KR101898250B1

KR101898250B1 - 감탕나무 추출물을 포함한 피부 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101898250B1
Application number: KR1020170096718A
Authority: KR
Inventors: 윤경섭; 김무한; 정택규; 김미진; 김자영
Original assignee: 주식회사 사임당화장품
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2018-09-12

Abstract

본 발명은 감탕나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, DPPH 활성 억제, 멜라닌 생성 억제, 및 Tyrosinase 저해 활성 억제 효과가 뛰어난 감탕나무 추출물을 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

Description

감탕나무 추출물을 포함한 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening comprising the Ilex integra extract}

본 발명은 감탕나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 감탕나무 추출물을 포함하는 항산화 및 피부 미백 효과가 탁월한 화장료 조성물에 관한 것이다.

감탕나무(Ilex integra)는 감탕나무과의 상록 활엽 소교목으로 우리나라 전라남도, 경상남도, 제주도 등지의 바닷가 산기슭에 자생하고 있다. 감탕나무는 껍질을 찧어 물에 담가 두면 아교나 송진처럼 끈끈한 감탕이 된다고 해서 붙여진 이름이다. 예전에는 감탕나무 껍질과 잎을 약재로 사용하였으나 요즘은 짙은 녹색의 잎사귀와 열매가 아름다워서 관상용으로 많이 재배되고 있다.

감탕나무의 효능은 항균작용, 화상치료, 요로감염 치료에 사용되어 왔다고 전해지고 있다.

생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성 산소는 생체의 노화를 촉진시키거나, 암을 발생시키는 등 많은 문제의 원인이 된다. 따라서 활성 산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 항산화 물질은 산화를 방지하는 물질을 말한다. 항산화 작용을 하는 물질이 많은 식물로는 블루베리, 아로니아베리, 아사이베리 등이 있다. 이러한 항산화 작용을 하는 물질로는 카로테노이드류(베타카로틴, 라이코펜, 루테인), 플라보노이드류 (안토시아닌, 카테킨, 레스베라트롤, 프로안토시아니딘), 이소플라본류(제니스테인, 다이드제인), 비타민, 미네랄 등이 있다.

또한, 피부 미백이 멜라닌 색소와 직접적으로 관련 되어 있다는 것은 널리 알려진 사실이다. 사람의 피부 내 멜라닌 농도와 분포에 따라 유전적으로 결정되나, 자외선이나 피로, 스트레스 등 환경적 여건에 따라 영향을 받는다.

멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제 (tyrosinase) 라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후, 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다.

많이 알려진 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin), 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C (L-Ascorbic acid) 등과 각종 식물 추출물이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 합성을 저해시킴으로 피부 미백 효과뿐만 아니라, 자외선에 의한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능하다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 감탕나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 자외선에 의해 피부에 발생된 산화 스트레스 및 피부 멜라닌 축적, 또한 피부 자극에 의한 염증을 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 감탕나무 (Ilex integra Thunb.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물, 및 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

다른 실시예에서 본 발명은 감탕나무 추출물을 포함하는, 피부에 발생된 산화 스트레스 및 피부 멜라닌 축적을 완화하고, 피부 자극에 의한 염증을 개선 또는 해결할 수 있는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

즉, 본 발명은 감탕나무 추출물의 항산화용, 또는 피부 미백용이라는 새로운 용도를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 감탕나무 추출물이 자유 라디칼을 소거하여 항산화 효과가 있으며, 멜라닌 합성을 억제하여 미백 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 발명자들은 감탕나무는 아일렉스(Ilex) 속(genus) 중에서 특히 탁월한 피부 미백 효과, 피부 자극 완화효과, 및 항산화 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 용어 '피부'는 인체의 외부를 덮고 있는 기관으로, 상기 인체에는 얼굴 또는 몸을 포함한다.

본 발명에 있어서, '항산화 효과'라 함은 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, '미백 효과'라 함은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착이 개선되는 것도 포함될 수 있다.

피부 미백 효과가 있는 성분들 중에서는 피부에 자극을 유발하는 경우가 많으나, 본 발명은 피부 미백 효과가 탁월하면서도 피부에 자극을 유발하지 않는, 감탕나무 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 감탕나무 추출물에는 감탕나무에서 유래하여 얻어진 물질이라면, 추출하는 방법, 성분의 종류 등과 무관하게 모두 포함될 수 있다.

본 발명에서 '추출물'은 식물체 등을 추출용매로 추출하거나 추출용매로 추출하여 제조한 추출물에 분획용매를 가하여 분획하여 제조할 수 있다.

