KR101667149B1 - 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법 - Google Patents

표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 핵산 증폭을 위하여 온도를 변화시킬 필요가 없고, 외부의 동력 공급이 없어도 표적 단백질 또는 표적 펩타이드를 검출할 수 있다. 따라서 복잡한 장비를 수반할 필요가 없으며, 간단하고 저렴하게 제조가 가능하고, 조작이 간편하며, 휴대가 용이하다. 또한 다양한 단백질의 검출에 이용할 수 있고, 2 이상의 단백질을 동시에 검출하는데 이용할 수 있어, 프리온 등 사회적으로 문제가 되는 단백질의 검출, 또는 생체 시료 내 암특이 항원, 항체, 인터페론, 성장인자 등의 검출에도 널리 이용할 수 있다. 따라서 현장 진단에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법{Microfluidic device for detecting target protein or target peptide, method for preparing the same, and method for detecting target protein or target peptide using the same}
본 발명은 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법에 관한 것이다.
펩타이드(peptide)란 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결된 것을 지칭하며, 1개, 또는 2개 이상의 펩타이드가 거대한 분자(macromolecule)를 이룬 것을 단백질(protein)이라고 한다. 단백질과 펩타이드는 유기체를 구성하고 생물학적 반응을 촉매하는 등 생물학적으로 매우 다양한 중요한 역할을 수행한다.
단백질 또는 펩타이드를 검출하기 위한 다양한 방법들이 연구, 개발되어 왔는데, 그 중의 하나가 앱타머(aptamer)이다. 앱타머란 특정 표적물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 갖는 단일가닥 핵산 구조체로서, 특정 표적물질을 검출하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 앱타머는 약 20 ~ 26 nt 정도의 분자로서 길이가 짧고 변형이 용이하며 안정성이 매우 높은 장점이 있다. 다양한 표적물질에 대한 앱타머가 개발되어 있으며, 단백질 및 펩타이드를 표적물질로 하는 앱타머들도 다수 개발되어 있다. 예를 들어, 등록번호 10-1351647호는 심근을 수축시키는 역할을 하는 단백질로서, 급성심혈관질환의 바이오마커로 알려진 단백질인 트로포닌 Ⅰ에 특이적으로 결합하는 앱타머를 개시하고 있다.
미세 유동 장치(microfluidic device)란 기판 상에서 미세유체 유로(microfluidif channel)를 통해 각 구성이 연결되어, 시료 용액을 주입하면 검출 신호를 얻을 때까지 필요한 전 공정이 자동화되어 있는 장치를 말한다. 적은 양의 시료에서도 검출이 가능하며, 시약을 적게 사용하고, 전 공정이 자동화되어 있어 편리하다는 장점이 있다.
공개번호 10-2014-0032094호는 앱타머와 결합될 수 있는 미세 유동 장치를 개시하고 있다. 그러나 상기 문헌에 공개된 미세 유동 장치는 2층 구조이고 유로의 각도를 조절하여 시료를 흐르게 하므로 제조 공정과 사용 방법이 복잡하다. 또한 시료를 주입하기 위해 펌프를 이용하므로 외부에서 동력을 공급해야 하고, 한 번에 한가지 물질만을 검출할 수 있다.
국내등록특허 제10-1351647호(발명의 명칭: 인간 심근 트로포닌 Ⅰ에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머) 국내공개특허 제10-2014-0032094호(발명의 명칭: 표적 물질 포획이 용이한 미세유동 장치 및 상기 미세유동 장치를 이용한 표적 물질 분리 방법)
본 발명은 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은
기판;
상기 기판 상에 형성된 시료 용액이 외부로부터 유입되는 유입구;
상기 유입구와 연결되어 유입된 시료 용액을 수용하는 제 1 유로;
상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로;
상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치로서,
상기 제 2 유로 표면은 코팅되어 있고;
상기 코팅 상에 프라이머가 고정되고;
상기 고정된 프라이머에는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트가 결합되어 있으며,
상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합부, 상기 프라이머 결합부의 일 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분, 및 상기 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 다른 부분을 포함하는,
표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 제 2 유로는 1 내지 20개일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 제 2 유로는 2 내지 20개이며, 제 1 유로의 말단에서 각각의 제 2 유로가 분지되고, 각각의 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 서로 같거나 다른 단백질에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 코팅은 도파민, 5-하이드록시도파민 염산, 노르에피네프린, 에피네프린, 파이로갈롤아민, DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨, 탄닌류, 파이로갈롤, 파이로카테콜, 헤파린-카테콜, 키토산-카테콜, 폴리에틸렌글리콜-카테콜, 폴리에틸렌이민-카테콜, 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜, 히알루론산-카테콜, 폴리라이신-카테콜 (polylysine-catechol), 및 폴리라이신 (polylysine)을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 프라이머는 티올, 아민, 하이드록실, 카복실, 이소티오시아네이트, NHS 에스테르, 알데히드, 에폭시드, 카보네이트, HOBt 에스테르, 글루타르알데히드, 카바메이트, 이미다졸 카바메이트, 말레이미드, 아지리딘, 설폰, 비닐설폰, 하이드라진, 페닐 아자이드, 벤조페논, 안트라퀴논, 및 디엔 기를 포함하는 군으로부터 선택된 1 이상으로 말단이 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 코팅은 5-하이드록시도파민 염산이고, 상기 프라이머는 티올 또는 아민 기로 말단이 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 프라이머 결합부는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치로 검출할 수 있는 단백질 및 펩타이드는 단백질 항원, 항체, 성장인자, 수용체, 인터페론, 효소, 암특이 항원, 프리온 및 이들의 구성 펩타이드 등이 될 수 있으며, 예를 들어 전립선 특이항원, 혈소판 유래 성장인자, 혈관 내피 성장인자, 및 인터페론-감마, 전립선 특이항원, 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관 내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), ,인터페론-감마(IFN-γ). 프로게스테론 리셉터 (Progestrerone receptor), 에스트로겐 리셉터 (estrogen receptor), 허셉틴 2 리셉터 (HER2/neu), 표피성장인자 리셉터 (EGFR), 카보닉 앤하이드레이즈 IX (carbonic anhydrase IX, CAIX), 상피세포부착분자(endothelial cell adhesion molecule, EpCAM)를 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치;
dNTP;
리가아제;
및 등온 핵산 중합효소를 포함하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 리가아제는 DNA 리가아제, 예컨대 T7 리가아제, 또는 써클리가아제™(CircLigase™)일 수 있다. 또한 상기 등온 핵산 중합효소는 phi 29 폴리머라제일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 키트는 디티오트레이톨(DTT) 또는 파이로포스파타제(pyrophosphatase)를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 키트는 염색 시약, 고염 용액(high salt solution), 또는 형광 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 제조하는 방법을 제공한다.
