KR101716739B1 - 차전자 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 차전자(Plantaginis Semen, psyllium) 추출물을 함유하는 면역증강 또는 항바이러스용 조성물에 관한 것으로서, 상기 차전자 추출물은 선천면역증강 효과와 각종 바이러스에 대한 항바이러스 효과가 우수하여 면역증강, 항바이러스 활성이 있는 약학 조성물, 건강기능식품 또는 사료 첨가제로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

차전자 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising extract of Plantaginis Semen having activity of immune enhancement or for treating or preventing virus disease}

본 발명은 차전자(Plantaginis Semen, psyllium) 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

생체는 다양한 외부인자(병원성 미생물 등)로부터 방어작용을 하는데 이를 면역계라고 한다. 인체의 면역계는 감염에 대한 신체방어기전으로서, 태어날 때부터 가지고 있는 선천면역(innate immunity)과 생활 등에 적응되어 얻어지는 후천면역(acquired immunity)의 두 가지 메커니즘으로 구성되어 있다. 후천면역은 B 림프구, T 림프구의 면역세포로 구성되어 외부 항원(antigen)에 대하여 특이적으로 작용하여 면역반응을 나타내며, 면역 기억작용을 통하여 활성화된다. 선천면역은 일명 자연면역이라고도 하는 것으로, 후천면역과 달리 항원에 대하여 기억과 항원에 대하여 비특이적으로 반응하는 면역반응을 뜻한다.

선천면역은 감염 후 수 시간 내에 유도되어 작동하는 숙주의 가장 신속한 대응책으로, 선천면역계의 수용체들은 넓은 범위의 바이러스성 감염을 인지하고 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine) 등의 체액성 인자(humoral factor)를 발현시키는 유전자를 활성화시킨다. 바이러스 감염에 대한 선천면역 핵심반응은 인터페론(Interferon)의 발현이 유도되는 것으로, 바이러스성 감염에서 가장 중요한 사이토카인으로 여겨지는 인터페론은 뛰어난 항바이러스 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(isaacs and Lindernmann, 1957). 최근 바이러스에 대한 인터페론(Interferon, IFN)생성을 촉진하는 신호전달계가 규명되면서 각 바이러스의 선천면역회피(immune evasion) 기전이 주목을 받고 있다(Pichlmair et al., 2007).

선천면역반응은 바이러스 감염억제에 결정적인 역할을 할 뿐 아니라 만성감염의 조절에도 역할을 한다. 따라서 이러한 인터페론 활성화 기전 연구 및 유도시킬 수 있는 면역조절제제의 개발연구가 활발하게 진행되고 있다. 게다가, 병원체 감염에 따른 선천면역의 방어기작의 하나로 면역인자가 분비되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어지기 때문에, 적정한 수준의 염증반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있으며, 이를 유도시킬 수 있는 면역증강제제의 개발 연구가 필요하다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)은 돼지에서 유산, 생식기능 저하, 호흡기 증상에 의한 비육저하 및 폐사를 일으키는 질병으로, 우리나라를 포함한 전 세계 양돈 산업에 큰 경제적인 피해를 주고 있으며 현재 가장 중요한 바이러스 질병 중의 하나로 간주되고 있다. PRRS는 아르테리비리대(Arteriviridae)과의 막이 있는 양성 가닥 RNA 바이러스(enveloped positive-stranded virus)인 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus, PRRSV)에 의해서 유발된다(Snijder, E.F. and Meulenberg, J.J.M., 1998). 10~15년 전에 두 개의 다른 PRRS 바이러스 균주가 명백히 독립적으로 미국과 유럽에서 출현하였고, 현재 이 질병은 북미, 유럽 및 아시아의 많은 돼지 생산 국가에서 돼지의 생식능력 감소 및 호흡기 질환을 유발하고 있으며, 미국에서의 PRRS 감염의 유행은 70%에 이르는 것으로 추정된다(Snijder, E.F. and Meulenberg, J.J.M., 1998). PRRS 바이러스는 호흡, 성취, 물린 상처 또는 바늘에 의해서 감염되며, 점막, 폐 또는 국소부위의 대식세포(macrophage)에서 번식하고, 체액, 혈액, 배설물, 소변 및 정액을 통해 바이러스가 방출된다. PRRS에 감염되면 번식장애와 호흡기 질환이 복합적으로 일어나는데 감염된 모돈과 그 모돈에서 태어난 자돈들에 집중적으로 나타나고, 호흡기 장애는 전 일령에서 나타날 수 있으며, 특히 포유자돈과 이유자돈에서 집중적으로 나타난다. 호흡기 질환의 특징은 PRRS 단독 감염의 경우보다는 세균성, 바이러스성 병원체의 2차 감염 및 복합감염이 많으며 그 경우 병원성이 상당한 수준으로 증폭된다. 이와같은 PRRS 바이러스에 의한 돼지 생식기호흡기 증후군은 전 세계적으로 발생하고 있으며 발견한 이후 약 20년 동안 이 바이러스에 대한 예방법을 개발하기 위하여 많은 노력이 투자되었음에도 아직까지 효과적인 예방법이 개발되어지지 않아 축산산업에 있어 그 피해가 계속 증가되고 있는 실정으로 적절한 대책마련이 시급히 요구되고 있다.

수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)는 수포성 구내염의 병인(病因)이 되는 음성(-)가닥 RNA 바이러스이며, 랍도바이러스과로 분류하고 있다. 주로 말, 돼지, 소에 발생하는 발진성 전염병으로서 구강점막의 염증 및 수포형성이 특징이며, 구제역과 흡사하여 일명 가성구제역(Pseudo foot-and-mouth disease)이라고도 한다.

돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus)는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 인플루엔자 바이러스속에 속하는 A형 인플루엔자 바이러스의 아형(亞形)으로서, 대표주는 A/swine/Wisconsin/15/30(H1N1)이 있다. 바이러스에 감염된 돼지의 예후는 양호하지만 전파성은 강하다. 발열, 호흡속박, 기침, 눈물, 쇠약, 식욕부진 등이 나타난다. 돼지 인플루엔자 바이러스가 사람에게 감염된 예로는 1918년에 대유행하여 200만명이 사망했다는 '스페인 감기'가 유명하다.

신종플루 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1)는 돼지 인플루엔자 바이러스인 H1N1이 돼지에게 감염되어 발생한 신종플루의 원인이 되는 바이러스이다. 신종플루는 기본적으로 감기처럼 고열, 기침 등의 증상이 나타나는데 현재 상태보다 인간에게 치명적인 바이러스로 변할 가능성이 존재한다. 신종플루의 일반적인 증상은 일반 독감과 구별하기가 매우 어려운데, 일반 독감과 비슷하게 발열, 인후통, 기침, 콧물 또는 코막힘의 증상을 보이지만, 일반 독감보다 심한 치명적인 폐 손상을 유발하는 특징이 나타날 수 있다.

헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)는 헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로, 항원성, DNA의 성상, 생물학적 차이에 따라 HSV-1형과 HSV-2형으로 구별한다. 초기감염의 대부분은 부현성 감염이지만, 1형에 의한 현성감염으로는 소아기의 치육구내염의 형태를 취하는 경우가 많다. 특수한 병형으로는 음부헤르페스, 카포시수두유사발진증, 수막뇌염, 신생아의 전신감염 등이 있다. HSV-1형은 삼차 신경절에 교차 감염되어 구진헤르페스, 드물게 각막헤르페스로 회귀 발증 한다. HSV-2형은 초기 감염의 대부분이 성적 행위에 의해 감염되며 음부헤르페스를 유발한다. 치료 후에 요선추신경절에 잠복 감염되었다가 회귀성 음부헤르페스를 일으키기도 한다.

뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)는 Paramixoviridae과 Paramixovirus속의 조류 병원바이러스이다. 전염성이 강하고 기관지염, 폐렴, 설사나 경련, 마비 등을 일으키며 사망률이 높다. 주로 닭에서 발생하고, 다른 조류에서도 치사병변을 초래하며 사람에게도 결막염을 일으킨다. 발육계란의 장뇨막 및 닭배, 소의 신장, 사람태아, 헬라세포(Hela cell) 등의 각종 배양세포에서 증식한다. 각종 동물의 적혈구를 응집하고 세포융합도 일으킨다.

조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus)는 닭이나 칠면조와 같은 가금류와 야생 조류가 감염되는 급성바이러스 전염병을 일으키며, 주로 철새의 배설물에 의해 전파된다. 조류 인플루엔자에 걸린 조류의 콧물, 호흡기 분비물, 대변에 접촉한 조류들이 다시 감염되는 형태로 조류 사이에서 퍼진다. 지구상에 존재하는 조류 인플루엔자 바이러스는 모두 135종류의 혈청형으로 분류되며, 이들은 사람과 같은 다른 포유류 동물에게 전염되기도 한다. 이 중 사람들에게 가장 치명적인 것이 H5N1형이며, H5N2이나 H3N2 등의 바이러스도 빈번하게 발생하는 조류 인플루엔자의 원인이 된다. 이 중에서, H5N1형은 1997년 홍콩에서 첫 인체 감염을 일으켜 6명이 사망하면서 주목을 받았다. H5N1은 변이가 빠르고 다른 동물에게 쉽게 전이되는 특징을 갖고 있다. 게다가, 이 바이러스는 감염된 조류를 통해 인체에도 전염될 수 있는데, 발병하면 감기나 일반 독감에 걸렸을 때와 비슷하게 38℃ 이상의 고열이 나면서 기침과 인후통, 호흡 곤란 등의 증상을 보인다. 조류 인플루엔자 바이러스는 4℃일 때 철새 등의 배설물에서 최소 35일간 살 수 있지만 5분 동안 75℃로 열을 가하면 모두 죽는다. 한편, H3N2는 돼지와 같은 동물에서 변형을 일으켜 사람에게 감염을 일으키는 변종 인플루엔자 바이러스이며, 개 인플루엔자의 바이러스(Canine influenza virus)의 원인이 되기도 한다.

돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus)는 돼지 유행성 설사증(Porcine epidemic diarrhea)의 원인체인 바이러스로, 코로나바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로, 전염성이 높은 돼지의 장내 질환이다. 발병율은 신생자돈이나 육성돈의 경우, 100%에 육박하며, 성돈이나 번식돈의 경우 15~90%이다. 주된 증상은 1주령 미만의 포유자돈에서 구토증상 및 수양성 설사를 유발하여 심각할 경우 폐사가 발생하며, 이유자돈에서는 수양성 설사 지속 후 변이 점조성 등의 증상이 나타나며, 돼지 유행성 설사증에서 회복이 되어도, 체중감소가 심하게 나타나게 된다. 돼지 유행성 설사증의 치료 및 예방을 하기 위해서, 2차 세균감염 방지를 위해 항생제 또는 항균제를 투여하고, 포도당이나 전해질 및 물을 충분히 공급 하는 등 쾌적한 환경을 유지하여야 한다.