추출물 또는 분획물은, 상기 추출물의 희석이나 농축, 상기 추출물을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출물의 조정제물이나 정제물 또는 이들의 혼합물 등 추출물 자체와 추출물을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 또한, 추출 또는 분획과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 상기 수득한 추출물은 사용시까지 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관할 수 있다. 상기 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 본 발명의 목적 효과를 갖는 추출물을 수득할 수 있는 한 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다.

바람직하게, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드, n-헥산, 염산, 초산, 포름산, 구연산, 디에틸에테르, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 및 사이클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 추출 용매를 첨가하여 용매 추출에 의해 수득할 수 있다. 바람직하게, 상기 추출 용매 중에서 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 추출할 수 있다. 더 바람직하게 상기 알코올은 에탄올일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 10 내지 90%(v/v) 알코올일 수 있으며, 바람직하게 50 내지 80%(v/v) 알코올일 수 있고, 더욱 바람직하게는 70 내지 80%(v/v) 알코올일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 감탕나무 추출물을 전체 조성물 총 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 5 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 상기 감탕나무 추출물의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 항산화 및 피부 미백 효과를 기대할 수 없고, 50 중량%를 초과하는 경우에는 제형 안정성이 떨어지며 제조된 제형의 발림성이 떨어지는 등 화장품으로서 사용이 힘든 점이 있을 수 있다.

본 발명에서 추출물의 제조방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있고, 이들을 단독으로 수행하거나 2종 이상의 방법을 함께 수행할 수 있다. 또한, 고순도의 추출물을 얻기 위하여 추출액을 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출 할 수도 있다. 바람직하게 본 발명의 감탕나무 추출물은 감탕나무에 에탄올 수용액을 가한 후 열수 추출한 다음 여과하여 얻은 추출액을 감압 농축하여 수득할 수 있다.

상기 감탕나무 추출물은 감탕나무 부위를 모두 포함할 수 있으며, 그 일례로는 감탕나무 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합부위로부터 추출될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 감탕나무 전초 추출물의 경우 우수한 피부 미백 및/또는 항산화 효과를 구현할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 통상적인 화장료, 예를 들어, 피부 점착 타입의 화장료 제형, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 연고, 패치, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 분무제, 고체상 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 팩, 에센스 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 각 제형의 피부 항산화, 미백 효과에는, 전술한 유효성분들 이외에 다른 성분들이 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 배합될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물은 일반적으로 알려져 있는 피부 투여용 화장료 조성물 배합될 수 있는 기제 성분을 필요에 따라 추가할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 기름, 식물성 기름, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탤크 또는 산화아연, 산화 티타늄 등이 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 바디젤인 경우에 전술한 유효성분들 이외에 일반적으로 바디젤 제조 시에 사용되는 성분인, 카보머, 트리에탄올아민, 멘톨, 에탄올, 글리세린, 디소디움이디티에이, 메틸파라벤, 향 등이 첨가될 수 있다.

여기서, 카보머, 트리에탈올아민은 점증제로 작용하고, 멘톨은 향 성분으로 작용하며, 에탄올은 청량감을 부여하는 기능을 하고, 글리세린은 보습제로서의 역할을 하며, 디소디움이디티에이는 금속성분 킬레이트로 기능하고, 메틸파라벤은 방부제로의 기능을 위해 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제조 시에 상기 멘톨향 이외에도 허브향 등과 같은 다양한 향이 첨가될 수 있다.

전술한 구체적인 성분 이외에도, 상기에서 설명한 점증제, 청량감 부여, 향 성분, 보습제 등의 기능을 달성하기 위해 본 기술분야에서 널리 사용되고 있는 공지의 물질들을 적용하여 조성물을 제조하는 것 또한 본 발명의 범위에 포함될 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이(분무제)인 경우에 담체 성분으로서 락토스, 탤크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 첨가될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체가 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 첨가되는데, 이의 예로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 들 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에 담체 성분으로 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물은 통상의 첨가제를 부가하여 바디젤, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일 등의 조성물로 제조될 수 있으며, 에어졸 타입으로도 제조될 수 있다. 이 경우에 본 발명의 일 실시예에 따른 항산화, 피부 미백 효과를 지닌 화장료 조성물은 피부에 직접 도포하거나 살포하는 경피 투여의 방법으로 사용되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 항산화, 미백 효과를 지닌 화장료 조성물의 사용량은 연령, 피부 지방의 상태 정도 등의 개인 차나 제형, 형태에 따라 적절하게 조절될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따른 피부 미백 효과를 지닌 화장료 조성물은 피부 미백을 위한 화장품, 의약품, 또는 의약외품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 감탕나무 추출물을 개체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 미백, 항산화 방법을 제공한다. 상기 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.

