低。该法操作简便，降解过程中无需添加任何物质，无需后处理，属于清洁、绿色方法。
Description
发明领域
本发明涉及于一种降解透明质酸的新方法，属于生物化学技术领域。
发明背景
透明质酸(Hyaluronic acid，hyaluronan，简称HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一种独特的高分子量的直链酸性黏多糖，最早是由美国Meyer(Meyer K，Palmer J W.The polysaccharide of the vitreous humor[J].J.Biol.Chem.1934，107：629-634.)等从牛眼玻璃体中分离得到，它是由(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1→4)-D-D-葡萄醛酸双糖单位反复交替连接所组成的直链粘多糖，其结构如结构式1所示：
结构式1
目前制备的透明质酸相对分子质量在(80-500)×104Da范围内，相对分子质量不同，其性能有较大差异。研究表明，HA的多种生物活性具有相对分子质量依赖性，低分子量HA具有某些生物活性，而高分子量HA就没有或具有相反的作用。在实际应用中，要根据需要对透明质酸进行降解。透明质酸降解的方法主要为物理降解、化学降解和酶降解(崔向珍，王凤山，刘爱华，郭学平。低分子量和寡聚透明质酸研究进展[J].2006，(8)3：6-9.)。物理降解方法无需加入任何化学物质或酶，主要有微波和超声波两种方法。超声波可以明显降解透明质酸，然而超声波降解大分子速度较慢，而且单独使用超声波很难将透明质酸的相对分子质量降解至20万以下，对于需要更低相对分子质量的透明质酸甚至透明质酸寡聚糖还不能满足要求。(覃彩凤，王淼，陈晓峰。透明质酸的降解方法及工艺条件研究[J].2007，4：32-36.)。化学降解法主要分为碱水解、酸水解和氧化降解，需要较剧烈的反应条件，如较高的酸、碱浓度等，容易使糖链上的糖苷键断裂。目前一般用过氧化氢和抗坏血酸氧化降解法生产小分子量透明质酸，此方法属于氧化还原反应制备小分子量聚合物的应用技术领域。中国专利公开号CN 101293934A，公开日是2008年10月29日，名称为“一种用过氧化氢和抗坏血酸氧化降解法生产小分子量透明质酸的方法”中公开了一种采用过氧化氢(0.1～1.0mmol/g透明质酸)和抗坏血酸(0.05～0.5mmol/g透明质酸)氧化降解高分子量透明质酸生产小分子量透明质酸，温度为30～50℃，pH为4～6，反应时间为30～90min，所产生的小分子量透明质酸的分子量在20～100kDa之间。酶降解法提纯复杂，成本较高。中国专利公开号CN 101294179A，公开日是2008年10月29日，名称为“一种透明质酸发酵液中制备透明质酸的方法”中公开了一种在发酵过程中添加透明质酸酶生产小分子量透明质酸的方法，其工艺步骤为在发酵过程中(8h)添加透明质酸酶(0.05～0.25g/L)降解透明质酸，透明质酸的分子量由对照例(不加透明质酸酶)的1,300kDa降到20～100kDa。
机械研磨反应是一项可扩展的实验技术，在整个反应过程中不使用任何溶剂，使得整个反应过程中反应物都保持一个很大的浓度，加快反应速度，简化后处理过程，这些就是无溶剂化学反应的重要特点。近年来，无溶剂化学反应无疑已经成为一种重要的合成手段。把机械研磨方法应用到有机合成方面的例子也越来越多，利用它可以进行无溶剂反应来制备一些化合物，在反应过程中由于不需要使用有机溶剂，可以使得反应过程绿色化、减少废弃物、简化处理方法等等，有时也能提高反应的选择性，这使得机械研磨反应被认为是一种绿色化的反应过程。例如应用在无机材料的合成：一方面可以对无机材料(骨骼，陶瓷，纳米管等)进行研磨加工(得到粒度在100纳米以下的粉末)，另一方面还可以利用它合成具有某种功能的合金材料。作为无溶剂反应的一个方面，固相机械研磨技术(Suryanarayana，C.Prog.Mater.Sci.2001，46，1-184.)是近年来才被引入化学合成中的，并且由于其独特的性质而受到越来越多的关注(Beyer，M.K.；Clausen-Schaumann，H.Chem.Rev.2005，105，2921-2948.)。在机械研磨中使用的球磨机种类繁多，我们所使用的球磨机的研磨罐在水平方向上进行圆弧式径向振动，罐内的球体由于其惯性作用对位于光滑的研磨罐内额壁上的样品进行带有高能量的撞击，并以此粉碎样品。研磨罐的转动加上研磨球的运动对样品产生了高强度的混合作用。通过使用多个小球甚至可以进一步的提高混合的效果。当使用很多个小球(如玻璃球)时，生物细胞就可以被破碎了。球与球之间的摩擦撞击作用可以有效导致细胞的破碎。不同于一般的化学反应，研磨法通过充分地混合反应物增加反应表面积来改变反应的活性，由于反应过程中反应物的浓度非常大，接触非常充分，所以机械研磨反应一般速率要大于普通化学反应。
本发明采用医用透明质酸(Mw 2.8×106)为起始原料，用机械研磨方法对其进行降解，根据研磨时间的不同可以制备出不同平均分子量的透明质酸。研磨时间，振荡频率越高，得到的透明质酸的平均分子量越低。
对于我们提出的研磨法降解透明质酸衍生物的合成从未见文献报道。我们发明了一种新型的机械研磨法降解透明质酸的方法，可以制备不同平均分子量的透明质酸。
发明内容
本发明为克服上述现有技术中的不足，所解决的关键问题是提供一种获得低分子量透明质酸的方法。
本发明是采用以下技术方案实现的：将透明质酸放入固相球磨反应器直接固相研磨降解，其中研磨温度为室温，研磨时间为0.5-12h，振荡频率为10-30Hz。其中所述透明质酸的分子量Mw＝2.8×106。
本发明通过机械研磨方法可以有效降级透明质酸的相对分子量，得到不同低分子量的透明质酸，可以将其平均分子量降低到一万以下。研磨时间越长，振荡频率越高，得到的透明质酸的平均分子量越低。该法操作简便，降解过程中无需添加任何物质，无需后处理，属于清洁、绿色方法。
具体实施方式
本发明使用的固相球磨反应器为德国莱驰公司MM400型球磨仪固相研磨仪，其反应器的容积为5mL，并带有一个直径为6mm的不锈钢珠。
实施例1
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为30min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.468，平均分子量Mw＝1.144×106。
