KR101706999B1 - Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression analysis and the method for providing information for diagnosis of diabetic disease - Google Patents

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Abstract

본 발명은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 진단하는 데 사용되는 키트와, 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 특이적이고 신속하게 진단할 수 있고, 나아가서는 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다. The present invention relates to a kit used for diagnosing diabetes by measuring the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1) and a method for providing information for diagnosis of diabetes.
The present invention can diagnose diabetes mellitus in a specific and rapid manner by measuring the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1), and further plan for appropriate treatment in the future, have.

Description

Drp1 발현 정도의 측정을 이용한 당뇨병의 진단용 키트 및 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법{Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression analysis and the method for providing information for diagnosis of diabetic disease}Technical Field [0001] The present invention relates to a diagnostic kit for diabetes and a method for providing information for diagnosis of diabetes using the measurement of the degree of Drp1 expression,

본 발명은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 진단하는 데 사용될 수 있는 키트와, 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a kit which can be used for diagnosing diabetes by measuring the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1) and a method for providing information for diagnosis of diabetes.

인플라마좀(inflammasomes)은 카스파제-1-활성화 복합 단백질 복합체로, 1) 감각 단백질(sensor protein)인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3), 2) 연결 단백질(adaptor protein)인 ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) 및 3) 이펙터 단백질인 프로카스파제-1으로 구성된다. 상기한 인플라마좀 구성 성분들은 미생물의 감염이나 조직의 상해가 발생한 경우에 조립되는데, 시토졸에서 조립에 의해 활성화된 인플라마좀은 카스파제-1을 활성화시켜 인터루킨(IL)-1β 또는 인터루킨-18을 분비하여 숙주의 선천면역 방어기능을 수행한다(Schroder K, Tschopp J, Cell 140:821-832(2010); Franchi L, Munoz-Planillo R, Nunex, Nat Immunol 13:325-332(2012)). Inflammasomes are caspase-1-activated complex protein complexes, which are composed of 1) a sensor protein, NLRP3 (NLRP3), 2) an adapter protein, , And 3) an effector protein, pro-caspase-1, which is an ASC (apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain). The above inflammase components are assembled when microbial infection or tissue injury occurs. The inflammase activated by assembly in the cytosol activates caspase-1 to produce interleukin (IL) -1β or interleukin- 18, and performs the innate immune defense function of the host (Schroder K, Tschopp J, Cell 140: 821-832 (2010); Franchi L, Munoz-Planillo R, Nunex, Nat Immunol 13: 325-332 ).

반면 과도한 NLRP3 인플라마좀 신호가 제2형 당뇨병 및 동맥경화 등과 같은 대사성 질환이나 알츠하이머 등의 퇴행성 신경질환의 발병을 촉진할 수 있다고 알려졌다(Henao-Mejia J, Elinav Em Thaiss CA, Flavell RA(2014) Inflammasomes and metabolic disease. Annu Rev Physiol 76:57-78; Wen H, Ting JP, O’Neil LA(2012) A role for the NLRP3 inflammasome in metabolic diseases-did Warburg miss inflammation? Nat Immunol 13:352-357.). 그러나 불활성화된 NLRP3 형태가 어떻게 활성화된 형태로 전환되는지, 혹은 상기 불활성화된 NLRP3가 어떻게 다양한 자극에 의하여 인플라마좀 복합체로 조립되는 지는 아직 명확히 규명되지 않고 있다.On the other hand, excessive NLRP3 inflammase signaling has been shown to promote metabolic diseases such as type 2 diabetes and arteriosclerosis and the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's (Henao-Mejia J, Elinav Em Thaiss CA, Flavell RA (2014) Inflammasome and metabolic disease. Annu Rev Physiol 76: 57-78; Wen H, Ting JP, O'Neil LA (2012) A role for the NLRP3 inflammasome in metabolic diseases-did Warburg miss inflammation? Nat Immunol 13: 352-357. ). However, how inactivated forms of NLRP3 are converted into activated form, or how such inactivated NLRP3 is assembled into an in fl ammate complex by various stimuli, has not yet been clarified.

최근 들어 NLRP3 인플라마좀의 활성을 조절함에 있어서 미토콘드리아의 역할에 대한 연구의 중요성이 커지고 있다. 손상된 미토콘드리아의 축적은 미토콘드리아 활성 산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)을 생성하거나 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)를 시토졸로 방출함으로써 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다고 보고되었다. 또한, 미토콘드리아는 특정한 세포 환경에서, NLRP3 인플라마좀을 위한 분자적 플랫폼으로 기능할 수 있다; 예를 들어, MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein) 또는 Mfn2(mitofusin 2)와 같은 미토콘드리아 외막 단백질은 바이러스 감염 시 인플라마좀 복합체 조립을 위하여 NLRP3를 소집할 수 있다. Recently, the role of mitochondria in controlling the activity of NLRP3 inflammase has become increasingly important. Accumulation of damaged mitochondria has been reported to activate mitochondrial reactive oxygen species (mROS) or NLRP3 inflammase by releasing mitochondrial DNA (mtDNA) into the cytosol. In addition, mitochondria can function as a molecular platform for NLRP3 inflammases in specific cellular environments; For example, mitochondrial outer membrane proteins such as mitochondrial anti-viral signaling protein (MAVS) or mitofusin 2 (Mfn2) can harbor NLRP3 for inflammate complex assembly during viral infection.

미토콘드리아는 그 사이즈, 형상, mtDNA 자체 및 세포 환원 상태를 조절하기 위하여 계속해서 융합 및 분열을 반복하는 역동적인 소기관이다. 미토콘드리아 역학(mitochondrial dymamics)은 미토콘드리아 분열과 관련된 단백질인 디나민 유사 단백질 1(Drp1) 및 분열 단백질 1(Fis1)과, 융합과 관련된 단백질인 Mfn1, Mfn2 및 시신경 위축 유전자 1(optic atrophy gene 1, Opa1)에 의해 조절된다. 상기한 단백질들의 기능 상실 돌연변이로 인해 유발되는 미토콘드리아 역학 불균형은 에너지 생산, 세포 증식과 같은 미토콘드리아 또는 세포 기능에 장애를 초래할 뿐만 아니라, 파키슨병 또는 알츠하이머와 같은 복합적인 질병을 초래할 수 있다. Mitochondria are dynamic organelles that continually repeat fusion and cleavage to regulate their size, shape, mtDNA itself, and cellularity. Mitochondrial dymamics are characterized by mitochondrial division related proteins dinamin-like protein 1 (Drp1) and mitogen-1 (Fis1), fusion-associated proteins Mfn1, Mfn2 and optic atrophy gene 1 (Opa1 ). The mitochondrial epidemiological imbalance caused by the loss of function of the above-mentioned proteins may lead to a disorder of mitochondria or cell function such as energy production, cell proliferation, as well as a complex disease such as Parkinson's disease or Alzheimer's disease.

최근 들어, 미토콘드리아 역학이 선천면역 반응을 조절하는 가능성이 보고되었다: 바이러스 감염 시, Mfn2는 MAVS와의 결합을 통해 MAVS-중재 항바이러스 신호를 방해한다(Yasukawa K, et al. (2009) Mitofusin 2 inhibits mitochondrial antiviral signaling. Sci Signal 2:ra47.). 그러나, 또 다른 연구에서는, Mfn1-의존 방법에서 MAVS 신호를 위하여 미토콘드리아의 길이 신장이 요구된다고 밝혀졌다(Castanier C, Garcin D, Vazquez A, Arnoult D (2010) Mitochondrial dynamics regulate the RIG-I-like receptor antiviral pathway. EMBO Rep 11:133-138; Onoguchi K, et al. (2010) Virus-infection or 5'ppp-RNA activates antiviral signal through redistribution of IPS-1 mediated by MFN1. PLoS Pathog 6:e1001012). 이러한 연구들을 통하여 바이러스 감염 시 미토콘드리아의 융합에 의해 Ⅰ형 인터페론(IFN)이 생성이 증가됨을 알 수 있다. 그러나 인플라마좀 신호에 있어서 미토콘드리아 역학의 역할에 대하여는 아직까지 알려진 바가 없다. Recently, it has been reported that mitochondrial epidemiology modulates the innate immune response: when infected with virus, Mfn2 interferes with MAVS-mediated antiviral signal through binding with MAVS (Yasukawa K, et al. (2009) Mitofusin 2 inhibits mitochondrial antiviral signaling. Sci Signal 2: ra47.). However, another study has shown that mitochondrial length extension is required for the MAVS signal in Mfn1-dependent methods (Castanier C, Garcin D, Vazquez A, Arnoult D 2010). Mitochondrial dynamics regulate the RIG-I-like receptor antiviral pathway. EMBO Rep 11: 133-138; Onoguchi K, et al. (2010) Virus-infection or 5'ppp-RNA activates antiviral signal through redistribution of IPS-1 mediated by MFN1. Through these studies, it can be seen that the generation of Ⅰ type interferon (IFN) is increased by the fusion of mitochondria during viral infection. However, the role of mitochondrial dynamics in inflammatory signaling remains to be seen.

본 발명의 일 목적은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도의 측정을 이용한 당뇨병 진단용 키트를 제공하고자 한다. An object of the present invention is to provide a diabetes diagnostic kit using the measurement of the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1).

본 발명의 다른 목적은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다. Another object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosing diabetes by measuring the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1).

종래부터 과도한 NLRP3 인플라마좀의 활성이 제2형 당뇨병을 유발시킨다고 알려져 왔다(Henao-Mejia J et al., Annu Rev Physiol(2014) 76:57-78; Wen H et al., Nat Immunol(2012) 13:352-357.). Previously, it has been known that excessive NLRP3 inflammase activity causes type 2 diabetes (Henao-Mejia J et al., Annu Rev Physiol (2014) 76: 57-78; Wen H et al., Nat Immunol ) 13: 352-357.).