돼지 써코 바이러스(Porcine Circovirus 2)는 써코바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로 진핵 세포에서 자율적으로 복제하는 작은 바이러스이며, 감염된 세포의 핵에서 숙주의 중합효소(Polymerase)를 이용하여 자신의 유전체를 증폭시킨다. 돼지 써코바이러스는 2종류로 나눌 수 있으며, 돼지 써코 바이러스는 혈청형에 따라 1형, 2형으로 구분되고 있다. 1형은 돼지에서 쉽게 감염되나, 비병원성을 나타내며, 2형은 돼지에서 병원성을 나타낸다. 돼지 써코 바이러스 2형을 원인체로 하는 이유 후 전신성소모성증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome)은 이유자돈과 육성돈에서 발생하며, 체중 감소 및 전신쇠약, 빈혈증 및 황달, 호흡 불량 및 기침 등의 호흡기 질환 등의 증상이 나타난다. 이외에도 돼지 써코바이러스 2형에 감염이 되면, 돼지피부염신증증후군(PDNS), 돼지호흡기질병복합체(PRDC), 소화기 장애 등을 일으킬 수 있다.

차전자(Plantaginis Semen, psyllium)는 질경이과에 속하는 여러해살이 초본식물인 질경이(Plantago asiatica, Plantago depressa, Plantago alata, Plantago camtschatica, Plantago major var japonica)의 씨앗으로, 한방에서는 소변을 잘 통하게 하고, 습을 밖으로 배출시키는 동시에 설사를 치료하고 눈을 맑게 하며 담으로 인한 기침을 치료하는 작용과 간기능을 활성화하여 어지러증, 두통에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 차전자의 주요성분으로는 플라보노이드(flavonoid) 성분인 플란타고사이드(plantagoside), 플란타기닌(plantaginin), 호모플라타기닌(homoplataginin) 등이 있고, 뮤실라제(mucilage) 성분으로는 플라타산(platasan) 등이 있으며, 이리도이드(iridoid) 성분으로는 아우쿠빈(aucubin), 카타폴(catalpol) 성분과 페놀 글리코사이드(phenolic glycoside) 성분으로 아세토사이드(acetoside), 시린긴(syringin) 등이 함유되어 있다.

차전자에 관한 연구로는 약리학적으로 혈압하강작용, 장관과 자궁에 대한 수축작용, 심장박동수 감소 및 요량 감소 등에 효과가 있다는 연구(Suk Tai Ko et al. 1977), 항암활성성분이 있다는 연구(Moon, Hyung-In et al. 1997), 강장효과와 간 보호효과가 있음에 대한 연구(Hye Sook Yun et al. 1979), 차전자피의 사료첨가가 흰쥐의 혈청 지질대사를 개선시킴을 밝힌 연구(Yim, Moon-Yi et al. 2003) 등이 있다. 이외의 차전자에 관한 선행기술로는 한국등록특허 제1130989호의 차전자를 일부 구성성분으로 포함하는 천연 생약재를 포함하는 송아지의 설사병 예방활성을 가지는 사료첨가제의 제조방법이 개시된 기술이나, 한국등록특허 제487732호의 백혈구의 면역 활성 효과가 있는 차전자를 일부 구성성분으로 포함하는 생약이 함유된 사료첨가제가 함유된 사료에 관한 기술 등이 있다. 그러나 상기와 같은 차전자에 관한 연구나 특허 선행기술에서는 면역증강 효과나 항바이러스 효과 실험이 구체적으로 개시되어 있지는 않으며, 또한 차전자의 단독 추출물에 관한 효과가 나타나 있지는 않다.

한편, 한방생약자원은 오랜 역사의 전통의약에서 인체 감염성 질환의 치료에 효율적으로 사용되어 왔으며, 임상적으로 이미 안전성이 확보된 소재이다. 또한, 즉각적인 효과를 볼 수 있다는 점에서 높은 장점을 가지고 있다. 이러한, 한방생약은 이미 동양을 비롯하여 서양에서도 질병예방 및 치료를 위해 이용되어 왔으며 항균 항산화 항암 항염증 등의 다양한 생리활성효과가 널리 알려져 있는데다가, 식물체내 존재하는 페놀화합물 테르페노이드(terpenoid), 에센셜오일(essential oil), 폴리펩타이드(polypeptide), 폴리사카라이드(polysaccharide)와 같은 2차대사산물의 우수한 생리활성효과 및 가축에서의 이용가능성도 보고된 바 있다.

가축(domestic animal)은 인류가 야생동물을 길들이거나 개량한 것으로 인류생활에 유용한 동물을 통틀어 모두 이른다. 주로 축산물을 제공하고, 사역에 이용된다. 이 때, 유용하다는 것이란 젖, 고기, 알, 털, 피혁, 깃털 등의 축산물을 생산하는 것과 힘을 사역에 이용하는 것 이외에, 모습과 행동이나 소리를 감상하기 위한 애완동물도 포함한다. 현재 세계에서 가축으로 취급되는 것은 다음과 같다. 포유류에는 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 조류에는 닭, 칠면조, 거위, 집오리, 화조, 집비둘기, 메추리, 어류에는 잉어, 금붕어, 곤충류에는 누에, 꿀벌 등이 있다. 그러나, 어류와 곤충류를 제외하고 포유류와 조류만을 가축이라 말하기도 하며, 조류에 속한 것을 가금(家禽)이라 하여 이를 가축에서 제외하는 경우도 있고, 어떤 경우에 있어서는 포유류만을 좁은 뜻의 가축이라 하기도 한다.

본 발명자들은 차전자 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 차전자 추출물이 면역증강 또는 항바이러스 효과가 있음을 검증함으로써, 상기 차전자 추출물을 면역증강제, 항바이러스제, 이를 이용한 약학 조성물, 건강기능식품 또는 가축 사료 첨가제에 적용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제1130989호, 천연 생약재를 포함하는 송아지의 설사병 예방활성을 가지는 사료첨가제의 제조방법, 2012.03.21. 등록. 한국공개특허 제2005-0121816호, 한약재로 조성된 대장 활성 건강보조식품, 2005.12.28. 공개. 한국등록특허 제487732호, 사료첨가제가 함유된 사료 및 그의 제조방법, 2005.04.27. 공개.

