JP2012504401A - 抗cxcr4抗体および癌治療のためのそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ジーンバンクアクセッション番号(Genbank accession number)NP 003458 配列番号29:
MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS
で示される配列を有するケモカイン(C−X−Cモティーフ)受容体4アイソフォームb[ホモサピエンス]、
ジーンバンクアクセッション番号NP 001008540 配列番号30:
MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS
で示される配列を有するケモカイン(C−X−Cモティーフ)受容体4アイソフォームa[ホモサピエンス]、
配列番号29または30を有するこれらbまたはaアイソフォームの1つと少なくとも95%の同一性を有するその選択的転写スプライシング(alternate transcriptional splice)変異体または天然変異体、および
その天然リガンド間質細胞由来因子1(SDF−1)によって特異的に認識することができかつ好ましくは少なくとも100、150および200アミノ酸長を有するその断片
からなる群から選択される2種類のヒトCXCR4アイソフォームの1つである。
ジーンバンクアクセッション番号NP 001548 配列番号31:
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
で示される配列を有するインターロイキン8受容体β[ホモサピエンス]、
配列番号31を有するこのインターロイキン8受容体βと少なくとも95%の同一性を有するその選択的転写スプライシング変異体または天然変異体、および
IL−8によって特異的に認識することができかつ好ましくは少なくとも100、150および200アミノ酸長を有するその断片
からなる群から選択される。
a)核酸構築物、好ましくは前記CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体をコードするプラスミドのような発現ベクターにより、または
b)少なくとも1個の核酸構築物、好ましくは前記CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体のCXCR4部分をコードするプラスミドのような発現ベクターと、第二の構築物、好ましくは前記CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体のCXCR2部分をコードするプラスミドのような発現ベクターにより
前記宿主細胞を形質転換する段階を含んでなる、方法を含んでなる。
a)前記CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体を発現する本発明の組換え宿主細胞を供試化合物と接触させ、および
b)この化合物が組換え宿主細胞におけるこのCXCR4/CXCR2ヘテロ二量体複合体の活性を調節する、好ましくは阻害することができるかどうかを測定する
段階を含んでなる、前記方法も含んでなる。
i)産生した抗体をスクリーニングし、CXCR4に特異的に結合しかつCXCR4の活性化を調節することもできる抗体を選択し、
ii)段階i)で選択された抗体を試験し、CXCR4ホモ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択し、次いで、
iii)段階ii)で選択された抗体を試験し、CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択する
段階を含んでなる、前記方法に関する。
受容体CXCR4(例4参照)上、特にヒト野生型CXCR4受容体を安定的に発現するCHO−K1膜のような真核生物の形質転換した細胞膜上での競合によるリガンドSDF−1の細胞膜での特異結合、
受容体CXCR4(例5参照)上、特に野生型CXCR4受容体膜を安定的かつ構成的に発現するNIH−3T3細胞のような真核生物の形質転換した細胞膜上でのGTPγSの細胞膜での特異結合、
cAMP生成のCXCR4媒介性阻害(例7参照)、および
細胞内カルシウム貯蔵のCXCR4受容体媒介性流動化(例13参照)
を調節しようとするものである。
CDR−L1は、配列番号1または9の配列、または最適アライメント後に配列番号1または9の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、
CDR−L2は、配列番号2または10の配列、または最適アライメント後に配列番号2または10の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、および
CDR−L3は、配列番号3の配列、または最適アライメント後に配列番号3の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなる。
CDR−H1は、配列番号4、7または11の配列、または最適アライメント後に配列番号4、7または11の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、
CDR−H2は、配列番号5または12の配列、または最適アライメント後に配列番号5または12の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、および
CDR−H3は、配列番号6または8の配列、または最適アライメント後に配列番号6または8の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなる。
断片の1つは、配列番号11の配列であるCDR−H1、配列番号12の配列であるCDR−H2および配列番号6の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
CDR−L1は、配列番号40または46の配列、または最適アライメント後に配列番号40または46の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、
CDR−L2は、配列番号2または47の配列、または最適アライメント後に配列番号2または47の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、および
