KR102572009B1 - Biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising Cystatin C, and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시스타틴 C를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 야생형에 비해 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 해마의 시스타틴 C 생산 수준이 감소되어 있음을 확인하고, 야생형에 비해 시스타틴 C 생산 수준이 감소된 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도가 감소되어 있음을 확인함으로써, 시스타틴 C의 수준이 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도에 영향을 주는 것을 입증하고, 해마의 시스타틴 C의 생산 수준이 고지방(HF) 식단으로 유도되는 신경 손상을 억제함을 입증함으로써, 시스타틴 C를 포함하는 조성물을 퇴행성 신경 질환을 진단하는 마커로 제공하고, 이들을 이용하여 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물 및 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C and its use. Specifically, it is confirmed that the production level of cystatin C in the hippocampus is reduced in NOX4 knockout (NOX4 KO) compared to wild type, By confirming that the degree of branching of DCX-positive neuroblasts and dendrites was reduced in the NOX4 knockout (NOX4 KO) with reduced cystatin C production level compared to the wild type, the level of cystatin C was higher in DCX-positive neuroblasts and dendrites. By demonstrating that the degree of branching is affected and that the production level of cystatin C in the hippocampus inhibits nerve damage induced by a high-fat (HF) diet, a composition containing cystatin C is used to diagnose neurodegenerative diseases. It is provided as a marker, and a composition for diagnosing neurodegenerative diseases and a method for providing information for diagnosing neurodegenerative diseases using them are provided.

Description

시스타틴 C를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도{Biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising Cystatin C, and uses thereof}Biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising Cystatin C, and uses thereof

본 발명은 시스타틴 C를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C and its use.

해마의 신경 발생은 뇌의 학습 및 기억 기능에 중요한 역할을 한다. 해마의 신경 발생은 치상회(dentate gyrus) 및 인접한 하위 과립 구역(sub-granular zone)의 과립 세포층(granular cell layer)에서 세포 증식, 신경 분화 및 세포 생존에 의해 조절된다. 성체 뇌신경발생 및 신경발생 발달은 모두 유전 및 분자 프로그램에 의해 제어된다. 신경 발생을 증가 또는 감소시키는 내재적 또는 외적 요인이 있으며, 이는 인가의 행동이나 환경 요인에 따라 달라질 수 있으며, 새로운 뉴련의 형성을 증가 또는 감소시킬 수 있다.Hippocampal neurogenesis plays an important role in brain learning and memory functions. Hippocampal neurogenesis is regulated by cell proliferation, neuronal differentiation and cell survival in the granular cell layer of the dentate gyrus and adjacent sub-granular zones. Both adult cranial neurogenesis and neurogenesis development are controlled by genetic and molecular programs. There are intrinsic or extrinsic factors that increase or decrease neurogenesis, which may vary depending on human behavior or environmental factors, and may increase or decrease the formation of new neurons.

해마의 기능은 음식에 대한 행동 조절,장내 영양소 흡수, 열 발생, 간, 지방조직 및 골격근과 같은 대사 조직과의 상호작용을 포함한 다양한 측면을 통해 인체의 전신 대사와 연결된다. 또한, 해마의 기능은 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 인간 대사 질환에서 전신 염증과 호르몬 불균형을 통한 신체 대사 변화에 영향을 받는다. 최근에는 신경 발생의 기능 장애가 인간 대사 질환과 관련이 있다고 보고된 바 있다. 비만 및 제2형 당뇨병과 관련된 고지방 식단 하에서 해마의 신경 발생은 산화 스트레스의 증가와 강화된 해마 신경 발생에 관여하는 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neurotrophic facto)의 감소에 의해 억제된다.The function of the hippocampus is linked to the body's systemic metabolism through various aspects, including behavioral regulation of food, absorption of nutrients in the intestine, heat generation, and interaction with metabolic tissues such as the liver, adipose tissue, and skeletal muscle. In addition, the function of the hippocampus is affected by changes in body metabolism through systemic inflammation and hormonal imbalance in human metabolic diseases such as obesity and type 2 diabetes. Recently, it has been reported that dysfunction of neurogenesis is related to human metabolic diseases. Under a high-fat diet associated with obesity and type 2 diabetes, hippocampal neurogenesis is inhibited by increased oxidative stress and decreased brain-derived neurotrophic facto involved in enhanced hippocampal neurogenesis.

비만은 경미한 인지 장애, 노인성 치매 및 알츠하이머의 발병과 관련이 있다. 또한 당뇨병은 뉴련에서 글루코코르티코이드 매개 효과를 통해 해마 기능을 감소시킴으로써 해마 의존성 기억, 천공 경로 시냅스 가소성 및 성체 신경 발생을 손상시킨다. 해마가 보상 및 에너지 조절과 관련하여 신경 회로의 일부인 것으로 나타나지만, 만성 대사성 스트레스가 존재할 때에는 해마 신경 발생의 조절 메커니즘 및 핵심 요소에 대해서는 아직 연구가 미미한 상태이다.Obesity is associated with the development of mild cognitive impairment, senile dementia and Alzheimer's disease. Diabetes also impairs hippocampus-dependent memory, perforation pathway synaptic plasticity, and adult neurogenesis by reducing hippocampal function through glucocorticoid-mediated effects in the neuron. Although the hippocampus appears to be part of neural circuits related to reward and energy regulation, the regulatory mechanisms and key components of hippocampal neurogenesis in the presence of chronic metabolic stress are still poorly studied.