Hyung In Moon et al., Anticancer Compounds of Plantago asiatica L. 한국약용작물학회지, 7(2), 143-146, 1997. Hye Sook Yun et al., Plants with Liver Protective Activities (II) -Potential Hepatotonic Activities of Plantago asiatica Seed. 생약학회지, 9(3), 139-144, 1979. Moon Yi Yim et al. Effects of Psyllium Husk and Glucomannan on Serum Lipids, Fecal Fat Excretion and Body Fat in Rats Fed High-Fat Diet. 한국식품영양과학회지, 32(3), 469-473, 2003. Snijder, E.F. and Meulenberg, J.J.M., The molecular biology of arteriviruses. 79:961, 1998. Suk Tai Ko et al., Pharmacological Studies of Plantaginis Semen. Journal of Pharmaceutical Investigation, 7(1), 28-37, 1977.

본 발명의 목적은 차전자(Plantaginis Semen, psyllium) 추출물을 함유하는 면역증강용 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 차전자(Plantaginis Semen, psyllium) 추출물을 함유하는 면역증강용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 차전자 추출물은 차전자를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물을 이용하여 추출할 수 있다.

상기 면역증강용 약학 조성물은, 바람직하게는, 선천면역(innate immunity)을 증강시키는 조성물일 수 있다.

이에, 본 발명은 또한 차전자 추출물을 함유하는 면역증강용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

본 발명은 차전자 추출물을 함유하는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게는, 상기 약학 조성물은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus, PRRSV), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus), 신종플루 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus), 돼지 써코 바이러스(Porcine Circovirus 2), 돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus) 및 개 인플루엔자의 바이러스(Canine influenza virus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 바이러스에 관해 억제 활성이 있는 조성물일 수 있다.

이에, 본 발명은 차전자 추출물을 함유하는 바이러스 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 차전자 추출물을 함유하는 가축 사료 첨가제에 관한 것이다.

상기 가축은 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 닭, 칠면조, 거위, 집오리, 화조, 집비둘기 및 메추리로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 차전자 추출물을 함유하는 면역증강용 약학 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 차전자 추출물은 차전자를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물을 이용하는 것이 면역증강 효과 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료 효과가 더 좋다. 즉, 차전자 물 추출물은 차전자를 상기 C1~C4 알코올 또는 상기 알코올과 물과의 혼합용액으로 추출한 추출물보다 상기 면역증강 효과 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료 효과가 현저하게 좋다. 또한, 질경이 추출물과 비교하여, 본 발명의 차전자 추출물의 면역증강 효과 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료 효과도 매우 좋다.

상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 차전자 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 차전자 중량 기준 1~15배 부피(1kg 기준 1~15ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~10배를 사용할 수 있다. 상기 차전자 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1~48시간일 수 있다. 또한, 당 분야의 통상적인 방법으로서 상기 차전자 추출물의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획할 수 있다. 상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 50℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 1일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 차전자 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결 건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 차전자 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.

상기 차전자 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus), 신종플루 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus), 돼지 써코 바이러스(Porcine Circovirus 2), 돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus) 및 개 인플루엔자의 바이러스(Canine influenza virus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 바이러스에 관해 억제 활성이 있을 수 있다.

상기 돼지 인플루엔자 바이러스는 H1N1 일 수 있으며, 조류 인플루엔자 바이러스는 H5N1, H5N2, H9N2, H7N9 및 H3N2로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 본 발명의 차전자 추출물을 함유하는 면역증강용 약학 조성물 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에, 상기 차전자 추출물은 0.001~100 중량%로 포함될 수 있다.

한편, 상기 차전자 추출물은 물 추출되었을 경우, 그대로 약학 조성물이나 건강기능식품으로 이용가능하며, 물 또는 기타 용매를 이용하여 추출하였을 경우, 건조물로 제조한 후, 이를 물에 희석하여 이용하거나 또는 건조된 그대로 약학 조성물이나 건강기능식품으로 이용할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 차전자 추출물 및 약제학적 부형제를 함유할 수 있다. 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 약제학적 부형제로는 담체, 기타 부형제 및 희석제가 있으며, 바람직하게는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 차전자 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 면역증강용 건강기능식품 또는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품은 차전자 추출물의 추출용매 중, 물을 이용하였을 때가 면역증강 효과 또는 바이러스 질환의 예방 또는 개선 효과가 더 좋다.

상기 차전자 추출물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 포함될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

한편, 본 발명의 차전자 추출물은 파우치 형태에 멸균 포장되어 복용하기 용이한 형태로서 제공되어 약학 조성물이나 건강기능식품으로 이용될 수도 있다.

본 발명은 또한 차전자 추출물을 함유하는 가축 사료 첨가제에 관한 것으로서, 상기 사료 첨가제는 면역증강 또는 항바이러스 효과가 있어, 동물의 건강증진 효과를 가져올 수 있다.

상기 가축 사료 첨가제는 가축용 영양배합사료의 첨가제로 이용될 있으며, 상기 영양배합사료는 가축의 건강을 유지하고 그 가축이 가지고 있는 생산능력을 충분히 발휘시키기 위해 적절한 영양 성분을 포함하는 일반적으로 사용되는 배합사료를 말하며, 가축의 종류에 따른 각종 영양배합사료를 모두 포함할 수 있다. 상기 가축 사료 첨가제는 영양배합사료에 바람직하게는 0.001~30중량%, 더 바람직하게는 0.001~10중량%, 가장 바람직하게는 0.001~5중량%로 첨가될 수 있다.