CDR−L3は、配列番号41の配列、または最適アライメント後に配列番号41の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなる。
CDR−H1は、配列番号42、44または48の配列、または最適アライメント後に配列番号42、44または48の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、
CDR−H2は、配列番号5または49の配列、または最適アライメント後に配列番号5または49の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなり、および
CDR−H3は、配列番号45または43の配列、または最適アライメント後に配列番号45または43の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列を含んでなる。
配列番号1の配列、または最適アライメント後に配列番号1の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号2の配列、または最適アライメント後に配列番号2の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号3の配列、または最適アライメント後に配列番号3の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L3、および
下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号4の配列、または最適アライメント後に配列番号4の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号5の配列、または最適アライメント後に配列番号5の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号6の配列、または最適アライメント後に配列番号6の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H3
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号1の配列、または最適アライメント後に配列番号1の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号2の配列、または最適アライメント後に配列番号2の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号3の配列、または最適アライメント後に配列番号3の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L3、および
下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号7の配列、または最適アライメント後に配列番号7の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号5の配列、または最適アライメント後に配列番号5の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号8の配列、または最適アライメント後に配列番号8の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H3
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号9の配列、または最適アライメント後に配列番号9の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号10の配列、または最適アライメント後に配列番号10の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号3の配列、または最適アライメント後に配列番号3の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L3、および
下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号11の配列、または最適アライメント後に配列番号11の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号12の配列、または最適アライメント後に配列番号12の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号6の配列、または最適アライメント後に配列番号6の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H3を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号1の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2、および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号7の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2、および配列番号8の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
配列番号9の配列であるCDR−L1、配列番号10の配列であるCDR−L2、および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号11の配列であるCDR−H1、配列番号12の配列であるCDR−H2および配列番号6の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