본 발명은 시스타틴 C를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 야생형에 비해 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 해마의 시스타틴 C 생산 수준이 감소되어 있음을 확인하고, 야생형에 비해 시스타틴 C 생산 수준이 감소된 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도가 감소되어 있음을 확인함으로써, 시스타틴 C의 수준이 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도에 영향을 주는 것을 입증하고, 해마의 시스타틴 C의 생산 수준이 고지방(HF) 식단으로 유도되는 신경 손상을 억제함을 입증함으로써, 시스타틴 C를 포함하는 조성물을 퇴행성 신경 질환을 진단하는 마커로 제공하고, 이들을 이용하여 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물 및 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C and its use. Specifically, it is confirmed that the production level of cystatin C in the hippocampus is reduced in NOX4 knockout (NOX4 KO) compared to wild type, By confirming that the degree of branching of DCX-positive neuroblasts and dendrites was reduced in the NOX4 knockout (NOX4 KO) with reduced cystatin C production level compared to the wild type, the level of cystatin C was higher in DCX-positive neuroblasts and dendrites. By demonstrating that the degree of branching is affected and that the production level of cystatin C in the hippocampus inhibits nerve damage induced by a high-fat (HF) diet, a composition containing cystatin C is used to diagnose neurodegenerative diseases. Provided as markers, and using them to provide a composition for diagnosing neurodegenerative diseases and a method for providing information for diagnosing neurodegenerative diseases.

본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C.

또한, 본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제 또는 시스타틴 C(Cystatin C)의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the mRNA expression level of cystatin C or an agent for measuring the protein expression level of cystatin C. .

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the diagnostic composition.

또한, 본 발명은 시료로부터 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준 또는 시스타틴 C(Cystatin C)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 또는 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소되면 신경퇴행성 질환의 발병 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of measuring the mRNA expression level or the expression level of cystatin C (Cystatin C) from the sample; and determining that a neurodegenerative disease is likely to occur when the mRNA expression of the cystatin C or the expression level of the cystatin C protein is reduced compared to a normal control group. Provides a method for providing information for the diagnosis of

본 발명에 따르면, 야생형에 비해 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 해마의 시스타틴 C 생산 수준이 감소되어 있음을 확인하고, 야생형에 비해 시스타틴 C 생산 수준이 감소된 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도가 감소되어 있음을 확인함으로써, 시스타틴 C의 수준이 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도에 영향을 주는 것을 입증하고, 해마의 시스타틴 C의 생산 수준이 고지방(HF) 식단으로 유도되는 신경 손상을 억제함을 입증함으로써, 시스타틴 C를 포함하는 조성물을 퇴행성 신경 질환을 진단하는 마커로 제공하고, 이들을 이용하여 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물 및 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, it was confirmed that the level of cystatin C production in the hippocampus was reduced in the NOX4 knockout (NOX4 KO) compared to the wild type, and DCX positive in the NOX4 knockout (NOX4 KO) in which the level of cystatin C production was reduced compared to the wild type. By confirming that the degree of branching of neuroblasts and dendrites is reduced, it is proved that the level of cystatin C affects the degree of branching of DCX-positive neuroblasts and dendrites, and the production level of cystatin C in the hippocampus is high in fat. (HF) By demonstrating inhibition of diet-induced nerve damage, a composition containing cystatin C is provided as a marker for diagnosing neurodegenerative diseases, and a composition for diagnosing neurodegenerative diseases and diagnosis of neurodegenerative diseases using them information can be provided.

도 1은 NOX4 결핍에 따른 백색 지방 조직의 축적 변화를 평가한 결과이다.
도 2는 NOX4 결핍에 따른 체중 및 섭취량 변화를 평가한 결과이다.
도 3은 NOX4 결핍에 따른 해마 신경 발생에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 4는 NOX4 결핍에 따른 해마의 시스타틴 C 생산에 미치는 영향을 평가한 결과이다.1 is a result of evaluating changes in white adipose tissue accumulation according to NOX4 deficiency.
2 is a result of evaluating changes in body weight and intake according to NOX4 deficiency.
3 is a result of evaluating the effect of NOX4 deficiency on hippocampal neurogenesis.
4 is a result of evaluating the effect of NOX4 deficiency on the production of cystatin C in the hippocampus.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.The terms used in this specification have been selected from general terms that are currently widely used as much as possible while considering the functions in the present invention, but these may vary depending on the intention of a person skilled in the art, precedent, or the emergence of new technologies. In addition, in a specific case, there is also a term arbitrarily selected by the applicant, and in this case, the meaning will be described in detail in the description of the invention. Therefore, the term used in the present invention should be defined based on the meaning of the term and the overall content of the present invention, not simply the name of the term.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless defined otherwise, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Terms such as those defined in commonly used dictionaries should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related art, and unless explicitly defined in this application, it should not be interpreted in an ideal or excessively formal meaning. don't

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.Numerical ranges are inclusive of the values defined therein. Every maximum numerical limitation given throughout this specification includes every lower numerical limitation, as if such lower numerical limitations were expressly written. Every minimum numerical limitation given throughout this specification includes every higher numerical limitation, as if such higher numerical limitations were expressly written. Every numerical limitation given throughout this specification will include every better numerical range within the broader numerical range, as if the narrower numerical limitations were expressly written.

달리 지시된 바가 없으면, 핵산의 염기서열의 방향은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3'의 방향으로 읽혀지고, 아미노산 서열의 방향은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노기에서 카르복실기의 순서로 읽혀진다.Unless otherwise indicated, the orientation of the nucleic acid sequence is read from left to right and 5' to 3', respectively, and the orientation of the amino acid sequence is read from left to right, amino group to carboxyl group, respectively.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.The present invention provides a biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C.

