KR101731480B1 - 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물, 구체적으로 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초(Opintia humifusa) 씨 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성 및 피부세포 재생능을 가진 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 천년초 씨 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 다른 용매 또는 다른 부위를 사용한 것에 비하여 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능이 현저하게 우수하여, 항산화 기능이 우수한 화장료 조성물의 원료를 개발한 것이므로, 기존 식용 또는 목욕제 등 외용으로 사용되던 천년초의 새로운 활용도를 개발하였다는 점에서 그 의미가 크다.

Description

천년초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EASTERN PRICKLY PEAR EXTRACT HAVING ANTIOXIDANT ACTIVITY}

본 발명은 피부세포 노화방지능, 구체적으로 항산화 활성 및 피부섬유아세포 보호능을 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체중의 15% 내지 20%를 차지하는 인체의 가장 큰 기관으로서, 모든 장기와 기관을 싸고 있고, 외부 환경으로부터 신체를 보호하며, 체내의 수분과 온도를 유지하여 체내의 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 인체의 기관이다.

이러한 피부 또한, 다른 장기와 같이 나이가 들어감에 따라 노화현상이 일어나는데, 피부의 노화 현상은 구체적으로 내인성 노화와 외인성 노화로 나누어질 수 있다.

상기 내인성 노화는 시간이 지남에 따라 교원섬유, 탄력섬유 등 세포외 기질 단백질의 합성 양이 줄어들고 탄력이 감소되며 피부세포 내 수분이 손실되고 각질층의 구조가 변화하는 자연적 노화를 의미한다. 한편, 상기 외인성 노화는 자외선, 공기오염, 담배연기, 스트레스 등과 같은 외부자극이 반복되면서, 상기 외부자극이 원인이 되는 노화로, 대표적으로 광노화를 들 수 있다. 상기 광노화는 자외선 등의 과도한 광노출에 의해 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 발생되고, 이로 인해 사이토카인(cytokine)의 생성이 촉진되어 여러 신호전달 체계를 활성화시킴으로써, 결과적으로 activatorprotetin-1(AP-1)과 nuclearfactor-kB(NF-kB)의 활성화에 의한 염증반응이 유도되어 피부를 구성하는 지질, 단백질, 핵산, 효소 등이 손상되어 노화가 일어나는 것을 의미한다.

상기 자외선 노출에 의한 피부에서의 활성산소종 생성은 증가된 활성산소종의 생성이 항산화 방어 기전을 손상시켜 피부 단백질과 다른 고분자들의 산화 스트레스와 광 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부에 다양한 형태로 영향을 주어 깊은 주름, 잔주름, 피부 거침, 피부 건조와 같은 현상을 발생시켜 피부노화를 유발시키는 것으로 알려져 있다.

최근, 환경오염이나 이상기후 등으로 인한 피부손상이 더욱 많이 야기되면서, 이러한 피부손상의 예방 및 개선에 대한 수요가 증가하고 있으며, 이러한 수요 증가로 인해 기능성 화장품 연구에서 기존 미백이나 주름예방과 달리 피부손상의 예방 및 개선과 이를 위한 항산화 활성과 관련된 신소재 개발은 새롭게 각광받는 분야로, 그 중요성이 더욱 증대되고 있다.

특히, 환경오염으로 인해 민감성 피부를 가진 소비자가 증가하면서, 화학소재에 의한 자극을 최소화하기 위하여, 여러 기능성을 가진 천연물을 이용한 화장품에 대한 수요가 지속적으로 증가 추세에 있다.

이러한 이유로 피부 내에서 부작용이 나타나지 않으면서 효능을 나타낼 수 있는 천연물 유래 기능성 소재의 개발에 관심이 주목되고 있으며, 천연물질을 이용한 다양한 기능성 화장품의 개발과 효능 성분 개발에 관한 많은 연구들이 보고되고 있다.

현재까지, 국내에서는 귤, 자몽, 알로에, 해조류 등을 기능성 화장품 및 비누의 원료로 사용하고 있고 천연물 유래의 화학물질을 이용한 피부노화방지 효능의 화장품 원료 개발도 진행 중이다.

이와 관련하여, 현재까지 연구가 진행된 다양한 식물 자원을 바탕으로 항산화활성 및 피부세포보호능을 갖는 피부노화방지능에 관한 연구가 진행되었으나, 천년초 추출물을 이용하여 체계적이고 과학적인 연구를 통해 피부노화 방지 즉, 항산화 활성 및 피부세포 보호를 위한 최적 조건을 확인한 연구결과는 아직 보고되지 아니하였다.

