JP2021188970A - Method for examining lung cancer based on analysis of protein composite body in extracellular vesicle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は肺がんの検査方法に関する。 The present invention relates to a method for testing lung cancer.
生体試料中、特に血清中の腫瘍マーカーは、がんのスクリーニングといったがんの補助的な診断方法や、手術後の予後判断材料や治療効果の判断材料として使用されている。肺がんマーカーとしては、CYFRA21-1、CEA、SCC、SLX、CA125などが使用されてきたが、感
度や特異性が高いとは言えず、より優れた感度及び特異性を有する肺がんマーカーが望まれていた。
Tumor markers in biological samples, especially in serum, are used as an auxiliary diagnostic method for cancer such as cancer screening, as a material for determining prognosis after surgery, and as a material for determining therapeutic effect. CYFRA21-1, CEA, SCC, SLX, CA125, etc. have been used as lung cancer markers, but the sensitivity and specificity are not high, and lung cancer markers with better sensitivity and specificity are desired. rice field.
一方、本発明者らは、細胞接着分子であるCHL1(Close homolog of L1)のレベルが肺
がん患者において増加しており、CHL1を肺がんマーカーとして使用できることを報告した(特許文献1および非特許文献1)。
On the other hand, the present inventors reported that the level of CHL1 (Close homolog of L1), which is a cell adhesion molecule, is increased in lung cancer patients, and that CHL1 can be used as a lung cancer marker (
上記のように、CHL1をマーカーとした検査が肺がん診断に有用であることが明らかにされたが、より正確な診断指標を得るには改善の余地があった。
したがって、本発明は、より正確に肺がんを検査するための方法および検査キットを提供することを課題とする。
As mentioned above, it was clarified that the test using CHL1 as a marker is useful for diagnosing lung cancer, but there was room for improvement in order to obtain a more accurate diagnostic index.
Therefore, it is an object of the present invention to provide a method and a test kit for more accurately testing lung cancer.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、肺がん患者由来の血液試料中に含まれる細胞外小胞(EV)の膜においてCHL1とそのパートナータンパク質との複合体が有意に増加していることを見出し、被検者の血液試料を用いて当該複合体を解析することで肺がんの検査を正確に行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted diligent studies to solve the above problems. As a result, we found that the complex of CHL1 and its partner protein was significantly increased in the membrane of extracellular vesicles (EV) contained in the blood sample derived from lung cancer patients, and the blood sample of the subject was used. We have found that lung cancer can be accurately tested by analyzing the complex using the complex, and have completed the present invention.
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
[1]被検者の血液試料に含まれる細胞外小胞の膜におけるCHL1とCHL1パートナータンパク質との複合体を解析する工程を含む、肺がんの検査方法。
[2]CHL1パートナータンパク質がCaspase-14、SLC4A1 (Solute Carrier Family 4 Member 1)、Thrombospondin 1、Desmoplakin、Lactotransferrin、14-3-3 protein sigma、Heat shock protein beta-1、Annexin A2、Calmodulin-like protein 3、Galectin-7、Desmocollin-1、Fatty acid-binding protein 5、Transgelin-2、Annexin A1、Alpha-enolase、Glutathione S-transferase P、Tubulin beta-2A chain、14-3-3 protein zeta/delta、Tubulin alpha-4A chain、Epiplakin、Polymeric immunoglobulin receptor、Tubulin alpha-1B chain、Serpin B3、Tubulin beta-4B chain、Triosephosphate isomerase、Protein S100-A14、Protein S100-A11、Zymogen granule protein 16 homolog B、Calmodulin-like protein 5、Prelamin-A/C、Elongation factor 1-alpha 1、またはHeat shock co
gnate 71 kDa proteinである、[1]の肺がんの検査方法。
[3]CHL1パートナータンパク質がCaspase-14である、[1]の肺がんの検査方法。
[4]解析をEMARS法で行う、[1]〜[3]のいずれかの肺がんの検査方法。
[5]抗CHL1抗体およびCHL1パートナータンパク質検出試薬を含む、肺がん検査用キット。
[6]前記抗CHL1抗体が西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体であり、前記キッ
トはEMARS試薬を含む、[5]の肺がん検査用キット。
[7]さらに細胞外小胞を分離する試薬を含む、[5]または[6]の肺がん検査用キット。
That is, the gist of the present invention is as follows.
[1] A method for examining lung cancer, which comprises a step of analyzing a complex of CHL1 and a CHL1 partner protein in the membrane of extracellular vesicles contained in a blood sample of a subject.
[2] CHL1 partner proteins are Caspase-14, SLC4A1 (Solute Carrier Family 4 Member 1), Thrombospondin 1, Desmoplakin, Lactotransferrin, 14-3-3 protein sigma, Heat shock protein beta-1, Annexin A2, Calmodulin-like protein. 3, Galectin-7, Desmocollin-1, Fatty acid-
The method for testing lung cancer according to [1], which is a gnate 71 kDa protein.
[3] The method for testing lung cancer according to [1], wherein the CHL1 partner protein is Caspase-14.
[4] A lung cancer test method according to any one of [1] to [3], wherein the analysis is performed by the EMARS method.
[5] A lung cancer test kit containing an anti-CHL1 antibody and a CHL1 partner protein detection reagent.
[6] The kit for lung cancer testing according to [5], wherein the anti-CHL1 antibody is a horseradish peroxidase (HRP) -binding antibody, and the kit contains an EMARS reagent.
[7] The lung cancer test kit according to [5] or [6], which further comprises a reagent for separating extracellular vesicles.
本発明によれば、より正確に肺がんを検査することができ、医療や診断分野に貢献することができる。 According to the present invention, lung cancer can be examined more accurately, which can contribute to the medical and diagnostic fields.
本発明の肺がんの検査方法は、被検者の血液試料に含まれる細胞外小胞の膜におけるCHL1とCHL1パートナータンパク質との複合体を解析する工程を含む。 The method for testing lung cancer of the present invention comprises a step of analyzing a complex of CHL1 and a CHL1 partner protein in the membrane of extracellular vesicles contained in a blood sample of a subject.
被検者とは、肺がんを起こす可能性のある動物であれば何でもよいが、好ましくは哺乳類動物であり、さらに好ましくはヒトである。 The subject may be any animal that may cause lung cancer, but is preferably a mammal, and more preferably a human.
肺がんは、組織型により非小細胞肺がん及び小細胞肺がんに分類される。そして、非小細胞がんは、さらに腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんに分類される。本発明において肺がんとは、上記いずれの分類でもよい。さらには、肺がんは、肺における疾患部位、病期等において特に限定されることはなく、何れの疾患部位、病期等をも包含するものである。 Lung cancer is classified into non-small cell lung cancer and small cell lung cancer according to histological type. Non-small cell lung cancer is further classified into adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell carcinoma. In the present invention, lung cancer may be classified into any of the above. Furthermore, lung cancer is not particularly limited in terms of disease site, stage, etc. in the lung, and includes any disease site, stage, etc.
肺がんはEML4-ALK変異肺がんであってもよい。EML4-ALK変異肺がんとは非小細胞肺がんの一種であり、ヒトの場合は、2番染色体短腕内に微少な逆位が生じ、その結果受容体型チロシンキナーゼALKの細胞内領域が微少管結合タンパクEML4と融合した新しい活性型融
合キナーゼEML4-ALKが生じることを特徴とする肺がんである(参考:日本内科学会雑誌第99巻第4号p155−159)。ここで、EML4-ALK変異肺がんは、非小細胞肺がんの一種であり、非小細胞肺がん患者の約4〜5%に見られる。
Lung cancer may be EML4-ALK mutant lung cancer. EML4-ALK mutant lung cancer is a type of non-small cell lung cancer. In humans, a slight inversion occurs in the short arm of
血液試料には、血清、血漿等が含まれる。なお、血清や血漿はそのまま使用してもよい
が、沈殿画分(細胞外小胞含有画分)と上清画分に分け、沈殿画分を使用してもよい。
Blood samples include serum, plasma and the like. The serum or plasma may be used as it is, but it may be divided into a precipitate fraction (extracellular vesicle-containing fraction) and a supernatant fraction, and the precipitate fraction may be used.
細胞外小胞(EV)は、さまざまな種類の細胞から分泌される、膜構造を有する微小な小胞である。細胞外小胞としては、例えば、エクソソーム、エクトソーム、マイクロベシクルおよびアポトーシス小体などが挙げられる。好ましくは、細胞外小胞はエクソソームである。細胞外小胞はまた、そのサイズにより規定することができる。細胞外小胞のサイズは、例えば、30〜1000nmであり、好ましくは50〜300nm、より好ましくは80〜200nmである。細胞外小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。例えば、細胞外小胞のサイズの測定は、NanoSight(Malvern Instruments社製)により行われる
。
Extracellular vesicles (EVs) are tiny vesicles with a membrane structure that are secreted by various types of cells. Extracellular vesicles include, for example, exosomes, ectosomes, microvesicles and extracellular vesicles. Preferably, the extracellular vesicles are exosomes. Extracellular vesicles can also be defined by their size. The size of the extracellular vesicle is, for example, 30 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm, and more preferably 80 to 200 nm. The size of the extracellular vesicle can be measured, for example, by a method based on Brownian motion of the extracellular vesicle, a light scattering method, an electric resistance method, or the like. For example, the size of extracellular vesicles is measured by NanoSight (manufactured by Malvern Instruments).