상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽병, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 상기 신경퇴행성 질환은 고 지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 발병되는 질환이다.The neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, progressive supranuclear palsy, multiple system atrophy, olive-pony-cerebellar atrophy (OPCA), Schey-Drager syndrome, striatal-substantia nigra degeneration, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis ( ALS), essential tremor, cortico-basal ganglia degeneration, diffuse Lewy body disease, Parkinson-ALS-dementia complex, Niemann-Pick disease, Pick's disease, cerebral ischemia and cerebral infarction, and at least one selected from the group consisting of the above neurodegenerative disease is a disease caused by metabolic abnormalities chronically caused by a high-fat diet.

상기 시스타틴 C(Cystatin C)는 시스테인 단백질 분해 효소의 억제제이다. 시스타틴 C의 기능은 신장 질환, 심혈관 질환 및 신경 질환에서 확인된 바 있다. 시스타틴 C의 돌연변이는 뇌 출혈, 뇌졸중, 치매에 걸리기 쉬운 증상인 아이슬란드 유형의 유전성 대뇌 아밀로이드 혈관 병증과 관련이 있다. 최근 시스타틴 C는 아밀로이드 β(amyloid β)에 결합하여 응집 및 침착을 감소시킨다고 보고된 바 있다. 이는 시스타틴 C가 알츠하이머 병의 잠재적인 표적이란 것을 시사한다.The cystatin C (Cystatin C) is an inhibitor of cysteine protease. The function of cystatin C has been identified in renal, cardiovascular and neurological diseases. Mutations in cystatin C are associated with hereditary cerebral amyloid angiopathy of the Icelandic type, a condition predisposing to brain hemorrhage, stroke and dementia. Recently, it has been reported that cystatin C reduces aggregation and deposition by binding to amyloid β. This suggests that cystatin C is a potential target for Alzheimer's disease.

시스타틴 C는 파킨슨 병(Parkinson’s disease), 알츠하이머(Alzheimer’s disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis) 및 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage)을 포함하는 퇴행성 신경질환에서 신경을 보호하는 역할을 한다. 신경 발생에서 시스타틴 C의 역할은 해마에서 확인되며, 시스타틴 C의 수준은 신경 발생과 관련이 있다.Cystatin C plays a role in protecting nerves from neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis and subarachnoid hemorrhage. The role of cystatin C in neurogenesis is confirmed in the hippocampus, and the level of cystatin C is associated with neurogenesis.

구체적으로 본 발명에서 상기 시스타틴 C(Cystatin C)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된다.Specifically, in the present invention, the cystatin C (Cystatin C) is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제 또는 시스타틴 C(Cystatin C)의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the mRNA expression level of cystatin C or an agent for measuring the protein expression level of cystatin C. .

상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이고, 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이다.The agent for measuring the mRNA expression level of the cystatin C is an antisense oligonucleotide, primer pair or probe that specifically binds to the mRNA of the cystatin C, and the cystatin C ) Agents for measuring the protein expression level of the cystatin C (Cystatin C) protein specifically binding oligopeptide, monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric (chimeric) antibody, ligand, PNA (Peptide nucleic acid) or aptamer.

또한, 본 발명은 상기 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing a neurodegenerative disease comprising the composition for diagnosing a neurodegenerative disease.

상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질칩 키트이다.The kit is an RT-PCR kit, a competitive RT-PCR kit, a real-time RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit.

또한, 본 발명은 시료로부터 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준 또는 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 또는 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소되면 신경퇴행성 질환의 발병 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of measuring the mRNA expression level of cystatin C (Cystatin C) or the expression level of cystatin C (Cystatin C) protein from the sample; and determining that a neurodegenerative disease is likely to occur when the mRNA expression of the cystatin C or the expression level of the cystatin C protein is reduced compared to a normal control group. Provides a method for providing information for the diagnosis of

상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 요 및 조직생검으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.The sample is any one selected from the group consisting of blood, serum, plasma, lymph, cerebrospinal fluid, ascites, urine, and tissue biopsy.

상기 mRNA 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용하여 측정하고, 상기 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)을 이용하여 측정한다.The mRNA expression level is reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (competitive RT-PCR), real time reverse transcriptase polymerase reaction (real time quantitative RT-PCR), RNase protection assay (RNase protection method), Northern blotting, or DNA chip technology, and the expression level of the protein is measured by Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and radioimmunoassay (RIA). : radioimmunoassay), radial immunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement It is measured using a complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, fluorescence activated cell sorter analysis (FACS) or protein chip technology.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, experimental examples and examples will be described in detail to aid understanding of the present invention. However, the following experimental examples and examples are merely illustrative of the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following experimental examples and examples. Experimental examples and examples of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.

<실험예> 실험 재료 및 방법<Experimental Example> Experimental Materials and Methods

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.The following experimental examples are intended to provide experimental examples commonly applied to each embodiment according to the present invention.

1. 동물 연구1. Animal studies

모든 동물 실험은 순천향대 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Soonchunhyang University)의 승인(protocol #SCH19-0027)을 받았습니다. C57BL/6J 마우스 수컷을 새론 바이오(Gunpo, Korea)에서 구입하여 야생형(WT) 콜로니용으로 사용하였다. Jackson 실험실(Jackson laboratory, Farmington, CT, USA)에서 제공된 Nox4-/- 마우스를 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)으로 사용하였다. Nox4-/- 마우스의 꼬리로부터 DNA를 추출하여 PCR에 사용되었다.All animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Soonchunhyang University (protocol #SCH19-0027). Male C57BL/6J mice were purchased from Saeron Bio (Gunpo, Korea) and used for wild type (WT) colonies. Nox4 -/- mice provided by Jackson laboratory (Jackson laboratory, Farmington, CT, USA) were used as NOX4 knockout (NOX4 KO). DNA was extracted from the tails of Nox4 -/- mice and used for PCR.