KR 10-1238649 B KR 10-1402550 B KR 2013-0059780 A

상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 항산화 활성과 피부세포보호능이 우수한 천연물질 유래 성분을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천년초(Opintia humifusa) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초(Opintia humifusa) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 항산화 활성 및 피부세포 재생능을 가진 기능성 화장료 조성물일 수 있다.

또한, 상기 천년초는 천년초 씨앗일 수 있으며, 이러한 측면에서 상기 천년초 추출물은 천년초 씨앗의 메탄올 추출물일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "유효성분"은 피부 상태에 적용하여 예방, 개선 또는 보완 효과를 제공하는 화장료 조성물의 성분을 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "화장료 조성물"은 인체를 청결 및 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부 및 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 조성물로 세정제(detergents) 및 화장제(cosmetics)를 포함하는 개념이다.

본 발명의 발명자들은 종래 부작용이 문제되거나 그 효과 자체가 미비하였던 화학물질 유래 화장료 조성물의 기능성 성분을 대체하기 위하여, 항산화 활성을 갖는 여러 식물 등, 천연 물질 유래의 유효성분에 대해 연구하던 중, 천년초의 추출물이 항산화 활성이 매우 우수하고, 특히 천년초 씨의 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획이 다른 분획용매에 의한 분획에 비하여, 현저하게 우수한 항산화활성과 피부섬유아세포 보호능 또는 피부섬유아세포 재생능을 가진 다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초(Opintia humifusa) 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 천년초(Opintia humifusa, Eastern prickly pear)는 우리나라에 자생하는 오핀티아 속(Opintia sp.) 선인장 중 내륙에서 월동이 가능한 선인장으로, 제주도에 자생하는 선인장인 백년초와 구분된다. 상기 천년초는 줄기의 형태가 손바닥과 비슷하여 손바닥선인장으로도 불리운다

상기 천년초는 다육질의 여러해살이 풀 즉, 다년생 현화식물로 줄기는 일반적인 선인장처럼 다육질로서 몇 군데가 마디처럼 잘록한 경절이 있고, 상기 경절은 원통 모양, 공 모양, 타원 모양 등 그 모양이 여러 가지이며, 그 모양에 따라 분류되기도 한다. 상기 경절에는 헛물관이 있고, 표피 가까이에 관다발이 있으며, 새순에 달리는 잎은 바늘처럼 생겼고, 육질로서 완전히 자란 다음에 떨어진다. 떡잎은 바소꼴 또는 삼각형이며 같은 육질로서 화피와 포가 서로 다르다. 일반적으로, 상기 천년초는 자체수분을 절반 이하로 감소시켜, 영하 20℃에서도 얼어 죽지 않고 월동이 가능하여, 생명력을 유지할 수 있는 것으로 알려져 있다.

상기 천년초의 경우, 종래 동초강목 등을 통해 상기 천년초 즙이 변비 치료효과, 이뇨효과, 장운동의 활성화 및 식욕증진 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 천년초 줄기를 이용한 항산화 활성, 항비만활성, 간 보호 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 천년초에 관한 연구는 주로 줄기와 열매 특히, 줄기에 관한 수행되어 왔으며, 이러한 연구 결과로 천년초 과육 및 줄기는 식품으로 판매되고 있다. 이와 같이, 예로부터 다양한 방법으로 사용되어온 천년초의 경우, 식품이나 의약으로 사용되어 왔으므로, 그 안전성은 보장된 것이라고 평가된다.

상기 천년초는 바람직하게는 천년초 열매의 씨 즉, 천년초 씨 또는 천년초 씨앗일 수 있다.

상기 천년초 추출물은 천년초 씨의 용매 추출법에 의해 제조된 용매 추출물일 수 있으며, 상기 용매 추출물은 물, 유기용매 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 용매, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 용매, 더욱 바람직하게는 메탄올을 이용하여 제조한 것일 수 있다.

상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올, 상기 알코올 희석수, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매와 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 또는 디클로로메탄의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 피나콜 등의 2가 알코올인 글리콜 또는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올 등의 1가 알코올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알코올 희석수는 1가 알코올 또는 2가 알코올을 10%(v/v) 내지 99.9%(v/v)로 물에 희석한 것일 수 있다.