한편, 본 발명의 발명자들은 미토콘드리아의 분열과 관련된 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 억제 시 미토콘드리아의 신장(elongation)이 유도되고, 이는 세포 외 신호 조절 인산화 효소(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)의 활성을 증가시켜 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3)를 미토콘드리아 내로 위치하게 하며, 최종적으로는 NLRP3 인플라마좀의 생성량을 증가시키는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다. Meanwhile, the inventors of the present invention have found that mitochondrial elongation is induced by suppression of expression of dinamin-related protein 1 (Drp1) associated with mitochondrial division, which is caused by extracellular signal- regulated kinase, ERK) to increase the amount of NLRP3 inflammase produced by locating NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3) in the mitochondria. .

구체적으로, 본 발명의 일 구체 예에서, 디나민 유사 단백질 1을 포함하는 당뇨병 진단용 키트를 제공한다. 상기 구체 예에서 상기 디나민 유사 단백질 1은 당뇨병을 갖는 환자의 혈청 내 항체와 특이적으로 결합할 수 있다.Specifically, in one embodiment of the present invention, there is provided a diabetes diagnostic kit comprising dinamin-like protein 1. In this embodiment, the dinamin-like protein 1 can specifically bind to an antibody in serum of a patient with diabetes.

또한, 본 발명의 다른 구체 예에서, 디나민 유사 단백질 1에 특이적인 항체를 포함하는, 당뇨병 진단용 키트를 제공한다. 상기 구체 예에서, 상기 항체는 당뇨병을 갖는 환자의 혈청 내 디나민 유사 단백질 1과 특이적으로 결합할 수 있다. Further, in another embodiment of the present invention, there is provided a diabetes diagnostic kit comprising an antibody specific for dinamin-like protein 1. In this embodiment, the antibody can specifically bind to dinaminin-like protein 1 in the serum of a patient with diabetes.

본 발명에서, 진단의 대상이 되는 당뇨병의 유형은 특별히 한정하지 않으며, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증일 수 있으나, 바람직하게는 제2형 당뇨병일 수 있다. In the present invention, the type of diabetes to be diagnosed is not particularly limited, and may be type 1 diabetes, type 2 diabetes or pre-diabetes, preferably type 2 diabetes.

또한, 본 발명에서 상기 당뇨병의 진단에 사용되는 디나민 유사 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. In addition, the dinamin-like protein 1 used in the diagnosis of diabetes in the present invention may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질액 등을 포함할 수 있다. In addition, the kit for measuring the protein expression level in the present invention may include a substrate, a suitable buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate solution for immunological detection of the antibody.

여기서, 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.Here, the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, a glass slide glass, etc. The chromogenic enzyme may be peroxidase, Alkaline phosphatase and the like can be used. As the fluorescent material, FITC, RITC and the like can be used. The coloring substrate solution is ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazolin- Sulfonic acid) or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethylbenzidine) can be used.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, (a) 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 양을 측정하는 단계; 및In another embodiment of the present invention, there is provided a method of treating a patient, comprising: (a) measuring the amount of Dynamin related protein 1 (Drp1) in a sample isolated from a patient; And

(b) 상기 디나민 단백질 1의 양을 정상 대조군 시료 내 디나민 유사 단백질 1의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. (b) comparing the amount of dinamin protein 1 with the amount of dinaminin-like protein 1 in a normal control sample.

본 발명에서, 진단의 대상이 되는 당뇨병의 유형은 특별히 한정하지 않으며, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증일 수 있으나, 바람직하게는 제2형 당뇨병일 수 있다. In the present invention, the type of diabetes to be diagnosed is not particularly limited, and may be type 1 diabetes, type 2 diabetes or pre-diabetes, preferably type 2 diabetes.

또한, 본 발명에서 상기 당뇨병의 진단에 사용되는 디나민 유사 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.In addition, the dinamin-like protein 1 used in the diagnosis of diabetes in the present invention may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

본 발명은 상기 비교하는 단계에 있어서, 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 유사 단백질 1의 양이 정상 대조군 시료의 양보다 저발현된 경우 당뇨병으로 판단하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that when the amount of dinaminin-like protein 1 in the sample separated from the patient is lower than the amount of the normal control sample in the comparing step, the diabetes mellitus is judged to be diabetes.

본 발명에서 상기 디나민 유사 단백질 1의 양의 측정은 디나민 유사 단백질 1의 단량체 또는 중합체의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.In the present invention, the determination of the amount of the dinamin-like protein 1 comprises measuring the level of expression of the monomer or polymer of the dinamin-like protein 1.

바람직하게 본 발명은 시료에 상기 디나민 유사 단백질 1에 특이적인 항체를 처리하여, 그 반응 정도를 비교 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체의 당뇨병 발병 여부를 진단할 수 있다.Preferably, the present invention is capable of diagnosing the incidence of diabetes in a subject having a target sample by treating the sample with an antibody specific to the dinamin-like protein 1 and comparing the degree of the reaction.

본 발명은 상기와 같은 대조군 및 환자 시료군에 디나민 유사 단백질 1에 특이적인 항체를 처리한 후 항원-항체 반응의 반응 수준을 비교할 수 있는데, 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다. In the present invention, the level of the antigen-antibody reaction can be compared with the control group and the patient sample group after the treatment with the antibody specific for the dinamin-like protein 1. In the present invention, the level of the antigen- Means an amount of an antigen and an antibody recognizing it or an antigen-binding site thereof, and the amount of the antigen-antibody complex.

여기서, 상기 항원-항체의 반응 수준의 측정은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들면, 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으며, 이 중에서 실험 환경에 따라 적절한 방법을 선택하여 수행할 수 있다. The measurement of the level of the antigen-antibody reaction can be performed by any method commonly used in the art without limitation. For example, Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay A radioimmunoassay (RIA), a radioimmunodiffusion, an Ouchterlony immunodiffusion, a rocket immunoelectrophoresis, a tissue immuno staining, an immunoprecipitation assay, a complement fixation assay ), FACS, agglutination method, and protein chip. Among these, suitable methods can be selected according to the experimental environment.

구체적으로, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다. Specifically, the expression level of the protein in the present invention can be measured by an ELISA method. ELISAs include direct ELISA using labeled antibodies that recognize the antigen attached to the solid support, indirect ELISA using labeled antibodies that recognize the capture antibody in a complex of antibodies recognizing the antigen attached to the solid support, A direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes an antigen in the complex of antibody and antigen, a method of reacting with another antibody recognizing an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support, Indirect sandwich ELISA using a secondary antibody, and various ELISA methods. For example, an antibody may be attached to a solid support, reacted with a sample, labeled with an antibody that recognizes an antigen of an antigen-antibody complex, and then labeled with an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex The secondary antibody can be detected and detected by a sandwich ELISA method in which the secondary antibody is enzymatically developed. By checking the degree of complex formation of the marker protein and the antibody, it is possible to diagnose the onset of kidney cancer.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기 영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 당뇨병 발병 유무를 확인할 수 있다. 상기 정보 제공 방법은 당뇨병 발병 환자에서 디나민 유사 단백질 1의 발현량과 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량을 비교하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도)차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역 조직 염색을 실시할 수 있다. 당뇨병 발병 의심 개체의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.Western blotting using one or more antibodies to the marker may also be used. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the protein produced by the expression of the gene can be confirmed by confirming the amount of the antigen-antibody complex produced using the labeled antibody, and the presence or absence of diabetes can be confirmed. The information providing method comprises a method of comparing the expression level of dinamin-like protein 1 in the patient with diabetes mellitus and the expression level of the protein in the normal control group. Protein levels can be expressed as the absolute (eg, μg / ml) or relative (eg, the relative intensity of the signal) difference of the aforementioned marker proteins. Immunohistochemical staining using one or more antibodies to the marker can also be performed. After the tissue of suspected diabetic individuals is harvested and fixed, paraffin-embedded blocks are prepared by methods well known in the art. They are made into sections with a thickness of several micrometers and attached to a glass slide, and then reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels, and the labeling of the antibody is read on a microscope.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 당뇨병의 발병 유무를 진단할 수 있다.In addition, a protein chip in which one or more antibodies against the marker are arranged at predetermined positions on a substrate and immobilized at high density can be used. A method of analyzing a sample using a protein chip is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the protein, Diagnosis of diabetes mellitus can be made.

한편, 본 발명에서 용어 “디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)”이란 미토콘드리아 분열 단백질 중 하나로, 포유류 세포(mammalian cells)에서 미토콘드리아의 형상, 크기, 분포 및 유지 등에 중요한 역할을 한다. 최근에는 Drp1이 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 단편화, 인산화, 단백질 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 세포 사멸 등에 관련된 것으로 보고되었다. In the present invention, the term " Dynamin related protein 1 (Drp1) " is one of the mitochondrial cleavage proteins and plays an important role in the shape, size, distribution and maintenance of mitochondria in mammalian cells. Recently, Drp1 has been reported to be involved in mitochondrial and peroxisome fragmentation, phosphorylation, protein SUMOylation, ubiquitination and cell death.

본 발명에서 용어 “항체”란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 디나민 단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻한다. The term " antibody " as used herein refers to a specific protein molecule that is directed to an antigenic site as known in the art. For the purpose of the present invention, the antibody refers to an antibody that specifically binds to the dinamin protein 1 of the present invention, and the form of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, Part thereof is included in the antibody of the present invention and includes all the immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies. Antibodies used in the present invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function.