配列番号40の配列、または最適アライメント後に配列番号40の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号2の配列、または最適アライメント後に配列番号2の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号41の配列、または最適アライメント後に配列番号41の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−L3、および 下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号42の配列、または最適アライメント後に配列番号42の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号5の配列、または最適アライメント後に配列番号5の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号43の配列、または最適アライメント後に配列番号43の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR−H3
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号40の配列、または最適アライメント後に配列番号40の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号2の配列、または最適アライメント後に配列番号2の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号41の配列、または最適アライメント後に配列番号41の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L3、および
下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号44の配列、または最適アライメント後に配列番号44の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号:の配列、または最適アライメント後に配列番号5の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号45の配列、または最適アライメント後に配列番号45の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H3
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号46の配列、または最適アライメント後に配列番号46の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L1、
配列番号47の配列、または最適アライメント後に配列番号47の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L2、および
配列番号41の配列、または最適アライメント後に配列番号41の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−L3、および
下記の3種類のCDRを含んでなる重鎖:
配列番号48の配列、または最適アライメント後に配列番号48の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H1、
配列番号49の配列、または最適アライメント後に配列番号49の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H2、および
配列番号43の配列、または最適アライメント後に配列番号43の配列と少なくとも80%の同一性を有する配列のCDR−H3
を含んでなる、抗体、またはその誘導化合物または機能的断片を開示する。
配列番号40の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2、および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号44の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2、および配列番号45の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
配列番号46の配列であるCDR−L1、配列番号47の配列であるCDR−L2、および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号48の配列であるCDR−H1、配列番号49の配列であるCDR−H2、および配列番号43の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなることを特徴とする。
良好な系統発生的保存、
既知の三次元構造(例えば、結晶学、NMR分光法、または当業者に知られている任意の他の手法による)、
小サイズ、
転写後修飾が僅かまたは全くない、および/または
産生、発現および精製が容易
に適合しなければならないことが知られている(Skerra A., J. MoI. Recogn., 2000, 13:167-187)。
a)少なくとも1つの抗体CDRがグラフトしているペプチド骨格からなる化合物を、腫瘍細胞を増殖させる条件下で増殖することができるこれらの細胞を含む生物試料とインビトロで接触させ、
b)前記化合物がこれらの腫瘍細胞の増殖を阻害することができるときには、前記化合物を選択する
段階を含んでなることを特徴とし、かつ前記の少なくとも1つのグラフトしたCDRが、下記のCDR:
配列番号1、9、40、46の配列または最適アライメント後に配列番号1、9、40、46の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR、
配列番号2、10、47の配列または最適アライメント後に配列番号2、10、47の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR、
配列番号3、41の配列または最適アライメント後に配列番号3、41の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR、
配列番号4、7、11、42、44、48の配列または最適アライメント後に配列配列番号4、7、11、42、44、48の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR、