1) 기판, 상기 기판 상에 형성된 유입구, 상기 유입구와 연결되어 유입된 시료 용액을 수용하는 제 1 유로, 상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로, 상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
2) 상기 미세 유동 장치의 제 2 유로 표면을 코팅하는 단계;
3) 상기 코팅 상에 프라이머를 고정시키는 단계;및
4) 상기 고정된 프라이머에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 결합시키는 단계로서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합부, 상기 프라이머 결합부의 일 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분, 및 상기 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 다른 부분을 포함하는 것인, 단계.
또한 본 발명은 다음 단계를 포함하는 제1항의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 단백질 또는 표적 펩타이드를 검출하는 방법을 제공한다.
a) 제1항의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
b) 시료 용액을 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 유입구로 주입하는 단계;및
c) 상기 미세 유동 장치의 제 2 유로에 dNTP, 리가아제, 및 등온 핵산 중합효소를 첨가하는 단계.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 방법은
d) 상기 미세 유동 장치의 유입구에 염색 시약, 고염 용액 또는 형광 시약을 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산 증폭을 위하여 온도를 변화시킬 필요가 없고, 외부의 동력 공급이 없어도 표적 단백질 또는 표적 펩타이드를 검출할 수 있다. 따라서 복잡한 장비를 수반할 필요가 없으며, 간단하고 저렴하게 제조가 가능하고, 조작이 간편하며, 휴대가 용이하다. 또한 다양한 단백질의 검출에 이용할 수 있고, 2 이상의 단백질을 동시에 검출하는데 이용할 수 있어, 프리온 등 사회적으로 문제가 되는 단백질의 검출, 또는 생체 시료 내 암 관련 항원, 항체, 인터페론, 성장인자 등의 검출에도 널리 이용할 수 있다. 따라서 현장 진단에 매우 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 평면도(좌) 및 사시도(우)이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
100: 기판
101: 유입구
102: 제1유로
103: 제2유로
104: 배출구
도 2는 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 구조를 나타낸 도이다. 도 2A는 선형 구조를 나타낸 것이며, 도 2B는 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 고정된 프라이머에 결합되었을 경우의 템플레이트의 형태를 모식적으로 나타낸 것이며, 도 2C는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드와 결합한 경우의 형태를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3A는 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 제 2 유로에 프라이머가 고정되고, 상기 프라이머에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트가 결합된 모습을 나타낸 모식도이고, 도 3B는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드와 결합한 경우의 형태를 나타낸 모식도이며, 도 3C는 리가아제에 의하여 상기 템플레이트가 닫힌 형태가 된 모습을 나타낸 모식도이며, 도 3D는 등온 핵산 중합효소에 의하여 닫힌 형태의 상기 템플레이트를 주형으로 핵산이 합성되는 모습을 나타낸 모식도이다.
도 4A는 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치에서 시료 용액 내에 가장 왼쪽의 제 2 유로에서 검출되는 표적 물질만이 존재하는 경우를 염색 시약을 이용하여 시료 용액의 흐름을 관찰한 도이며, 도 4B는 도 4A의 결과를 Imager를 이용하여 관찰한 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 설명은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 설명에 한정되는 것은 아니며 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 또한, 도면들에 있어서, 구성요소의 폭, 길이, 두께 등은 편의를 위하여 과장되어 표현될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
또한, 일 구성요소가 다른 구성요소 위에 있다고 할 때, 이는 다른 구성요소 바로 위에 있는 경우 뿐 아니라, 그 중간에 또 다른 구성요소가 있는 경우도 포함한다.
표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 기본 구조
이하 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 기본 구조를 개략적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 간단한 모식도이다. 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치는 기판(100) 상에 유입구(101) 및 제 1 유로(102)가 기본적으로 존재하며, 제 1 유로에 연결된 제 2 유로(103) 및 제 2 유로에 연결된 배출구(104)가 1개 이상 존재할 수 있다. 도 1 및 4에서는 제 2 유로 및 제 2 유로에 연결된 배출구가 3개 존재하는 경우를 예시적으로 나타내었으며, 제 2 유로 및 배출구의 수는 이보다 증가하거나 감소될 수 있다.
유입구(101)로 시료 용액을 주입하면, 시료 용액은 제 1 유로(102)를 따라 흘러서 제 2 유로(103)로 각각 흘러 들어가도록 설계되어 있다. 각각의 제 2 유로는 코팅물질로 코팅되어 있으며, 코팅 상에 프라이머가 고정되어 있고, 고정된 프라이머에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트가 결합되어 있다. 제 2 유로 끝에는 배출구(104)가 있어, 시료가 배출구를 통해 제 2 유로 밖으로 배출된다.
각각의 제 2 유로에 고정된 프라이머와 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 서로 같거나 다를 수 있다. 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 기본 구조에 대한 모식도를 도 2에 나타내었다. 도 2의 A는 상기 템플레이트의 선형 구조이다. 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 단일가닥(single-stranded) 핵산으로서, 중앙부에는 프라이머에 상보적으로 결합하는 부분(프라이머 결합부)(도면상에 파란색으로 표시)이 존재한다. 프라이머 결합부의 일 말단에는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머(aptamer)의 일부분(도면상에 회색으로 표시한 부분)이 결합되어 있고, 다른 말단에는 상기 앱타머의 다른 부분(도면상에 진한 회색으로 표시한 부분)이 결합되어 있다.
앱타머란 특정 표적 물질에 선택적으로 결합하는 단일가닥 핵산으로서, 표적 물질에 결합하면 핵산의 입체 구조가 변화한다. 본 발명에서는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머를 절단하여 일부분은 프라이머 결합부의 일 말단에 부착하고, 다른 부분은 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합시켜 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 제조하였다.