본 발명에서 용어 “시료”란 개체로부터 분리한 전혈, 혈장, 혈액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하며, 디나민 단백질 1을 검출할 수 있는 시료이면 제한되지 않는다. The term " sample " in the present invention includes samples such as whole blood, plasma, blood, saliva, urine, sputum, lymphatic fluid, and intracellular fluid isolated from an individual and is not limited as long as it can detect dinamin protein 1 .

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 디나민 단백질 1과 이에 특이적인 항체 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해 정량적으로 측정할 수 있다.The term " antigen-antibody complex " in the present invention refers to dinaminin protein 1 and antibody-specific binding thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed is determined quantitatively through the signal label of the detection label .

본 발명은 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 특이적이고 신속하게 진단할 수 있고, 나아가서는 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다. The present invention can diagnose diabetes mellitus in a specific and rapid manner by measuring the expression level of dinamin-related protein 1 (Dynamin related protein 1, Drp1), and further plan for appropriate treatment in the future, have.

도 1은 대조군 생쥐 BMDMs(WT BMDM)과 Drp1-넌타겟팅 shRNA(이하, 'shSCR'로 기재한다.)가 감염된 BMDMs 및 Drp1-타겟팅 shRNA(이하, 'shDrp1'으로 기재한다.)가 감염된 BMDMs에서 Drp1의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 MitoTracker Red로 염색된 shSCR 및 shDrp1 BMDMs의 공초점 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 shSCR 및 shDrp1 BMDMs의 투과형 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다(Scale Bars, 5 ㎛, 20,000x 확대.).
도 4는 shSCR 및 shDrp1 BMDMs을 미처리한 경우(Unt), TNF-α 및 CHX로 자극을 가한 경우(TC)와 zVAD-fmk의 존재 하에서 상기 TNF-α 및 CHX로 자극을 가한 경우(TCZ)에 있어서의 LDH(lactated dehydrogenase) 방출 정도(%)와 프로카스파제-3, p17 및 Drp1의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 shSCR 및 shDrp1 BMDMs을 미처리한 경우(Unt)와 LPS(lipopolysaccharide)로 활성화시킨 뒤 니제리신으로 처리한 경우(L+N)에서 LDH 방출 정도(%)를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(1 또는 2 mM, A; 2.5 mM, B)를 처리한 후 얻어진 배양 상청액(Sup)과 세포 용해물(Lys)을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(1 또는 2 mM, A; 2.5 mM, B)를 처리한 후 얻어진 배양 상청액에 대하여 세포 외 IL-1β를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 야생형 BMDMs에 mdivi-1(25 μM) 또는 CCCP(1-10 Μm) 전처리의 수행 또는 비수행 후 LPS로 처리 또는 비처리한 뒤 ATP(2.5 mM, 40분간)를 처리한 후 얻어진 배양 상층액 또는 세포 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤 ATP(2.5 mM, 30 분 간)로 처리 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 처리 또는 미처리한 뒤 니제리신(5 mM, 45 분 또는 120분 간)으로 처리 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, ASC 올리고머 구조는 DSS-중재 가교 결합에 의해 분석하였다.
도 12 및 도 13은 야생형 BMDMs에 CCCP(5 μΜ)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 3시간 동안 처리 또는 미처리한 뒤, ATP(2.5 mM, 30분간) 또는 니제리신(5 μΜ, 30분간)으로 처리한 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화는 상기 도 3A 및 도 3B에서와 동일한 방법으로 분석하였다.
도 14는 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 30분간)로 처리하고, 세포를 MitoSOX로 염색한 뒤 플로 사이토메트리를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 LPS로 shScr BMDMs, shDrp1 BMDM와 야생형 및 Nlrp3-/- BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(15 또는 30분간, 왼쪽; 30분간, 오른쪽)로 처리한 후 시토졸 mtDNA의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16 및 도 17은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 30분간)로 처리하고, MitoTracker Green 및 MitoTracker Red로 공동 염색한 후 플로 사이메트리를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 10분 또는 30분간)로 처리하고, 세포 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 U0126(10 mM, LPS 처리 전 30분 또는 120분간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤 ATP(2.5 mM, 10분 또는 30분간)로 처리하고, 배양 상청액 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 야생형 BMDMs에 CCCP(5 μΜ)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 2시간 또는 4시간 동안 처리 또는 미처리한 뒤, ATP로 처리하고, 배양 상청액 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 U0126(10 μM, 2시간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤, 세포 용해물을 미토콘드리아-풍부(Mito) 또는 시토졸(Cyt) 분획으로 분류하고, 각각의 분획 샘플을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 야생형 BMDMs를 U0126(10 μM, 30분간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤, ATP로 처리하고, 세포 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시킨 뒤, 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.Brief Description of the Drawings Figure 1 shows the effect of BMDMs infected with control mouse BMDMs (WT BMDM) and Drp1-non-targeted shRNA (hereinafter referred to as 'shSCR') and BMDMs infected with Drp1-targeted shRNA (hereinafter referred to as 'shDrp1'Lt; RTI ID = 0.0 > Drp1. ≪ / RTI >
Figure 2 is a confocal microscope photograph of shSCR and shDrp1 BMDMs stained with MitoTracker Red.
Figure 3 shows a transmission electron micrograph of shSCR and shDrp1 BMDMs (Scale Bars, 5 占 퐉, 20,000x magnification).
Fig. 4 shows the results of the case (TCZ) when the shSCR and shDrp1 BMDMs were untreated (Unt), when stimulated with TNF-α and CHX (TC) and when stimulated with TNF-α and CHX in the presence of zVAD-fmk (%) Of LDH (lactated dehydrogenase) release and the degree of expression of pro-caspase-3, p17 and Drp1.
FIG. 5 shows the degree of LDH release (%) when shSCR and shDrp1 BMDMs were treated with untreated (Unt) and LPS (lipopolysaccharide) and treated with nigerin (L + N).
FIG. 6 shows the results of immunoprecipitation of supernatant (Sup) and cell lysate (Lys) obtained after shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs were activated with LPS and treated with ATP (1 or 2 mM, A; 2.5 mM, The results are shown.
FIG. 7 shows the results of analysis of extracellular IL-1β against the culture supernatant after treatment of shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs with LPS and treatment with ATP (1 or 2 mM, A; 2.5 mM, B) .
Figures 8 and 9 show that wild-type BMDMs were pretreated with mdivi-1 (25 μM) or CCCP (1-10 mM), or treated with LPS followed by ATP (2.5 mM, 40 min) And the obtained culture supernatant or cell lysate was subjected to immunoassay.
FIG. 10 shows the results of immunoprecipitation of the lysate obtained after treatment with shampooing shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs with LPS and ATP (2.5 mM for 30 minutes) using an anti-ASC antibody, and then immunoprecipitates or lysates were immune The results are as follows.
Fig. 11 shows the results of treatment of shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs with LPS followed by treatment with nigerin (5 mM, 45 min or 120 min) followed by immunoprecipitation with anti-ASC antibody, Immunoprecipitates or lysates were immuno-assayed. However, the ASC oligomer structure was analyzed by DSS-mediated cross-linking.
Figures 12 and 13 show that wild-type BMDMs were treated or not treated with LPS for 3 hours in the presence or absence of CCCP (5 μM), followed by ATP (2.5 mM for 30 minutes) or nigerisin (5 μM for 30 minutes) After the treatment, the obtained lysate was subjected to immunoprecipitation using an anti-ASC antibody, followed by immunoassay of immunoprecipitates or lysates. However, the NLRP3-ASC interaction and the ASC oligomerization were analyzed in the same manner as in FIGS. 3A and 3B.
Fig. 14 shows the results of treatment with shampooing shSrr BMDMs and shDrp1 BMDMs treated with LPS, followed by treatment with ATP (2.5 mM, 30 min), staining with MitoSOX, and analysis with flow cytometry will be.
Figure 15 shows the results of measuring the amount of cytosolic mtDNA after activation of shScr BMDMs, shDrp1 BMDM and wild type and Nlrp3 - / - BMDMs with LPS followed by treatment with ATP (15 or 30 min, left: 30 min, right) .
FIGS. 16 and 17 show shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs treated with LPS or untreated, treated with ATP (2.5 mM, 30 minutes), co-stained with MitoTracker Green and MitoTracker Red, The results are shown in Fig.
FIG. 18 shows the results of immunological analysis of cell lysates treated with LPS or untreated shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs followed by treatment with ATP (2.5 mM, 10 minutes, or 30 minutes).
Figure 19 shows that shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs are treated or not treated with LPS in the presence or absence of U0126 (10 mM, 30 min or 120 min pretreatment before LPS treatment) and then treated with ATP (2.5 mM, 10 min or 30 min) , Culture supernatant, or lysate.
Figure 20 shows the results of immunoassay of cultured supernatant or lysate treated with ATP followed by treatment or untreated with LPS for 2 hours or 4 hours in the presence or absence of CCCP (5 [mu] M) in wild-type BMDMs.
Figure 21 shows that shScr BMDMs and shDrp1 BMDMs were treated or untreated with LPS in the presence or absence of U0126 (10 [mu] M, 2h pretreatment) and the cell lysates were classified as mitochondria-rich (Mito) or cytosol (Cyt) fractions And the result of immunological analysis of each fraction sample.
Figure 22 shows that wild-type BMDMs were treated or not treated with LPS in the presence or absence of U0126 (10 [mu] M, 30 min pretreatment) and then treated with ATP and the cell lysates were immunoprecipitated with anti- The results of immune analysis of sediment or lysate are shown.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예Example 1: 항체 및 시약 1: Antibodies and reagents