EVは、当分野で公知の任意の方法、例えば、密度勾配遠心分離、ショ糖勾配などを利用した超遠心分離、精密濾過、イムノクロマトグラフィー、細胞外小胞の外膜に存在する物質に結合する抗体が固定化された担体を用いた分離方法及び市販キット(例えば、ExoQuick(商標))により分離することができる。 EV binds to any method known in the art, such as density gradient centrifugation, ultracentrifugation utilizing sucrose gradient, microfiltration, immunochromatography, substances present on the outer membrane of extracellular vesicles. It can be separated by a separation method using a carrier on which an antibody is immobilized and a commercially available kit (for example, ExoQuick ™).
CHL1(Close homolog of L1)タンパク質は、細胞接着分子L1であるCALL(cell adhesion L1-like)とも呼ばれる一回膜貫通型の細胞接着分子(CAM)であり、神経細胞での機
能が示唆されている。
CHL1 (Close homolog of L1) protein is a one-time transmembrane cell adhesion molecule (CAM), also called CALL (cell adhesion L1-like), which is a cell adhesion molecule L1, and its function in nerve cells has been suggested. There is.
CHL1タンパク質は、被検対象に由来するタンパク質であればよいが、被検対象がヒトである場合は、配列番号1のアミノ酸配列が例示され、被検対象がマウスである場合は、配列番号2のアミノ酸配列が例示される。また、CHL1タンパク質の機能を保持し、EV膜上でパートナータンパク質との複合体を形成する限り、配列番号1または2のアミノ酸配列において、1または数個(例えば1〜20個)のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号1または2と90%以上または95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。また、被検対象として異なる動物を使用する場合は、該動物由来のホモログタンパク質が測定対象となる。 The CHL1 protein may be a protein derived from the test subject, but when the test target is a human, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is exemplified, and when the test target is a mouse, SEQ ID NO: 2 is exemplified. The amino acid sequence of is exemplified. In addition, as long as it retains the function of the CHL1 protein and forms a complex with the partner protein on the EV membrane, one or several (for example, 1 to 20) amino acids are substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. , A protein having an amino acid sequence deleted, inserted or added, or a protein having an amino acid sequence having 90% or more or 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 or 2. When a different animal is used as the test target, the homolog protein derived from the animal is the measurement target.
CHL1パートナータンパク質としては、CHL1とEVの膜上で複合体を形成し、該複合体が肺がんで増加するタンパク質であればよいが、例えば、後述の表1に記載のタンパク質が挙げられる。表1には、各パートナータンパク質のヒトタンパク質の配列の一例(GenBank
登録配列)を挙げた。ただし、表1に参考文献を記載したように、各パートナータンパク質は公知であり、これらの配列以外にも様々な配列のバリエーションを有するタンパク質が知られており、これら特定の配列のタンパク質には限定されない。好ましくは、各パートナータンパク質は、表1に記載のアミノ酸配列と90%以上または95%以上の配列同一性を有する。
The CHL1 partner protein may be any protein that forms a complex on the membrane of CHL1 and EV and the complex increases in lung cancer. Examples thereof include the proteins shown in Table 1 below. Table 1 shows an example of the human protein sequence of each partner protein (GenBank).
Registration sequence) is listed. However, as shown in the references in Table 1, each partner protein is known, and proteins having various sequence variations other than these sequences are known, and are limited to proteins having these specific sequences. Not done. Preferably, each partner protein has 90% or more or 95% or more sequence identity with the amino acid sequences listed in Table 1.
CHL1パートナータンパク質の好ましい例としては、Caspase-14が挙げられる。Caspase-14はケラチノサイトの分化に関与するカスパーゼファミリーのメンバーであり(J Cell Biol 180(3):451-458. 2008、Cancer Res. 58 (22), 5201-5205. 1998)、表1に記載の通り、GenBank P31944(ヒト)(配列番号3)またはO89094(マウス)(配列番号4)の配列を有する。Caspase-14は配列番号3または4のアミノ酸配列において、1または数個(例えば1〜20個)のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質や配列番号3または4と90%以上または95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。 Preferred examples of CHL1 partner proteins include Caspase-14. Caspase-14 is a member of the caspase family involved in keratinocyte differentiation (J Cell Biol 180 (3): 451-458. 2008, Cancer Res. 58 (22), 5201-5205. 1998) and is listed in Table 1. As shown, it has the sequence of GenBank P31944 (human) (SEQ ID NO: 3) or O89094 (mouse) (SEQ ID NO: 4). Caspase-14 is a protein or SEQ ID NO: 3 or 4 having an amino acid sequence in which one or several (for example, 1 to 20) amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. It may be a protein having an amino acid sequence having 90% or more or 95% or more identity.
CHL1パートナータンパク質の他の好ましい例としては、SLC4A1が挙げられる。SLC4A1は陰イオンの細胞内外の輸送を担う膜タンパク質であり(Biochem. J. 256 (3), 703-712 (
1988)、Nature 316 (6025), 234-238 (1985))、例えば、GenBank P02730(ヒト)(配列番号5)またはP04919(マウス(配列番号6))の配列を有する。SLC4A1は配列番号5または6のアミノ酸配列において、1または数個(例えば1〜20個)のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質や配列番号5または6と90%以上または95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。
Another preferred example of the CHL1 partner protein is SLC4A1. SLC4A1 is a membrane protein responsible for the intracellular and extracellular transport of anions (Biochem. J. 256 (3), 703-712 (
1988), Nature 316 (6025), 234-238 (1985)), eg, GenBank P02730 (human) (SEQ ID NO: 5) or P04919 (mouse (SEQ ID NO: 6)). SLC4A1 is 90% with proteins or SEQ ID NOs: 5 or 6 having an amino acid sequence in which one or several (
CHL1パートナータンパク質の他の好ましい例としては、Thrombospondin 1 (THBS1)が挙げられる。THBS1は細胞接着に関与する糖タンパク質であり(J. Cell Biol. 103 (5), 1635-1648 (1986)、Genomics 11 (3), 587-600 (1991))、例えば、GenBank P07996(ヒト
)(配列番号7)またはP35441(マウス)(配列番号8)の配列を有する。THBS1は配列
番号7または8のアミノ酸配列において、1または数個(例えば1〜20個)のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質や配列番号7または8と90%以上または95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。
Another preferred example of the CHL1 partner protein is Thrombospondin 1 (THBS 1). THBS1 is a glycoprotein involved in cell adhesion (J. Cell Biol. 103 (5), 1635-1648 (1986), Genomics 11 (3), 587-600 (1991)), for example, GenBank P07996 (human). It has the sequence of (SEQ ID NO: 7) or P35441 (mouse) (SEQ ID NO: 8). THBS1 is 90% with proteins or SEQ ID NOs: 7 or 8 having an amino acid sequence in which one or several (eg 1-20) amino acids have been substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8. It may be a protein having an amino acid sequence having the above or 95% or more identity.
複合体の解析方法
複合体の解析法は特に制限されず、生化学分野および遺伝子工学分野で公知の手法を使用することができるが、例えば、血液試料から精製されたEVもしくはその膜画分またはそれらの処理物を抗CHL1抗体で処理してCHL1とCHL1パートナータンパク質との複合体を分離し、さらに、抗CHL1パートナータンパク質抗体などのCHL1パートナータンパク質検出試薬で検出する方法が例示される。フローサイトメトリーや共免疫沈降などの方法も例示される。
Analysis method of complex The analysis method of the complex is not particularly limited, and methods known in the fields of biochemistry and genetic engineering can be used. For example, EV purified from a blood sample or a membrane fraction thereof or a membrane fraction thereof or Examples thereof include a method in which these treated products are treated with an anti-CHL1 antibody to separate a complex of CHL1 and a CHL1 partner protein, and further detected with a CHL1 partner protein detection reagent such as an anti-CHL1 partner protein antibody. Methods such as flow cytometry and co-immunoprecipitation are also exemplified.
使用される各抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよいし、Fabなどの抗体断片でもよい。また、各抗体は一般的に用いられているマウス、ラット、
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、トリ由来のもの等が使用できるがこれらに限定されず、CHL1やCHL1パートナータンパク質に特異的に結合する抗体であれば何れも使用できる。抗体は、市販されているものを使用することもできるし、当業者に周知慣用の抗体作製方法により入手したものを使用してもよい。
なお、EV膜上のCHL1を測定するためには、CHL1の細胞外ドメインを認識する抗体が好ましい。具体的には、ヒトCHL1においては配列番号1の1〜1096番目のアミノ酸で表される細胞外ドメインの一部を認識する抗体が好ましい。
Each antibody used may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, or may be an antibody fragment such as Fab. In addition, each antibody is commonly used in mice, rats, etc.
Rabbit, goat, sheep, bird-derived antibodies, etc. can be used, but the antibody is not limited to these, and any antibody that specifically binds to CHL1 or CHL1 partner protein can be used. As the antibody, a commercially available antibody may be used, or an antibody obtained by a method known to those skilled in the art for producing an antibody may be used.
In order to measure CHL1 on the EV membrane, an antibody that recognizes the extracellular domain of CHL1 is preferable. Specifically, in human CHL1, an antibody that recognizes a part of the extracellular domain represented by the
抗CHL1抗体や抗CHL1パートナー抗体は酵素や色素で標識されていてもよい。
標識物質は、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ(AP
)、グルコースオキシダーゼ(GOD)等がより好ましく、後述のEMARS法を行うためにはラジカルを生じさせる酵素を用いることが好ましく、HRPが特に好ましい。
また、標識物質としては、他にFITC、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。
The anti-CHL1 antibody and the anti-CHL1 partner antibody may be labeled with an enzyme or a dye.