상기 가축은 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 조류에는 닭, 칠면조, 거위, 집오리, 화조, 집비둘기 및 메추리로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 차전자(Plantaginis Semen, psyllium) 추출물을 함유하는 면역증강 또는 항바이러스용 조성물에 관한 것으로서, 상기 차전자 추출물은 선천면역증강 효과와 각종 바이러스에 대한 항바이러스 효과가 우수하여 면역증강, 항바이러스 활성이 있는 약학 조성물, 건강기능식품 또는 사료 첨가제로서 용이하게 이용될 수 있다.

도 1은 PRRS 바이러스에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 실험 결과로서, 도 1의 A-1은 MARC145 세포에서 TCID₅₀을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, A-2는 RAW264.7(RAW) 세포에서 TCID₅₀을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1의 B-1은 MARC145 세포에서 Real time RT-PCR을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, B-2는 RAW264.7(RAW) 세포에서 Real time RT-PCR을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 VSV-GFP(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein, GFP가 발현되는 VSV)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물이 갖는 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 2A는 VSV-GFP 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 2B는 세포 생존율을 나타내며, 도 2C는 GFP 흡수도(absorbance)을 나타낸다. 도 2D는 바이러스 역가를 나타낸다.
도 3은 H1N1-GFP(GFP가 발현되는 H1N1)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 3A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 3B는 세포 생존율을 나타내며, 도 3C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 3D는 바이러스 역가를 나타낸다.
도 4는 HSV-GFP(GFP가 발현되는 Herpes simplex virus)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 4A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 4B는 세포 생존율을 나타내며, 도 4C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 4D는 바이러스 역가를 나타낸다.
도 5는 NDV-GFP(GFP가 발현되는 Newcastle disease virus)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 5A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 5B는 세포 생존율을 나타내며, 도 5C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 5D의 상단은 NDV 바이러스의 양을 상대적으로 비교한 RT-PCR 결과를 수치화한 결과를, 도 5D의 하단은 이 RT-PCR 결과의 DNA band 전기영동 사진을 나타낸다.
도 6은 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 다양한 사이토카인 유도 실험결과를 나타낸다.
도 7은 실시예 1의 차전자 물 추출물이 박테리아의 엔도톡신(Endotoxin) 오염이 되었는지를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 면역블랏팅을 이용하여 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 각종 신호전달분자들의 활성화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 마우스의 H5N2, H1N1 및 H3N2 바이러스의 감염 억제 실험결과로서, 마우스의 체중 변화도(도 9A, 9B, 9C), 생존율(도 9D, 9E, 9F) 및 폐 내부의 바이러스 역가(도 9G)를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 차전자 물 추출물의 제조>

차전자 1kg에 10kg의 증류수를 첨가하여 105℃에서 150분간 열수추출하고, 0.45㎛로 1차 여과한 후, 0.22㎛로 최종 여과하여 침전물을 제거하였다. 이어서, pH 7.0으로 조정하고, 이를 동결 건조하여 분말로 제조한 후, 각 실험에 사용하기 전에 증류수에 녹여 사용하였다.

<실시예 2. 항바이러스 활성 실험 ①>

돼지 호흡기 질병의 주요 원인 바이러스인 PRRSV(Porcine respiratory and reproductive syndrome Virus)에 대한 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험을 하기와 같이 수행하였다.

원숭이 신장세포주인 MARC145(1.5×10⁵/well)와 마우스 대식세포주인 RAW264.7(6×10⁵/well)을 6-웰 TC 플레이트에 키워 실험에 사용하였다. 12시간 후 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM에 실시예 1에서 제조된 차전자 물 추출물(pH 7.0)을 최종농도가 50㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 차전자 물 추출물 처리 12시간 후, 배양액을 제거한 후 각 세포를 세척하고 FBS(Fetal bovine serum)가 5%(v/v) 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)으로 배양액을 교체한 후, PRRSV(MOI:5)를 접종하였다. 접종 72시간 후, TCID₅₀(tissue culture infectious dose 50 : 50%의 세포 변성효과가 나타나는 바이러스 희석배수) 측정과 Real-time PCR을 이용하여 바이러스 감염정도를 측정하였다. TCID₅₀을 측정하기 위해서는 96-웰 플레이트에 MARC145와 RAW264.7을 각각 1×10⁴/well 수준으로 100㎕씩 접종하고 PRRSV 바이러스를 10배씩 단계 희석하여 100㎕씩 접종하여 감염시켰다. 또한, PRRSV strain CH-1a의 N gene을 target으로 Real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR에 사용된 PCR-Primer의 염기 서열과 반응조건은 하기와 같다.

N Forward primer 5'-CCCFFFTTFAAAAGCCTCGTGT-3'

N Reverse primer 5'-GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTCCTA-3'

총 40 Cycle로서, 각 Cycle은 Denaturation을 위하여 94℃에서 30초, Annealing을 위하여 56℃에서 20초, Extension을 위하여 72℃에서 20초 수행.

상기 실험 결과들은 도 1에 나타내었다.

도 1은 PRRS 바이러스에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 실험 결과로서, 도 1의 A-1은 MARC145 세포에서 TCID₅₀을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, A-2는 RAW264.7(RAW) 세포에서 TCID₅₀을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 1의 B-1은 MARC145 세포에서 Real time RT-PCR을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과, B-2는 RAW264.7(RAW) 세포에서 Real time RT-PCR을 이용하여 바이러스 역가를 측정한 결과를 나타낸다(con:대조군[차전자 물 추출물의 비처리군], 차전자:차전자 물 추출물).

도 1을 참고하면, MARC145, RAW 두 세포주 모두에서 실시예 1의 차전자 물 추출물을 처리한 군이 대조군에 비해 바이러스 역가가 감소된 것이 관찰된다.

<실시예 3. 항바이러스 활성 실험 ②>

수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus)에 대한 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험을 하기와 같이 수행하였다.