配列番号5、12、49の配列または最適アライメント後に配列番号5、12、49の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR、および
配列番号6、8、43、45の配列または最適アライメント後に配列番号6、8、43、45の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDR
から選択されることを特徴とする。
本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA、
a)で定義した核酸に相補性の核酸、
配列番号15〜26または配列番号52〜61の核酸配列または最適アライメント後に配列番号15〜26または配列番号52〜61の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列のCDRの少なくとも1個と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18個のヌクレオチドの核酸、および
少なくとも配列番号27または配列番号62または配列番号68または70の核酸配列の軽鎖および/または配列番号28または配列番号63または配列番号69または71の核酸配列の重鎖または最適アライメント後に配列番号27および/または28または配列番号62および/または63または配列番号68および/または69または配列番号70および/または71の配列と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%および98%の同一性を有する配列と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18個のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする、単離核酸に関する。
a)本発明による宿主細胞の培地および適当な培養条件での培養、および
b)このようにして培養培地または前記培養細胞から産生した前記抗体、またはその機能的断片の1つの回収
の段階を含んでなることを特徴とする、前記方法に関する。
a)生物試料を本発明による抗体、またはその誘導化合物または機能的断片と接触させ、
b)形成される可能性がある抗原−抗体複合体を明らかにする
段階を含んでなる、前記方法に用いることができる。
a)本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体、
b)場合によっては、免疫反応に好都合な媒体を構成する試薬、
c)場合によっては、免疫反応によって産生される抗原−抗体複合体を明らかにする試薬
を含んでなる、上記方法の実施のためのキットまたは付属品も含んでなる。
Q−PCR分析:
様々な癌細胞系におけるCXCR4およびCXCR2の相対発現を定量するため、リアルタイムRT−PCRを用いた。
フォワードプライマー:5’−GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG−3’(配列番号32)、
リバースプライマー:5’−AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA−3’(配列番号33)、
プローブ:5−(FAM)−TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA−(TAMRA)−3’(配列番号34)
であった。
フォワードプライマー:5’−CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC−3’(配列番号35)、
リバースプライマー:5’−CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG−3’(配列番号36)
であった。
フォワードプライマー:5’−GTGGTCATTATCTATGCCCTGG−3’(配列番号37)、
リバースプライマー:5’−CGACCCTGCTGTATAAGATGAC−3’(配列番号38)、
プローブ:5−(FAM)−TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA−(TAMRA)−3’(配列番号39)
であった。
相対的遺伝子発現=(1+E遺伝子)−ΔCt(1)/(1+ERPL0)−ΔCt(2)
E遺伝子=定量した遺伝子のプライマー/プローブを用いるPCR効率
ERPL0=RPL0プライマー/プローブを用いるPCR効率
Ct=サイクル閾値
ΔCt(l)=Ct遺伝子(供試細胞系)−Ct遺伝子(参照細胞系)
ΔCt(2)=CtRPL0(供試細胞系)−CtRPL0(参照細胞系)
を用いて計算した。
MDA−MB−231、PC3およびU937癌細胞系を透過性化した後、抗−CXCR4モノクローナル抗体[44717(R&D Systems)対そのアイソタイプコントロールIgG2b(SIGMA)]10μg/mlまたは抗−CXCR2モノクローナル抗体(抗h−CXCR2、クローン48311,R&D Systems,Mab331対そのアイソタイプコントロールIgG2a)10μg/mlとインキュベーションした。細胞を、次に1%BSA/PBS/0.01%NaN3で洗浄した。次いで、Alexa標識した二次抗体を細胞に加え、4°Cで20分間インキュベーションした。細胞を、次に2回再度洗浄した。2回目の洗浄の後、FACS分析を行った。これらの結合研究の結果を、図2に示す。従って、MDA−MB−231、PC3およびU937のような腫瘍細胞は、CXCR4およびCXCR2タンパク質を両方とも発現した。
CXCR4に対するモノクローナル抗体を産生させるため、Balb/cマウスを、組換えNIH3T3−CXCR4細胞および/またはCXCR4細胞外N末端およびループに対応するペプチドで免疫した。最初の免疫時に6〜16週齢のマウスを、完全フロイントアジュバント中の抗原で1回皮下(s.c.)免疫した後、不完全フロイントのアジュバント中の抗原で2〜6回皮下免疫した。免疫応答を、後眼窩採血によって観察した。血清をELISAによってスクリーニングし(後記)、高い力価の抗−CXCR4抗体を有するマウスを用いて融合した。マウスに抗原を静脈内投与で追加免疫し、2日後に屠殺して、脾臓を取り出した。