Examples of the labeling substance include enzymes, radioisotopes, fluorescent substances, luminescent substances, colloidal gold and the like. As enzymes, horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP)
), Glucose oxidase (GOD) and the like are more preferable, and an enzyme that generates radicals is preferably used in order to carry out the EMARS method described later, and HRP is particularly preferable.
In addition, fluorescent dyes such as FITC and rhodamine can also be used as the labeling substance.
より特異的にCHL1とCHL1パートナータンパク質の複合体を検出するためには、複合体の解析においてEMARS(Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources method)法を使
用することが好ましい。
EMARS法は以下の文献に記載されている。
Jiang,S., Kotani,N., Honke,K., et.al., A proteomics approach to the cell-surface
interactome using the enzyme-mediated activation of radical sources reaction. Proteomics 2012,12,54-62
Kotani N, Gu J, Isaji T, Udaka K, Taniguchi N, Honke K. Biochemical visualizatio
n of cell surface molecular clustering in living cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 105(21):7405-9 (2008).
Taniguchi,N.,Commentary-Searching for partners, Proteomics 2012,12,9-10
特許5773405号明細書
特許4929462号明細書
In order to detect the complex of CHL1 and CHL1 partner protein more specifically, it is preferable to use the EMARS (Enzyme-Mediated Activation of Radical Sources method) method in the analysis of the complex.
The EMARS method is described in the following literature.
Jiang, S., Kotani, N., Honke, K., et.al., A proteomics approach to the cell-surface
interactome using the enzyme-mediated activation of radical sources reaction. Proteomics 2012,12,54-62
Kotani N, Gu J, Isaji T, Udaka K, Taniguchi N, Honke K. Biochemical visualizatio
n of cell surface molecular clustering in living cells.
Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 105 (21): 7405-9 (2008).
Taniguchi, N., Commentary-Searching for partners, Proteomics 2012,12,9-10
Japanese Patent No. 5773405 Japanese Patent No. 4927462
EMARS法としては、具体的には以下のような方法が例示される。
(1)EVに、HRP標識された認識分子(抗CHL1抗体)を添加し、さらにアリールアジドな
どのラジカル源と蛍光物質などの標識物質を含む化合物であるEMARS試薬を添加する。
(2)EMARS試薬を構成するアリールアジドなどのラジカル源が、HRPの存在下でラジカル化され、EV膜上の限られた範囲(HRPの近傍300nm以内)に集まっている分子を攻撃し、CHL1と会合する分子(パートナータンパク質)を標識する。
(3)EMARS反応の後、 EMARS試薬で標識された分子(パートナータンパク質)を抗体や
その他のタンパク解析の手法で同定する。
Specifically, the following methods are exemplified as the EMARS method.
(1) An HRP-labeled recognition molecule (anti-CHL1 antibody) is added to EV, and an EMARS reagent, which is a compound containing a radical source such as aryl azide and a labeling substance such as a fluorescent substance, is added.
(2) Radical sources such as aryl azide constituting the EMARS reagent are radicalized in the presence of HRP and attack molecules gathered in a limited range on the EV membrane (within 300 nm near HRP), and CHL1 Labels molecules (partner proteins) that associate with.
(3) After the EMARS reaction, the molecule (partner protein) labeled with the EMARS reagent is identified by an antibody or other protein analysis method.
EMARS試薬は、市販のEMARS試薬(東京未来スタイル)を使用することもできる。 As the EMARS reagent, a commercially available EMARS reagent (Tokyo Mirai Style) can also be used.
EMARS反応により、標識物質でラベルされたCHL1パートナータンパク質(CHL1と複合体
を形成したタンパク質)は免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ELISA、質量分析等公
知の方法で検出すればよい。
CHL1パートナータンパク質の検出のために使用する検出試薬はCHL1パートナータンパク質に特異的に結合する物質が使用でき、抗CHL1パートナータンパク質抗体が好適に使用できる。
なお、CHL1に結合したCHL1パートナータンパク質については、ウェスタンブロットのバンド強度、ELISA、蛍光測定などにより定量を行うこともできる。
By the EMARS reaction, the CHL1 partner protein (protein forming a complex with CHL1) labeled with the labeling substance may be detected by a known method such as immunoprecipitation, Western blotting, ELISA, and mass spectrometry.
As the detection reagent used for detecting the CHL1 partner protein, a substance that specifically binds to the CHL1 partner protein can be used, and an anti-CHL1 partner protein antibody can be preferably used.
The CHL1 partner protein bound to CHL1 can also be quantified by Western blotting band intensity, ELISA, fluorescence measurement, or the like.
本発明の方法においては、「CHL1とCHL1パートナータンパク質との複合体を解析」は、複合体の検出および/または定量を含む。
複合体の存在または存在量に基づいて肺がんを検査することができる。すなわち、本発明の方法では、肺がんを診断するためのデータを提供することができる。
In the method of the invention, "analyzing a complex of CHL1 and a CHL1 partner protein" comprises detecting and / or quantifying the complex.
Lung cancer can be tested based on the presence or abundance of the complex. That is, the method of the present invention can provide data for diagnosing lung cancer.
例えば、複合体が検出された場合、例えば、CHL1に結合したCaspase-14が検出された場合に、被検者は肺がんに罹患しているまたは肺がんのリスクが高いと判定することができる。また、肺がんの予後予測も可能である。
また、複合体の量が一定量以上の場合、例えば、健常者の1.5倍以上または2倍以上の場合に、被検者は肺がんに罹患しているまたは肺がんのリスクが高いと判定することができる。カットオフ値をあらかじめ定め、その値より高いときに、被検者は肺がんに罹患しているまたは肺がんのリスクが高いと判定することができる。
For example, if a complex is detected, for example, if Caspase-14 bound to CHL1 is detected, the subject can be determined to have or are at high risk for lung cancer. It is also possible to predict the prognosis of lung cancer.
In addition, when the amount of the complex is a certain amount or more, for example, when the amount is 1.5 times or more or twice or more that of a healthy person, the subject is determined to have lung cancer or have a high risk of lung cancer. be able to. When the cutoff value is predetermined and higher than that value, the subject can be determined to have lung cancer or to be at high risk of lung cancer.
本発明の方法による検査結果は他の肺がんマーカー検査や画像検査などと組み合わせてもよい。
医師は本発明の測定結果をもとに肺がんを診断することができ、その結果をもとに、肺がん治療薬の投与や肺がん手術の施術等、治療方針を策定することができる。
The test result by the method of the present invention may be combined with other lung cancer marker tests, imaging tests, and the like.
A doctor can diagnose lung cancer based on the measurement results of the present invention, and based on the results, can formulate a treatment policy such as administration of a lung cancer therapeutic agent or lung cancer surgery.
本発明の他の態様は、抗CHL1抗体およびCHL1パートナータンパク質検出試薬を含む、肺がんの検査用キットを提供する。
抗CHL1抗体およびCHL1パートナータンパク質検出試薬(好ましくは抗CHL1パートナータンパク質抗体)は上述したとおりである。
Another aspect of the invention provides a kit for testing lung cancer comprising an anti-CHL1 antibody and a CHL1 partner protein detection reagent.
The anti-CHL1 antibody and CHL1 partner protein detection reagent (preferably anti-CHL1 partner protein antibody) are as described above.
EMARS法を行う場合には、HRP等のラジカル発生酵素で標識した抗CHL1抗体およびEMARS
試薬を含んでもよい。
When performing the EMARS method, anti-CHL1 antibody labeled with a radical generating enzyme such as HRP and EMARS
Reagents may be included.
さらに、本発明のキットは被検者の血液試料からEVを分離するための試薬を含んでもよい。
また、標準物質、標識化二次抗体、標識が酵素である場合その基質、BSA等のブロッキ
ング剤等の試薬を含めることもできる。さらに、手順や診断基準を記載した添付文書を含んでもよい。
In addition, the kit of the invention may include reagents for separating EVs from a subject's blood sample.
In addition, reagents such as a standard substance, a labeled secondary antibody, a substrate thereof when the label is an enzyme, and a blocking agent such as BSA can be included. In addition, package inserts describing procedures and diagnostic criteria may be included.
以下実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は下記実施例には限定されない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited to the following examples.
<材料と方法>
動物
野生型マウスとして使用したC57BL/6Jマウスは、日本クレア株式会社(Japan CLEA Co.)(日本国東京)より購入したマウスのペアを自家繁殖させ、20〜25℃の、特定の病原体を保有しない状態(SPF)で飼育維持した。
EML4-ALK遺伝子導入マウス(Proc Natl Acad Sci 105(50):19893-19897.2008)につい
ても室温のSPF状態で飼育維持した。
動物は全て、明期12時間/暗期12時間の環境下に維持し、餌および水は自由摂取とした。
<Materials and methods>
The C57BL / 6J mice used as animal wild-type mice are self-propagated with a pair of mice purchased from Japan CLEA Co. (Tokyo, Japan) and carry a specific pathogen at 20 to 25 ° C. The animals were bred and maintained in a non-existent state (SPF).
EML4-ALK transgenic mice (Proc Natl Acad Sci 105 (50): 19893-19897.2008) were also bred and maintained in an SPF state at room temperature.
All animals were maintained in an environment of 12 hours in the light period / 12 hours in the dark period, and food and water were freely ingested.