마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×10⁶cell/well의 농도로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM에 실시예 1의 차전자 물 추출물(pH 7.0)을 최종농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 대조군(Control)에는 FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM만을 처리하였다. 차전자 물 추출물과 비교하기 위해 사용된 IFN-β는 500 units/㎖의 농도의 Mouse IFN-β를 처리하였다. 차전자 물 추출물 처리 12시간 후, VSV-GFP(MOI:1), H1N1-GFP(MOI:1), HSV-GFP(MOI:1), NDV-GFP(MOI:1)를 각각 RAW 264.7 세포에 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고, PBS(phosphate buffered saline)로 RAW 264.7 세포를 3회 세척하고, FBS가 10% 첨가된 신선한 DMEM으로 교환해준 뒤 12~24시간 후, UV(345 nm) 필터를 이용하여 바이러스 감염 정도를 현미경 관찰하고, 이를 측정하였다(도 2A, 3A, 4A 및 5A). 또한, 각 조건에서의 GPF 형광 발현량을 보다 정확하게 비교하기 위해, 통상의 GFP 발현량 확인 시스템을 통해 확인하였다(도 2C, 3C, 4C 및 5C).

상기 바이러스 감염 상태에서의 세포 생존율은 MTT 어세이를 통해 확인하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하기 위해서는, RAW 264.7을 96웰 플레이트에 웰당 5×10³개로 분주한 후, 상기와 같은 조건으로 IFN-β, 차전자 물 추출물, 각 GPF 발현 바이러스들을 처리한 후, 48시간 후, 100 ㎕의 1 ㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 더하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 ㎕를 더하여, 세포 내에 생성된 포마잔염(formazan salt)을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 Microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 540 nm에서 측정하였다(도 2B, 3B, 4B 및 5B).

또한, 이와 같은 IFN-β, 차전자 물 추출물, 각 GPF 발현 바이러스들을 MDCK(Canine cocker spaniel kidney) 세포, Vero 세포에 처리하여 실시예 2의 TCID₅₀ 방법으로 각 바이러스들의 역가를 구하였다(도 2D, 3D 및 4D).

한편, 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus, NDV)에 대해서는 추가적으로 RAW 264.7 세포에서 증식한 바이러스 양을 상대적으로 확인하기 위해 reverse transcription(RT-PCR)을 수행하였다. House Keeping Gene으로는 GAPDH를 control로 사용하였고, NDV 유전자의 유무(Matrix[M gene])를 확인하였다(도 5D).

상기 실험 결과들은 도 2 내지 5에 나타내었다.

도 2는 VSV-GFP(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein, GFP가 발현되는 VSV)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물이 갖는 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 2A는 VSV-GFP 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 2B는 세포 생존율를 나타내며, 도 2C는 GFP 흡수도(absorbance)을 나타낸다. 도 2D는 바이러스 역가를 나타낸다(Control:대조군[VSV-GFP, IFN-β 및 차전자 물 추출물의 비처리군], IFN-β/VSV-GFP: IFN-β 처리 후 VSV-GFP를 처리한 군, VSV-GFP: VSV-GFP만 처리한 군, 차전자/VSV-GFP: 차전자 물 추출물 처리 후 VSV-GFP를 처리한 군).

도 2를 참고하면, VSV-GFP 처리군에서는 VSV의 활성으로 GFP 발현이 왕성한 것으로 확인되지만, 차전자 물 추출물을 처리한 군은 GFP 발현이 거의 되지 않아, VSV 감염율이 현저하게 떨어졌음을 알 수 있다(도 2A 및 도 2C). 또한, 차전자 물 추출물의 처리군에서는 세포 생존율(도 2B)은 상승하였고, 바이러스 역가(도 2D)도 감소하였다. 차전자 물 추출물의 활성은 항바이러스 활성이 잘 알려진 IFN-β와 그 효능이 유사하다.

도 3은 H1N1-GFP(GFP가 발현되는 H1N1)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 3A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 3B는 세포 생존율를 나타내며, 도 3C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 3D는 바이러스 역가를 나타낸다(Control:대조군[H1N1-GFP, IFN-β 및 차전자 물 추출물의 비처리군], IFN-β/H1N1-GFP:IFN-β 처리 후 H1N1-GFP를 처리한 군, H1N1-GFP:H1N1-GFP만 처리한 군, 차전자/H1N1-GFP:차전자 물 추출물 처리 후 H1N1-GFP를 처리한 군).

도 4는 HSV-GFP(GFP가 발현되는 Herpes simplex virus)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 4A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 4B는 세포 생존율을 나타내며, 도 4C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 4D는 바이러스 역가를 나타낸다(Control:대조군[HVS-GFP, IFN-β 및 차전자 물 추출물의 비처리군], IFN-β/HSV-GFP:IFN-β 처리 후 HSV-GFP를 처리한 군, HSV-GFP:HSV-GFP만을 처리한 군, 차전자/HSV-GFP:차전자 물 추출물 처리 후 HSV-GFP를 처리한 군).

도 5는 NDV-GFP(GFP가 발현되는 Newcastle disease virus)에 대한 실시예 1의 차전자 물 추출물의 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 5A는 감염 12, 24시간 후의 GFP 형광이미지를 나타내고, 도 5B는 세포 생존율을 나타내며, 도 5C는 GFP 흡수도(absorbance)를, 도 5D의 상단은 NDV 바이러스의 양을 상대적으로 비교한 RT-PCR 결과를 수치화한 결과를, 도 5D의 하단은 이 RT-PCR 결과의 DNA band 전기영동 사진을 나타낸다(Control: 대조군[NDV-GFP, IFN-β 및 차전자 물 추출물의 비처리군], IFN-β/NDV-GFP:IFN-β 처리 후 NDV-GFP를 처리한 군, NDV-GFP:NDV-GFP만을 처리한 군, 차전자/NDV-GFP:차전자 물 추출물 처리 후 NDV-GFP를 처리한 군).