LPS, ATP, 니제리신(nigericin), 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX), CCCP, mdivi-1, U0126 및 Drp1-타켓팅 또는 넌타겟팅 shRNA 렌티바이러스 플라스미드는 Sigma에서 구입하였다. z-VAD-플루오로메틸케톤(zVAD-fmk)는 Bachem으로부터 얻었다. 생쥐 IL-1β 효소 면역 분석(ELISA) 키트는 R&D로부터 얻었다. MitoSOX, MitoTracker Green, MitoTracker Deep Red 및 생쥐 재조합 TNF-α는 Invitrogen에서 구입하였다. 안티-ASC, 안티-포스포-ERK 및 안티-β-액틴 항체는 Santa Cruz(미국, CA, 산타크루즈)로부터 구입하였다. 안티-생쥐 IL-1β 항체는 R&D로부터 얻었다. 안티-생쥐 카스파제-1(p20) 및 안티-NLRP3 항체는 Adipogen으로부터 얻었다. 안티-Drp1 및 안티-JNK1/2 항체는 BD Biosciences(미국, CA, 산디에고)에서, 안티-포스포-JNK1/2 항체는 Invitrogen에서 구입하였으며, 안티-VDAC1 항체는 Abcam에서 얻었다. 인간 IL-1β, 카스파제-3, ERK 및 IκB를 감지하는 모든 항체들은 Cell Signaling(미국, MA, Berverly)에서 얻었다.
LPS, ATP, nigericin, cycloheximide (CHX), CCCP, mdivi-1, U0126 and Drp1-targeting or non-targeting shRNA lentivirus plasmids were purchased from Sigma. z-VAD-fluoromethyl ketone (zVAD-fmk) was obtained from Bachem. Mouse IL-1 beta enzyme immunoassay (ELISA) kit was obtained from R & D. MitoSOX, MitoTracker Green, MitoTracker Deep Red and mouse recombinant TNF-a were purchased from Invitrogen. Anti-ASC, anti-phospho-ERK and anti-beta-actin antibodies were purchased from Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Anti-mouse IL-1 beta antibodies were obtained from R & D. Anti-mouse caspase-1 (p20) and anti-NLRP3 antibodies were obtained from Adipogen. Anti-Drp1 and anti-JNK1 / 2 antibodies were purchased from BD Biosciences (San Diego, CA, USA), anti-phospho-JNK1 / 2 antibodies were purchased from Invitrogen and anti-VDAC1 antibodies were obtained from Abcam. All antibodies that detect human IL-1 [beta], caspase-3, ERK, and I [kappa] B were obtained from Cell Signaling (Berverly, MA, USA).

실시예Example 2: 세포 배양(Cell Culture) 2: Cell Culture

C57BL/6 또는 Nlrp3 -/- 생쥐로부터 생쥐 골수 유래 대식세포(mouse bone marrow-derived macrophages, BMDMs)를 얻었다(Fernandes-Alnemri T, et al.(2010) The AIMS inflammasome is critical for innate immunity to Francisella turlarensis. Nat Immunol 11:385-393.). 모든 생쥐들을 특정한 무병 조건 하에서 생육하였으며, 동물 실험을 위한 프로토콜은 연세대학교 윤리 위원회로부터 승인을 받았다. Drp1 발현의 넉다운을 위하여, shRNA 넌타겟팅(scrambled) 또는 타겟팅 Drp1을 포함하는 렌티바이러스 입자를 사용하여 생쥐 BMDMs를 감염시켰다. 그 후 shRNA를 안정적으로 발현시키는 세포들을 퓨로마이신 선별에 의해 복제하였고, 모든 BMDMs를 10% FBS와 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 L929-조정 DMEM에서 배양하였다.
(AMP), which is the major factor responsible for the innate immunity of the AIMS, was obtained from C57BL / 6 or Nlrp3 - / - mice (Fernandes-Alnemri T, et al. Nat Immunol 11: 385-393.). All mice were grown under specific disease-free conditions. Protocols for animal experiments were approved by the Ethics Committee of Yonsei University. For knockdown of Drp1 expression, mouse BMDMs were infected with lentiviral particles containing either shRNA non-targeted (scrambled) or targeted Drp1. Cells stably expressing shRNA were then cloned by puromycin selection and all BMDMs were cultured in L929-regulated DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U / ml penicillin / streptomycin.

실시예Example 3: 세포 사멸 분석(Cell death Assay) 3: Cell death assay

세포 자기 사멸(apoptotic cell death), 계획성 세포 괴사(necroptotic cell death), 세포 사멸(pyroptotic cell death)을 유도하기 위하여, 세포에 TNF-α(30 ng/ml) 및 사이클로헥시미드(CHX, 0.4 ㎍/ml)와 선택적으로 zVAD-fmk(20 μM)를 20시간 동안 처리하거나, 혹은 세포를 LPS(0.25 ㎍/ml)로 활성화시킨 뒤, 세포에 니제리신(5 μM)을 45분간 처리하였다. 그 후 CytoTox96 비방사성 세포 독성 분석 키트(Promega)를 이용하여 락테이트 디하이드로제네이즈(lactate dehydrogenase, LDH)의 세포 외 방출을 통해 세포 사멸을 확인하였다. LDH 방출률(%)은 [세포 외 LDH/(세포 내 LDH + 세포 외 LDH) X 100]으로 계산하였다.
To induce apoptotic cell death, necroptotic cell death, and pyroptotic cell death, cells were treated with TNF-α (30 ng / ml) and cycloheximide (CHX, 0.4 Cells were treated with LPS (0.25 μg / ml) and treated with nigerisin (5 μM) for 45 minutes after treatment with zVAD-fmk (20 μM) . Cell death was then confirmed by extracellular release of lactate dehydrogenase (LDH) using the CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega). The LDH release rate (%) was calculated as [extracellular LDH / (intracellular LDH + extracellular LDH) X 100].

실시예Example 4: 면역  4: Immunity 블롯Blot 분석( analysis( ImmunoblotImmunoblot Analysis) Analysis)

세포를 0.5% Nonidet P-40(NP-40), 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA 및 프로테아제 억제제를 포함하는 20 mM HEPES(pH 7.5) 버퍼에 용해시켰다. 수용성 용해물을 SDS-PAGE에 로딩한 뒤, 적절한 항체를 이용하여 면역 분석을 수행하였다. 공동-면역 침전(co-immunoprecipitation) 실험을 위하여, 세포를 0.2% NP-40, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM EGTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제를 포함하는 20 mM HEPES(pH 7.5) 버퍼에 용해시켰다. 이 후 용해물을 단백질 G 세파로즈 4 비즈를 이용하여 정제한 뒤, 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시켰다. 비즈에 결합한 단백질들은 적절한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석하였다. 모든 블롯들은 최소 3개의 독립된 실험의 대표적 이미지를 나타낸 것이다.
Cells were dissolved in 0.5% Nonidet P-40 (NP -40), 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2, 1 mM EGTA and 20 mM HEPES (pH 7.5) containing a protease inhibitor buffer. The aqueous lysates were loaded onto SDS-PAGE and immunoassays were performed using appropriate antibodies. For co-immunoprecipitation experiments, cells were resuspended in 20 mM HEPES (pH 7.5) containing 0.2% NP-40, 100 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM EGTA, 1 mM DTT, Buffer. Thereafter, the lysate was purified using protein G Sepharose 4 beads, followed by immunoprecipitation using an anti-ASC antibody. Proteins bound to beads were immunoblotted using appropriate antibodies. All the blots represent representative images of at least three independent experiments.

실시예Example 5: 세포 이하의 분류(Subcellular Fractionation) 5: Subcellular fractionation

세포를 10 mM HEPES(pH 7.), 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1% NP-40 및 프로테아제 억제제를 포함하는 버퍼에 용해시켰다. 용해물은 700 g의 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하였고, 상청액을 12,500 g의 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하였다. 최종 얻어진 상청액을 시토졸 분획으로 사용하였다. 펠렛은 0.5% NP-40, 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA 및 프로테아제 억제제를 포함하는 10 mM HEPES(pH 7.4) 버퍼에 재현탁시킨 뒤, 12,500 g 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하고, 얻어진 상청액을 미토콘드리아-풍부 분획으로 사용하였다.
The cells 10 mM HEPES (pH 7.), 10 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.1 mM EGTA, was dissolved in a buffer containing 1 mM DTT, 0.1% NP- 40 and protease inhibitors. The lysate was centrifuged at 700 g for 10 minutes, and the supernatant was centrifuged at 12,500 g for 10 minutes. The resulting supernatant was used as the cytosol fraction. The pellet is 0.5% NP-40, 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl 2, 1 mM EGTA , and HEPES 10 mM, including protease inhibitors (pH 7.4) after the panoramic was resuspended in buffer, 10 minutes at 12,500 g Conditions And the resulting supernatant was used as a mitochondria-rich fraction.

실시예Example 6: 미토콘드리아 형상의 관찰 6: Observation of mitochondrial form

MitoTracker Red(Invitrogen)과 Hoechst 33258(Sigma)을 이용하여 세포를 염색한 뒤, 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss)을 이용해 분석하였다. 세포를 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4)에서 2% 글루타르알데히드-파라포름알데히드를 이용하여 2시간 동안 고정한 뒤, 투과형 전자 현미경(transmission electron microscope, TEM)으로 분석하였다. 세척 후, 세포를 0.1 M 인산 완충액에서 1% OsO4를 이용하여 2시간 동안 고정(post-fixed)하고, 에탄올(ascending gradual series, 50~100%)을 이용하여 수화하였다. 시료를 Poly/Bed 812 키트(Polysciences, Inc.)에 삽입한 뒤, 70-나노미터-두께의 시료를 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 염색하였다. 염색된 시료를 JEM-1011(JEOL) 투과형 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다.
Cells were stained with MitoTracker Red (Invitrogen) and Hoechst 33258 (Sigma) and analyzed using a confocal microscope (LSM700, Carl Zeiss). The cells were fixed with 2% glutaraldehyde-paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 2 hours and analyzed by transmission electron microscope (TEM). After washing, cells were post-fixed for 2 hours in 1% OsO 4 in 0.1 M phosphate buffer and hydrated using ascending gradual series (50-100%). The sample was inserted into a Poly / Bed 812 kit (Polysciences, Inc.) and the 70-nanometer-thick sample was stained with uranyl acetate and lead citrate. The dyed samples were observed using a JEM-1011 (JEOL) transmission electron microscope.