ヒト血清サンプル
健康な人及び肺癌患者の血清サンプルは、メディカルゲノムセンターバイオバンク(Medical Genome Center Biobank)、国立長寿医療研究センター(National Center for Geriatrics and Gerontology)及び日本医療研究開発機構(Japan Agency for Medical Research and Development)(AMED)の支援下にあるバイオバンク・ジャパン・プロジェクト(BioBank Japan Project)(J Epidemiol 27(3):S2-S21,2017)より入手したものを使用した。
Human serum samples Serum samples for healthy people and lung cancer patients are available at the Medical Genome Center Biobank, the National Center for Geriatrics and Gerontology, and the Japan Agency for Medical. The one obtained from the BioBank Japan Project (J Epidemiol 27 (3): S2-S21, 2017) supported by Research and Development (AMED) was used.
細胞培養及びEV単離
LK2ヒト扁平細胞肺癌細胞株(理研細胞バンク(RIKEN CELL BANK))を、5%ウシ胎児血清(FBS; GIBCO)を添加したRPMI 1640培地(和光純薬(Wako Chemicals))を用いて5% CO2を含む37℃の加湿空気中で培養した。LK2細胞から分泌されたEVを回収するために、培地を新たに無血清培地であるASF培地104(味の素(Ajinomoto))と交換した後、細胞を2
日間連続培養した。培養により得られた培地画分を、ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution(20 μl/100 μl血清;System Biosciences)を使用して4℃で一晩処理する
ことにより、分泌されたEVを部分精製した。EVを含む沈殿をPBS 100 μlで可溶化した後
、さらなる解析に使用した。
Cell culture and EV isolation
LK2 human squamous cell lung cancer cell line (RIKEN CELL BANK) 5% CO using RPMI 1640 medium (Wako Chemicals) supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS; GIBCO) The cells were cultured in humidified air at 37 ° C containing 2. In order to recover EV secreted from LK2 cells, the medium was replaced with ASF medium 104 (Ajinomoto), which is a serum-free medium, and then the cells were replaced with 2 cells.
Incubated continuously for days. The medium fraction obtained by culturing was partially purified by treating the secreted EV with ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution (20 μl / 100 μl serum; System Biosciences) overnight at 4 ° C. Precipitates containing EV were solubilized in 100 μl PBS and then used for further analysis.
EMARS反応用HRP結合抗体の作製
マウス及びヒト抗CHL1抗体(AF2147及びMAB2126;R&D systems)を一部還元し、ペルオキシダーゼ標識キットSH(同仁化学研究所(Dojindo))を使用してHRPに結合させた。HRP標識した抗体の結合能を既報に従い評価した(Cancer Sci 110(8):2607-2619,2019)。
Preparation of HRP-binding antibody for EMARS reaction Mouse and human anti-CHL1 antibodies (AF2147 and MAB2126; R & D systems) were partially reduced and bound to HRP using the peroxidase labeling kit SH (Dojindo). .. The binding ability of HRP-labeled antibody was evaluated according to the previous report (Cancer Sci 110 (8): 2607-2619, 2019).
血清EVの精製及びEMARS反応
マウス及びヒト血清由来の血清EVを、ポリマー沈殿及びサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。サイズ排除クロマトグラフィーにおいてどの画分をEV精製用に回収すべきかを決定するために、マウス血清及びブルーデキストラン(Sigma-Aldrich)
を、Sephacryl S-500樹脂(GE Healthcare Life Sciences)2 mlを充填しPBSで平衡化し
たショートカラムにかけた。EVの樹脂への非特異的結合を回避するために、樹脂を酵母エキス溶液で前処理(BD Biosciences;0.1 g/100 ml H2O、1時間)した。次いで、サンプ
ルの画分を100 μL PBS/画分で溶出させた。各画分のタンパク質濃度を、micro BCAタン
パク質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific)を使用し、VarioSkan Flashマイク
ロプレートリーダー(Thermo Fisher Scientific)を用いて562 nmで測定した。ブルーデキストランはVarioSkan Flash マイクロプレートリーダーを用いて300 nmで測定した。
Purification of Serum EV and EMARS Reaction Serum EV from mouse and human serum was purified in combination with polymer precipitation and size exclusion chromatography. Mouse serum and blue dextran (Sigma-Aldrich) to determine which fractions should be recovered for EV purification in size exclusion chromatography.
Was placed on a short column packed with 2 ml of Sephacryl S-500 resin (GE Healthcare Life Sciences) and equilibrated with PBS. To avoid non-specific binding of EV to the resin, the resin was pretreated with yeast extract solution (BD Biosciences; 0.1 g / 100 ml H 2 O, 1 hour). The sample fraction was then eluted with 100 μL PBS / fraction. The protein concentration of each fraction was measured at 562 nm using a micro BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific) and a VarioSkan Flash microplate reader (Thermo Fisher Scientific). Blue dextran was measured at 300 nm using a VarioSkan Flash microplate reader.
血清(50〜100 μl)をExoQuick Exosome Precipitation Solution(25.2 μl/100 μl血清;System Biosciences)を用いて氷上で30分間処理した。沈殿(以後、沈殿したEVと称する)を100 μlのPBSで可溶化した後、0.25 μgのHRP結合抗マウス又はヒトCHL1抗体
を穏やかに撹拌しながら添加した。室温で20分間インキュベートした後、沈殿したEVの混合物を、PBSで平衡化した、2mlのSephacryl S-500を充填したショートカラムにかけた。PBSを重力落下によって送流することにより段階溶出させた(100 μl PBS/画分)。HRP結
合CHL1抗体を有するEVを含む画分No. 6〜8を各実験毎に回収し、Nanosep(登録商標)遠
心デバイス(30K)に添加した後、8,000 gで5分間遠心することによりEV粒子を濃縮した
。フィルタ上に濃縮されたEV粒子を100 μl PBSで1回遠心することにより洗浄し、次い
でEMARS反応試薬であるフルオレセイン−チラミド(FT)試薬(Cancer Sci 110(8):2607-2619,2019)を穏やかに撹拌しながらフィルタ上に加えた。室温で10分間インキュベート
した後、残留FT試薬を8,000 gで5分間遠心することにより除去し、次いでPBSと1回遠心
することにより洗浄した。フィルタ上のEMARS反応したEVタンパク質に1% SDSを含む50 mM
Tris-HCl(pH 7.4)30 μlを加えて穏やかにピペッティングし、新しいチューブに移し
て回収した。過剰のFT試薬を除去するために、回収したサンプルを、1% SDSを含む50 mM Tris-HCl(pH 7.4)で平衡化したSephadex G-50(GE Healthcare Life Sciences)約1ml
を充填したミニカラムにかけた。溶出したサンプル(約30 μl)を、後述する免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ELISA等のEMARS産物の解析に使用した。EMARS産物をSDS-PAGEゲルで直接検出する場合は、ゲルをChemiDoc MP画像解析装置(BIO-RAD)を用いてゲル
蛍光検出モード(フルオレセイン用青色光フィルタ)で直接測定した。ローディングコントロール用として、露光後のゲルをCoomassie Brilliant Blue溶液で染色した。
Serum (50-100 μl) was treated with ExoQuick Exosome Precipitation Solution (25.2 μl / 100 μl serum; System Biosciences) on ice for 30 minutes. The precipitate (hereinafter referred to as precipitated EV) was solubilized with 100 μl of PBS, and then 0.25 μg of HRP-binding anti-mouse or human CHL1 antibody was added with gentle stirring. After incubating for 20 minutes at room temperature, the precipitated EV mixture was run on a short column packed with 2 ml Sephacryl S-500 equilibrated with PBS. Stepwise elution was performed by feeding PBS by gravity drop (100 μl PBS / fraction). Fractions No. 6-8 containing EV with HRP-bound CHL1 antibody were collected for each experiment, added to Nanosep® centrifuge device (30K), and then centrifuged at 8,000 g for 5 minutes to produce EV particles. Was concentrated. Wash the concentrated EV particles on the filter by centrifuging once with 100 μl PBS, followed by the EMARS reaction reagent fluorescein-tyramide (FT) reagent (Cancer Sci 110 (8): 2607-2619, 2019). It was added onto the filter with gentle stirring. After incubating for 10 minutes at room temperature, the residual FT reagent was removed by centrifugation at 8,000 g for 5 minutes and then washed by centrifugation once with PBS. 50 mM containing 1% SDS on EMARS-reacted EV protein on filter
30 μl of Tris-HCl (pH 7.4) was added, gently pipetting, and transferred to a new tube for recovery. Approximately 1 ml of Sephadex G-50 (GE Healthcare Life Sciences) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 1% SDS of the recovered sample to remove excess FT reagent.
Was placed on a mini column filled with. The eluted sample (about 30 μl) was used for analysis of EMARS products such as immunoprecipitation, Western blotting, and ELISA described later. When EMARS products were detected directly on SDS-PAGE gels, the gels were measured directly in gel fluorescence detection mode (blue light filter for fluorescein) using a ChemiDoc MP image analyzer (BIO-RAD). Post-exposure gels were stained with Coomassie Brilliant Blue solution for loading control.
クライオ電子顕微鏡法
EVをクライオ電子顕微鏡法で画像化するために、グロー放電処理された孔開きカーボン膜付きグリッド(glowdischarged holey carbon grid)(Quantifoil Mo 2/2、200メッシュ)にサンプル3 μlを載せることによりグリッドを作製した。サンプルをLEICA EM GP2
を用いて湿度100%、10℃で氷包埋した。Falcon III検出器を搭載したFEI Talos Arctica 顕微鏡(200 kV)を使用し、リニアモードで、ボルタ位相板を用いて画像を取得した。線量率(dose rate)を10e-/pixel/secとし、4秒間で総照射電子線量(total accumulated dose)を約40 e-/Å2として各データを取得した。
Cryo electron microscopy
To image the EV with cryo-electron microscopy, place the grid on a glow discharged holey carbon grid (
Was embedded in ice at a humidity of 100% and 10 ° C. Images were acquired using a Volta phase plate in linear mode using a FEI Talos Arctica microscope (200 kV) equipped with a Falcon III detector. Dose rate (dose rate) 10e - and / pixel / sec, the total irradiation electron dose (total accumulated dose) at 4 seconds to about 40 e - has acquired the data as / Å 2.