본 발명의 감탕나무 추출물은 항산화 및 피부 미백용 약학 조성물 및 건강 기능성 식품으로도 활용될 수 있다.

본 발명은 감탕나무 추출물을 포함하는 항산화 효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 감탕나무 추출물을 포함하는 피부 미백 효과가 뛰어난 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 세포 독성이 없으며, 피부에 자극을 유발하지 않는 안전한 자연유래 성분을 포함한 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 감탕나무 추출물의 DPPH 활성 억제를 보여주는 결과이다.
도 2는 감탕나무 추출물이 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 갖는다는 점을 보여주고 세포 독성이 없다는 점을 보여주는 결과이다.
도 3은 감탕나무 추출물의 멜라닌 생성 억제를 보여주는 결과이다. 동속식물인 먼나무 추출물에 비해 멜라닌 생성 억제 효과가 탁월한 것으로 확인되었다.
도 4는 감탕나무 추출물의 Tyrosinase 저해 활성을 보여주는 결과이다. 동속식물인 먼나무 추출물에 비해 Tyrosinase 저해 활성 효과가 탁월한 것으로 확인되었다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 및 실험예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예에 한정되는 것으로 해석 되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

실시예 1. 식물 추출물의 제조

건조된 감탕나무 가지, 잎, 열매 등의 전초의 중량을 측정하고, 그 중량의 10배의 75% 에탄올을 첨가하여 가온 추출한 후 여과하였다. 상기 추출액을 2회 반복 실시하였으며 얻은 감탕나무 추출액을 감압 농축하여 추출물로 제조하였다.

실시예 2. 항산화 실험

(1) DPPH radical 소거활성에 의한 항산화 활성 평가

전자공여능(electron donating ability) 측정은 Blois 방법(Blois, 1958)에 의한 DPPH 자유 라디칼(free radical) 소거법에 따라 측정하였다. 즉 메탄올에 녹인 시료(1,000 μg/mL)를 각각 6단계의 농도로 만들어 96 well plate에 100 μL씩 분주하고 0.4 mM DPPH 용액을 동량 첨가하여 실온에서 10분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 Ascorbic acid를 사용하였다. DPPH radical 소거활성은 시료 무처리군 대비 시료 처리군의 DPPH radical 소거 정도를 백분율로 산출하고, 결과값은 DPPH의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC₅₀)로 표 1에 나타내었다. 실험은 각 시료에 대해서 3회 반복하여 실시하였으며 결과값은 평균값을 기초로 산출하였다.

DPPH radical 소거활성 (%) = (A_Control-A_Sample)/A_Control×100

A_Sample=시료를 첨가한 반응액의 흡광도

A_Control=시료 대신 메탄올을 첨가한 반응액의 흡광도

상기 표 1과 도 1을 참조하여 보면, 감탕나무 추출물은 대표적인 항산화 물질은 Ascorobic aicd에 비해 그 활성은 비록 낮으나 매우 우수한 항산화 효과를 보이고 있다.

시료	Free radical 소거율(IC₅₀)
Aascorobic acid	3 μg/mL
감탕나무 추출물	120 μg/mL

실시예 3. 항염증 활성 실험

(1) 세포 배양

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/mL) 및 streptomycin (100 g/mL)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃ 에서 95% air, 5% CO₂가습 공기 조건 하 포화 상태(subconfluence)에서 배양하였으며, 3일마다 계대배양하였다.

(2) NO (Nitric oxide) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.8×10⁵cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 실시예의 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약 [1% (w/v) Sulfanilamide, 0.1% (w/v) Naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) Phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO^2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 L와 Griess 시약 100 L를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 Sodium nitrite (NaNO₂)를 standard로 비교하였다.

결과를 도 2에 나타내었다. 도 2를 참조할 때, 감탕나무 추출물을 50, 100 및 200 μg/mL로 처리하였을 때의 결과 경우 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다(* P<0.05,** P<0.01). 도 2에서 양성대조군으로는 2-Amino-4-methyl pyridine (10 μM)를 사용하였다.