抗−CXCR4抗体を産生するマウスを選択するため、免疫化マウスの血清をELISAによって試験した。簡単に説明すれば、マイクロタイタープレートを、5μg当量ペプチド/mlでBSAに接合した精製した[1−41]N末端ペプチドでコーティングし、100μl/ウェルを4°Cで一晩インキュベーションした後、250μl/ウェルの0.5%ゼラチン/PBSでブロックした。CXCR4を免疫したマウスからの血漿の希釈物をそれぞれのウェルに加え、37°Cで2時間インキュベーションした。プレートをPBSで洗浄した後、HRP(Jackson Laboratories)に接合したヤギ抗−マウスIgG抗体と37°Cにて1時間インキュベーションした。洗浄後、プレートをTMB基質で展開し、100μl/ウェルの1MH2SO4を加えて5分後に反応を停止した。最高力価の抗−CXCR4抗体を発現したマウスを用いて、抗体を産生した。
最高力価の抗−CXCR4抗体を発現したBalb/cマウスから単離したマウス脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞系Sp2/OにPEGを用いて融合した。細胞を、約1x105/ウェルでマイクロタイタープレートにて培養した後、ウルトラ(ultra)培養培地+2mML−グルタミン+1mMピルビン酸ナトリウム+1xHATを含む選択培地で2週間培養した。次いで、ウェルを抗−CXCR4モノクローナルIgG抗体についてELISAによってスクリーニングした。次に、抗体を分泌するハイブリドーマを、限定希釈によって少なくとも2回サブクローニングし、インビトロで培養し、抗体を産生して更に分析した。
この実験では、抗−CXCR4Mab 414H5および515H7のヒトCXCR4に対する特異的結合を、FACS分析によって検討した。
この分析により、414H5および515H7 Mabの放射性標識した[125I]SDF−1のヒトCXCR4受容体へのオルソステリックまたはアロステリック結合部位のいずれかにおける結合について競合する能力を評価することができる。
この機能分析により、野生型ヒトCXCR4受容体を介するGタンパク質活性化およびCXCR4リガンドおよび414H5および515H7mAbによるその調節を観察することができる。
KB=[拮抗剤濃度]/{(EC50’/EC50)−l}
(式中、EC50およびEC50’は、それぞれmAbの非存在下および存在下でのSDF−1の効能である)
を適用することによって計算した。
この機能分析により、CXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ−二量体形成並びにβ−アレスチン−2シグナル伝達タンパク質の動員のレベルでCXCR4受容体に結合するSDF−1および/または414H5および515H7Mabで誘導されるコンホメーション変化を評価することができる。
(式中、同一実験条件下でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞については、Cf=(発光530nm)/(発光485nm)である)。この式の簡略化は、BRET比は、2つのBRETパートナーが存在するときに得られる比530/485nmに対応し、Rlucに融合したパートナーのみが分析で存在するときに同じ実験条件下で得られる比530/485nmによって補正されることを示している。判読しやすくするため、結果はミリBRET単位(mBU)で表され、mBUは、BRET比に1000を乗じたものに相当する。
この機能分析は、阻害性Gi/oタンパク質を介するアデニレートシクラーゼのレベルでのCXCR4受容体シグナル伝達を観察する目的で行った。
この機能分析により、構成的活性変異体(CAM)Asn119SerCXCR4受容体を介するGタンパク質活性化を観察することができる(Zhang et al, 2002参照)。この高感度の分析により、固有活性に基づいてCXCR4リガンドを識別することができる(部分作動薬、サイレント拮抗薬または逆作動薬)。Zhangと協同研究者らによって以前に報告されているように、AMD3100またはT140のようなCXCR4リガンドは、CAM CXCR4受容体でそれぞれ部分作動薬および逆作動薬として作用した。このクラスの分子はCXCR4の活性および不活性状態のいずれについても同様の親和性を示さなければならないので、サイレント拮抗薬の同定は困難なことがある(Wurch et al., 1999)。
ATCCからのHeLa細胞を、EMEM培地(Lonza Corporation. Venders.ベルギー)、10%FCS(SIGMA Corporation,St Louis,米国)、1%L−グルタミン(Invitrogen Corporation,スコットランド.英国)、2%重炭酸ナトリウム7.5%溶液(Invitrogen Corporation.スコットランド.英国)中で常法により培養した。細胞を、増殖分析3日前に継代し、コンフルエントになるようにした。
HeLa細胞を、96−ウェル組織培養プレートに200μlの無血清培地(EMEM培地+1%L−グルタミン、2%重炭酸ナトリウム7.5%溶液)中1x104細胞/ウェルの密度で播種した。播種から24時間後、SDF−1の適当な希釈液をHeLa細胞に加えた。全部で76時間の培養後、細胞に0.25μCiの[3H]チミジン(Amersham Biosciences AB,Uppsala,スウェーデン)を16時間加えた。DNAに組込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
HeLa細胞を、96−ウェル組織培養プレートに200μlの無血清培地(EMEM培地+1% L−グルタミン、2%重炭酸ナトリウム7.5%溶液)中1x104細胞/ウェルの密度で播種した。播種の24時間後に、抗−CXCR4Mab414H5の適当な希釈液である希釈培地を、SDF−1の存在下または非存在下にて最終濃度200ng/ml(25nM)でHeLa細胞に3回加えた。全部で76時間の培養の後、細胞に0.25μCiの[3H]チミジン(Amersham Biosciences AB,Uppsala,スウェーデン)を16時間加えた。DNAに組込まれた[3H]チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
Fa=[1−[Mab+SDF−1とインキュベーションした細胞の平均cpm/希釈培地+SDF−1とインキュベーションした細胞の平均cpm)]x100
を用いて計算した影響比(affected fraction;Fa)として表した。