EMARS産物の精製及び濃縮
EMARS産物を、抗フルオレセイン抗体を結合させたSepharoseを用いて既報に従い精製及び濃縮した(Cancer Sci 110(8):2607-2619,2019)。具体的には、上に述べたG-50カラムの素通り画分をNP-40溶解バッファー300 μLで希釈した。次いで、抗フルオレセイン抗体(600101096;Rockland又は6400-01;Southern Biotech)とNHS活性化Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences)とを結合反応させることにより作製した抗フルオ
レセイン抗体Sepharose 20 μlをサンプルに添加し、4℃で一晩回転させながら混合した
。樹脂を洗浄した後、適切な溶液(ウェスタンブロッティング用還元SDSサンプルバッフ
ァー又はMS解析用MPEX PTS試薬(GL Science)含有1 % SDS 溶液)をSepharoseビーズに
添加し、95℃で5分間加熱することにより、フルオレセイン標識分子を樹脂から溶出させ
た。
Purification and concentration of EMARS products
EMARS products were purified and concentrated according to previously reported using Sepharose conjugated with an anti-fluorescein antibody (Cancer Sci 110 (8): 2607-2619, 2019). Specifically, the pass-through fraction of the G-50 column described above was diluted with 300 μL of NP-40 lysis buffer. Next, 20 μl of the anti-fluorescein antibody Sepharose 20 μl prepared by binding reaction between the anti-fluorescein antibody (600101096; Rockland or 6400-01; Southern Biotech) and NHS activated
質量分析を用いたEMARS産物のプロテオミクス解析
ナノ液体クロマトグラフィー/エレクトロスプレーイオン化質量分析(nano LC-ESI-MS/MS)を用いてプロテオミクス解析を実施した。具体的には、血清EVから得られたEMARS産物のペプチドサンプルを、上述の手順と同様にして精製し、ナノUHPLC装置(Bruker Daltonics)に注入した。質量分析にはナノESI源を備えたmaXis-4G-CPR(Bruker Daltonics)質量分析計を使用した。Magic C18AQ UHPLC NanoTrapカラム(粒子径5 μm、細孔径200
Å)を上流に接続したL-column ODS(0.1×150 mm、粒子径3 μm、Ceri)を使用した。ペ
プチドをアセトニトリルを用いて10%〜35%の勾配をかけて50分間でカラムから溶出させた。溶出したペプチドを直接エレクトロスプレーして分光装置に導入し、MS/MSスペクトル
をデータ依存モードで取得した。
Proteomics analysis of EMARS products using mass spectrometry Proteomics analysis was performed using nano liquid chromatography / electrospray ionization mass spectrometry (nano LC-ESI-MS / MS). Specifically, a peptide sample of the EMARS product obtained from serum EV was purified in the same manner as described above and injected into a nano-UHPLC device (Bruker Daltonics). A maXis-4G-CPR (Bruker Daltonics) mass spectrometer equipped with a nano-ESI source was used for mass spectrometry. Magic C18AQ UHPLC NanoTrap column (
An L-column ODS (0.1 × 150 mm,
ヒト血清 EV中のBiEVのプロテオミクス解析にあたっては、マウスサンプルと同様にし
て調製したEMARS産物のペプチドサンプルをUltimate 3000 RSLCnano(Thermo Fisher Scientific)に注入した。ナノESI源を備えたLTQ Orbitrap XL質量分析計(Thermo Fisher Scientific)を用いて質量分析を行った。C18 PepMap100カラム(300 μm I.D × 5 mm; Thermo Fisher Scientific)を上流に接続したNIKKYOナノHPLCキャピラリーカラム(3 μm C18、75 μm I.D.×120 mm;日京テクノス株式会社(Nikkyo Technos))を使用した。ペ
プチドを、アセトニトリルを使用して4%〜35%の勾配をかけて97分間で溶出させた。溶出
されたペプチドを直接エレクトロスプレーして分光装置に導入し、前駆イオンスキャン及びデータ依存MS/MSスキャンを行った。
For proteomics analysis of BiEV in human serum EV, peptide samples of EMARS products prepared in the same manner as mouse samples were injected into Ultimate 3000 RSLC nano (Thermo Fisher Scientific). Mass spectrometry was performed using an LTQ Orbitrap XL mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) equipped with a nano ESI source. A NIKKYO nano HPLC capillary column (3 μm C18, 75 μm ID x 120 mm; Nikkyo Technos Co., Ltd.) with a C18 PepMap100 column (300 μm ID x 5 mm; Thermo Fisher Scientific) connected upstream was used. The peptide was eluted with acetonitrile using a gradient of 4% -35% in 97 minutes. The eluted peptides were directly electrosprayed and introduced into the spectroscope for precursor ion scanning and data-dependent MS / MS scanning.
生データをProteome Discoverer ver. 2.2 ソフトウェア(Thermo Fisher Scientific
)を用いて解析した。パラメータは次の通りである:Cys alkylation:iodoacetamide Digestion:Trypsin、Species:Homo sapiens又はMus musculus、FDR(偽発見率):strict
1%、relaxed 5%。
Raw data from Proteome Discoverer ver. 2.2 software (Thermo Fisher Scientific)
) Was used for analysis. The parameters are as follows: Cys alkylation: iodoacetamide Digestion: Trypsin, Species: Homo sapiens or Mus musculus, FDR (false discovery rate): strict
1%, relaxed 5%.
ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析を行うために、還元SDSサンプルバッファーで可溶化したサン
プル(精製EV等)又は上に述べた濃縮精製樹脂から溶出したサンプルを、各候補タンパク質の分子量に合わせて調整するように、典型的なSDS泳動バッファー又はRapid Running Buffer Solution(Nacalai tesque)を用いて6〜12%のSDS-PAGEに供した。次いでゲルをImmobilon(登録商標)-P PVDF Membrane(Millipore)にブロッティングした。5%スキムミルク溶液でブロッキングした後、転写したメンブレンを次に示す一次抗体と反応させた:抗フルオレセイン抗体(600101096;Rockland;0.2 μg/ml)、抗マウス及びヒトCHL1抗
体(AF2147及びMAB2126;R&D systems;1 μg/ml)、HRP結合抗マウス及びヒトCHL1抗体
(上述)、抗α2インテグリン抗体(ab133557;Abcam;1 μg/ml)、抗β1インテグリン
抗体(610467;BD transduction laboratories;0.25 μg/ml)、抗FGFR3抗体(c-15;Santa cruz;0.2 μg/ml 5% BSA-PBS)、抗TSG101抗体(EXOABTSG101-1;System Biosciences;1:500)、抗CD63抗体(EXOAB-CD63A-1;System Biosciences;1:500)、抗CD5L抗体
(AF2834;R&D systems;0.4 μg/ml)、抗Pregnancy Zone Protein(PZP)抗体(PAG324Ra01;CLOUD-CLONE;0.5 μg/ml)、抗SLC4A1抗体(18566-1-AP;PROTEINTECH;0.6 μg/ml)、抗トロンボスポンジン1(THBS1)抗体(PAA611Hu01;CLOUD-CLONE;0.5 μg/ml)
及び抗Caspase-14抗体(MAB8215;R&D systems;0.5 μg/ml)。一次抗体との反応は室温で1時間〜一晩行った。次いで適切な二次抗体である、HRP結合抗マウスIgG(Promega;1:3000-5000)、HRP結合抗ウサギIgG(Promega;1:3000-5000)、HRP結合抗ヤギIgG(Santa Cruz;1:3000-5000)、Rabbit若しくはMouse TrueBlot(登録商標):抗ウサギ若しくは
マウスIgG HRP(Rockland;1:1000)又はHRP結合抗ラットIgG(Santa Cruz;1:3000-5000)を室温で1時間反応させた。抗体で処理した後、メンブレンをImmobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)と反応させた。メンブレンを露光し、ChemiDoc
MP Image analyzer (BIO-RAD)で解析した。分子量マーカーとしてPre-stained Protein
Markers, Broad Range(ナカライテスク(Nacalai Tesque))を使用した。ローディング
コントロールとしてSDS-PAGEゲルをCoomassie Brilliant Blue溶液で染色した。メンブレンをストリッピングする場合は、ストリッピング溶液(和光純薬(Wako Chemicals))を
用いてメンブレンを室温で20分間処理し、再ブロッキングし、適切な抗体で再染色した。
Western Blotting Analysis To perform Western blot analysis, the sample solubilized in reduced SDS sample buffer (purified EV, etc.) or the sample eluted from the concentrated purified resin described above should be adjusted according to the molecular weight of each candidate protein. Was subjected to 6-12% SDS-PAGE using typical SDS running buffer or Rapid Running Buffer Solution (Nacalai tesque). The gel was then blotting to Immobilon®-P PVDF Membrane (Millipore). After blocking with 5% skim milk solution, the transferred membrane was reacted with the following primary antibody: anti-fluorescein antibody (600101096; Rockland; 0.2 μg / ml), anti-mouse and human CHL1 antibody (AF2147 and MAB2126; R & D systems). 1 μg / ml), HRP-binding anti-mouse and human CHL1 antibody (above), anti-α2 integrin antibody (ab133557; Abcam; 1 μg / ml), anti-β1 integrin antibody (610467; BD transduction laboratories; 0.25 μg / ml) , Anti-FGFR3 antibody (c-15; Santa cruz; 0.2 μg /
And anti-Caspase-14 antibody (MAB8215; R & D systems; 0.5 μg / ml). The reaction with the primary antibody was carried out at room temperature for 1 hour to overnight. Then the appropriate secondary antibodies are HRP-bound anti-mouse IgG (Promega; 1: 3000-5000), HRP-bound anti-rabbit IgG (Promega; 1: 3000-5000), HRP-bound anti-goat IgG (Santa Cruz; 1: 3000-5000), Rabbit or Mouse TrueBlot®: Anti-rabbit or mouse IgG HRP (Rockland; 1: 1000) or HRP-bound anti-rat IgG (Santa Cruz; 1: 3000-5000) reacted at room temperature for 1 hour. rice field. After treatment with the antibody, the membrane was reacted with Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore). Exposing the membrane, ChemiDoc
It was analyzed by MP Image analyzer (BIO-RAD). Pre-stained Protein as a molecular weight marker
Markers, Broad Range (Nacalai Tesque) was used. SDS-PAGE gels were stained with Coomassie Brilliant Blue solution as a loading control. When stripping the membrane, the membrane was treated with a stripping solution (Wako Chemicals) at room temperature for 20 minutes, reblocked and restained with the appropriate antibody.