본 발명의 미세 유동 장치에서, 상기 템플레이트의 프라이머 결합부는 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 상보적으로 결합되므로, 상기 템플레이트는 도 2의 B에 모식적으로 나타낸 것과 같은 상태로 존재한다. 표적 물질이 존재하는 경우, 도 2의 C와 같이 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분과 다른 부분은 표적물질에 선택적으로 결합하며 입체구조가 변화하여 5′ 말단과 3′ 말단이 서로 가까워져 그 사이에 작은 틈새인 닉(nick)만을 남기게 된다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드는 임의의 단백질(protein), 펩타이드(peptide) 또는 이의 일부분이 될 수 있으며, 그 종류에 제한이 없다.
상기 단백질 또는 펩타이드는 상황에 따라 신속한 검출이 요구되는 물질, 예컨대 프리온(prion, PrPc)이 될 수 있다. 또한 상기 단백질 또는 펩타이드는 단백질 항원, 항체, 성장인자, 인터페론, 효소, 암특이 항원 (cancer antigen) 등이 될 수 있다. 상기 단백질은 어떤 질환의 바이오마커가 될 수 있는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질은 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관 내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 인터페론-감마(IFN-γ), 섬유아세포 성장인자(Fibroblst Growth Factor), S100 칼슘 결합 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9), 케라틴 10(Keratin 10), 락토페린(lactoferrin), 칼파인-유사 프로테아제 CAPN10b(calpain-like protease CAPN10b), 피브리노겐, 피브린, 트랜스페린(transferrin),액틴, 사이클로필린(Cyclophilin B), 미오신(myosin), 열충격단백질(Heat Shock Protein, HSP), 징크 핑거 단백질(zinc finger protein), 아밀라아제, 트립신, 리파아제, 액틴 결합 단백질, 지단백(lipoprotein), 아포지단백(apolipoprotein), 사이토크롬 P450(cytochrome P450), 헤모글로빈, 엠비진(embigin), p53 단백질, 프로게스테론 리셉터 (Progestrerone receptor), 에스트로겐 리셉터 (estrogen receptor), 허셉틴 2 리셉터 (HER2/neu), 표피성장인자 리셉터 (EGFR), 카보닉 앤하이드레이즈 IX (carbonic anhydrase IX, CAIX), 상피세포부착분자 (endothelial cell adhesion molecule, EpCAM) 등이 될 수 있다. 그러나 본 발명에 의해 검출될 수 있는 단백질은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 기판, 제 1 유로, 제 2 유로, 유입구 및 배출구의 재질은 시료 용액과 반응하지 않는 한 제한이 없다. 예를 들어 폴리머(polymer), 유리(glass), 실리콘(silicon), 세라믹(ceramic) 등의 재질을 사용할 수 있다. 그 중에서, 성형의 용이성 및 비용적 측면을 중점적으로 고려한다면 폴리머 재질이 유리하다. 예를 들어 PP(polypropylene), PC(polycarbonate), PE(polyethylene), PET(polyethylene terephthalate), PMMA(polymethylmethacrylate (acrylic)), PS (Polystyrene) 및 COC(cyclic olefin copolymer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 그 외에, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane), 금(Au), 금속 산화물(metal oxide)(TiO2, Al2O3, 산화 인듐-주석(Indium-Tin Oxide)) 등의 재질이 될 수 있다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 상기 제 2 유로는 1개 이상일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개가 될 수 있다. 본 발명에 있어서, 제 2 유로의 수는 검출하고자 하는 표적 물질의 가지수에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 3가지 물질을 동시에 검출하고자 하는 경우, 대조군을 위한 것까지 포함하여 제 2 유로가 총 4개가 될 수 있다. 그러나 제 2 유로의 수에는 제한이 없다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 상기 제 2 유로의 직경은 1 μm 내지 5 mm의 크기일 수 있고, 다른 일 구체예에서 상기 제 2 유로의 직경은 50 μm 내지 5 mm의 크기일 수 있다. 또한 일 구체예에서 제 2 유로의 직경은 0.25 mm 내지 2 mm의 크기일 수 있고, 다른 일 구체예에서 0.5 mm 내지 1.5 mm의 크기일 수 있다. 그러나 제 2 유로의 직경은 적절히 조절될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 제 2 유로의 코팅은 하이드록시 벤젠류의 모노머 또는 폴리머 코팅이 될 수 있다. 또한 상기 코팅은 일례로 카테콜아민 폴리머 코팅을 포함할 수 있다. 하이드록시 벤젠류의 모노머 또는 폴리머는 뛰어난 표면 특성으로 인해 귀금속들, 금속 산화물들, 세라믹들, 및 합성 폴리머들을 포함한 광범위한 소재에 용이하게 코팅될 수 있다. 상기 하이드록시 벤젠류의 모노머 및 폴리머의 구체적인 예는 비제한적으로 도파민(dopamine), 5-하이드록시도파민 염산(5-hydroxydopamine HCl), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 파이로갈롤아민(pyrogallol amine), DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨(catechin), 탄닌류(tannins), 파이로갈롤(pyrogallol), 파이로카테콜(pyrocatechol), 헤파린-카테콜(heparin-catechol), 키토산-카테콜(chitosan-catechol), 폴리에틸렌글리콜-카테콜(poly(ethylene glycol)-catechol), 폴리에틸렌이민-카테콜 (poly(ethyleneimine)-catechol), 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜(poly(methyl methacrylate)-catechol), 히알루론산-카테콜(hyaluronic acid-catechol), 폴리라이신-카테콜 (polylysine-catechol), 폴리라이신 (polylysine) 등이 될 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 친수성 물질을 코팅물질로 사용하는 경우 제 2 유로 상에 시료 용액의 흐름을 도울 수 있다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 상기 프라이머는 예를 들어 10 내지 40량체(mer) 길이의 임의의 단일가닥 핵산이 될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 프라이머의 길이 및 서열에는 제한이 없다. 상기 프라이머는 제 2 유로 상의 코팅에 용이하게 고정될 수 있도록 말단에 적합한 관능기(functional group)을 가질 수 있다. 예를 들어, 티올(thiol), 아민(amine), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), NHS 에스테르, 알데히드(aldehyde), 에폭시드(epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 카바메이트(carbamate), 이미다졸 카바메이트(imidazole carbamate), 말레이미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 설폰(sulfone), 비닐설폰(vinylsulfone), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 디엔(Diene) 기 등을 가질 수 있으며, 바람직하게는 티올 기 또는 아민 기를 가질 수 있다. 그러나 관능기의 종류는 이에 제한되지 않으며, 제 2 유로 상의 코팅에 따라 다양한 관능기가 사용될 수 있다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 사용되는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머 및 프라이머의 길이에 따라, 안정성 및 회전환 증폭 효율을 고려하여 다양하게 설계할 수 있다. 예를 들어 단백질 검출용 템플레이트는 총 40 내지 160량체 길이의 단일가닥 핵산이 될 수 있다.