무게가 22 g 내지 25 g인 야생형과 NOX4 녹아웃 마우스를 각각 선별하여 22±2 ℃, 60% 습도 조건에서 12 시간 명암 주기로 사육되었다. 일반 식이(NC) 식단(2018S, Harlan, USA) 또는 고지방(HF) 식단(Research Diets, New Brunswick, NJ, USA)을 제공하는 군으로 분류하고, 식단과 물은 자유롭게 배급되었다. 실험에 사용된 모든 마우스는 일주일 동안 적응 기간 후에 사용되었다. 마우스 분류는 일반 식이 식단이 제공된 야생형(NC/WT) 및 NOX4 녹아웃(NC/KO)과 고지방 식단이 제공된 야생형(HF/WT) 및 NOX4 녹아웃(HF/KO)로 분류되었다. 7주 동안 매일 마우스의 체중과 식단 섭취량이 측정되었다.Wild-type and NOX4 knockout mice, each weighing 22 g to 25 g, were selected and bred at 22 ± 2 °C and 60% humidity in a 12-hour light/dark cycle. They were divided into groups serving either a normal diet (NC) diet (2018S, Harlan, USA) or a high-fat (HF) diet (Research Diets, New Brunswick, NJ, USA), and diet and water were provided ad libitum. All mice used in the experiments were used after an acclimatization period of one week. Mice were grouped into wild type (NC/WT) and NOX4 knockout (NC/KO) fed a regular chow diet and wild type (HF/WT) and NOX4 knockout (HF/KO) fed a high-fat diet. Body weight and food intake of the mice were measured daily for 7 weeks.

7주 이후에 일부 마우스를 치사하고 복부 및 고환의 백색 지방조직(white adipose tissue, WAT)을 완전히 제거하고 무게를 측정하였다. 뇌의 두개강(cranial cavity)을 제거하고 해마(hippocampus)를 분리하였다. 일부 마우스는 우레탄(1g/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 마취하고, 0.1M 인산 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 관류했습니다.After 7 weeks, some mice were sacrificed, and white adipose tissue (white adipose tissue, WAT) of the abdomen and testes was completely removed and weighed. The cranial cavity of the brain was removed and the hippocampus was isolated. Some mice were anesthetized with urethane (1 g/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and perfused with 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4).

2. 체지방량 및 총 체중 분석2. Body fat mass and total body weight analysis

마우스로부터 분리된 부고환의 백색 지방조직(Epididymal white adipose tissues, eWAT)은 체중 증가에 따른 체지방 변화 분석 및 세포성 측정에 사용되었다. eWAT는 혈액 공급이 손상되지 않도록 주의하여 분리되었다. 객관적인 평가를 위해 동물의 모습을 촬영하였으며, 눈금자를 이용하여 그룹 간의 차이점을 도식화하였다.Epididymal white adipose tissues (eWAT) isolated from mice were used for body fat change analysis and cellular measurement according to weight gain. eWAT was isolated with care not to damage the blood supply. For objective evaluation, the animals were photographed, and differences between groups were plotted using a ruler.

3.시약 및 항체3. Reagents and Antibodies

사용된 항체는 다음과 같다: polyclonal rabbit anti-Ki67 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK), polyclonal goat anti-doublecortin (anti-DCX) antibody (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), biotinylated rabbit anti-goat IgG (diluted 1:200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), 및 biotinylated goat anti-rabbit IgG (diluted 1:200, Vector Laboratories).The antibodies used were as follows: polyclonal rabbit anti-Ki67 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK), polyclonal goat anti-doublecortin (anti-DCX) antibody (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA ), biotinylated rabbit anti-goat IgG (diluted 1:200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), and biotinylated goat anti-rabbit IgG (diluted 1:200, Vector Laboratories).

0.1M Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)에서 3, 3'-daminobenzidine으로 염색하여 섹션을 시각화하였다. 탈수 후 Canada Balsam (Wako, Tokyo, Japan)을 사용하여 젤라틴 코팅 슬라이드에 섹션을 장착하였다.Sections were visualized by staining with 3,3'-daminobenzidine in 0.1M Tris-HCl buffer (pH 7.2). After dehydration, sections were mounted on gelatin-coated slides using Canada Balsam (Wako, Tokyo, Japan).