血清又はEV中のCHL1タンパク質のELISA
マウス血清のCHL1量を、既報に従い、HRP結合抗マウス及びヒトCHL1抗体を用いて直接ELISA法で測定した(Biochem Biophys Res Commun 501(4):982-987, 2018)。血清及び血
清EV中のヒトCHL1量をサンドイッチELISAで測定する場合は、上述の希釈血清又は沈殿し
た血清EVを、補足抗体としての抗ヒトCHL1抗体(10143-MM05;Sino Biological)でコー
ティングしたELISAプレートに添加した後、HRP結合抗ヒトCHL1抗体(上述)で検出した。マウス血清のCHL1量を測定するための相対的な指標値(CHL1)を、先に述べた基準サンプルの値に基づき決定した(Biochem Biophys Res Commun 501(4):982-987, 2018)。ヒトCHL1のELISAの場合は、組換えヒトCHL1部分タンパク質(10143-H08H;Sino Biological)
を基準として使用した。
ELISA of CHL1 protein in serum or EV
The amount of CHL1 in mouse serum was measured by the direct ELISA method using HRP-binding anti-mouse and human CHL1 antibody according to the previous report (Biochem Biophys Res Commun 501 (4): 982-987, 2018). When measuring the amount of human CHL1 in serum and serum EV by sandwich ELISA, an ELISA plate in which the above-mentioned diluted serum or precipitated serum EV is coated with an anti-human CHL1 antibody (10143-MM05; Sino Biological) as a supplementary antibody. After addition to, it was detected with an HRP-bound anti-human CHL1 antibody (above). Relative index values (CHL1) for measuring CHL1 levels in mouse serum were determined based on the values of the reference sample described above (Biochem Biophys Res Commun 501 (4): 982-987, 2018). In the case of human CHL1 ELISA, recombinant human CHL1 partial protein (10143-H08H; Sino Biological)
Was used as a reference.
フルオレセイン標識されたタンパク質のELISA
サンドイッチELISAを用いてフルオレセイン標識SLC4A1又はCaspase-14を測定するため
に、96 well ELISAプレート(#3369;CORNING)に抗マウス及びヒトSLC4A1抗体(18566-1-AP;PROTEINTECH;1 μg/ml PBS)又は抗ヒトCaspase-14抗体(H00023581-M01;Abnova
;0.6 μg/ml PBS)を4℃で一晩かけてコーティングした。1% BSA-PBS(Caspase-14の場
合は5%スキムミルク-PBS)溶液を用いて37℃で1時間ブロッキングした後、フルオレセイ
ン標識SLC4A1又はフルオレセイン標識Caspase-14を含む対応するEMARS産物を添加し、37
℃で1時間インキュベートした。各ウェルをPBST(0.05 % tween-PBS溶液)で穏やかに洗
浄し、次いで、ペルオキシダーゼ標識キットNH2(同仁化学研究所(Dojindo))を使用し
て製造業者の指示に従い、抗フルオレセイン抗体(600101096;Rockland)から作製したHRP結合抗フルオレセイン抗体(1 μg/ml)で、37℃で1時間処理した。SLC4A1分子自体を検出する場合は、組換えヒトSLC4A1ポリペプチド(CSBEP021663HU;CAUABIO THECHNOLOGY)及びZenonウサギIgG HRP標識キット(Thermo Fisher Scientific)を用いて製造業者の指示に従い作製したHRP結合抗SLC4A1抗体を使用した。SureBlue/TMBペルオキシダーゼ基質
(100 μl/各ウェル;Sera care)を室温で適切な時間(3〜10分間)反応させることにより発色させた。2M HCl溶液で反応を停止した後、Varioskan Flashマイクロプレートリー
ダー(Thermo Fisher Scientific)を使用して吸光度(O.D. 450 nm)を測定した。フル
オレセイン標識SLC4A1(100 μl)の基準サンプルは、大腫瘍担持EML4-ALK遺伝子導入マ
ウス(30週齢雄)の血清100 μlから得られたEMARS産物として調製した。ELISAプレート
間の差を相殺するために、基準サンプルの値に基づく相対値を“BiEV指標値”として求めた。本研究に用いた“BiEV指標値(SLC4A1)”は、何マイクロリットルが上述の基準サンプルに相当するかを示したものである。フルオレセイン標識Caspase-14の場合、NHS-フルオレセイン(Thermo Fisher Scientific)で標識された、フルオレセイン標識組換えCaspase-14タンパク質(11856-H07E;Sino Biological)を基準とする“BiEV指標値(Caspase-14)”を使用した。Caspase-14タンパク質(2.5 μg)及びNHS-フルオレセイン(8 μg
)を20 μl PBS中で混合した後、室温で50分間インキュベートした。過剰のNHS-フルオレセインを除去するために、反応混合物をSephadex G-50(GE Healthcare Life Sciences)約0.5 mlを充填したミニカラムにかけた。
Fluorescein-labeled protein ELISA
Anti-mouse and human SLC4A1 antibody (18566-1-AP; PROTEINTECH; 1 μg / ml PBS) on a 96-well ELISA plate (# 3369; CORNING) to measure fluorescein-labeled SLC4A1 or Caspase-14 using sandwich ELISA. Or anti-human Caspase-14 antibody (H00023581-M01; Abnova)
(0.6 μg / ml PBS) was coated overnight at 4 ° C. After blocking with a 1% BSA-PBS (5% skim milk-PBS for Caspase-14) solution at 37 ° C. for 1 hour, add the corresponding EMARS product containing fluorescein-labeled SLC4A1 or fluorescein-labeled Caspase-14. 37 37
Incubated at ° C for 1 hour. Gently wash each well with PBST (0.05% tween-PBS solution) and then follow the manufacturer's instructions using the peroxidase labeling kit NH 2 (Dojindo) to anti-fluorescein antibody (600101096; It was treated with an HRP-binding anti-fluorescein antibody (1 μg / ml) prepared from Rockland) at 37 ° C. for 1 hour. When detecting the SLC4A1 molecule itself, use the HRP-binding anti-SLC4A1 antibody prepared according to the manufacturer's instructions using the recombinant human SLC4A1 polypeptide (CSBEP021663HU; CAUABIO THECHNOLOGY) and the Zenon rabbit IgG HRP labeling kit (Thermo Fisher Scientific). did. Color was developed by reacting SureBlue / TMB peroxidase substrate (100 μl / well; Sera care) at room temperature for an appropriate period of time (3-10 minutes). After stopping the reaction with 2M HCl solution, the absorbance (OD 450 nm) was measured using a Varioskan Flash microplate reader (Thermo Fisher Scientific). A reference sample of fluorescein-labeled SLC4A1 (100 μl) was prepared as an EMARS product obtained from 100 μl serum of a large tumor-carrying EML4-ALK gene-introduced mouse (30-week-old male). In order to offset the difference between the ELISA plates, the relative value based on the value of the reference sample was calculated as the “BiEV index value”. The "BiEV index value (SLC4A1)" used in this study indicates how many microliters correspond to the above-mentioned reference sample. In the case of fluorescein-labeled Caspase-14, "BiEV index value (Caspase-14)" based on the fluorescein-labeled recombinant Caspase-14 protein (11856-H07E; Sino Biological) labeled with NHS-fluorescein (Thermo Fisher Scientific). "It was used. Caspase-14 protein (2.5 μg) and NHS-fluorescein (8 μg)
) Was mixed in 20 μl PBS and then incubated at room temperature for 50 minutes. To remove excess NHS-fluorescein, the reaction mixture was run on a mini-column packed with about 0.5 ml of Sephadex G-50 (GE Healthcare Life Sciences).
<結果と考察>
EML4-ALK遺伝子導入マウス由来血清EVのEMARS反応
マウス血清からEVを粗精製することができたことはCD63(EV膜に発現するタンパク質)を用いたウェスタンブロット解析により確認した(図は示さず)。EML4-ALK遺伝子導入マウス由来血清EV中にはCHL1が多量に検出された(図は示さず)。
<Results and discussion>
EMARS reaction of serum EV derived from EML4-ALK gene-introduced mouse It was confirmed by Western blot analysis using CD63 (protein expressed on EV membrane) that EV could be crudely purified from mouse serum (not shown). .. A large amount of CHL1 was detected in serum EV derived from EML4-ALK transgenic mice (not shown).