상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트에서 프라이머 결합부는 예를 들어 10 내지 40량체 길이가 될 수 있으며, 본 발명에 사용되는 프라이머에 상보적으로 결합하는 임의의 서열을 갖는 단일가닥 핵산이 될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 프라이머 결합부의 길이 및 서열에는 제한이 없다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트에서 프라이머 결합부에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분과 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 다른 부분은 하나의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머를 절단한 것이다. 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머는 단백질 또는 펩타이드 검출에 이용될 수 있는 임의의 앱타머를 의미하며, 공지된 앱타머가 될 수 있다. 당업자는 반복적인 실험에 의하여 공지의 앱타머를 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트에 적용하기에 적절한 지점에서 절단할 수 있다.
본 발명의 미세 유동 장치에 있어서, 외부 동력 공급 없이도 모세관 현상에 의하여 시료 용액이 유로를 흐를 수 있다. 그러나 필요에 따라 펌프, 전류 등을 이용하여 외부 동력을 공급하여 용액 흐름을 조절할 수 있으며, 유로의 각도를 조절하여 용액 흐름을 조절할 수도 있다.
표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 제조방법
이하에서 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 제조방법을 개략적으로 설명한다.
1단계 : 미세 유동 장치를 제조하는 단계
기판(100) 상에 유입구(101) 및 제 1 유로(102)를 형성시키고, 제 1 유로에 연결된 제 2 유로(103) 및 제 2 유로에 연결된 배출구(104)를 1개 이상 형성시켜서, 도 1에 예시적으로 나타낸 바와 같은 미세 유동 장치를 제조한다.
시판되는 미세 유동 장치를 이용하는 것도 가능하다. 예를 들어 ibidi 사에서 제조한 1 μ-Slide Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber 제품을 이용할 수 있다.
2단계 : 미세 유동 장치의 제 2 유로를 코팅하는 단계
미세 유동 장치의 각 제 2 유로를 코팅물질로 코팅한다.
3단계 : 미세 유동 장치의 제 2 유로에 프라이머를 부착시키는 단계
미세 유동 장치의 제 2 유로의 코팅 상에 프라이머를 부착시킨다.
프라이머는 본 발명의 미세 유동 장치에 사용하기에 적절한 형태로 준비할 수 있다. 예를 들어, 필수적인 것은 아니나, DTT(dithiothreitol)를 처리하여 프라이머 내에 생성된 이황화 결합이 모두 제거된 선형(linear form)의 프라이머를 준비할 수 있다. 또한 프라이머 말단을 코팅과의 반응을 용이하게 하는 관능기로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 티올기 또는 아민기가 프라이머의 일 말단에 결합될 수 있다.
프라이머와 코팅 간의 반응에 의하여 프라이머가 코팅 상에 부착될 수 있다.
4단계 : 미세 유동 장치의 제 2 유로에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 고정시키는 단계
상술한 바와 같이, 도 2의 A와 같은 구조를 갖는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 제조한다. 여기서 프라이머 결합부는 상기 3단계에서 제 2 유로에 부착시킨 프라이머에 상보적으로 결합하는 임의의 단일가닥 핵산이 될 수 있다.
상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 제 2 유로에 넣으면 제 2 유로에 고정된 프라이머와 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 프라이머 결합부 간에 상보적 결합이 일어나, 도 3A에 나타낸 바와 같이 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트가 결합된다.
표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 이용한 검출방법
이하에서 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 이용한 검출방법을 개략적으로 설명한다.
1단계 : 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치에 시료 용액을 유입시키는 단계
상술한 바와 같이 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 준비하고, 확인하고자 하는 시료 용액을 유입구로 주입한다.
유입구로 주입된 시료 용액은 모세관 현상에 의해 이동하여, 제 1 유로를 따라 제 2 유로로 흘러 들어간다.
시료 용액은 단백질 또는 펩타이드가 용해되어 있는 다양한 용액이 될 수 있으며, 예를 들어 수질 오염, 토양 오염 등을 분석하기 위한 물이나 토양 시료의 용액이 될 수 있다. 또한 시료 용액은 생물학적 시료가 될 수 있다. 생물학적 시료의 예로는 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 복수, 낭액 및 소변 등이 있다. 그러나 본 발명에 사용될 수 있는 시료 용액의 종류는 이에 제한되지 않는다.
2단계 : 회전환 증폭 단계
시료 용액이 각각의 제 2 유로로 흘러들어가면, 제 2 유로에 dNTPs(ATP, GTP, TTP, CTP), 리가아제, 등온 핵산 중합효소, 및 기타 효소의 반응에 필요한 시약, 완충액 등을 첨가한다. 이러한 시약은 효소와 함께 시판되는 것을 이용할 수 있다. 또한 이황화 결합을 끊기 위해 DTT를 더 첨가할 수 있으며, 핵산 중합 반응을 안정적이고 빠르게 진행되도록 하기 위해 파이로포스파타제(pyrophosphatase)를 더 첨가할 수 있다.
시료 용액 내 표적 물질이 존재하는 경우, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트에서 앱타머의 일부분과 앱타머의 다른 부분이 단백질에 결합하면서 입체 구조가 변화하여 양 말단이 서로 가까워져, 그 사이에 작은 틈새, 즉 닉(nick)만이 존재하게 된다. 상기 닉이 인접한 5′ 말단과 3′ 말단을 연결하는 효소인 리가아제에 의하여 서로 연결되어, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 완전히 닫힌 형태(closed form)가 되게 된다(도 3C 참조).