실시예Example 7:  7: NLRP3NLRP3 인플라마좀Inflammase 활성 분석(Assay of  Assay of NLRP3NLRP3 InflammasomeInflammasome Activation) Activation)

세포를 LPS(0.25 ㎍/ml)를 이용하여 2시간 동안 활성화한 뒤, ATP(1~2.5 Mm, 30~40 분간) 또는 니제리신(2.5 μM, 40 분간)으로 처리하였다. 이 후, 배양 상청액을 침전시키고(Fernandes-Alnemri T, Yu JW, Datta P, Wu Jm Alnemri ES(2009) AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA. Nature 458:509-513.), 안티-카스파제-1 또는 IL-1β 항체를 이용하여 면역 분석을 수행하거나 ELISA를 이용하여 세포 외 1L-1β를 분석하였다. ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain)의 올리고머화를 확인하기 위하여 디숙시니미딜 수베르산염(DSS)를 이용해 화학적 가교-결합을 형성하였다(Yu JW, et al.(2007) Pyrin activates the ASC pyroptosome in response to engagement by autoinflammatory PSTPIPI mutants. Mol Cell 28: 214-227.).
Cells were activated with LPS (0.25 μg / ml) for 2 h and then treated with either ATP (1-2 Mm, 30-40 min) or nigerisin (2.5 μM, 40 min). The culture supernatant is then precipitated (Fernandes-Alnemri T, Yu JW, Datta P, Wu Jm Alnemri ES (2009) AIM2 activates the inflammation and cell death in response to cytoplasmic DNA. Nature 458: 509-513) - caspase-1 or IL-1 beta antibody, or extracellular 1L-1 beta was analyzed using ELISA. Linkage was formed using di succinimidyl succinate (DSS) to confirm oligomerization of ASC (adapter protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) (Yu JW, et al (2007) Pyrin activates the ASC pyroptosome in response to engagement by autoinflammatory PSTPIPI mutants. Mol Cell 28: 214-227.).

실시예Example 8: 미토콘드리아 유래 물질 및 미토콘드리아 손상의 확인(Determination of Mitochondria-Derived Products and  8: Determination of Mitochondrial Derived Products and Mitochondrial Damage MitochondrialMitochondrial Damage) Damage)

mROS 생성 여부를 확인하기 위하여, 세포를 MitoSOX(Invitrogen)을 이용하여 염색하였다. 그 후 플로 사이토미터(FACSVerse, BD)를 이용하여 세포의 형광성을 관찰하였다. 시토졸 mtDNA를 측정하기 위하여, NP-40-프리 버퍼 A에서 21G 시린지를 이용하여 세포를 용해하고, 실시예 5에서 얻어진 시토졸 분획을 준비하여 10,000g 조건 하에서 마지막 원심 분리를 수행하였다. 그 후, DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen)을 이용하여 시토졸 분획으로부터 DNA를 분리하였다. 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 통하여 사이토크롬 c 옥시데이즈 Ⅰ을 코딩하는 유전자의 복제수를 확인하였다(프라이머; 5'-GCCCCAGATATAGCATTCCC-3'(주형가닥) 및 5'-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3'(비주형가닥)). 미토콘드리아의 손상과 전체 미토콘드리아의 무게를 측정하기 위하여, MitoTracker Deep Red(Invitrogen) 및 MitoTracker Green(Invitrogen)을 이용한 공동 염색과, MitoTracker Green을 이용한 단일 염색을 각각 수행하였고, 그 후 세포를 플로 사이토메트리를 이용하여 분석하였다. 플로 사이토메트리 데이터는 최소 3번의 독립적 실험의 대표를 나타낸 것이다.
Cells were stained with MitoSOX (Invitrogen) to determine whether mROS was generated. The fluorescence of the cells was then observed using a flow cytometer (FACSVerse, BD). In order to measure cytosol mtDNA, the cells were dissolved in NP-40-pre-buffer A using a 21G syringe, and the cytosol fraction obtained in Example 5 was prepared and final centrifugation was performed under 10,000 g conditions. DNA was then isolated from the cytosol fraction using a DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen). (Primer: 5'-GCCCCAGATATAGCATTCCC-3 '(template strand) and 5'-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3' (SEQ ID NO: 1) were confirmed by quantitative real- (Non-mold strand)). To measure mitochondrial damage and total mitochondrial weights, co-staining with MitoTracker Deep Red (Invitrogen) and MitoTracker Green (Invitrogen) and single staining with MitoTracker Green were performed respectively, Respectively. Flow cytometry data represent a representative of at least three independent experiments.

실험 결과Experiment result

단, 통계적 분석(Statistical Analysis) 시 모든 값들은 평균±각각의 샘플의 SEM으로 나타내었다. 데이터는 스튜던트의 t-검정(Student’s t-test)을 이용하여 분석하였고, P-값≤0.05는 통계적 유의성을 의미한다.
In statistical analysis, all values are expressed as mean ± SEM of each sample. Data were analyzed using Student's t-test (Student's t-test), and P-value ≤0.05 means statistical significance.

실험예Experimental Example 1:  One: Drp1Drp1 넉다운에In knockdown 기인한 미토콘드리아의 신장 및 세포 사멸 감수성의 증대 Increase in kidney and cell death susceptibility of mitochondria caused by

Drp1이 안정적으로 넉다운된 대식세포를 생산하기 위하여, 넌타겟팅(scrambled) 또는 Drp1-타켓팅 짧은 헤어핀 구조의 RNA(shRNA)를 이용하여 생쥐의 골수 유래 대식세포(BMDMs)를 감염시켰다. Drp1 infected mouse bone marrow macrophages (BMDMs) with scrambled or Drp1-targeting short hairpin RNA (shRNA) to produce stable knockdown macrophages.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, Drp1-타겟팅 shRNA가 감염된 BMDMs(Drp1)에서 Drp1의 발현 수준이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, Drp1이 넉다운된 대식세포에서 미토콘드리아의 길이가 신장되거나 혹은 형태가 커진 것을 볼 수 있다. As a result, as shown in Fig. 1, it was confirmed that the expression level of Drp1 in BMDMs (Drp1) infected with Drp1-targeted shRNA was significantly decreased. Also, as shown in FIGS. 2 and 3, it can be seen that the length of mitochondria is elongated or increased in the macrophages with Drp1 knocked down.

한편, 미토콘드리아는 계획된 세포 예정사(programmed cell death)에 중요한 역할을 하는 바, 대식세포의 세포 자기 사멸, 계획성 세포 괴사 및 세포 사멸 자극에 대한 민감도를 확인하였다. On the other hand, mitochondria play an important role in programmed cell death, confirming sensitivity to macrophage cell death, planned cell necrosis and apoptosis.

도 4에서 보는 바와 같이, TNF-α-사이클로헥시미드(TC) 자극 시 신장된 미토콘드리아를 포함하는 shDrp1 세포는 shScr BMDMs와 비교할 때, 세포 자기 사멸성이 감소되고, 카스파제-3 처리 또한 감소한 것을 확인할 수 있었다. 하지만, TCZ 자극 시에는 shScr 세포 및 shDrp1 세포 모두에서 RIP-3-의존 계획성 세포 괴사가 유사한 수준으로 발생하는 것을 볼 수 있었다. As shown in FIG. 4, shDrp1 cells containing mitochondria elongated upon TNF-α-cycloheximide (TC) stimulation showed reduced apoptosis and reduced caspase-3 treatment as compared to shScr BMDMs . However, at the time of TCZ stimulation, RIP-3-dependent planar cell necrosis occurred at similar levels in both shScr and shDrp1 cells.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이, NLRP3-활성 LPS/니제리신 자극 시 shDrp1 BMDMs가 대조군에 비교하여 카스파제-1-의존 세포 사멸이 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 5, caspase-1-dependent cell death was significantly increased in shDrp1 BMDMs when NLRP3-activated LPS / nigeric neurons were stimulated as compared with the control group.

이를 통하여 카스파제-1/인플라마좀 신호는 shScr BMDMs의 경우보다 신장된 미토콘드리아를 포함하는 shDrp1 BMDMs에서 더욱 강력히 작용하는 것을 알 수 있었다.
It was found that caspase-1 / inflammase signal was more potent in shDrp1 BMDMs containing elongated mitochondria than shScr BMDMs.

실험예Experimental Example 2:  2: Drp1Drp1 녹다운의  Knockdown NLRP3NLRP3 인플라마좀Inflammase 활성화 및 조립 촉진 Facilitate activation and assembly

다음으로, 미토콘드리아의 신장이 카스파제-1의 NLRP3-의존 활성화에 영향을 미치는 지 확인하였다. Next, it was determined whether mitochondrial kidney affects NLRP3-dependent activation of caspase-1.

도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, LPS 활성화 처리 없이 ATP 또는 니제리신으로 바로 처리한 경우, shScr BMDMs과는 달리 shDrp1 BMDMs에서는 카스파제-1 활성화가 수행된 것을 볼 수 있었다.As shown in FIGS. 6 and 7, caspase-1 activation was observed in shDrp1 BMDMs unlike shScr BMDMs when treated directly with ATP or nigerin without LPS activation treatment.