4.면역 조직 화학 및 면역 형광 분석4. Immunohistochemistry and Immunofluorescence Analysis

면역 조직 화학을 분석하기 위해, 두개강을 제거하여 뇌 조직을 분리하고 4℃ 조건에서 4% 파라 포름알데하이드(paraformaldehyde)로 밤새 고정하였다. Bregma 뒤쪽 -1.82 mm 내지 -2.46 mm 사이를 30 μm 두께로 절편하였다. 섹션은 특정 표적에 대한 항체로 염색하고, 사용된 2차 항체는 신경아세포(doublecortin, DCX)에 대한 각각 biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories) 및 biotinylated rabbit antigoat (Vector Laboratories)이다. 그 후, 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 복합체(streptavidin peroxidase complex, Vector Laboratories)로 25℃에서 2 시간 동안 비오틴화 하였다. 염색된 뇌조직을 Olympus BX53M 현미경으로 분석하고, Olympus Stream 소프트웨어 및 ImageJ 소프트웨어 v1.52a (Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화하였다. 객관성을 보장하기 위해 모든 측정은 동일한 조건에서 실험 당 두 명의 관찰자에 의해 블라인드 조건에서 수행되었다. 신경아세포를 계수하고, 치상회(dentate gyrus, DG) 및 하위 과립 구역(sub-granular zone, SGZ)에 3차 분지형 수상돌기를 갖는 신경아세포를 분석하였다.To analyze immunohistochemistry, brain tissue was isolated by removing the cranial cavity and fixed overnight with 4% paraformaldehyde at 4°C. A 30 μm thick section was sectioned between -1.82 mm and -2.46 mm posterior to Bregma. Sections were stained with antibodies against specific targets, and secondary antibodies used were biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Laboratories) and biotinylated rabbit antigoat (Vector Laboratories), respectively, against neuroblasts (doublecortin, DCX). Thereafter, biotinylation was performed at 25° C. for 2 hours with streptavidin peroxidase complex (Vector Laboratories). Stained brain tissue was analyzed with an Olympus BX53M microscope and quantified using Olympus Stream software and ImageJ software v1.52a (Bethesda, MD, USA). To ensure objectivity, all measurements were performed under blind conditions by two observers per experiment under identical conditions. Neuroblasts were counted, and neuroblasts with tertiary branched dendrites in the dentate gyrus (DG) and sub-granular zone (SGZ) were analyzed.

5. 시스타틴 C 및 사이토카인 분석5. Cystatin C and Cytokine Analysis

시스타틴 C 및 사이토카인 분석을 위해, 마우스의 뇌에서 해마 조직을 분리하고, 조직 추출 시약 I(Tissue Extraction Reagent I, FNN0071, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 용해하였다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 15,300 xg 조건으로 원심분리하여 상층액을 얻었다. 단백질의 농도는 Bradford 분석 (500-0006, BioRad Laboratories (Hercules, CA, USA))으로 측정하였다. 제조사의 가이드에 따라, Mouse XL Cytokine Array Kit (ARY028, R&D systems (Minneapolis, MN, USA))을 사용하여 100 μg 단백질 용해물에 존재하는 시스타틴 C, 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자 등을 포함하는 111개의 가용성 단백질을 분석하였다. 해마의 단백질 용해물은 4℃에서 16 시간 동안 111개의 서로 다른 항체를 포함하는 4개의 나이트로 셀룰로오스 막에 반응시켰다. 나이트로 셀룰로오스 막을 검정 완충액에 희석된 검출 항체와 실온에서 2 시간 동안 처리된 후, 검정 완충액에서 0.5 시간 동안 streptavidin-horseradish peroxidase (HRP)와 반응시켰다. 나이트로 셀룰로오스 막의 면역 반응성 반점은 화학 시약 혼합물에 의해 검출된 다음 X- 선 필름에 노출시켰다. X-선 포지티브 신호로부터 현상된 픽셀 밀도는 전송 모드 스캐너와 이미지 분석 소프트웨어(HLImage++ Version 25.0.0r, https://www.wvision.com/QuickSpots.html, Western Vision Software, Salt Lake City, UT, USA)를 사용하여 수집 및 분석되었다. 픽셀 밀도를 정량화하고, 분석 물질 수준의 상대적 변화를 측정하였다.For cystatin C and cytokine analysis, hippocampal tissue was isolated from mouse brain and lysed with Tissue Extraction Reagent I (FNN0071, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). The lysate was centrifuged at 4° C. for 10 minutes at 15,300 xg to obtain a supernatant. Concentration of protein was determined by Bradford assay (500-0006, BioRad Laboratories (Hercules, CA, USA)). According to the manufacturer's guide, Mouse XL Cytokine Array Kit (ARY028, R&D systems (Minneapolis, MN, USA)) was used to measure cystatin C, cytokines, chemokines, growth factors, etc. present in 100 μg protein lysate. 111 soluble proteins were analyzed. Hippocampal protein lysates were reacted on 4 nitrocellulose membranes containing 111 different antibodies for 16 hours at 4°C. The nitrocellulose membrane was treated with the detection antibody diluted in assay buffer for 2 hours at room temperature, and then reacted with streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) in assay buffer for 0.5 hour. Immunoreactive spots on nitrocellulose membranes were detected by a mixture of chemical reagents and then exposed to X-ray film. Pixel densities developed from X-ray positive signals were measured using a transmission mode scanner and image analysis software (HLImage++ Version 25.0.0r, https://www.wvision.com/QuickSpots.html, Western Vision Software, Salt Lake City, UT, USA). ) was collected and analyzed. Pixel densities were quantified and relative changes in analyte levels were measured.

6.통계 분석6. Statistical Analysis

모든 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시됩니다. 모든 통계 테스트는 두 그룹의 비교를 위해 양측 Student 's t-test를 사용하고 여러 그룹의 비교를 위해 통계 소프트웨어 패키지((GraphPad Prism version 8.0, GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA)))를 사용하여 분산 분석을 사용하여 분석되었습니다. P 값 (*, p <0.05, **, p <0.005, ***, p <0.0005)은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.All data are expressed as mean ± standard deviation (SD) or standard error of the mean (SEM). All statistical tests were performed using a two-tailed Student's t-test for comparison of two groups and a statistical software package ((GraphPad Prism version 8.0, GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, USA))) for comparison of multiple groups. was analyzed using analysis of variance using . P values (*, p < 0.05, **, p < 0.005, ***, p < 0.0005) were considered statistically significant.