(3) 세포독성 평가 - LDH assay

RAW 264.7 세포(1.8×10⁵cells/mL)를 DMEM 배지에 실시예의 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 L와 reconstituted substrate mix를 50 L를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 L의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군 (LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다. 결과는 도 2에 나타내었으며, 감탕나무 추출물은 세포독성을 보이지 않음을 알 수 있다.

실시예 4. 미백 활성 실험

(1)멜라닌 생성 억제 실험

상기 실시예에서 얻어진 감탕나무 추출물의 미백 활성을 Murine B16f10 melanoma cell을 이용하여 멜라닌 생성 억제 활성으로 평가하였다. Murine B16F10 melanoma cell은 한국세포주은행(KCLB; Seoul, Korea)으로부터 분양받아 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Gard Island, NY, USA) 를 사용하여 37℃, 5% CO₂항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

먼저 6 well plate에 5×10⁴cell/mL로 세포를 분주하고 37℃, 5% CO₂조건하에서 24시간 배양 후 배지를 제거하였다. D-phosphate buffered saline (D-PBS)으로 세척한 후 1 μM α-MSH를 포함하는 배지로 교환 후, 실시예의 시료를 100 μg/mL의 농도로 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 동안 배양 후 배지를 제거하고 D-PBS buffer로 세척한 후, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 1 M NaOH 300 μL를 첨가 후 55℃에서 2시간 방치하여 세포 내의 melanin을 얻었다. 이를 96 well plate로 옮긴 후 ELISA reader를 이용해 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 미백 화장품의 주원료인 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.

결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 참조하여 보면 감탕나무 추출물을 50, 100 및 200 μg/mL로 처리하였을 때 농도 의존적으로 멜라닌 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다(* P<0.05, ** P<0.01). 감탕나무 추출물의 melanin 생성 억제 활성은 양성대조군으로 사용된 알부틴(Arbutin)에 비해 우수한 melanin 억제 효과를 나타내었다.

(2) Tyrosinase 저해 활성실험

용매에 녹인 시료를 적당한 농도범위로 희석한 시료액 20 μL를 0.1 M 인산염 환충용액(pH 6.5) 220 μL에 넣고 mushroom tyrosinase (1500 U/mL, Sigma, USA)액 20 μL를 첨가한 후, 1.5 mM 티로신 용액 40 μL를 섞어서 37℃, 15분 동안 반응시킨다. 그리고 475 nm에서 흡광도를 측정하여 배양 전의 흡광도의 차이로 억제되는 정도를 측정하였다. 활성저해를 계산하는 식은 다음과 같다.

Tyrosinase inhibition (%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C) × 100

A와 B는 각각 시료를 가지는 용액의 배양 전과 후의 흡광도

C와 D는 각각 시료를 넣지 않은 용액(기준용액)의 배양 전과 후의 흡광도

여러 농도에서 저해 정도를 측정한 후에 Inhibition Concentration at 50% of Activity (IC₅₀) 값을 계산하였다.

상기 표 2와 도 4를 참조하여 보면, 감탕나무 추출물은 대표적인 양성대조 물질인 Arbutin에 비해 우수한 Tyrosinase 억제 효과를 나타내고 있다.

시료	Tyrosinase inhibiton(IC₅₀)
Arbutin	500 μg/mL
감탕나무 추출물	250 μg/mL

(3) 통계처리

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean±standard error 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student's t-test 분석방법을 사용하였다(* P<0.05, ** P<0.01).

실시예 3. 동속식물과의 비교실험

감탕나무와 동속식물인 먼나무(Ilex rotunda)의 추출물을 준비하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 먼나무의 추출물을 준비하였다.

감탕나무와 먼나무의 미백 효과를 상호 비교하기 위하여 실시예 4의 미백 효과에 대한 실험방법과 동일한 방법으로, Tyrosinase 저해 활성 실험 및 멜라닌 생성 저해 실험을 각각 실시하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4와 같이 감탕나무 추출물은 같은 속과 비교하여 tyrosinase 저해 활성이 뛰어나고, 멜라닌 생성 억제 능력이 뛰어난 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 감탕나무는 우수한 미백 효과를 가진 화장품의 원료로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

감탕나무(Ilex integra) 추출물을 포함하는, 티로시나제 저해 활성에 의한 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 감탕나무 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르, 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 감탕나무 추출물은 감탕나무에 에탄올 수용액을 가한 후 가온 추출한 다음 여과하여 얻은 추출액을 감압 농축한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 감탕나무 추출물을 함유하는 조성물 총 중량에 대하여 0.01~50중량%로 감탕나무 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물의 제형은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 에센스, 로션, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.