도 8에서 보는 바와 같이, 야생형 BMDMs에서 미토콘드리아 분열 억제제-1(mdivi-1)에 의한 Drp1의 억제 시 LPS/ATP- 또는 ATP-중재 카스파제-1의 활성이 지속적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다. As shown in FIG. 8, the inhibition of Drp1 by mitochondrial mitogen-1 (mdivi-1) in the wild-type BMDMs showed that the activity of LPS / ATP- or ATP-mediated caspase-1 was continuously increased.

프로토노포어 CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)는 미토콘드리아 분열을 촉진하는 것으로 알려져 있는데, 도 9에서 보는 바와 같이, CCCP 처리는 LPS/ATP-자극된 BMDMs에서 카스파제-1 활성을 약화시키고, IL-1β의 분비를 감소시키는 것을 볼 수 있다. As shown in FIG. 9, the CCCP treatment attenuates caspase-1 activity in LPS / ATP-stimulated BMDMs and inhibits IL-1 activity in LPS / ATP-stimulated BMDMs. Lt; RTI ID = 0.0 > secretase < / RTI >

이를 통하여 미토콘드리아의 신장은 NLRP3 인플라마좀의 활성을 강화시키고, 미토콘드리아의 분열은 활성을 억제함을 알 수 있었다. Through this, it was found that the mitochondrial kidney enhances the activity of NLRP3 inflammase and the mitochondrial division inhibits the activity.

다음으로, NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화를 확인하여 NLRP3 인플라마좀의 조립에 있어서 미토콘드리아 역학의 역할을 확인하였다. 양자 모두 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 위한 필수적 전제 조건이다. Next, confirmation of NLRP3-ASC interaction and ASC oligomerization confirmed the role of mitochondrial dynamics in the assembly of NLRP3 inflammases. Both are essential prerequisites for the activation of NLRP3 inflammases.

도 10에서 보는 바와 같이, LPS 처리 시 ASC와 NLRP3의 연관성이 기본적으로 높아지는 것을 볼 수 있었다. 그런데, Drp1가 넉다운된 BMDMs에서는 NLRP3-ASC 상호작용이 특히 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다. As shown in Fig. 10, the correlation between ASC and NLRP3 in the LPS treatment was basically increased. However, it was observed that the NLRP3-ASC interaction was significantly increased in Drp1 knockdown BMDMs.

도 11에서 보는 바와 같이, LPS/니제리신 자극에 의해 유도된 ASC 올리고머화는 shScr BMDMs와 비교하여 shDrp1 BMDMs에서 보다 강력한 효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다. As shown in Fig. 11, ASC oligomerization induced by LPS / niger stimulation showed stronger effect on shDrp1 BMDMs than shScr BMDMs.

또한, 도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이, 미토콘드리아 분열을 유도하기 위한 CCCP의 처리는 NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화를 약화시키는 것을 볼 수 있었다. In addition, as shown in FIGS. 12 and 13, the treatment of CCCP to induce mitochondrial division was found to attenuate NLRP3-ASC interaction and ASC oligomerization.

이를 통하여, Drp1 넉다운에 의한 미토콘드리아의 신장은 NLRP3-ASC 상호작용을 높이고 ASC 올리고머화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.
Through this, it was found that mitochondrial elongation by Drp1 knockdown enhances NLRP3-ASC interaction and promotes ASC oligomerization.

실험예Experimental Example 3:  3: Drp1Drp1 넉다운Knockdown 대식세포에서의  In macrophages 증가된Increased 미토콘드리아 손상 및  Mitochondrial damage and 카스파제Caspase -1 활성화와의 관계-1 Relationship with Activation

미토콘드리아의 길이 신장이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 어떻게 촉진시킬 수 있는 지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 유래 물질로 mROS 및 mtDNA 의 생성 정도를 확인하였다. Mitochondrial length To confirm how the kidneys could promote NLRP3 in fl ammation, the degree of mROS and mtDNA production was confirmed by mitochondrial-derived materials.

도 14에서 보는 바와 같이, mROS-민감 MitoSOX 염색 결과에 따르면, LPS/ATP 자극 시 mROS 생성량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 다만, shScr BMDMs의 경우보다 Drp1 넉다운 BMDMs에서 mROS 생성량이 조금 더 증가한 것을 볼 수 있었다.As shown in Fig. 14, mROS-sensitive MitoSOX staining results showed that the amount of mROS produced during LPS / ATP stimulation increased. However, mRNA production was slightly increased in Drp1 knockdown BMDMs than shScr BMDMs.

도 15에서 보는 바와 같이, LPS-활성화된 BMDMs에 ATP로 자극을 가한 경우, mtDNA의 시토졸로의 방출이 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 더욱이 상기 mtDNA 방출은 특히 ATP로 15분 처리하였을 때 shScr BMDMs보다 shDrp1 BMDM에서 더욱 증가한 것을 볼 수 있었다. 그러나, Nlrp3-/- BMDMs에서는 mtDNA의 LPS/ATP 유도 세포질 방출이 수행되지 않는 것을 볼 수 있다. 이를 통하여 mtDNA 방출은 카스파제-1 활성화 또는 NLRP3의 존재에 의존하는 것을 알 수 있었다. As shown in FIG. 15, when ATP stimulation was applied to LPS-activated BMDMs, the release of mtDNA into the cytosol was accelerated. Moreover, the mtDNA release was found to be more increased in shDrp1 BMDM than in shScr BMDMs, especially when treated with ATP for 15 min. However, it can be seen that LPS / ATP-induced cytosolic release of mtDNA is not performed in Nlrp3 - / - BMDMs. It has been found that mtDNA release is dependent on the presence of caspase-1 activation or NLRP3.

또한, 미토콘드리아의 손상 증가가 Drp1 넉다운 세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성화와 어떠한 관련이 있는 지를 확인하기 위하여, MitoTracker Green 및 MitoTracker Red로 공동 염색된 세포에서 미토콘드리아의 손상을 확인해 미토콘드리아 막 전위의 소멸을 측정하였다. In addition, in order to determine how the increase in mitochondrial damage correlates with NLRP3 inflammation activation in Drp1 knockdown cells, mitochondrial membrane potential disruption was measured by examining mitochondrial damage in co-stained cells with MitoTracker Green and MitoTracker Red .

도 16에서 보는 바와 같이, LPS/ATP 자극 시 손상된 미토콘드리아를 포함하는 세포의 수가 증가시키는 것을 볼 수 있었다. As shown in FIG. 16, it was observed that the number of cells containing damaged mitochondria was increased during LPS / ATP stimulation.

또한 도 17에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서는 미토콘드리아 중량에서 카스파제-1-의존 감소(caspase-1-dependent decrease)가 관찰되었으나, shDrp1 BMDMs에서는 카스파제-1 활성이 증가하였음에도 불구하고, 카스파제-1-의존 감소가 관찰되지 않았다. As shown in FIG. 17, caspase-1-dependent decrease in mitochondrial weight was observed in shScr BMDMs, but caspase-1-dependent decrease was observed in shDrp1 BMDMs, No 1-dependent reduction was observed.

이를 통하여 미토콘드리아 신장은 카스파제-1-의존 소모(caspase-1-dependent depletion)로부터 미토콘드리아를 보호할 수 있고, 최종적으로 미토콘드리아는 NLRP3 인플라마좀 활성화를 촉진할 수 있는 것을 알 수 있었다.
It has been found that the mitochondrial kidney can protect the mitochondria from caspase-1-dependent depletion and ultimately mitochondria can promote NLRP3 inflammation activation.

실험예Experimental Example 4:  4: Drp1Drp1 녹다운에 기인한  Due to knockdown ERKERK 활성화 및  Activation and NLRP3NLRP3 인플라마좀Inflammase 조립 촉진 Facilitate assembly

최근 연구에서는 ERK 신호가 LPS-유도 NLRP3 활성화에 중요한 역할을 하고, 인플라마좀 활성화의 전제 조건이 된다고 밝혀진 바 있다(Ghonime MG, et al.(2014) Inflammasome priming by lipopolysaccharide is dependent upon ERK signaling and proteasome function. J Immunol 192: 3881-3888). 이에, Drp1 넉다운 세포에서 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀 활성화의 촉진에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 ERK 인산화를 수행하였다. Recent studies have shown that the ERK signal plays an important role in the activation of LPS-induced NLRP3 and is a prerequisite for the activation of inflammation (Ghonime MG, et al. (2014)). Inflammation of ERK signaling and proteasome J Immunol 192: 3881-3888). ERK phosphorylation was performed to determine whether the ERK signal in NLRP3 knockdown cells affects the stimulation of NLRP3 inactivation.

도 18에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 LPS 자극은 ERK1 및 ERK2 인산화를 일으키는 것을 볼 수 있었다. 반면 Drp1 녹다운 BMDMs는 LPS 자극 없이도 기초적인 ERK 인산화가 발생하는 것을 볼 수 있었다. As shown in Fig. 18, LPS stimulation in shScr BMDMs was found to cause ERK1 and ERK2 phosphorylation. On the other hand, Drp1 knockdown BMDMs showed that basic ERK phosphorylation occurred without LPS stimulation.

또한, 도 19에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 U0126, MEK1 및 MEK2의 선택적 억제제에 의한 ERK 경로의 방해가 LPS/ATP-중재 ERK 인산화 및 카스파제-1 활성화를 현저히 감소시킨 것을 볼 수 있었고, 이를 통하여 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀의 활성화에 요구되는 것을 알 수 있었다. 한편, shDrp1 BMDMs에서도 U0126에 의해 ERK 인산화가 감소되었고, 이러한 U0126 처리는 ATP 또는 니제리신 중재 카스파제-1 활성화를 실질적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 19, it was observed that disturbance of ERK pathway by selective inhibitor of U0126, MEK1 and MEK2 in shScr BMDMs significantly reduced LPS / ATP-mediated ERK phosphorylation and caspase-1 activation, ERK signal is required for activation of NLRP3 inflammase. In shDrp1 BMDMs, ERK phosphorylation was decreased by U0126, and it was found that U0126 treatment substantially inhibited ATP or nigerin-induced caspase-1 activation.