등온 핵산 중합효소는 상기 닫힌 형태의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 주형으로 dNTP가 소진되기 전까지 핵산을 무한히 반복하여 복제하는 회전환 증폭(Rolling Circle Replication, RCA)을 한다(도 3D 참조). 복제된 부분은 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트에서 떨어져 나가기 때문에, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 서열이 반복하여 존재하는 선형(linear) 핵산이 생성된다. 이 선형 핵산에 존재하는 앱타머의 일부분과 앱타머의 다른 부분 각각이 표적 단백질 또는 표적 펩타이드와 결합하고 회전환 증폭 반응이 일어나 길고 엉킨 핵산 덩어리가 생성되며, 이는 제 2 유로의 코팅과 함께 엉겨 큰 하이드로겔 덩어리를 형성한다.
상기 생성된 핵산 덩어리는, 예를 들어 직경 약 0.5 μm 내지 약 50 μm의 크기를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에서 상기 핵산 덩어리와 코팅이 함께 엉긴 하이드로겔 덩어리는 직경 약 50 μm 내지 5 mm, 예를 들어 직경 약 0.25 mm 내지 2 mm의 크기를 가질 수 있다. 그러나 본 발명에서 생성되는 핵산 덩어리 또는 하이드로겔 덩어리의 크기는 이에 제한되지 않는다.
상기 증폭된 핵산 덩어리는 후크(hook) 모양의 둥근 부분과 일정한 길이를 가지는 벨크로(velcro)가 연속된 형태의 엉킨 단일가닥이 될 수 있다. 각 가닥의 길이는 0.5 μm 내지 50 μm 크기일 수 있다. 전체적으로, 상기 핵산 덩어리는 둥근 원형과 일정한 길이를 갖는 다리를 가진 삼발이 형태일 수 있다.
상기 리가아제는 핵산의 인접한 5′ 말단과 3′ 말단을 라이게이션으로 연결할 수 있는 한 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어 DNA 리가아제를 사용할 수 있다. 상기 DNA 리가아제는 T7 리가아제, CircLigase™ 등의 효소를 포함한다.
상기 등온 핵산 중합효소는 온도를 변화시키지 않고 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 중합효소이면 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어 phi 29 폴리머라제를 사용할 수 있다. 본 발명은 등온 핵산 중합효소를 사용하기 때문에 PCR에 사용되는 열 순환기(Thermocycler)와 같은 장치를 이용하여 온도를 조절하지 않고도 핵산 증폭이 일어나도록 할 수 있다. 그러나 필요에 따라 등온 핵산 중합효소가 아닌 핵산 중합효소도 사용할 수 있으며, 이 경우 효소의 성질에 따라 온도를 변화시키는 장치와 함께 사용할 수도 있다.
회전환 증폭 반응은 10분 내지 5시간, 예를 들어 3시간 동안 수행할 수 있다. 반응시 온도는 효소를 불활성화 시키는 정도의 온도가 아닌 한 별도로 조절할 필요가 없다. 예를 들어 0 ~ 50 ℃의 온도, 예컨대 20 ~ 40 ℃, 예를 들어 30 ℃의 온도에서 반응을 수행할 수 있다.
상기 반응을 수행하는 환경에 따라, 유로 내의 수분이 증발하는 것을 막기 위하여 적절한 조건을 제공할 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 조건에서 반응을 수행할 수 있다. 일 예로서, 파라 필름으로 밀봉한 플라스틱 용기 안에 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 넣고, 플라스틱 안을 물에 적신 휴지 및 물로 채울 수 있다.
3단계 : 검출 단계
생성된 핵산과 코팅이 함께 엉긴 하이드로겔 덩어리는 제 2 유로의 배출구를 막게 된다. 점도가 높은 덩어리에 의해 배출구가 막혀 시료 용액이 흐르지 못하는 것은 육안으로 쉽게 확인할 수 있다. 상기 결과를 보고 시료 용액 내에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드가 존재함을 알 수 있다.
제 2 유로마다 상이한 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 부착할 수 있기 때문에, 2 이상의 제 2 유로를 갖는 미세 유동 장치를 사용하여 2 이상의 단백질의 존부를 동시에 검출할 수 있다.
색상을 나타내는 물질 또는 탁도를 높이는 물질을 유로에 흘려 줌으로써 시료 용액의 흐름을 보다 용이하게 관찰할 수 있다.
예를 들어, Gel red™, 트리판 블루 다이(trypane blue dye), 에반스 블루 다이(Evans Blue dye), 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin stain), 크리스탈 바이올릿(crystal violet), 메틸렌 블루(methylene blue)와 같은 염색 시약을 적절한 농도로 희석하여 시료 유입구로 유입시킬 수 있다. 그러면 도 4의 A에 예시적으로 나타낸 바와 같이 유로에서 시료 용액의 흐름을 보다 용이하게 관찰할 수 있다. 또한 도 4의 B에 예시적으로 나타낸 바와 같이 Imager(Gel Doc™ EZ(Bio-rad))를 통하여 보다 확실히 관찰할 수 있다.
또한 형광 시약을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 형광을 나타내는 스트렙타비딘 비드, 예컨대 Streptavidin Fluoresbrite YG Microspheres™과 같은 물질을 적절한 농도로 희석하여 시료 유입구로 유입시켜 시료 용액의 흐름을 관찰할 수도 있다.
침전을 증가시켜 탁도를 높이는 물질로서 고염 용액(high salt solution)을 사용할 수 있다. 고염 용액의 예로는 염화마그네슘(MgCl2) 수용액, 염화암모늄(NH4Cl) 수용액, 아세트산암모늄(NH4OAC) 수용액, 염화나트륨(NaCl) 수용액, 황산암모늄((NH4)2SO4) 수용액, 또는 중성아미노산 용액 등이 있다.
본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치는 육안으로도 표적 단백질 또는 표적 펩타이드의 존재를 충분히 식별할 수 있으나, 사용 목적에 따라 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명의 필수적 특징을 변경하지 않고 다양한 구체적인 형태로 실시할 수 있다. 이러한 예로, 당업자는 사용 목적에 따라 본 발명의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 검출 민감도를 증가시키기 위해 추가로, 전극 사이의 전류, 전압, 전위차, 저항변화 등을 측정하는 전기화학센서, 자외선, 가시광, 형광, 적외선, 라만 등의 다양한 광원을 이용하는 광학센서, 금속, 세라믹, 폴리머 등의 소재를 활용한 나노센서, 또는 효소, 항원, 항체 등의 생체 감지 물질을 이용한 바이오센서를 포함하여 실시할 수도 있다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 혈소판 유래 성장인자 검출용 미세 유동 장치
혈소판 유래 성장인자(PDGF)는 성장인자의 하나로서, 특히 혈관신생(angiogeneiss)에서 중요한 역할을 수행하고, 그 외 배아 발달, 섬유아세포 분열 등 다양한 과정에 관여한다. 재조합 PDGF는 만성 궤양 및 골소실의 치료제로도 사용된다.