실시예 1.Example 1. NOX4 결핍에 따른 지방 축적 변화Fat accumulation changes according to NOX4 deficiency

고지방 식단(HFD) 조건에서 해마의 신경 발달에 NOX4가 미치는 영향을 평가하기 위해, NOX4 유전적 결핍이 고지방 식단(HFD) 조건에서 변화되는 지방 축적 변화를 분석하였다.To evaluate the effect of NOX4 on hippocampal neurodevelopment under high-fat diet (HFD) conditions, we analyzed the changes in lipid accumulation in NOX4 genetic deficiency under high-fat diet (HFD) conditions.

7 주 동안 일반 식이(NC) 식단 또는 고지방(HF) 식단이 배급된 야생형 마우스(WT) 및 NOX4 녹아웃 마우스(KO)의 등, 복부 및 부고환의 지방 크기를 분석하고, 마우스에 축적된 백색 지방 조직(white adipose tissue, eWAT) 비율을 측정하였다.The amount of fat in the back, abdomen, and epididymis of wild-type mice (WT) and NOX4 knockout mice (KO) fed either a normal diet (NC) diet or a high-fat (HF) diet for 7 weeks was analyzed, and white adipose tissue accumulated in the mice was analyzed. (white adipose tissue, eWAT) ratio was measured.

도 1에 나타난 바와 같이, 고지방(HF) 식단이 배급된 마우스들 중에서 NOX4 녹아웃 마우스(KO)는 야행성(WT)에 비해 더 얇은 체형을 나타내고, 내부 지방 축적 정도가 적었다. 또한, 백색 지방 조직이 축적된 정도도 적게 나타났다.As shown in FIG. 1 , among mice fed a high-fat (HF) diet, NOX4 knockout mice (KO) showed a thinner body shape and less internal fat accumulation than nocturnal mice (WT). Also, the degree of accumulation of white adipose tissue was less.

상기 결과는 NOX4 결핍이 만성 HFD에서 전신 지방 축적을 감소시킨다는 것을 시사한다.The above results suggest that NOX4 deficiency reduces systemic fat accumulation in chronic HFD.

실시예 2.Example 2. NOX4 결핍에 따른 체중 변화Weight change with NOX4 deficiency

고지방 식단(HFD) 조건에서 해마의 신경 발달에 NOX4가 미치는 영향을 평가하기 위해, NOX4 유전적 결핍이 고지방 식단(HFD) 조건에서 체중 변화 및 섭취량 변화에 영향을 미치는지 분석하였다.To evaluate the effect of NOX4 on hippocampal neurodevelopment under high-fat diet (HFD) conditions, we analyzed whether NOX4 genetic deficiency affects body weight change and intake change under high-fat diet (HFD) conditions.

도 2에 나타난 바와 같이, 고지방(HF) 식단이 배급된 마우스들 중에서 NOX4 녹아웃 마우스(KO)는 야행성(WT)에 비해 체중이 증가되는 정도가 감소되는 것으로 나타났으나, 섭취량은 유사하게 나타났다.As shown in FIG. 2 , among mice fed a high-fat (HF) diet, NOX4 knockout mice (KO) showed a reduced degree of weight gain compared to nocturnal (WT) mice, but the amount of intake was similar.

상기 결과는 NOX4 결핍이 만성 HFD에서 전신 대사에 영향을 준다는 것을 시사한다.The above results suggest that NOX4 deficiency affects systemic metabolism in chronic HFD.

실시예 3.Example 3. NOX4 결핍에 따른 해마의 신경 발생 손상 변화Changes in hippocampal neurogenesis impairment following NOX4 deficiency

고지방 식단(HFD) 조건에서 해마의 신경 발달에 NOX4가 미치는 영향을 평가하기 위해, NOX4 유전적 결핍이 고지방 식단(HFD) 조건에서 신경 분화 마커인 DCX 양성 신경아세포, 수상돌기의 분지 정도에 미치는 영향을 분석하였다.To evaluate the effect of NOX4 on hippocampal neuronal development under high-fat diet (HFD) conditions, the effect of NOX4 genetic deficiency on DCX-positive neuroblasts, a neuronal differentiation marker, and the degree of branching of dendrites under high-fat diet (HFD) conditions was analyzed.

해마 신경 발생은 하위 과립 구역 해마 치상회(dentate gyrus hippocampal dentate gyrus)에서 신경아세포(neuroblast)의 발달을 유도하고, 신경아세포는 성숙하는 동안 과립세포층(granular cell layer)으로 이동한다. 수상 돌기는 주변 대뇌 실질 구조와 결합하여 신경아세포 신호 전달에서 뻗어나 오므로 수상 돌기의 가지 수와 신경아세포의 수를 고려한다.Hippocampal neurogenesis induces the development of neuroblasts in the dentate gyrus hippocampal dentate gyrus, which migrate to the granular cell layer during maturation. Since dendrites combine with surrounding cerebral parenchyma structures and extend from neuroblast signal transmission, consider the number of branches of dendrites and the number of neuroblasts.

분화된 신경하세포인 DCX 양성 세포(DCX-positive cells)와 해마 치상회(hippocampal dentate gyrus)의 하위 과립 구역(sub-granular zone) 및 과립 세포층(granular cell layer)에 분포된 신경아세포의 수상돌기 분기 정도를 측정하였다.DCX-positive cells, which are differentiated subneural cells, and dendrite branching of neuroblasts distributed in the sub-granular zone and granular cell layer of the hippocampal dentate gyrus The degree was measured.