또한, 도 20에서 보는 바와 같이, CCCP가 LPS 또는 LPS/ATP-중재 ERK 인산화를 감소시키는 것을 볼 수 있었다.Also, as shown in Fig. 20, it was seen that CCCP reduced LPS or LPS / ATP-mediated ERK phosphorylation.

이를 통하여 Drp1 넉다운 세포에서 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀 활성화에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. This suggests that the ERK signal affects NLRP3 inactivation in Drp1 knockdown cells.

한편, 미토콘드리아는 인플라마좀 구성 성분을 조립하는데 플랫폼 역항르 수행하기 때문에, NLRP3 인플라마좀 구성 성분의 세포 이하 분포를 확인하였다. On the other hand, because the mitochondria perform platform reversal to assemble the components of the inflammase, subcellular distribution of NLRP3 inflammase components was confirmed.

도 21에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 LPS 활성화에 의해 NLRP3의 미토콘드리아 내 분포가 증가하는 것을 볼 수 있었으나, 이는 U0126에 의해서는 억제되는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 21, the distribution of NLRP3 in the mitochondria was increased by LPS activation in shScr BMDMs, but this was suppressed by U0126.

또한, 도 22에서 보는 바와 같이, U0126의 처리에 의해 NLRP3 및 ASC의 연관성이 부분적으로 감소한 것을 볼 수 있었고, 이를 통해 NLRP3의 ERK-의존성 미토콘드리아 내의 위치화가 NLRP3 조립에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. In addition, as shown in FIG. 22, the association of NLRP3 and ASC was partially reduced by treatment with U0126, and it was found that NLRP3 localization in ERK-dependent mitochondria plays an important role in NLRP3 assembly .

한편, 도 21에서 보는 바와 같이, ERK 인산화뿐만 아니라, 미자극된 shDrp1 BMDMs는 shScr BMDMs의 경우보다 미토콘드리아 내 NLRP3의 분포가 증가한 것을 볼 수 있었다. On the other hand, as shown in Fig. 21, not only ERK phosphorylation but also the unstimulated shDrp1 BMDMs showed an increase in the distribution of NLRP3 in the mitochondria than in the shScr BMDMs.

즉, 미토콘드리아 내 ASC 수준이 shDrp1 세포에서 높았고, 이는 NLRP3 인플라마좀의 조립을 위한 세포 환경을 유지하기 위하여 사용되는 것임을 알 수 있었다. 또한, 미토콘드리아의 길이 신장이 ERK 경로의 활성화를 유도하고, 최종적으로는 NLRP3 인플라마좀의 조립 및 활성화를 촉진함을 알 수 있다.
That is, the level of ASC in mitochondria was high in shDrp1 cells, which was used to maintain the cellular environment for the assembly of NLRP3 inflammases. Also, it can be seen that mitochondrial length elongation induces activation of the ERK pathway and ultimately facilitates assembly and activation of NLRP3 inflammas.

따라서, 본 발명에서는 Drp1의 넉다운에 의해 미토콘드리아 분열에 결함이 생긴 경우, NLRP3를 통한 신호에 영향을 미치는 것을 알 수 있었고, 구체적으로는 Drp1-타켓팅 shRNA를 안정적으로 발현시키는 Drp1 넉다운 대식세포는 미토콘드리아의 신장이 관찰될 뿐만 아니라, LPS/ATP 자극에 의해 카스파제-1 활성 및 인터루킨-1-β 분비가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 미토콘드리아 분열의 화학적 유도자인 카보닐 시아니드 m-클로로페닐 하이드라존(CCCP)의 경우 NLRP3 인플라마좀의 조립 및 활성화를 방지하는 것을 볼 수 있었다. 또한, Drp1 넉다운 세포에서 NLRP3-활성화 자극은 미토콘드리아 활성화 산소종의 생성이나, 미토콘드리아 DNA의 방출과 같은 미토콘드리아 손상을 유도하지만, 카스파제-1 활성화를 촉진하는 것을 볼 수 있었다. 즉, Drp1-넉다운 세포에서 세포 외 신호-조절 키네이즈(ERK)의 구조적 인산화가 발생하고, ERK 신호의 증가는 NLRP3를 미토콘드리아 내부로 위치화시켜 NLRP3 인플라마좀의 조립을 촉진하며, 이를 통해 제2형 당뇨병과 같은 대사성 질환이 유도되는 것을 알 수 있었다. Therefore, in the present invention, when a defect in mitochondrial division is caused by the knockdown of Drp1, it is found that it affects the signal through NLRP3. Specifically, Drp1 knockdown macrophage stably expressing Drp1-targeting shRNA expresses mitochondria Not only kidney was observed but also that secretion of caspase-1 and interleukin-1-beta was increased by LPS / ATP stimulation. On the other hand, the chemical inducer of mitochondrial division, the carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), was found to prevent the assembly and activation of the NLRP3 inflammase. In addition, NLRP3-activated stimulation in Drp1 knockdown cells induces mitochondrial damage such as mitochondrial activated oxygen species production or mitochondrial DNA release, but promotes caspase-1 activation. That is, the structural phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) occurs in Drp1-knockdown cells and the increase of the ERK signal locates NLRP3 inside the mitochondria to promote NLRP3 inflammase assembly, And metabolic diseases such as type 2 diabetes were induced.