본 발명에서는 하기와 같이 PDGF 검출용 미세 유동 장치 및 이를 이용하여 PDGF를 검출하는 방법을 제공한다.
1-1. PDGF 검출용 미세 유동 장치의 제조
ibidi 사에서 제조한 1 μ-Slide Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber 제품을 구입하여 준비하였다. 상기 제품은 도 1에 나타낸 바와 같은 구조를 갖고 있으며, 본래 세포의 현미경 관찰을 위해 사용하기 위한 목적으로 제조된 것이다. 가격이 저렴하고 본 발명의 미세 유동 장치에 사용하기에 적합한 구조를 갖고 있다고 판단되어 상기 제품을 이용하였다.
제 2 유로의 코팅물질로서 5-하이드록시도파민 염산(5-hydroxydopamine HCl)을 사용하였다. 구체적으로, 5-하이드록시도파민 염산(Sigma Aldrich)을 1mg/ml 농도로 10mM Tris 완충액(1M UltraPure 1M Tris-HCl pH 8.0 / Invitrogen)에 녹였다. 그 후 pH를 8로 맞추어 코팅용 조성물을 제조하였다. 상기 코팅용 조성물로 상기 1 μ-Slide Ⅲ 3in1uncoated Microscopy Chamber 제품의 각 제 2 유로를 채웠다. 2시간 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE)로 세척(washing) 하였다.
또한 상기 제 2 유로의 코팅 상에 부착시킬 프라이머를 준비하였다. 프라이머는 하기 서열을 갖는 Primer-5SS-polyA9 (BIONEER)를 구입하여 사용하였다. 하기 프라이머 서열의 5′ 말단은 티올기가 결합되어 있다.
5′-Thiol-AAA AAA AAA GGG ACG TCG ATA CTA GCA TGC TA-3′ (서열번호 1)
상기 프라이머 100pmol과 5M DTT(DL-Dithiothreitol/Sigma Aldrich)를 준비한 후, 100pmol의 프라이머에 5M DTT 5㎕를 첨가하고, 여기에 총 50㎕가 되게 DDW(Water Purification System/LABOGENE)를 첨가하여 프라이머 조성물을 제조하였다. DTT에 의해 프라이머 내에 생성되었을 수 있는 이황화 결합이 끊어지도록 4시간 동안 방치한 후, 3K 아미콘 튜브(amicon tube)(Amicon Ultra Centrifugal Filters 3K / MILLIPORE)를 이용하여 132,000 rpm, 4℃, 25분에서 1차 원심분리하고, 40㎕ DDW를 첨가하고 2차 원심분리하여 반응 후 남아있는 DTT를 완전히 제거하였다. 상기 DTT가 제거된 프라이머 조성물을 제 2 유로마다 5㎕씩 넣고 2시간 동안 방치하여 프라이머가 제 2 유로의 코팅 상에 부착되도록 한 후, DDW(Water Purification System / LABOGENE) 세척(washing) 하였다.
또한 PDGF 검출용 템플레이트를 하기와 같이 제조하였다. 상기 템플레이트에서 프라이머 결합부는 상기 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 상보적으로 결합하도록 하기 서열을 갖도록 제조하였다.
5′-TA GCA TGC TAG TAT CGA CGT-3′(서열번호 2)
또한 Zhao et al.(Nature Nanotechnology, Vol 6, August 11)에 기재된 바와 같이 5'-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3'의 서열을 갖는 앱타머를 제조하고, 5′ 말단에서 17번째 염기와 18번째 염기 사이를 절단하여, 상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분까지를 PDGF 앱타머의 일부분으로, 나머지 부분을 PDGF 앱타머의 다른 부분으로 하였다. 상기 프라이머 결합부의 양 말단에 상기 PDGF 앱타머의 일부분과 다른 부분을 각각 부착하여, PDGF 검출용 템플레이트를 제조하였다.
100μM PDGF 검출용 템플레이트 0.2㎕(=20pmole)에 1X PBS(lifetechnoligies사의 gibco®)를 첨가하여 5㎕의 PDGF 검출용 템플레이트 조성물을 제조하여 제 2 유로에 넣었다. 상기 PDGF 검출용 템플레이트의 프라이머 결합부와 제 2 유로에 고정된 프라이머 간에 상보적 결합이 일어나도록 2시간 동안 방치한 후 DDW(Water Purification System / LABOGENE) 세척하였다.
1-2. PDGF 검출용 미세 유동 장치를 이용한 PDGF 검출
PDGF을 포함하는 용액을 시료 용액으로서 준비하였다. 상기 시료 용액 60㎕를 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 유입구를 통해 제 1 유로에 유입시켰다. 단일 표적 유전자 검출용 미세 유동 장치의 제 1 유로로 유입된 시료 용액은 모세관 현상에 의하여 제 1 유로를 거쳐 제 2 유로로 이동하였다. 2시간 방치한 후, DDW(Water Purification System/LABOGENE) 세척하였다.
상기 제 2 유로에 T7 리가아제 30㎕, 100mM DTT 0.2㎕, 25mM dNTP 2㎕, phi 29 폴리머라제(10 unit/㎕) 50㎕, 파이로포스파타제(pyrophosphatase) 1㎕, 각 효소의 반응 완충액, 및 DDW를 첨가하였다. 제 2 유로 내 안의 수분이 날아가는 것을 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉 한 플라스틱 용기 안에 넣었다. 플라스틱 안은 물에 적신 휴지와 30℃ 물로 채웠다. 그 후 무교반(non-shaking), 30℃, 3시간 조건에 방치하여 PDGF 검출용 템플레이트의 닉의 라이게이션 및 회전환 증폭 반응이 일어나도록 하였다.
PDGF 검출용 템플레이트가 증폭되어 제 2 유로를 코팅한 하이드록시도파민 염산과 함께 엉겨 큰 하이드로겔 덩어리를 형성하여 제 2 유로의 배출구를 막음을 육안으로 확인할 수 있다.