도 3에 나타난 바와 같이, 해마 치상회(hippocampal dentate gyrus)의 하위 과립 구역(sub-granular zone) 및 과립 세포층(granular cell layer)에 분포된 DCX 양성 세포(DCX-positive cells) 및 분지형 수상돌기의 수는 고지방 식이(HFD)를 한 마우스에서 억제되었다. 또한, NOX4 녹아웃 마우스(KO)는 야행성(WT)에 비해 DCX 양성 세포(DCX-positive cells) 및 분지형 수상돌기의 수가 현저히 감소되는 것으로 나타났다.As shown in Figure 3, DCX-positive cells and branched dendrites distributed in the sub-granular zone and granular cell layer of the hippocampal dentate gyrus The number of was suppressed in mice fed a high fat diet (HFD). In addition, NOX4 knockout mice (KO) showed a significantly reduced number of DCX-positive cells and branched dendrites compared to nocturnal mice (WT).

또한, 신경 아세포의 기능적 형태를 조사하기 위해, 하위 분기를 정량화하여 신경아세포에서 3 차 분기된 수상 돌기의 수를 분석한 결과, NOX4 녹아웃 마우스(KO)는 야행성(WT)에 비해 3 차 분기된 수상 돌기의 수가 현저하게 적고, 짧은 가지를 갖고, 미성숙한 수상돌기(도 3B의 검은 화살표)들이 나타났다.In addition, to investigate the functional morphology of neuroblasts, we analyzed the number of tertiary branched dendrites in neuroblasts by quantifying subbranches. Significantly fewer dendrites appeared, with short branches and immature dendrites (black arrows in Fig. 3B).

상기 결과는 NOX4 결핍이 해마의 신경 발생의 손상에 영향을 주며, NOX4 결핍이 만성 HFD에 의해 유도되는 신경손상을 악화시킨다는 것을 시사한다.These results suggest that NOX4 deficiency affects the impairment of hippocampal neurogenesis and that NOX4 deficiency exacerbates the neuronal damage induced by chronic HFD.

실시예 4. NOX4 결핍에 따른 해마의 시스타틴 C 수준 변화Example 4. Cystatin C level changes in the hippocampus according to NOX4 deficiency

고지방 식단(HFD) 조건에서 해마의 분자적 메커니즘에 미치는 영향을 평가하기 위해, NOX4 유전적 결핍이 고지방 식단(HFD) 조건에서 해마 뉴런의 사이토카인, 케모카인, 및 성장 인자 등의 111개의 가용성 단백질의 수준에 미치는 영향을 분석하고, 시스타틴 C의 수준을 측정하였다.To evaluate the effect on molecular mechanisms in the hippocampus under high-fat diet (HFD) conditions, NOX4 genetic deficiency inhibited the production of 111 soluble proteins, including cytokines, chemokines, and growth factors, in hippocampal neurons under high-fat diet (HFD) conditions. The effect on the level was analyzed and the level of cystatin C was determined.

도 4에 나타난 바와 같이, NOX4 녹아웃 마우스(KO)의 해마는 야행성(WT)에 비해 시스타틴 C의 수준이 상당히 적게 나타났다. 시스타틴 C의 수준은 해마 신경 발생과 관련이 있다. 이는 NOX4 결핍이 해마에서 시스타틴 C의 생성을 억제한다는 것을 시사한다.As shown in FIG. 4 , the hippocampus of NOX4 knockout mice (KO) showed a significantly lower level of cystatin C than that of nocturnal mice (WT). Levels of cystatin C are associated with hippocampal neurogenesis. This suggests that NOX4 deficiency inhibits the production of cystatin C in the hippocampus.

고지방 식단(HFD) 조건에서 NOX4 결핍이 체중 증가 및 지방 축적이 억제되는 반면, 해마의 신경 기능 보호에 중요한 역할을 하는 시스타틴 C의 생산을 감소시키는 것으로 나타났다. 상기 결과들은 NOX4 결핍이 고지방 식단(HFD) 조건에 의해 유도된 시스타틴 C 의존성 해마 신경 발생의 손상을 악화시키고, 해마 신경 성숙을 억제시킨다는 것을 입증한다.It has been shown that under high-fat diet (HFD) conditions, NOX4 deficiency suppresses weight gain and fat accumulation, while reducing the production of cystatin C, which plays an important role in protecting neuronal function in the hippocampus. These results demonstrate that NOX4 deficiency exacerbates the impairment of cystatin C-dependent hippocampal neurogenesis induced by high-fat diet (HFD) conditions and inhibits hippocampal neuronal maturation.

상기 결과들은 야생형에 비해 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 해마의 시스타틴 C 생산 수준이 감소되어 있음을 확인하고, 야생형에 비해 시스타틴 C 생산 수준이 감소된 NOX4 녹아웃(NOX4 KO)에서 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도가 감소되어 있음을 확인함으로써, 시스타틴 C의 수준이 DCX 양성 신경아세포 및 수상돌기의 분지 정도에 영향을 주는 것을 입증하고, 해마의 시스타틴 C의 생산 수준이 고지방(HF) 식단으로 유도되는 신경 손상을 억제함을 입증한다.The above results confirm that the level of cystatin C production in the hippocampus is reduced in the NOX4 knockout (NOX4 KO) compared to the wild type, and DCX-positive neuroblasts in the NOX4 knockout (NOX4 KO) in which the level of cystatin C production is reduced compared to the wild type. And by confirming that the degree of branching of dendrites is reduced, it is demonstrated that the level of cystatin C affects the degree of branching of DCX-positive neuroblasts and dendrites, and the production level of cystatin C in the hippocampus is high in fat (HF). ) to suppress diet-induced nerve damage.