이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is clearly understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be taken by way of limitation, It is to be understood that the invention may be practiced within the scope of the appended claims.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression analysis and the method for providing information for diagnosis of diabetic disease <130> DPB150034 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ala Leu Ile Pro Val Ile Asn Lys Leu Gln Asp Val Phe Asn 1 5 10 15 Thr Val Gly Ala Asp Ile Ile Gln Leu Pro Gln Ile Val Val Val Gly 20 25 30 Thr Gln Ser Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ser Leu Val Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Leu Pro Arg Gly Thr Gly Ile Val Thr Arg Arg Pro Leu Ile 50 55 60 Leu Gln Leu Val His Val Ser Gln Glu Asp Lys Arg Lys Thr Thr Gly 65 70 75 80 Glu Glu Asn Gly Val Glu Ala Glu Glu Trp Gly Lys Phe Leu His Thr 85 90 95 Lys Asn Lys Leu Tyr Thr Asp Phe Asp Glu Ile Arg Gln Glu Ile Glu 100 105 110 Asn Glu Thr Glu Arg Ile Ser Gly Asn Asn Lys Gly Val Ser Pro Glu 115 120 125 Pro Ile His Leu Lys Ile Phe Ser Pro Asn Val Val Asn Leu Thr Leu 130 135 140 Val Asp Leu Pro Gly Met Thr Lys Val Pro Val Gly Asp Gln Pro Lys 145 150 155 160 Asp Ile Glu Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ile Leu Arg Phe Ile Ser Asn 165 170 175 Pro Asn Ser Ile Ile Leu Ala Val Thr Ala Ala Asn Thr Asp Met Ala 180 185 190 Thr Ser Glu Ala Leu Lys Ile Ser Arg Glu Val Asp Pro Asp Gly Arg 195 200 205 Arg Thr Leu Ala Val Ile Thr Lys Leu Asp Leu Met Asp Ala Gly Thr 210 215 220 Asp Ala Met Asp Val Leu Met Gly Arg Val Ile Pro Val Lys Leu Gly 225 230 235 240 Ile Ile Gly Val Val Asn Arg Ser Gln Leu Asp Ile Asn Asn Lys Lys 245 250 255 Ser Val Thr Asp Ser Ile Arg Asp Glu Tyr Ala Phe Leu Gln Lys Lys 260 265 270 Tyr Pro Ser Leu Ala Asn Arg Asn Gly Thr Lys Tyr Leu Ala Arg Thr 275 280 285 Leu Asn Arg Leu Leu Met His His Ile Arg Asp Cys Leu Pro Glu Leu 290 295 300 Lys Thr Arg Ile Asn Val Leu Ala Ala Gln Tyr Gln Ser Leu Leu Asn 305 310 315 320 Ser Tyr Gly Glu Pro Val Asp Asp Lys Ser Ala Thr Leu Leu Gln Leu 325 330 335 Ile Thr Lys Phe Ala Thr Glu Tyr Cys Asn Thr Ile Glu Gly Thr Ala 340 345 350 Lys Tyr Ile Glu Thr Ser Glu Leu Cys Gly Gly Ala Arg Ile Cys Tyr 355 360 365 Ile Phe His Glu Thr Phe Gly Arg Thr Leu Glu Ser Val Asp Pro Leu 370 375 380 Gly Gly Leu Asn Thr Ile Asp Ile Leu Thr Ala Ile Arg Asn Ala Thr 385 390 395 400 Gly Pro Arg Pro Ala Leu Phe Val Pro Glu Val Ser Phe Glu Leu Leu 405 410 415 Val Lys Arg Gln Ile Lys Arg Leu Glu Glu Pro Ser Leu Arg Cys Val 420 425 430 Glu Leu Val His Glu Glu Met Gln Arg Ile Ile Gln His Cys Ser Asn 435 440 445 Tyr Ser Thr Gln Glu Leu Leu Arg Phe Pro Lys Leu His Asp Ala Ile 450 455 460 Val Glu Val Val Thr Cys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Pro Val Thr Asn 465 470 475 480 Glu Met Val His Asn Leu Val Ala Ile Glu Leu Ala Tyr Ile Asn Thr 485 490 495 Lys His Pro Asp Phe Ala Asp Ala Cys Gly Leu Met Asn Asn Asn Ile 500 505 510 Glu Glu Gln Arg Arg Asn Arg Leu Ala Arg Glu Leu Pro Ser Ala Val 515 520 525 Ser Arg Asp Lys Ser Ser Lys Val Pro Ser Ala Leu Ala Pro Ala Ser 530 535 540 Gln Glu Pro Ser Pro Ala Ala Ser Ala Glu Ala Asp Gly Lys Leu Ile 545 550 555 560 Gln Asp Ser Arg Arg Glu Thr Lys Asn Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly 565 570 575 Val Gly Asp Gly Val Gln Glu Pro Thr Thr Gly Asn Trp Arg Gly Met 580 585 590 Leu Lys Thr Ser Lys Ala Glu Glu Leu Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys 595 600 605 Pro Ile Pro Ile Met Pro Ala Ser Pro Gln Lys Gly His Ala Val Asn 610 615 620 Leu Leu Asp Val Pro Val Pro Val Ala Arg Lys Leu Ser Ala Arg Glu 625 630 635 640 Gln Arg Asp Cys Glu Val Ile Glu Arg Leu Ile Lys Ser Tyr Phe Leu 645 650 655 Ile Val Arg Lys Asn Ile Gln Asp Ser Val Pro Lys Ala Val Met His 660 665 670 Phe Leu Val Asn His Val Lys Asp Thr Leu Gln Ser Glu Leu Val Gly 675 680 685 Gln Leu Tyr Lys Ser Ser Leu Leu Asp Asp Leu Leu Thr Glu Ser Glu 690 695 700 Asp Met Ala Gln Arg Arg Lys Glu Ala Ala Asp Met Leu Lys Ala Leu 705 710 715 720 Gln Gly Ala Ser Gln Ile Ile Ala Glu Ile Arg Glu Thr His Leu Trp 725 730 735 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression          analysis and the method for providing information for diagnosis          of diabetic disease <130> DPB150034 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ala Leu Ile Pro Val Ile Asn Lys Leu Gln Asp Val Phe Asn   1 5 10 15 Thr Val Gly Ala Asp Ile Ile Gln Leu Pro Gln Ile Val Val Val Gly              20 25 30 Thr Gln Ser Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Ser Ser Val Val Gly Arg          35 40 45 Asp Leu Leu Pro Arg Gly Thr Gly Ile Val Thr Arg Arg Pro Leu Ile      50 55 60 Leu Gln Leu Val His Val Ser Gln Glu Asp Lys Arg Lys Thr Thr Gly  65 70 75 80 Glu Glu Asn Gly Val Glu Ala Glu Glu Trp Gly Lys Phe Leu His Thr                  85 90 95 Lys Asn Lys Leu Tyr Thr Asp Phe Asp Glu Ile Arg Gln Glu Ile Glu             100 105 110 Asn Glu Thr Glu Arg Ile Ser Gly Asn Asn Lys Gly Val Ser Pro Glu         115 120 125 Pro Ile His Leu Lys Ile Phe Ser Pro Asn Val Val Asn Leu Thr Leu     130 135 140 Val Asp Leu Pro Gly Met Thr Lys Val Pro Gly Asp Gln Pro Lys 145 150 155 160 Asp Ile Glu Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ile Leu Arg Phe Ile Ser Asn                 165 170 175 Pro Asn Ser Ile Ile Leu Ala Val Thr Ala Ala Asn Thr Asp Met Ala             180 185 190 Thr Ser Glu Ala Leu Lys Ile Ser Arg Glu Val Asp Pro Asp Gly Arg         195 200 205 Arg Thr Leu Ala Val Ile Thr Lys Leu Asp Leu Met Asp Ala Gly Thr     210 215 220 Asp Ala Met Asp Val Leu Met Gly Arg Val Ile Pro Val Lys Leu Gly 225 230 235 240 Ile Ile Gly Val Val Asn Arg Ser Gln Leu Asp Ile Asn Asn Lys Lys                 245 250 255 Ser Val Thr Asp Ser Ile Arg Asp Glu Tyr Ala Phe Leu Gln Lys Lys             260 265 270 Tyr Pro Ser Leu Ala Asn Arg Asn Gly Thr Lys Tyr Leu Ala Arg Thr         275 280 285 Leu Asn Arg Leu Leu Met His His Ile Arg Asp Cys Leu Pro Glu Leu     290 295 300 Lys Thr Arg Ile Asn Val Leu Ala Gln Tyr Gln Ser Leu Leu Asn 305 310 315 320 Ser Tyr Gly Glu Pro Val Asp Asp Lys Ser Ala Thr Leu Leu Gln Leu                 325 330 335 Ile Thr Lys Phe Ala Thr Glu Tyr Cys Asn Thr Ile Glu Gly Thr Ala             340 345 350 Lys Tyr Ile Glu Thr Ser Glu Leu Cys Gly Gly Ala Arg Ile Cys Tyr         355 360 365 Ile Phe His Glu Thr Phe Gly Arg Thr Leu Glu Ser Val Asp Pro Leu     370 375 380 Gly Gly Leu Asn Thr Ile Asp Ile Leu Thr Ala Ile Arg Asn Ala Thr 385 390 395 400 Gly Pro Arg Pro Ala Leu Phe Val Pro Glu Val Ser Phe Glu Leu Leu                 405 410 415 Val Lys Arg Gln Ile Lys Arg Leu Glu Glu Pro Ser Leu Arg Cys Val             420 425 430 Glu Leu Val His Glu Glu Met Gln Arg Ile Ile Gln His Cys Ser Asn         435 440 445 Tyr Ser Thr Gln Glu Leu Leu Arg Phe Pro Lys Leu His Asp Ala Ile     450 455 460 Val Glu Val Thr Cys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Pro Val Thr Asn 465 470 475 480 Glu Met Val His Asn Leu Val Ala Ile Glu Leu Ala Tyr Ile Asn Thr                 485 490 495 Lys His Pro Asp Phe Ala Asp Ala Cys Gly Leu Met Asn Asn Asn Ile             500 505 510 Glu Glu Gln Arg Arg Asn Arg Leu Ala Arg Glu Leu Pro Ser Ala Val         515 520 525 Ser Arg Asp Lys Ser Ser Lys Val Ser Ser Ala Leu Ala Pro Ala Ser     530 535 540 Gln Glu Pro Ser Pro Ala Ala Ser Ala Glu Ala Asp Gly Lys Leu Ile 545 550 555 560 Gln Asp Ser Arg Arg Glu Thr Lys Asn Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly                 565 570 575 Val Gly Asp Gly Val Gln Glu Pro Thr Thr Gly Asn Trp Arg Gly Met             580 585 590 Leu Lys Thr Ser Lys Ala Glu Glu Leu Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys         595 600 605 Pro Ile Pro Ile Met Pro Ala Ser Pro Gln Lys Gly His Ala Val Asn     610 615 620 Leu Leu Asp Val Pro Val Val Ala Arg Lys Leu Ser Ala Arg Glu 625 630 635 640 Gln Arg Asp Cys Glu Val Ile Glu Arg Leu Ile Lys Ser Tyr Phe Leu                 645 650 655 Ile Val Arg Lys Asn Ile Gln Asp Ser Val Pro Lys Ala Val Met His             660 665 670 Phe Leu Val Asn His Val Lys Asp Thr Leu Gln Ser Glu Leu Val Gly         675 680 685 Gln Leu Tyr Lys Ser Ser Leu Leu Asp Asp Leu Leu Thr Glu Ser Glu     690 695 700 Asp Met Ala Gln Arg Arg Lys Glu Ala Ala Asp Met Leu Lys Ala Leu 705 710 715 720 Gln Gly Ala Ser Gln Ile Ile Ala Glu Ile Arg Glu Thr His Leu Trp                 725 730 735

Claims (9)

서열번호 1로 표시되는 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1), 또는 이에 특이적인 항체를 포함하며,
상기 디나민 유사 단백질 1의 발현이 정상 대조군에 비하여 낮은 경우 당뇨병으로 진단하기 위한, 당뇨병 진단용 키트. A Dynamin related protein 1 (Drp1) represented by SEQ ID NO: 1, or an antibody specific thereto,
Wherein the expression of the dinamin-like protein 1 is lower than that of the normal control. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 진단용 키트.The method according to claim 1,
Wherein the diabetes is type 2 diabetes. (a) 환자로부터 분리된 시료 내 서열번호 1로 표시되는 디나민 유사 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 양을 측정하는 단계;
(b) 상기 디나민 유사 단백질 1의 양을 정상 대조군 시료 내 디나민 유사 단백질 1의 양과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 비교하는 단계 시 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 유사 단백질 1의 양이 정상 대조군 시료의 양보다 적은 경우 당뇨병으로 판단하는 단계를 포함하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법. (a) measuring the amount of a dinamin-related protein 1 (Drp1) shown in SEQ ID NO: 1 in a sample isolated from a patient;
(b) comparing the amount of said dinamin-like protein 1 to the amount of dinamin-like protein 1 in a normal control sample; And
(c) determining that the amount of dinamin-like protein 1 in the sample separated from the patient is less than the amount of the normal control sample during the comparison in the step (b). Way. 삭제delete 삭제delete 제4항에 있어서,
상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.5. The method of claim 4,
Wherein the diabetes is type 2 diabetes. 제4항에 있어서,
상기 디나민 유사 단백질 1의 양을 측정하는 단계는 디나민 유사 단백질 1에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.5. The method of claim 4,
Wherein the step of measuring the amount of the dinaminin-like protein 1 is carried out using an antibody specific for dinamin-like protein 1. 제4항에 있어서,
상기 디나민 유사 단백질 1의 양을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법을 이용하여 수행되는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.5. The method of claim 4,
The step of measuring the amount of the dinaminin-like protein 1 may be performed by Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, Ouchteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assays, FACS or protein chip method for the diagnosis of diabetes.
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