또한 염색 시약인 Gel red(GelRed™ / Biotium)를 1:10000으로 희석하여 첨가하여, 시료 용액의 흐름을 보다 용이하게 확인할 수 있다.
실시예 2. 프리온 검출용 미세 유동 장치
프리온(prion, PrPc)은 바이러스처럼 전염력을 가진 단백질 입자로서, 양이나 염소의 스크래피병, 광우병, 크로이츠펠트-야콥병 등의 원인이다.
본 발명에서는 하기와 같이 프리온 검출용 미세 유동 장치 및 이를 이용하여 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.
2-1. 프리온 검출용 미세 유동 장치의 제조
본 발명의 프리온 검출용 미세 유동 장치는 프리온 검출용 템플레이트의 앱타머 부분을 제외한 나머지 부분은 1-1과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
프리온 검출용 템플레이트는 하기와 같이 제조할 수 있다. 상기 템플레이트에서 프라이머 결합부는 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 상보적으로 결합하도록 서열번호 2의 서열을 갖도록 제조하였다.
또한 Lei Zhan et al.(Analyst, 2013, 138, 825-830)에 기재된 바와 같이 5′-CTT ACG GTG GGG CAA TT-3′의 서열을 갖는 앱타머를 제조하고, 5′ 말단에서 8번째 염기와 9번째 염기 사이를 절단하여, 상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분까지를 프리온 앱타머의 일부분으로, 나머지 부분을 프리온 앱타머의 다른 부분으로 하였다. 상기 프라이머 결합부의 양 말단에 상기 프리온 앱타머의 일부분과 다른 부분을 각각 부착하여, 프리온 검출용 템플레이트를 제조하였다.
2-2. 프리온 검출용 미세 유동 장치를 이용한 프리온 검출
프리온을 포함하는 용액을 시료 용액으로서 준비하였다. 이하 1-2와 동일한 방법으로 프리온을 검출하였다.
실시예 3. 전립선 특이항원 검출용 미세 유동 장치
전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA)은 전립선의 상피세포에서 합성되는 단백분해 효소로 전립선 이외의 조직에서는 거의 발현되지 않아(암 특이항원) 전립선암에 대한 바이오마커로 이용되는 단백질이다.
본 발명에서는 하기와 같이 PSA 검출용 미세 유동 장치 및 이를 이용하여 프리온을 검출하는 방법을 제공한다.
3-1. PSA 검출용 미세 유동 장치의 제조
본 발명의 PSA 검출용 미세 유동 장치는 PSA 검출용 템플레이트의 앱타머 부분을 제외한 나머지 부분은 1-1과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
PSA 검출용 템플레이트는 하기와 같이 제조할 수 있다. 상기 템플레이트에서 프라이머 결합부는 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 상보적으로 결합하도록 서열번호 2의 서열을 갖도록 제조하였다. 또한 Zhanguang Chen et al.(Biosensors and Bioelectronics 36(2012) 35-40)에 기재된 바와 같이 ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GC-30의 서열을 갖는 앱타머를 제조하고, 5′ 말단에서 11번째 염기와 12번째 염기 사이를 절단하여, 상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분까지를 PSA 앱타머의 일부분으로, 나머지 부분을 PSA 앱타머의 다른 부분으로 하였다. 상기 프라이머 결합부의 양 말단에 상기 PSA 앱타머의 일부분과 다른 부분을 각각 부착하여, PSA 검출용 템플레이트를 제조하였다.
3-2. PSA 검출용 미세 유동 장치를 이용한 PSA 검출
PSA를 포함하는 용액을 시료 용액으로서 준비하였다. 이하 1-2와 동일한 방법으로 PSA를 검출하였다.
실시예 4. 혈관 내피 성장인자 검출용 미세 유동 장치
혈관 내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)는 혈관신생을 자극하는 신호 단백질로서, 태아 발달에 관여한다. 또한 VEGF가 과도하게 발현되는 경우 유방암, 난소암 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 하기와 같이 VEGF 검출용 미세 유동 장치 및 이를 이용하여 VEGF를 검출하는 방법을 제공한다.
4-1. VEGF 검출용 미세 유동 장치의 제조
본 발명의 VEGF 검출용 미세 유동 장치는 VEGF 검출용 템플레이트의 앱타머 부분을 제외한 나머지 부분은 1-1과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
VEGF 검출용 템플레이트는 하기와 같이 제조할 수 있다. 상기 템플레이트에서 프라이머 결합부는 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 상보적으로 결합하도록 서열번호 2의 서열을 갖도록 제조하였다. 또한 Hansang Cho et al.(ACS Nano. 2012 September 25; 6(9): 7607-7614)에 기재된 바와 같이 5′-ACG CAG UUU GAG AAG UCG CGC GU-3′의 서열을 갖는 앱타머를 제조하고, 5′ 말단에서 10번째 염기와 11번째 염기 사이를 절단하여, 상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분까지를 VEGF 앱타머의 일부분으로, 나머지 부분을 VEGF 앱타머의 다른 부분으로 하였다. 상기 프라이머 결합부의 양 말단에 상기 VEGF 앱타머의 일부분과 다른 부분을 각각 부착하여, VEGF 검출용 템플레이트를 제조하였다.
4-2. VEGF 검출용 미세 유동 장치를 이용한 VEGF 검출
VEGF를 포함하는 용액을 시료 용액으로서 준비하였다. 이하 1-2와 동일한 방법으로 VEGF를 검출하였다.
실시예 5. 인터페론-γ 검출용 미세 유동 장치
인터페론-γ(Interferon-γ, IFN-γ)는 T 세포 및 대식세포에 의하여 생산되는 사이토카인으로서, 바이러스 감염, 세균 감염, 암 등에 대하여 면역 작용을 한다. 비정상적인 인터페론-γ는 과도한 염증 및 자가면역질환과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 하기와 같이 인터페론-γ 검출용 미세 유동 장치 및 이를 이용하여 인터페론-γ를 검출하는 방법을 제공한다.
5-1. 인터페론-γ 검출용 미세 유동 장치의 제조
본 발명의 인터페론-γ 검출용 미세 유동 장치는 인터페론-γ 검출용 템플레이트의 앱타머 부분을 제외한 나머지 부분은 1-1과 동일한 방법으로 제조할 수 있다.