实施例2
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为60min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.444，平均分子量Mw＝5.043×105。
实施例3
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为120min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.425，平均分子量Mw＝3.009×105。
实施例4
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为180min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.368，平均分子量Mw＝1.604×105。
实施例5
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为360min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.112，平均分子量Mw＝8.949×104。
实施例6
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为720min，振动频率为10Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.595，平均分子量Mw＝2.569×104。
实施例7
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为30min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.303，平均分子量Mw＝4.832×105。
实施例8
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为60min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.321，平均分子量Mw＝2.348×105。
实施例9
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为120min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.463，平均分子量Mw＝1.419×105。
实施例10
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为180min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.335，平均分子量Mw＝6.079×104。
实施例11
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为360min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.126，平均分子量Mw＝4.553×104。
实施例12
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为720min，振动频率为20Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.302，平均分子量Mw＝1.308×104。
实施例13
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为30min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.578，平均分子量Mw＝1.875×105。
实施例14
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为60min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.180，平均分子量Mw＝8.695×104。
实施例15
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为120min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝2.486，平均分子量Mw＝5.678×104。
实施例16
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为180min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝1.885，平均分子量Mw＝2.763×104。
实施例17
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为360min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝1.778，平均分子量Mw＝1.57×104。
实施例18
称取100mg透明质酸(Mw 2.8×106)放入球磨机的不锈钢反应器中，封闭反应器并固定在机械研磨机上，设定反应时间为720min，振动频率为30Hz。把反应后得到的固体溶解于氯化钠水(娃哈哈牌纯净水)溶液，用于凝胶渗透色谱测定，测得降解后透明质酸的分子量分布系数Mw/Mn＝1.199，平均分子量Mw＝4.67×103。用该方法降解得到的透明质酸的平均分子量可以低于一万。
Claims (2)
1.一种制备低分子量透明质酸的方法，其特征在于将透明质酸放入固相球磨反应器直接固相研磨降解，其中研磨温度为室温，研磨时间为0.5-12h，振荡频率为10-30Hz。
2.根据权利要求1所述的一种制备低分子量透明质酸的方法，其特征在于其中所述透明质酸的分子量Mw＝2.8×106。
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