상기 천년초 추출물은 용매 추출법에 의한 용매 추출물일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 천년초 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법, 즉 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일 예로, 냉침추출법, 온침추출법, 열 추출법, 초음파 추출법, 수증기 증류법 또는 초임계유체 추출법이나 아임계유체 추출법 등의 방법으로 제조된 것일 수 있다. 상기 추출법을 수행하기 위해서는 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다.

상기 천년초 추출물의 분획물은 천년초 씨, 천년초 씨의 건조물 또는 천년초 씨의 건조물의 분쇄물에 추출용매를 가하여 추출함으로써 제조된 조추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조된 것일 수 있다.

또한, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 상기 분획 시 용매는 2종 이상 사용할 수 있으며, 용매의 극성에 따라 순차적으로 사용하거나 혼합하여 사용하여, 각 용매 분획물을 제조할 수 있다.

상기 분획용매는 바람직하게는 최종 제조된 천년초 추출물의 분획물의 항노화 효과, 구체적으로 항산화 효과 및 피부섬유아세포 보호능의 측면에서 효과가 우수한 에틸아세테이트 일 수 있다.

상기 제조된 추출물 또는 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압 농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.

상기 천년초 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 항산화 활성이 우수하고 피부섬유아세포 재생능이 뛰어나므로, 광노화 등에 의한 피부노화의 예방 및 개선에 효과적으로 이용될 수 있다. 이러한 측면에서, 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 화장료 조성물, 구체적으로 항산화 활성 및 피부세포 재생능을 가진 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 상기 천년초 추출물, 바람직하게는 천년초 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 전체 조성물에 대하여 0.0001 내지 50중량% 또는 0.001 내지 25중량% 또는 0.01 내지 10중량% 포함될 수 있다. 보다 구체적으로, 천년초 추출물, 바람직하게는 천년초 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 함량은 피부노화의 예방 또는 개선 효과의 달성을 위하여 최소치 이상의 함량이어야 하나, 피부자극 여부 및 과량 첨가에 따른 사용감 저하나 각종 제형에의 적용 가능성을 고려하여, 상기 범위 이내에서 자유롭게 조절될 수 있다.

이때, 유효성분의 함량 및 추가 성분의 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 성분들의 함량에 따라 상기 범위 내에서 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 외용연고, 기초화장품, 메이크업 화장품, 바디 화장품 또는 면도용 화장품 등의 용도로 제공될 수 있으며, 상기 기초화장품의 예로는 에센스, 로션, 크림, 젤, 화장수, 팩, 마사지 크림, 유액 등이 있을 수 있고, 상기 메이크업 화장품의 예로는 파운데이션, 립스틱, 아이새도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬, 메이크업 베이스 등이 있을 수 있으며, 바디 화장품으로는 비누, 액체 세정제, 입욕제, 썬 스크린 크림, 썬 오일 등이 있을 수 있고, 면도용 화장품으로는 애프터셰이브로션, 셰이빙 크림 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 유효성분으로 천년초 추출물, 바람직하게는 천년초 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하거나, 상기 유효성분에 추가로 항산화활성 또는 피부세포보호능을 갖는 기능성 물질이나 물성 개선을 위한 부형제, 희석제 등의 물질이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 물질이나 물성 개선을 위한 물질은 본 발명의 효과를 유지하는 범위 내에서 추가될 수 있다.

일 예로, 상기 화장료 조성물에는 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류 또는 합성 고분자 물질 등이 추가로 첨가될 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로 유지 성분, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 안료, 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, pH 조정제, 알코올, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제 또는 정제수 등일 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩타이드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군중에서 선택된 1종 이상을 더욱 포함할 수 있다.

상기 유효성분 이외의 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되지 않으며, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

또한, 상기 화장료 조성물은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형 일 예로 스프레이, 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등의 제형일 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 화장료 조성물은 스프레이, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스 및 팩의 제형을 포함할 수 있다.