遊走過程に対する抗−CXCR4モノクローナル抗体414H5および515H7の阻害効果を評価するため、2%FCSを補足したRPMI1640培地中の100 000個のU−937細胞を、ウェルの下室にSDF−1の存在下または非存在下にてかつ上室にMab 414H5および515H7の有りまたはなしで、遊走チャンバー(8−μm細孔径を有する24ウェルプレート)の上室に播種した。この試験では、マウスIgG2aおよびIgG2Bをアイソタイプコントロールとして導入した。播種の2時間後に、遊走細胞を計数した。414H5について図10Aおよび515H7について図10Bに示した結果は、予想したように、SDF−1がU−937細胞遊走の有意な増加を誘導することができることを示していた。IgG2アイソタイプコントロールとインキュベーションした細胞には、効果は全く見られなかった。対照的に、414H5および515H7 Mabとインキュベーションした細胞については、SDF−1誘導U937細胞遊走の有意かつ再現性のある減少が観察された:414H5Mabでは50%であり、515H7Mabでは80%を上回った。
これらの実験の目的は、Nod/ScidマウスでのMDB−MB−231異種移植片の増殖を阻害する抗−CXCR4Mab 414H5および515H7の能力を評価することであった。
ATCCからのU937細胞を、RPMI1640培地、10%FCS、1%L−グルタミンで培養した。細胞を、移植2日前に継代し、対数増殖期となるようにした。107個のU937細胞を、雌のNOD/SCIDマウスにi.p.投与した。移植から2日後に、マウスに414H5mAb/マウス 2mg負荷用量を皮下注射(s.c.)処理した後、抗体/マウス1mgを週2回処理した。以前の検討では、PBSを投与したマウスとマウスIgGアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には、生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはPBS注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
この機能分析は、小胞体からの細胞内貯蔵からカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激によるCXCR4受容体シグナル伝達の観察を目的として行った。
この実験の目的は、Nod/ScidマウスでのKARPAS299異種移植片の増殖を阻害する抗−CXCR4Mab 414H5および515H7の能力を評価することであった。
ATCCからのU937細胞を、RPMI1640培地、10%FCS、1%L−グルタミンで培養した。細胞を、移植2日前に継代し、対数増殖期となるようにした。107個のU937細胞を、雌のNOD/SCIDマウスにi.p.投与した。移植から2日後に、マウスに515H7Mab/マウス2mgの負荷用量をs.c.投与した後、抗体/マウス1mgを週2回投与した。以前の検討では、PBSを投与したマウスとマウスIgGアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはPBS注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
この実験の目的は、Nod/ScidマウスにおけるKARPAS299異種移植片の増殖を阻害する抗−CXCR4Mab515H7の能力を評価することである。
マウス414H5および515H7Mabのキメラ型を、下記のようにして設計した:それらは、ヒトCκおよびIgG1定常ドメインに遺伝学的に融合した目的のマウス抗体の軽および重鎖可変ドメインに相当する。すべての組換えMabは、pCEP4発現ベクターを有するHEK293/EBNAシステム(InVitrogen,米国)を用いることによって一過性トランスフェクションによって産生した。
この実験では、ヒトCXCR4への抗−CXCR4キメラMab c414H5およびc515H7の特異的結合を、FACS分析によって検討した。
この分析により、放射能標識[125I]SDF−1のヒトCXCR4受容体のオルソステリックまたはアロステリック結合部位での結合を競合するマウスMab m414H5、m515H7およびキメラMab c414H5、c515H7の能力を評価することができる。
この機能分析により、野生型ヒトCXCR4受容体を介するGタンパク質活性化および抗−CXCR4マウスMab m414H5、m515H7およびキメラMab c414H5、c515H7によるその調節を観察することができる。
この機能分析により、CXCR4ホモ二量体およびCXCR2/CXCR4ヘテロ−二量体形成並びにβ−アレスチン−2シグナル伝達タンパク質の動員のレベルでCXCR4受容体に結合するSDF−1および/またはm414H5、m515H7マウスMabおよびc414H5、およびc515H7キメラMabで誘導されるコンホメーション変化を評価することができる。
(式中、同一実験条件下でRluc融合タンパク質のみを発現する細胞については、Cf=(発光530nm)/(発光485nm)である)。この式の簡略化は、BRET比は、2つのBRETパートナーが存在するときに得られる比530/485nmに対応し、Rlucに融合したパートナーのみが分析に存在するときに同じ実験条件下で得られる比530/485nmによって補正されることを示している。判読しやすくするため、結果はミリBRET単位(mBU)で表され、mBUは、BRET比に1000を乗じたものに相当する。
この機能分析は、小胞体からの細胞内貯蔵からカルシウム遊離を誘導するホスホリパーゼC経路の刺激によるCXCR4受容体シグナル伝達の観察を目的として行った。
遊走工程に対する抗−CXCR4Mabm414H5、m515H7、c414H5およびc515H7の阻害効果を評価するため、2%FCSを補足したRPMI1640培地中の100 000 U−937細胞を、ウェルの下室にSDF−1の存在下または非存在下にて、かつ上室にMabc414H5、m414H5、c515H7およびm515H7の有りまたはなしで、遊走チャンバー(8−μm細孔径を有する24ウェルプレート)の上室に播種した。この試験では、マウスIgG2aおよびIgG2Bをアイソタイプコントロールとして導入した。播種の2時間後に、遊走細胞を計数した。図22A(c414H5対m414H5)および図22B(c515H7対m515H7)に示した結果は、予想したように、SDF−1がU−937細胞遊走の有意な増加を誘導することができることを示していた。細胞をIgG2アイソタイプコントロールとインキュベーションしたときには、効果は全く見られなかった。対照的に、c414H5、m414H5、c515H7およびm515H7Mabとインキュベーションした細胞については、SDF−1−誘導U937細胞遊走の有意かつ再現性のある減少が観察され、c414H5およびm414H5Mabでは50%であり、c515H7およびm515H7Mabでは80%を上回った。