血清EV中のBiEV解析の典型的な概要を図1に示す。CHL1プローブ(+)のサンプル中には
、沈殿した血清EV(粗精製EV)に由来するEMARS産物が検出されたが、EMARSプローブ(-)
のサンプル中には検出されなかった。これは、CHL1プローブが十分にEMARS反応すること
と、血清因子が非特異的EMARS反応を誘発しなかったこととを示唆している。しかしなが
ら、フルオレセイン標識したEMARS産物には非常に多くの血清タンパク質が含まれていた
ため、サイズ排除クロマトグラフィーも行った。Sephacryl S-500樹脂で分画した画分No.
6〜8は、血清タンパク質の混入量が限られており、血清EVの回収に最も適していた(図2A)。クライオ電子顕微鏡観察では、画分No. 6〜8のサンプルには、数十ナノメートルの
大きさの多数の球状粒子が脂質二重層と共に認められ(図2B)、それぞれの画分は直径約20〜100 nmのEVを含んでいた。明らかな血清タンパク質の混入は見られないようであった(図2B)。
A typical overview of BiEV analysis in serum EV is shown in FIG. EMARS products derived from precipitated serum EV (crude purified EV) were detected in the CHL1 probe (+) sample, but the EMARS probe (-)
Was not detected in the sample. This suggests that the CHL1 probe responded adequately to EMARS and that serum factors did not elicit a non-specific EMARS response. However, fluorescein-labeled EMARS products contained so many serum proteins that size exclusion chromatography was also performed. Sephacryl S-500 Fraction No. fractioned with resin
6-8 had a limited amount of serum protein contamination and were most suitable for serum EV recovery (Fig. 2A). Cryo-electron microscopy shows that samples of fractions No. 6-8 show a large number of spherical particles with a size of several tens of nanometers together with a lipid bilayer (Fig. 2B), each fraction having a diameter of about 20. It contained an EV of ~ 100 nm. No obvious serum protein contamination appeared (Fig. 2B).
血清が由来するマウス:野生型(WT)マウス、大腫瘍(TL;腫瘍重量が0.15 g超)を有するEML4-ALK遺伝子導入マウス及び小腫瘍(TS;腫瘍重量が0.1 g以下)を有するEML4-ALK遺伝子導入マウス、に応じて血清を3群に分けた。複数匹のマウスで平均化した実験結
果を得るために、各群につき10匹から分取した血清10 μlを等しい比率で混合し、次の実験に使用した。
TLマウス由来のサンプルにおいてはEMARS産物が検出されたが、WT及びTSマウスでは検
出されなかった(図2C)。WTサンプルのバンドパターンはTSサンプルのパターンと類似していた(図2C)。TLサンプル中には、TSG101及びCD63分子が他の2種のサンプルと比較す
るとある程度多く存在しており、このことは、大腫瘍組織がCHL1を発現しているcEV(が
んEV)をある程度多く分泌したことにより、TLサンプル中にEMARS産物のシグナルが見ら
れたことを示唆している。
Serum-derived mice: wild-type (WT) mice, EML4-ALK-introduced mice with large tumors (TL; tumor weight> 0.15 g) and EML4- with small tumors (TS; tumor weight of 0.1 g or less) Serum was divided into 3 groups according to the ALK gene-introduced mice. To obtain averaged experimental results in multiple mice, 10 μl of serum from 10 mice in each group was mixed in equal proportions and used in the next experiment.
EMARS products were detected in TL mouse-derived samples, but not in WT and TS mice (Fig. 2C). The band pattern of the WT sample was similar to that of the TS sample (Fig. 2C). TSG101 and CD63 molecules are present in the TL sample to some extent compared to the other two samples, which means that the large tumor tissue has a certain amount of cEV (cancer EV) expressing CHL1. The secretion suggests that a signal of EMARS product was seen in the TL sample.
血清cEVにおけるCHL1のパートナー分子の同定
小腫瘍担持マウスの血清cEV中には、標識された分子の量が少ないため、血清cEVから特定のBiEVを検出することが困難な可能性がある。EML4-ALK遺伝子導入マウスの腫瘍スクリーニングに適したCHL1のBiEVパートナーの候補を、TL及びTSの両方のEMARS産物を用いて
、質量分析(MS)によるプロテオミクスによって調査し、4種の候補分子(CD5L、PZP、THBS1及びSLC4A1)を選定した。
Identification of CHL1 Partner Molecules in Serum cEV Due to the low amount of labeled molecules in serum cEVs of small tumor-carrying mice, it may be difficult to detect specific BiEVs from serum cEVs. Candidates for CHL1 BiEV partners suitable for tumor screening in EML4-ALK transgenic mice were investigated by mass spectrometric (MS) proteomics using both TL and TS EMARS products and four candidate molecules (CD5L). , PZP, THBS1 and SLC4A1) were selected.
抗CD5L抗体を用いたウェスタンブロット解析から、TLサンプルでは約60 kDaに中程度のバンドが認められたが、他の2種のサンプルには明確なバンドは検出されなかった。スト
リッピングを行った後、同じメンブレンを抗PZP抗体で再染色した。WTサンプルにおいてPZP(約130 kDa)が高濃度で検出された。この結果は、一部のCHL1 BiEVはWTマウス由来の血清EVにおいても発現していることを示唆している。
Western blot analysis with anti-CD5L antibody showed a moderate band at about 60 kDa in the TL sample, but no clear band in the other two samples. After stripping, the same membrane was restained with anti-PZP antibody. High concentrations of PZP (approximately 130 kDa) were detected in the WT sample. This result suggests that some CHL1 BiEVs are also expressed in serum EVs derived from WT mice.
対照的に、抗SLC4A1抗体及び抗トロンボスポンジン1(THBS1)抗体を用いたウェスタンブロット解析では、TL及びTSサンプルの両方に中程度のバンドが確認されたが、WTサンプルには認められなかった(図2D)。したがって、血清EV中のCHL1-SLC4A1 BiEVの測定がEML4-ALK遺伝子導入マウスのcEVスクリーニングにおける有効な指標となり得ると考えられ
た。
In contrast, Western blot analysis with anti-SLC4A1 and anti-thrombospondin 1 (THBS1) antibodies confirmed moderate bands in both TL and TS samples, but not in WT samples. (Fig. 2D). Therefore, it was considered that the measurement of CHL1-SLC4A1 BiEV in serum EV could be an effective index in cEV screening of EML4-ALK gene-introduced mice.
サンドイッチELISAを用いたCHL1-SLC4A1 BiEVの測定
血清のCHL1量は、ある程度大きな肺癌を担持したEML4-ALK遺伝子導入マウスの重要な指標となることが同定されている(非特許文献1)。しかしながら、これは、小さな癌腫瘍を担持したEML4-ALK遺伝子導入マウスの指標とするには不十分であった。
血清EV中のCHL1-SLC4A1 BiEVが、EML4-ALK遺伝子導入マウス、特にTSマウスで上昇しているか否かを確認するために、サンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)を用いて、CHL1-SL
C4A1 BiEVの量を示すフルオレセイン標識SLC4A1の測定を行った。
Measurement of CHL1-SLC4A1 BiEV using sandwich ELISA The amount of CHL1 in serum has been identified as an important indicator for EML4-ALK transgenic mice carrying moderately large lung cancer (Non-Patent Document 1). However, this was insufficient to be an indicator of EML4-ALK transgenic mice carrying small cancer tumors.
CHL1-SL using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine if CHL1-SLC4A1 BiEV in serum EV is elevated in EML4-ALK transgenic mice, especially TS mice.
Measurements of fluorescein-labeled SLC4A1 indicating the amount of C4A1 BiEV were performed.
WTマウス及びEML4-ALK遺伝子導入マウスのBiEV指標値(SLC4A1)を図3Aにまとめた。小腫瘍担持マウスの血清中CHL1量はWTマウスと比較して有意差は見られなかったが、EML4-ALK遺伝子導入マウスのBiEV指標値(SLC4A1)は全体としてWTマウスよりも高くなる傾向にあった(図3A)。WTマウスのBiEV指標値(SLC4A1)の平均値は0.1457(標準偏差[SD] = 0.0679)であり、EML4-ALK遺伝子導入マウスの平均値は0.3162(SD = 0.1979)であった。p値の8.9 × 10-3は、WTマウス及びEML4-ALK遺伝子導入マウス間のCHL1-SLC4A1 BiEV量の差が有意であることを示している(図3B)。各BiEV指標値(SLC4A1)のROC曲線に基づく
曲線下面積(AUC)及びカットオフ値は、それぞれ0.782及び0.238と算出された(図3C)
。また、Spearmanの順位相関係数から、BiEV指標値(SLC4A1)と腫瘍体積との間に相関が認められた(図3D)。これは、CHL1-SLC4A1 BiEVを発現するcEVは、小腫瘍状態ではさほ
ど多く分泌されず、その結果として、腫瘍サイズにある程度比例する相関関係が見られたことを示唆している。EML4-ALK遺伝子導入マウスにおいてCHL1-SLC4A1 BiEVが増加したこととは対照的に、EML4-ALK遺伝子導入マウスの血清EV全体(whole-serum EV)のSLC4A1タンパク質発現量の平均は低下していることが認められた(図3E)。
The BiEV index values (SLC4A1) of WT mice and EML4-ALK gene-introduced mice are summarized in Fig. 3A. The serum CHL1 level of small tumor-carrying mice was not significantly different from that of WT mice, but the BiEV index value (SLC4A1) of EML4-ALK gene-introduced mice tended to be higher than that of WT mice as a whole. (Fig. 3A). The mean value of the BiEV index value (SLC4A1) of WT mice was 0.1457 (standard deviation [SD] = 0.0679), and the mean value of EML4-ALK transgenic mice was 0.3162 (SD = 0.1979). A p-value of 8.9 × 10 -3 indicates that the difference in the amount of CHL1-SLC4A1 BiEV between WT mice and EML4-ALK transgenic mice is significant (Fig. 3B). The area under the curve (AUC) and cutoff value based on the ROC curve of each BiEV index value (SLC4A1) were calculated to be 0.782 and 0.238, respectively (Fig. 3C).