인터페론-γ 검출용 템플레이트는 하기와 같이 제조할 수 있다. 상기 템플레이트에서 프라이머 결합부는 서열번호 1로 표시되는 프라이머와 상보적으로 결합하도록 서열번호 2의 서열을 갖도록 제조하였다. 또한 Ying Liu et al.(Anal Chem. 2010 October 1; 82(19): 8131-8136)에 기재된 바와 같이 5′-C6-GGGGTTGGTTGTGTTGGGTGTTGTGTCCAACCCC-C3-3′의 서열을 갖는 앱타머를 제조하고, 상기 서열에서 밑줄로 표시한 부분까지를 VEGF 앱타머의 일부분으로, 나머지 부분을 VEGF 앱타머의 다른 부분으로 하였다. 상기 프라이머 결합부의 양 말단에 상기 인터페론-γ 앱타머의 일부분과 다른 부분을 각각 부착하여, 인터페론-γ 검출용 템플레이트를 제조하였다.
5-2. 인터페론-γ 검출용 미세 유동 장치를 이용한 VEGF 검출
인터페론-γ를 포함하는 용액을 시료 용액으로서 준비하였다. 이하 1-2와 동일한 방법으로 인터페론-γ를 검출하였다.
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Claims (17)

  1. 기판;
    상기 기판 상에 형성된 시료 용액이 외부로부터 유입되는 유입구;
    상기 유입구와 연결되어 유입된 시료 용액을 수용하는 제 1 유로;
    상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로;
    상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치로서,
    상기 제 2 유로 표면은 코팅되어 있고;
    상기 코팅 상에 프라이머가 고정되고;
    상기 고정된 프라이머에는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트가 결합되어 있으며,
    상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합부, 상기 프라이머 결합부의 일 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분, 및 상기 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 다른 부분을 포함하는,
    표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제 2 유로는 1 내지 20개인 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제 2 유로는 2 내지 20개이며, 제 1 유로의 말단에서 각각의 제 2 유로가 분지되고,
    각각의 제 2 유로 상에 고정된 프라이머에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 서로 같거나 다른 단백질에 결합하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코팅은 도파민, 5-하이드록시도파민 염산, 노르에피네프린, 에피네프린, 파이로갈롤아민, DOPA(3,4-Dihydroxyphenylalanine), 카테킨, 탄닌류, 파이로갈롤, 파이로카테콜, 헤파린-카테콜, 키토산-카테콜, 폴리에틸렌글리콜-카테콜, 폴리에틸렌이민-카테콜, 폴리메틸메타크릴레이트-카테콜, 히알루론산-카테콜, 폴리라이신-카테콜 (polylysine-catechol), 및 폴리라이신 (polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 티올(thiol), 아민(amine), 하이드록실(hydroxyl), 카복실(carboxyl), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), NHS 에스테르, 알데히드(aldehyde), 에폭시드(epoxide), 카보네이트(Carbonate), HOBt 에스테르, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde), 카바메이트(carbamate), 이미다졸 카바메이트(imidazole carbamate), 말레이미드(maleimide), 아지리딘(aziridine), 설폰(sulfone), 비닐설폰(vinylsulfone), 하이드라진(hydrazine), 페닐 아자이드(phenyl azide), 벤조페논(benzophenone), 안트라퀴논(anthraquinone), 및 디엔(Diene) 기로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상으로 말단이 변형된 것인, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코팅은 5-하이드록시도파민 염산이고, 상기 프라이머는 말단이 티올 또는 아민 기로 변형된 것인, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트의 프라이머 결합부는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 포함하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 프리온, 단백질 항원, 항체, 인터페론, 성장인자, 및 암특이 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 전립선 특이항원(prostate specific antigen, PSA), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈관 내피 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), ,인터페론-감마(IFN-γ). 프로게스테론 리셉터 (Progestrerone receptor), 에스트로겐 리셉터 (estrogen receptor), 허셉틴 2 리셉터 (HER2/neu), 표피성장인자 리셉터 (EGFR), 카보닉 앤하이드레이즈 IX (carbonic anhydrase IX, CAIX), 및 상피세포부착분자 (endothelial cell adhesion molecule, EpCAM)로 이루어진 군으로부터 선택된, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치.
  10. 제1항의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치;
    dNTP;
    리가아제;
    및 등온 핵산 중합효소를 포함하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리가아제는 DNA 리가아제인, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트.
  12. 제10항에 있어서, 상기 등온 핵산 중합효소는 phi 29 폴리머라제인, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트.
  13. 제10항에 있어서, 디티오트레이톨(DTT) 또는 파이로포스파타제(pyrophosphatase)를 더 포함하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트.
  14. 제10항에 있어서, 염색 시약, 고염 용액(high salt solution), 또는 형광 시약을 더 포함하는, 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치 키트.
  15. 다음 단계를 포함하는 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 제조하는 방법:
    1) 기판, 상기 기판 상에 형성된 유입구, 상기 유입구와 연결되어 유입된 시료 용액을 수용하는 제 1 유로, 상기 제 1 유로와 연결된 제 2 유로, 상기 제 2 유로와 연결된 배출구를 포함하는 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
    2) 상기 미세 유동 장치의 제 2 유로 표면을 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅 상에 프라이머를 고정시키는 단계;및
    4) 상기 고정된 프라이머에 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트를 결합시키는 단계로서, 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 템플레이트는 상기 프라이머에 상보적으로 결합하는 프라이머 결합부, 상기 프라이머 결합부의 일 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 일부분, 및 상기 프라이머 결합부의 다른 말단에 결합된 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 앱타머의 다른 부분을 포함하는 것인, 단계.
  16. 다음 단계를 포함하는 제1항의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 이용하여 표적 단백질 또는 표적 펩타이드를 검출하는 방법.
    a) 제1항의 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치를 제공하는 단계;
    b) 시료 용액을 상기 표적 단백질 또는 표적 펩타이드 검출용 미세 유동 장치의 유입구로 주입하는 단계;및
    c) 상기 미세 유동 장치의 제 2 유로에 dNTP, 리가아제, 및 등온 핵산 중합효소를 첨가하는 단계.
  17. 제16항에 있어서,
    d) 상기 미세 유동 장치의 유입구에 염색 시약, 고염 용액 또는 형광 시약을 주입하는 단계를 더 포함하는 방법.
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