ATCCからのU937細胞を、RPMI1640培地、10%FCS、1%L−グルタミンで培養した。細胞を、移植2日前に継代し、対数増殖期となるようにした。107個のU937細胞を、雌のNOD/SCIDマウスにi.p.投与した。移植から2日後に、マウスにc414H5またはc515H7Mab/マウス 2mgの負荷用量をs.c.投与した後、抗体/マウス1mgを週2回投与した。以前の検討では、PBSを投与したマウスと、マウスIgGアイソタイプコントロールを投与したマウスとの間には生存率の差は見られなかったことが示されているので、コントロールマウスにはPBS注射液を投与した。マウスの生存は、毎日観察した。
Claims (39)
- CXCR4の活性化を阻害することができる抗CXCR4抗体、またはその機能的断片または誘導体の選択方法であって、
i)産生した抗体をスクリーニングし、CXCR4に特異的に結合しかつCXCR4の活性化を調節することができる抗体を選択し、
ii)段階i)で選択された抗体を試験し、CXCR4ホモ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択し、次いで、
iii)段階ii)で選択された抗体を試験し、CXCR4/CXCR2ヘテロ二量体にコンホメーション変化を誘導することができる抗体を選択する
段階を含んでなる、方法。 - 段階ii)が、CXCR4−RLuc/CXCR4−YFPを両方とも発現する細胞上でBRET分析によって抗体を評価し、BRETシグナルの少なくとも40%を阻害することができる抗体を選択することからなる、請求項1に記載の方法。
- 段階iii)が、CXCR4−RLuc/CXCR2−YFPを両方とも発現する細胞上でBRET分析によって抗体を評価し、BRETシグナルの少なくとも40%を阻害することができる抗体を選択することからなる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって得ることができる単離抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- モノクローナル抗体からなる、請求項4に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 少なくとも配列番号1、2、3、4、5または6を含んでなる配列のCDRから選択される少なくとも1個のCDRを含んでなる、請求項4に記載の単離抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号1の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号9の配列であるCDR−L1、配列番号10の配列であるCDR−L2および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号7の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2および配列番号8の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号11の配列であるCDR−H1、配列番号12の配列であるCDR−H2および配列番号6の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号1の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号7の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2および配列番号8の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。 - 配列番号9の配列であるCDR−L1、配列番号10の配列であるCDR−L2および配列番号3の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号11の配列であるCDR−H1、配列番号12の配列であるCDR−H2および配列番号6の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。 - 配列番号13のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号14のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項6に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 少なくとも配列番号40、2、41、42、5または43を含んでなる配列のCDRから選択される少なくとも1個のCDRを含んでなる、請求項4に記載の単離抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号40の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号46の配列であるCDR−L1、配列番号47の配列であるCDR−L2および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号44の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2および配列番号45の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号48の配列であるCDR−H1、配列番号49の配列であるCDR−H2および配列番号43の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号40の配列であるCDR−L1、配列番号2の配列であるCDR−L2および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号44の配列であるCDR−H1、配列番号5の配列であるCDR−H2および配列番号45の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなる請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。 - 配列番号46の配列であるCDR−L1、配列番号47の配列であるCDR−L2および配列番号41の配列であるCDR−L3を含んでなる軽鎖、および