일 예로, 본 발명의 제형이 스프레이 또는 파우더인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으며, 특히 본 발명의 제형이 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제, 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르일 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 천년초 씨 추출물은 항산화 활성 및 피부세포 보호능을 가지며, 더 나아가 본 발명의 발명자는 해당 천년초 씨 추출물이 특정 용매를 이용하여 분획물을 제조하는 경우 그 효과가 현저하게 상승됨을 확인하였고, 이로부터 본 발명에서 선택된 분획용매인 에틸아세테이트로 분획한 분획물이 다른 분획물에 비하여 현저하게 우수한 항산화활성을 가질 뿐만 아니라, 종래 항산화물질로 보고된 비타민 C(Vit C) 보다도 우수한 항산화 활성을 가지며, 피부섬유아세포 보호능을 가진다는 것을 확인하였다. 본 발명에서 이용된 천년초는 천연물질로, 식용 또는 약용으로 사용되어, 독성과 부작용이 없는 것으로 확인되었으므로, 이러한 천년초를 이용하여, 최적의 조건을 확립하여 피부보호를 위한 화장품 활성물질의 개발하였다는 점에서 본 발명의 산업적 의의가 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유효성분인 천년초 추출물의 에탈아세테이트 분획물은 다른 분획물에 비하여 항산화 효과가 현저하게 우수하고, 피부세포보호능이 뛰어날 뿐만 아니라, 상기 천년초 추출물의 분획물의 분획대상인 천년초는 독성과 부작용이 없어, 안전성이 보장된 것이므로, 천년초 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 부작용 없이 항산화 활성 및 피부세포보호능을 갖는 화장품의 유효성분이란 점에서 산업적 효과가 클 것으로 예상된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 천년초 추출물의 각 분획물의 제조과정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 천년초 추출물의 각 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위한, DPPH 라디칼 소거능(DPPH radical-scavenging activity)을 확인한 그래프로, 상기 가로축은 추출물의 사용함량이고, 상기 세로축은 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 천년초 추출물의 각 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위한, SOD 활성(SOD-like activity)을 확인한 그래프로, 상기 가로축은 추출물의 사용함량이고, 상기 세로축은 SOD 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 NIH3T3 세포에서 천년초 추출물의 각 분획물의 세포보호능을 확인하기 위하여, MTT 실험(MTT Assay)를 수행한 결과를 나타낸 그래프로, 상기 가로축은 추출물의 사용함량이고, 상기 세로축은 아무런 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 세포 생존도를 나타낸 것이며, 도 4a은 에틸아세테이트 분획을 처리한 실험결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 부탄올 분획을 처리한 실험결과를 나타낸 것이며, 도 4c는 헥산 분획을 처리한 실험결과를 나타낸 것이고, 도 4d는 물 분획층을 처리한 실험결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시 할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 천년초 추출물 및 분획물의 제조

항산화 효과 및 세포 보호능이 우수한 최적의 분획물을 확인하기 위하여, 분획용매에 따른 4종의 천년초 추출물의 분획물을 제조하였다.

우선, 천년초 씨앗 추출물은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

우선, 2014년 10월 구입한 천년초의 열매를 유수에서 세척한 후 불순물을 제거하고, 세척된 천년초의 열매를 동결건조한 후 씨앗을 분리한 후 분쇄하여 분말을 제조하였다.

상기 천년초 열매 분쇄물 건조 시료 50 g 에 메탄올 1 L를 가하고, 70℃에서 4시간 추출한 후, 감압 농축하는 과정을 2회 반복하고, 건조하여, 최종적으로 천년초 씨앗 추출물을 제조하였다.

상기 천년초 씨앗 추출물을 이용한 분획물의 제조는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

상기 분획물은 상기 천년초 씨앗 메탄올 추출물에 증류수를 가하여 얻은 액에 도 1에 나타낸 바와 같이, 헥산(hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)의 순서대로 용매를 가하고, 분획하는 방법으로 분획층을 분리한 후, 각각의 분획층을 감압 농축 후 동결 건조하는 방법으로 제조하였다.

상기 동결 건조하여 얻은 천년초 씨앗 분획물 분말은 실험에 사용하기 전까지 각각 -20℃에서 보관하였다.

실시예 2. 천년초 추출물의 분획용매 별 항산화 효과 측정

천년초 씨앗 추출물의 분획용매 별 항산화 효과를 측정하기 위하여, DPPH 라디칼 소거능과 SOD 활성을 측정하였다.

우선, DPPH(1-1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능(DPPH radical) 측정은 Blois의 방법에 따라 각 시료의 DPPH radical에 대한 환원력을 측정하는 방법으로 수행하였다.

우선, 각 분획물을 에탄올에 용해한 후 농도별로 희석하고 시료와 에탄올에 용해시킨 150 μM DPPH를 혼합하여 30분 동안 반응시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였으며, 양성대조군으로 비타민 C(Vit C)를 이용하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 에탈아세테이트 분획물은 부탄올 분획이나 헥산 분획 또는 물 분획에 비하여 현저하게 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 특히, 50 ㎍/ml에서도 90%가 넘는 DPPH radical 소거능을 나타내었으며, 양성 대조군인 비타민 C와 유사한 DPPH radical 소거능을 나타내어, 다른 농도에 비하여 우수한 항산화 활성을 갖는 것이 확인되었다.