도 3 내지 5의 결과를 통해서도, 도 2의 결과와 마찬가지로, H1N1-GFP, HSV-GFP, NDV-GFP의 바이러스만을 처리한 군에서는, 각 바이러스의 감염으로 인해 GFP 발현이 왕성한 것으로 확인되지만, 차전자 물 추출물을 함께 바이러스와 함께 처리한 군은 GFP 발현이 거의 되지 않아, 각각의 바이러스 감염율이 현저하게 떨어졌음을 알 수 있다(도 3 내지 5의 2A 및 2C). 또한, 차전자 물 추출물의 처리군에서는 세포 생존율(도 3 내지 5의 B)은 상승하였고, 바이러스 역가(도 3 및 4의 D)도 감소하고, 바이러스의 상대적인 양 또한 줄어들고 있음을 알 수 있다(도 5D). 한편, NDV-GFP의 처리군에서는 특히 차전자 물 추출물이 IFN-β보다 더 우수한 항바이러스 효과가 있다.

<실시예 4. 선천면역 관련 사이토카인 유도 확인 실험>

차전자 물 추출물의 면역인자 유도효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

사이토카인을 유도하기 위해서, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×10⁶ cell/well로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM에 실시예 1의 차전자 물 추출물(pH 7.0)을 최종농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다.

음성 대조군(Control)에는 FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군으로는 Mouse IFN-β(500units/ml)을 처리하였다. 이 후, 12시간, 24시간 후에 각 처리군에서 TNF-α, IL-6, IFN-β의 값을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

TNF-α는 면역 및 염증반응의 매개물질로 대식세포주를 활성화시키며 다양한 사이토카인 분비를 유도하는 물질로 B-세포를 증식시키고, IL-6는 B-세포를 활성화시켜 항체생산을 증가시켜 항원특이적 면역반응을 촉진하는 중요한 사이토카인이다. 또한, IFN-β는 바이러스, 암세포 등의 외부 물질에 반응하여 분비되는 사이토카인으로, 세포내 항암 및 항바이러스 작용을 일으켜 면역반응을 유도하는 물질이다.

상기 실험 결과들은 도 6에 나타내었다.

도 6은 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 다양한 사이토카인 유도 실험결과를 나타낸다(Control:음성 대조군[IFN-β와 차전자 물 추출물의 비처리군], IFN-β:양성 대조군, 차전자:차전자 물 추출물 처리군).

도 6을 참고하면, 차전자 물 추출물에 의하여 RAW 264.7 세포로부터 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine; TNF-α, IL-6) 및 IFN-β(Interferon-β)의 유도능이 나타나는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 5. 엔토톡신 오염 여부 확인 실험>

상기 실시예에서 얻은 차전자 물 추출물을 Pierce^® LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit(Product# 88282, Thermo Scientific, Rockford, 미국)를 이용하여 해당 Kit에 명시된 실험방법에 따라 Endotoxin Concentration을 측정하였다.

96-웰 플레이트에 실시예 1의 차전자 물 추출물(최종농도가 각 웰당 50㎍/㎖가 되도록 조정함)과 LPS(lipopolysaccharide)(최종 농도가 각 웰당 0.01~0.1ng이 되게 함)를 각각 50㎕씩 넣고, 37℃에서 5분간 반응시켰다. 각 웰에 LAL(Limulus Amebocyte Lysate)를 50㎕ 넣은 후, 교반하여 10분간 반응시켰다. 반응 후 각 웰에 Substrate solution을 100㎕를 넣고, 37℃에서 6분간 반응시켰다. 이후 25% 아세트산(acetic acid)을 각 웰에 50㎕씩 첨가하여, 405~410nM의 흡광도를 Micro plate reader를 이용하여 측정하였다.

상기 실험 결과들은 도 7에 나타내었다.

도 7은 실시예 1의 차전자 물 추출물이 박테리아의 엔도톡신(endotoxin) 오염이 되었는지를 확인한 결과를 나타낸다(Control:음성 대조군[LPS와 차전자 물 추출물의 비처리군], LPS:양성대조군, 차전자:차전자 물 추출물).

도 7을 참고하면, 차전자 물 추출물 내에는 엔도톡신이 거의 포함되어 있지 않음을 확인할 수 있다. 엔도톡신의 경우 상피세포에 자극을 주어 항바이러스 기전에 의한 항바이러스 효능을 유도할 수는 없다. 따라서 차전자 물 추출물은 선천면역을 활성화시켜 침입하는 바이러스를 방어할 수 있는 주요 성분을 포함하고 있음을 알 수 있다.

<실시예 6. 선천면역 관련 주요 신호전달 분자들의 활성화 확인 실험>

차전자 물 추출물의 선천면역 관련 주요 신호전달 분자들의 활성화를 통한 항바이러스 효능을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×10⁶cell/well로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM에 상기에서 실시예 1의 차전자 물 추출물(pH 7.0)을 최종농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 음성 대조군에는 FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM만을 처리하였고, 양성 대조군에는 LPS(lipopolysaccharide, 100ng/well)를 처리하였다. 이 후, 0시간, 6시간, 12시간, 18시간 후에 각각 면역블랏팅을 수행하였다. 이를 위해, 0시간, 6시간, 12시간, 18시간 반응된 세포를 세포 용해완충액(lysis buffer)에서 용해시킨 후, 동량의 단백질을 10~15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩(loading)하여 전기영동한 후, 상기 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 그 다음, Blocking Solution(5% non-fat milk in PBS-tween) 용액에 니트로셀룰로스 막을 넣어, 1시간동안 부드럽게 반응 후, 10분 간격으로 3번 PBS-tween을 이용하여 씻어내었다. 다음으로, 1차 항체 처리를 1시간 동안 반응 하고, 10분 간격으로 3번 PBS-tween을 이용하여 씻어내었다. 이후, HRP(hourseradish peroxidase) 컨쥬게케이트 된 2차 항체와 반응하고, 10분 간격으로 3번 PBS-tween을 이용하여 씻어내었다. 그 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 키트를 이용하여 면역 활성을 검출하였고, 면역블랏팅에는 phospho-IRF3, IRF3, phospho-p65, p65, phospho-STAT1, STAT1, phospho-TBK1, TBK1, phospho-p38, p38, phospho-ERK, ERK 및 β-Actin을 항체로 사용하였다.