配列番号48の配列であるCDR−H1、配列番号49の配列であるCDR−H2および配列番号43の配列であるCDR−H3を含んでなる重鎖
を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。 - 配列番号50のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号51のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 2007年10月22日にCNCM、Pasteur Institute、パリにI−3860の番号で寄託されたまたは2008年6月25日にCNCM、Pasteur Institute、パリにI−4019の番号で寄託されたハイブリドーマから選択される、マウスハイブリドーマ。
- 請求項22に記載のハイブリドーマによって分泌される、抗体。
- キメラ抗体からなる、請求項6または14に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号64のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号65のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項6および24に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 配列番号66のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなり、かつ配列番号67のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列を含んでなる、請求項14および24に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 請求項4〜21および23〜26のいずれか一項に記載の抗体またはその誘導化合物または機能的断片をコードする核酸、DNAまたはRNA、
a)に記載の核酸に相補的な核酸、
配列番号15〜26または配列番号52〜61の核酸配列のCDRの少なくとも1個と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18個のヌクレオチドの核酸、および
少なくとも配列番号27または配列番号62または配列番号68または70の核酸配列の軽鎖および/または配列番号28または配列番号63または配列番号69または71の核酸配列の重鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも18個のヌクレオチドの核酸
から選択される、単離核酸。 - 請求項27に記載の核酸から構成される、ベクター。
- 請求項28に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
- 請求項29に記載のベクターによって形質転換した細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
- 請求項4〜21および23〜26のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片の産生方法であって、
請求項29に記載の宿主細胞の培地および適当な培養条件での培養、および
培地からまたは前記培養細胞から産生した前記抗体、またはその機能的断片の1つの回収
の段階を含んでなる、前記方法。 - 薬剤として使用するための、請求項4〜21および23〜26のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片。
- 請求項4〜21、23〜26および32のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片からなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。
- 同時、個別または拡張手法で使用する配合物としてCXCR4に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を更に含んでなる、請求項33に記載の組成物。
- 同時、個別または拡張手法で使用する配合または接合生成物として細胞毒性/細胞増殖抑制剤、細胞毒素および/または放射性同位体を更に含んでなる、請求項33または34に記載の組成物。
- 薬剤として使用するための、請求項33〜35のいずれか一項に記載の組成物。
- 細胞におけるCXCR4活性を調節する薬剤としての、請求項4〜21、23〜26および32のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、および/または請求項33〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 癌の予防または治療のための、請求項4〜21、23〜26および32のいずれか一項に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、および/または請求項33〜36のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌から選択される癌である、請求項38に記載の抗体、またはその誘導化合物または機能的断片、および/または組成物。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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