또한, SOD(Superoxide dismutase) 유사활성은 Marklund 등의 방법에 따라, 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

구체적으로, H₂O₂로 전환시키는 반응을 촉매하는 pylogallol의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내기 위하여, 시료를 농도별로 희석하여, 시료 10 ㎕에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer(50 mM tris [hydroxymethyl] amino-methane, 10 mM EDTA, pH 8.5)와 7.2 mM pyrogallol를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후, 1N HCl를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 ELISA reader를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 천년초 씨앗 분획물의 SOD 유사 활성능은 DPPH 라디칼 소거능의 결과와 유사하게, 에틸아세테이트 분획이 다른 분획 즉 부탄올 분획, 헥산 분획 및 물 분획 보다 모든 농도에서 높은 활성을 나타내었다. 특히, 에틸아세테이트 분획은 100 ㎍/ml 농도에서부터 약 100%에 가까운 활성을 나타내어, 양성 대조군인 비타민 C와 유사한 활성을 나타내어, 항산화 활성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.

실시예 3. 천년초 추출물의 분획용매 별 세포 보호 효과 측정

천년초 추출물의 분획용매 별 세포 보호효과를 확인하기 위하여, 피부세포를 이용한 피부세포의 증식여부를 확인하였다.

우선, 피부세포는 한국세포주은행에서 분양받은 섬유아세포인 NIH-3T3 세포를 이용하였고, 상기 세포 배양은 10% FBS와 1% antibiotics를 포함한 α-DMEM 배지를 이용하여 수행하였다. 상기 세포배양은 37℃의 온도 조건 및 5%의 CO₂ 조건의 배양기(incubator)에서 2일 마다 배지를 교환하면서 실험에 사용하였다.

상기 세포 증식 여부는 MTT assay 방법을 사용하여 측정하였다.

우선, 상기 배양한 NIH3T3 세포를 96 well plate에 seeding 하였다. 그 후 농도 별로 준비된 천년초 씨앗 분획물을 첨가하고 37℃의 온도 조건 및 5%의 CO₂ 조건의 배양기에서 48시간 배양하였다. 이 후, MTT시약을 처리하고, 배양한 후, 배지를 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤, ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 세포 증식률은 천년초 씨앗 분획물 처리군의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 에틸아세테이트 분획물은 낮은 농도에서도 대조군 대비 피부섬유아세포 NIH3T3의 증식이 현저하게 촉진되었으며, 1,000 ㎍/ml 농도에서는 약 180%에 가까운 활성을 나타낸 반면, 부탄올 분획의 경우, 100 ㎍/ml 이상의 농도에서는 증식이 억제되었고, 물 분획은 500 ㎍/ml 이상의 농도에서, 헥산 분획은 1,000 ㎍/ml 이상의 농도에서 증식이 억제되었으로, 피부섬유아세포 세포 보호능은 에틸아세테이트 분획이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

Claims (4)

1. 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초(Opintia humifusa) 씨앗 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 활성 및 피부세포 재생능을 가진 기능성 화장료 조성물.
2. 세척된 천년초(Opintia humifusa) 열매를 동결건조한 후 씨앗을 분리하고 분쇄하여 천년초 열매 분쇄물을 제조하는 단계;
   상기 천년초 열매 분쇄물에 메탄올을 가하고, 70℃에서 4시간 추출하여 천년초 씨앗 메탄올 추출물을 제조하는 단계; 및
   상기 천년초 씨앗 메탄올 추출물에 증류수를 가하여 천년초 씨앗 메탄올 추출액을 제조한 다음, 상기 천년초 씨앗 메탄올 추출액에 헥산을 첨가하고 혼합한 후, 층이 분리되도록 방치한 다음 윗층인 헥산층을 제거하는 과정, 및 상기 헥산층을 제거하고 남은 나머지 용액에 동일한 양의 에틸아세테이트를 첨가하고 혼합한 후, 층이 분리되도록 방치한 다음 윗층인 에틸아세테이트층을 수득하는 과정으로 이루어진 천년초 씨앗 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 단계
   을 포함하는 항산화 활성 및 피부섬유아세포 재생능을 가진 천년초 씨앗 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법.
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