.. In addition, Spearman's rank correlation coefficient showed a correlation between the BiEV index value (SLC4A1) and the tumor volume (Fig. 3D). This suggests that cEV expressing CHL1-SLC4A1 BiEV was not secreted so much in the small tumor state, and as a result, a correlation was found that was somewhat proportional to the tumor size. In contrast to the increase in CHL1-SLC4A1 BiEV in EML4-ALK transgenic mice, the average SLC4A1 protein expression in whole-serum EV of EML4-ALK transgenic mice was decreased. Was observed (Fig. 3E).
肺がん患者におけるBiEV解析及び測定
BiEVがマウスの血清EVのスクリーニングに有用であることが判明したため、健康な人及び肺がん(LC)患者から得た血清EVについても同様の解析を行った。モデルマウス実験と同様に、健康な人(H)及びLC患者から分取した血清を等しい比率で混合し、次の実験に
使用した。CHL1 EMARSプローブを使用して得られたEMARS産物が両方の血清EV中で検出さ
れた(図4A)。モデルマウス実験で同定されたフルオレセイン標識SLC4A1をヒトLCサンプル中でも検出することができるか否かを確かめるために、H及びLCから得られたEMARS産物についてSLC4A1のウェスタンブロット解析及びELISAによる定量化を行った。ヒトのサン
プルにおいて好適なBiEVの同定が可能であることを示唆していた。
BiEV analysis and measurement in lung cancer patients
Since BiEV was found to be useful for screening serum EV in mice, similar analysis was performed on serum EV obtained from healthy individuals and lung cancer (LC) patients. As in the model mouse experiment, sera collected from healthy individuals (H) and LC patients were mixed in equal proportions and used in the next experiment. EMARS products obtained using the CHL1 EMARS probe were detected in both serum EVs (Fig. 4A). To confirm whether the fluorescein-labeled SLC4A1 identified in the model mouse experiment can be detected in human LC samples, Western blot analysis and ELISA quantification of SLC4A1 were performed on the EMARS products obtained from H and LC. rice field. It was suggested that suitable BiEV could be identified in human samples.
肺がん患者で増加するCHL1のBiEVパートナーの候補をMSプロテオミクスにより同定した。結果を表1に示す。 MS proteomics identified potential BiEV partners for CHL1 in patients with lung cancer. The results are shown in Table 1.
免疫沈降及びウェスタンブロット解析から、ケラチノサイトの分化に関与するカスパーゼファミリーのメンバーであるCaspase-14(J Cell Biol 180(3):451-8. 2008)がLC由来の血清EVにおけるCHL1 BiEV のパートナーとして多量に検出されたことが判明した(図4B:二量体及び単量体)。LK2 LC細胞から分泌されたEVのEMARS産物においてもフルオレセ
イン標識Caspase-14が検出されており、CHL1-Caspase-14 BiEVが、LC細胞から分泌されたEVの典型的な指標となることを示唆している。これに従い、血清EV中のCHL1-Caspase-14 BiEVの測定が、LC中のcEVスクリーニングに好適な指標となると考えられた。
From immunoprecipitation and Western blot analysis, Caspase-14 (J Cell Biol 180 (3): 451-8. 2008), a member of the caspase family involved in keratinocyte differentiation, is the partner of CHL1 BiEV in LC-derived serum EV. It was found to be detected in large quantities (Fig. 4B: dimer and monomer). Fluorescein-labeled Caspase-14 was also detected in the EMARS product of EV secreted from LK2 LC cells, suggesting that CHL1-Caspase-14 BiEV is a typical indicator of EV secreted from LC cells. ing. Therefore, the measurement of CHL1-Caspase-14 BiEV in serum EV was considered to be a suitable index for cEV screening in LC.
EMARS産物中のフルオレセイン標識Caspase-14をサンドイッチELISAを使用して測定するために、組換えCaspase-14を用いて、フルオレセイン標識されたCaspase-14の基準物質を作製した。Caspase-14のELISAシステムはフルオレセイン標識されたCaspase-14基準物質
を高感度で測定するのに適しており、検量線の相関係数は0.9878であった。ELISAの各実
験結果を異なるプレート間で比較するために、フルオレセイン標識されたCaspase-14基準物質の測定値(ng/mL)に基づきBiEV指標値(Caspase-14)を設定した。
To measure fluorescein-labeled Caspase-14 in EMARS products using sandwich ELISA, recombinant Caspase-14 was used to make a reference material for fluorescein-labeled Caspase-14. The Caspase-14 ELISA system was suitable for sensitive measurement of fluorescein-labeled Caspase-14 reference material, with a calibration curve correlation coefficient of 0.9878. BiEV index values (Caspase-14) were set based on measurements of fluorescein-labeled Caspase-14 reference material (ng / mL) to compare the results of each ELISA experiment between different plates.
H及びLC血清のEVから得られたBiEV指標値(Caspase-14)を図4Cにまとめた。LCのEVは
全体としてHのEVよりも高くなる傾向が見られた。HのEVのBiEV指標値(Caspase-14)の平均値は1.065(SD = 1.168)であり、LCのEVの平均値は3.707(SD = 2.829)であった。p
値が0.019であったことは、HのEV及びLCのEV間のCHL1- Caspase-14 BiEV量の差が有意で
あったことを示している(図4D)。各BiEV指標値のROC曲線に基づき求められたAUC及びカットオフ値はそれぞれ0.811及び1.889であった(図4E)。H及びLC血清EV間で、血清EV全
体のCaspase-14分子の総タンパク質発現量の増加は認められなかった(図4F)。
BiEV index values (Caspase-14) obtained from EVs of H and LC sera are summarized in Fig. 4C. The EV of LC tended to be higher than the EV of H as a whole. The average value of the BiEV index value (Caspase-14) of EV of H was 1.065 (SD = 1.168), and the average value of EV of LC was 3.707 (SD = 2.829). p
The value of 0.019 indicates that the difference in the amount of CHL1-Caspase-14 BiEV between the EV of H and the EV of LC was significant (Fig. 4D). The AUC and cutoff values obtained based on the ROC curve of each BiEV index value were 0.811 and 1.889, respectively (Fig. 4E). No increase in total protein expression of Caspase-14 molecules throughout serum EV was observed between H and LC serum EV (Fig. 4F).
以上のように、本発明の方法においてCHL1とCHL1パートナータンパク質の複合体を解析することにより肺がんを効率よく検出することができ、特に、血清EV膜におけるCHL1とCaspase-14の複合体は肺がん診断のための指標として非常に優れることが分かった。 As described above, lung cancer can be efficiently detected by analyzing the complex of CHL1 and CHL1 partner protein in the method of the present invention, and in particular, the complex of CHL1 and Caspase-14 in the serum EV membrane is used for lung cancer diagnosis. It turned out to be very good as an indicator for.
Claims (7)
、Thrombospondin 1、Desmoplakin、Lactotransferrin、14-3-3 protein sigma、Heat shock protein beta-1、Annexin A2、Calmodulin-like protein 3、Galectin-7、Desmocollin-1、Fatty acid-binding protein 5、Transgelin-2、Annexin A1、Alpha-enolase、Glutathione S-transferase P、Tubulin beta-2A chain、14-3-3 protein zeta/delta、Tubulin alpha-4A chain、Epiplakin、Polymeric immunoglobulin receptor、Tubulin alpha-1B chain、Serpin B3、Tubulin beta-4B chain、Triosephosphate isomerase、Protein S100-A14、Protein S100-A11、Zymogen granule protein 16 homolog B、Calmodulin-like
protein 5、Prelamin-A/C、Elongation factor 1-alpha 1、またはHeat shock cognate 71 kDa proteinである、請求項1に記載の肺がんの検査方法。 CHL1 partner proteins are Caspase-14, SLC4A1 (Solute Carrier Family 4 Member 1)
, Thrombospondin 1, Desmoplakin, Lactotransferrin, 14-3-3 protein sigma, Heat shock protein beta-1, Annexin A2, Calmodulin-like protein 3, Galectin-7, Desmocollin-1, Fatty acid-binding protein 5, Transgelin-2 , Annexin A1, Alpha-enolase, Glutathione S-transferase P, Tubulin beta-2A chain, 14-3-3 protein zeta / delta, Tubulin alpha-4A chain, Epiplakin, Polymeric immunoglobulin receptor, Tubulin alpha-1B chain, Serpin B3 , Tubulin beta-4B chain, Triosephosphate isomerase, Protein S100-A14, Protein S100-A11, Zymogen granule protein 16 homolog B, Calmodulin-like
The method for testing lung cancer according to claim 1, wherein the protein is protein 5, Prelamin-A / C, Elongation factor 1-alpha 1, or Heat shock cognate 71 kDa protein.
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