상기 실험 결과들은 도 8에 나타내었다.

도 8은 면역블랏팅을 이용하여 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 각종 신호전달분자들의 활성화를 확인한 결과를 나타낸다(Control:음성 대조군[LPS와 차전자 물 추출물의 비처리군], LPS:양성대조군, 차전자:차전자 물 추출물).

도 8을 참고하면, 차전자 물 추출물이 면역세포를 자극하여 항바이러스 효능에 중요한 인터페론 분비 신호체계의 구성요소인 IRF3, STAT1, TBK1 등의 인산화를 유도하였고, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 분비 신호체계의 구성요소인 NF-kB(p65), ERK kinase, p38 등의 인산화를 유도하고 있음을 확인할 수 있다.

<실시예 7. 항바이러스 활성 실험 ③>

다양한 타입의 인플루엔자 바이러스에 대한 차전자 물 추출물의 예방적, 치료적 효능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

4~5주령의 Female Balb/c 마우스를 대조군과 차전자 물 추출물 전처리군(차전자 200 3D Pre:바이러스 접종 전의 5일 동안 2일 간격으로 실시예 1의 차전자 물 추출물 200㎕ 처리), 차전자 물 추출물 후처리군(차전자 200 4D Post: 바이러스 접종 후 7일 동안 2일 간격으로 4번 실시예 1의 차전자 물 추출물 200㎕ 처리), 차전자 물 추출물 지속처리군(차전자 200 3D Pre/4D Post:바이러스 접종 전의 5일 동안 2일 간격으로, 그리고 바이러스 접종 후 7일 동안 2일 간격으로 4번 실시예 1의 차전자 물 추출물 200㎕ 처리) 각각 그룹을 나누었다. 대조군(Control)에는 차전자 물 추출물 지속처리군에서 차전자 물 추출물을 투여할 때, 동일한 방법으로 PBS를 처리하였다.

H5N2(10LD₅₀), H1N1(10LD₅₀) 및 H3N2(10LD₅₀) 바이러스는 치사량으로 각각 모든 군의 마우스 비강으로 투여하여 공격 접종 하였다. 바이러스 접종일 기준(0일)으로 2일 간격으로 마우스의 체중을 측정하였고, 마우스가 치사되기까지의 마우스의 생존 실험을 수행하였다.

상기 실험 결과들은 도 9에 나타내었다.

도 9는 실시예 1의 차전자 물 추출물에 의한 마우스의 H5N2, H1N1 및 H3N2 바이러스의 감염 억제 실험결과로서, 마우스의 체중 변화도(도 9A, 9B, 9C), 생존율(도 9D, 9E, 9F) 및 폐 내부의 바이러스 역가(도 9G)를 각각 나타낸다.

도 9를 참고하면, 바이러스 공격 접종 후 대조군의 경우 14일 이내에 모두 치사된 것에 반해, 차전자 물 추출물 투여군은 최종 80%의 생존율과 체중변화의 회복이 관찰되었고(도 9D, 9E, 9F), 폐 내부의 바이러스 역가 또한 대조군에 비해 감소하였음이 확인된다(도 G). 마우스들의 체중변화는 치사된 것을 제외하고는 거의 비슷하다(도 9A, 9B, 9C).

이러한 결과는 실시예 1의 차전자 물 추출물이 마우스의 선천면역을 증가시켜 인플루엔자 바이러스의 감염 및 증식을 억제한 것으로 판단되며, 혈청형이 다양한 인플루엔자 바이러스 모두에서 예방적, 치료적 효능이 나타난 것은 선천면역 증진을 통한 비특이적 항바이러스 효과가 나타난 것으로 보이며, 이를 통해 차전자 물 추출물이 다양한 바이러스에 대한 치료제로서 적용가능함을 알 수 있다.

<실시예 8. 독성실험>

실시예 8-1. 급성독성

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군과 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v) 만을 투여하고, 실험군은 본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 상기 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)에 녹여 각각 경구투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2g/㎏/day 농도의 본 발명 실시예 1의 차전자 물 추출물을 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하는 것으로 확인되었다.

실시예 8-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 각 농도로 8주 동안 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 투여한 실험군과 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 실시예 1의 차전자 물 추출물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (6)

1. 차전자(Plantaginis Semen, psyllium)를 물을 용매로 하여 추출한 차전자 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 선천면역(innate immunity)증강 효과가 있는 가축 사료 첨가제.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 가축은 말, 당나귀, 소, 물소, 면양, 염소, 낙타, 순록, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 닭, 칠면조, 거위, 집오리, 화조, 집비둘기 및 메추리로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 선천면역(innate immunity)증강 효과가 있는 가축 사료 첨가제.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 가축 사료 첨가제는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus), 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus), 돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus), 신종플루 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 조류 인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus), 돼지 써코 바이러스(Porcine Circovirus 2), 돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus) 및 개 인플루엔자의 바이러스(Canine influenza virus)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 바이러스 질환의 예방 또는 개선 효과가 있는 것을 특징으로 하는 선천면역(innate immunity)증강 효과가 있는 가축 사료 첨가제.
6. 삭제

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