따라서 시스타틴 C의 수준은 고지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 발병되는 신경퇴행성 질환을 진단하는 바이오마커로 사용될 수 있음을 입증한다.Therefore, it is demonstrated that the level of cystatin C can be used as a biomarker for diagnosing neurodegenerative diseases caused by metabolic abnormalities chronically caused by a high-fat diet.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear to those skilled in the art that these specific descriptions are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. do. That is, the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Soonchunhyang University <120> Biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising Cystatin C, and uses thereof <130> ADP-2020-0511 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cystatin C <400> 1 Met Ala Gly Pro Leu Arg Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Ala Gly Ser Ser Pro Gly Lys Pro 20 25 30 Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Gly 35 40 45 Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys Ala Ser 50 55 60 Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln Val Val Arg Ala Arg Lys 65 70 75 80 Gln Ile Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg 85 90 95 Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His 100 105 110 Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe Cys Ser Phe Gln Ile Tyr 115 120 125 Ala Val Pro Trp Gln Gly Thr Met Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gln 130 135 140 Asp Ala 145 <110> Chongqing University <120> Biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases Cystatin C, and uses it <130> ADP-2020-0511 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Cystatin C <400> 1 Met Ala Gly Pro Leu Arg Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ala 1 5 10 15 Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Ala Gly Ser Ser Pro Gly Lys Pro 20 25 30 Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Glu Gly 35 40 45 Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys Ala Ser 50 55 60 Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln Val Val Arg Ala Arg Lys 65 70 75 80 Gln Ile Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg 85 90 95 Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His 100 105 110 Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe Cys Ser Phe Gln Ile Tyr 115 120 125 Ala Val Pro Trp Gln Gly Thr Met Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gln 130 135 140 Asp Ala 145

Claims (13)

시스타틴 C(Cystatin C)를 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 바이오마커 조성물로서,
상기 퇴행성 신경 질환은 고지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 NOX4 결핍에 의해 발병되는 질환인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.A biomarker composition for diagnosing neurodegenerative diseases containing cystatin C,
The biomarker composition, characterized in that the neurodegenerative disease is a metabolic abnormality chronically caused by a high-fat diet and is a disease caused by NOX4 deficiency. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 시스타틴 C(Cystatin C)는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.The biomarker composition according to claim 1, wherein the cystatin C is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제 또는 시스타틴 C(Cystatin C)의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물로서,
상기 퇴행성 신경 질환은 고지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 NOX4 결핍에 의해 발병되는 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환 진단용 조성물.A composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising, as an active ingredient, an agent for measuring the mRNA expression level of cystatin C or an agent for measuring the protein expression level of cystatin C,
The neurodegenerative disease is a composition for diagnosing a neurodegenerative disease, characterized in that it is a disease caused by NOX4 deficiency due to metabolic abnormalities chronically caused by a high-fat diet. 제5항에 있어서, 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.The method of claim 5, wherein the agent for measuring the mRNA expression level of Cystatin C is an antisense oligonucleotide, a primer pair or a probe that specifically binds to the mRNA of Cystatin C. Diagnostic composition to be. 제5항에 있어서, 상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.The method of claim 5, wherein the agent for measuring the protein expression level of Cystatin C is an oligopeptide, monoclonal antibody, or polyclonal antibody that specifically binds to the Cystatin C protein. , Chimeric (chimeric) antibody, ligand, PNA (peptide nucleic acid) or aptamer (aptamer) characterized in that the diagnostic composition. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트로서,
상기 퇴행성 신경 질환은 고지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 NOX4 결핍에 의해 발병되는 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환 진단용 키트.A kit for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the composition of any one of claims 5 to 7,
The neurodegenerative disease is a diagnostic kit for neurodegenerative disease, characterized in that it is a disease caused by NOX4 deficiency as a metabolic abnormality chronically caused by a high-fat diet. 제8항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.The kit according to claim 8, wherein the kit is a RT-PCR kit, a competitive RT-PCR kit, a real-time RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit. 시료로부터 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 수준 또는 시스타틴 C(Cystatin C)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및상기 시스타틴 C(Cystatin C)의 mRNA 발현 또는 시스타틴 C(Cystatin C) 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소되면 신경퇴행성 질환의 발병 가능성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
상기 퇴행성 신경 질환은 고지방 식이로 인해 만성적으로 나타난 대사 이상으로 NOX4 결핍에 의해 발병되는 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.Measuring the mRNA expression level of cystatin C or the expression level of cystatin C from the sample; and determining that there is a possibility of developing a neurodegenerative disease when the mRNA expression of the cystatin C or the expression level of the cystatin C protein is reduced compared to a normal control group. As an information providing method for diagnosis of,
The method for providing information for diagnosis of neurodegenerative diseases, characterized in that the neurodegenerative disease is a disease caused by NOX4 deficiency as a metabolic abnormality chronically caused by a high-fat diet. 제10항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 뇌척수액, 복수, 요 및 조직생검으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.The method of claim 10, wherein the sample is any one selected from the group consisting of blood, serum, plasma, lymph, cerebrospinal fluid, ascites, urine, and tissue biopsy. 제10항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.The method of claim 10, wherein the mRNA expression level is reverse transcriptase polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcriptase polymerase reaction (competitive RT-PCR), real-time reverse transcriptase polymerase reaction (real time quantitative RT-PCR), An information providing method characterized in that the measurement is performed using an RNase protection method, Northern blotting, or DNA chip technology. 제10항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.
11. The method of claim 10, wherein the expression level of the protein is measured by western blotting, enzyme linked immunosorbentassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radial immunodiffusion, or Okteroni immunodiffusion ( Ouchterlony immunodiffusion), rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography ( An information providing method characterized by measuring using immunochromatography, FACS analysis (fluorescence activated cell sorter analysis) or protein chip method (protein chip technology).
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