KR20140029825A

KR20140029825A - 표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법

Info

Publication number: KR20140029825A
Application number: KR1020120095583A
Authority: KR
Inventors: 박현규; 박기수; 정철희
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-03-11
Also published as: KR101400995B1

Abstract

본 발명은 표적물질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer)의 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생리활성 물질에 특이적으로 결합하는 압타머의 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 (APINA: APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification) 및 이를 이용하여 DNA, 단백질, 또는 생리활성 물질을 고감도로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 현재의 핵산검사를 현장진단 기술로 구현하는데 가장 큰 걸림돌인 기존 핵산 증폭방법(PCR)의 온도 변화를 요구하는 문제점을 해결함으로서, 체외진단 시장에서 경쟁력을 가지게 되어 막대한 경제, 산업적 가치의 창출을 기대할 수 있고, 상기 개발된 압타머 기반 등온 핵산증폭 기술(APINA)을 면역검사에도 적용하여 표적물질 (DNA, 단백질 및 생리활성물질)을 초고감도로 검출하기에 유용하다.

Description

표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법 {APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification (APINA) method and its use for ultra-high sensitive detection of biomolecules}

본 발명은 표적물질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer)의 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생리활성 물질에 특이적으로 결합하는 압타머의 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법(APINA: APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification) 및 이를 이용하여 DNA, 단백질 또는 생리활성 물질을 고감도로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

분자진단검사(Molecular diagnostic testing) 또는 핵산진단검사(NAT; nucleic acid testing)는 체외진단검사 시장 중 가장 빠른 속도로 성장하는 분야로 세계시장에서 약 20%의 연평균 성장률을 보이고 있다. 앞으로 5~10년 이후에는 자동화된 핵산 검사 장치 기술과 다양한 질병관련 핵산 표지(marker) 개발의 가속화에 힘입어 매우 빠른 성장을 보일 것으로 예상되고 있다. 현재는 전체 체외진단검사 시장 중 10-15% 점유율을 보이고 있지만, 그 비율은 크게 증가하고 있는 추세이다. 현재의 핵산진단검사의 대상을 크게 두 가지로 나누면, 인체에 감염된 병원체에서 유래된 핵산과 인체에서 직접 유래된 핵산이다. 전자는 감염 여부를 진단하는 검사로 분자진단 시장의 80% 이상을 차지하고 있다. 후자는 질환 유발과 치료에 관련된 핵산을 분석하는 유전자검사이며 시장점유율 20% 미만이지만 잠재적 가치와 시장성은 매우 높을 것으로 전망되고 있다. 분자진단검사는 현재 북미(43%), 서유럽(31%), 일본(11%)의 순으로 가장 큰 시장을 이루고 있지만, 중국과 인도의 경우 각각 연평균 성장률이 16%와 21%를 상회하는 급성장 추세를 보이고 있으며 최근 관련 기업들은 인수 합병을 통해 제품의 차별화된 유용성과 특수성을 내세우며 지속적인 성장 추세를 보이고 있는 상황이다 (전주홍, 핵산진단기술의 연구동향, 보건산업기술동향, (2005)).

특히, Roche는 1991년 Chiron으로부터 핵산 증폭기술인 PCR에 대한 특허권을 인수한 이후, 이를 기반으로 다양한 analytical platform technology를 개발하여 분자진단검사 시장의 40% 이상을 점유하고 있다 (전주홍, 분자진단검사법 개발 및 기술 연구동향, 보건산업기술동향, (2006)). 따라서 서구 선진 진단 회사들은 이 특허를 피하기 위해 새로운 DNA 증폭방법을 개발하였다. 현재 50개 이상의 회사에서 독자적인 DNA 증폭 기술을 보유하고 있다. DNA 증폭방법으로는 DNA 자체를 직접 증폭하는 표적증폭법 (target amplification), 핵산 검출에 이용되는 탐침을 증폭시키는 탐침증폭법(probe amplification), 검출신호를 증폭시키는 신호증폭법(signal amplification)으로 구분할 수 있다 (전주홍, 분자진단검사법 개발 및 기술 연구동향, 보건산업기술동향, (2006)). 표적증폭법으로는 Roche의 PCR이외에도 Becton Dickinson의 SDA(strand displacement amplification), RCA(rolling circle amplification), Gen-probe의 TMA(transcription-mediated amplification)와 bioMerieux의 NASBA(nucleic acid sequence-based amplification) 등을 들 수 있다. 탐침증폭법으로는 Abbott Laboratories의 LCR(ligase chain reaction), CPT(cycling probe technology), Invader assay 등이 있다.

각각의 증폭방법마다 장점들이 있지만 범용으로 사용하기에는 아직까지는 기존의 PCR이 가장 효과적이다. 그러나 기존의 PCR 방법은 온도 변화를 기반으로 하기 때문에 온도조절장치(thermocycler)를 반드시 필요로 한다. 따라서, 향후 시료에서 결과까지 분석 수행자 없이 진행되는 현장진단(POCT, point-of-care testing)을 목적으로 하는 미세유체제어(microfluidics) 기술 등이 융합된 랩온어칩(LOC, lab-on-a-chip) 또는 미세종합 분석시스템(μTAS, micro total analysis system)에 적용하기 어렵다는 치명적인 단점이 있다. 또한 고열이 수반되는 반응이므로 사용 가능한 효소 등이 제한적이며, 증폭 시간도 오래 걸린다는 단점도 수반한다. 이와 같은 문제를 극복하고 현상진단 시스템에 적용할 수 있게 하는 기술이 바로 등온 핵산 증폭 기술이다.

등온증폭방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 2000년 Notomi 등에 의해 고안된 검출방법이며, 기존의 PCR법과 유사하지만 PCR이나 real-time PCR 반응 시에 DNA 변성(denaturation), 프라이머의 접합(annealing), 중합효소의 신장(extension)에 필요했던 온도 변화가 필요 없이 60℃의 한 온도에서 증폭반응이 가능한 검출 방법이다. LAMP의 가장 큰 특징은 등온에서 유전자의 증폭이 이루어진다는 점으로, 온도의 구배가 필요한 PCR에 비해서 등온조건은 몇 가지 이점을 가지고 있다. 먼저 온도 조절이 필요 없기 때문에 상대적으로 반응 시간이 짧아진다. 따라서 좀 더 빠른 시간 내에 유전자 증폭을 가능하게 한다. LAMP를 이용한다면 전기영동 시간을 제외하고 한 시간 내에 유전자 증폭이 가능함을 기존 여러 논문에서 이미 보고되었다. 더구나 온도 변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없기 때문에 증폭 효율이 매우 높다. 또한 등온 조건에서의 증폭은 LAMP가 다른 검출 방법들과 달리 현장성을 가질 수 있다는 근거가 된다. 일정한 온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요없이 항온수조 등 간단한 장비만을 가지고도 반응이 가능하다. 따라서 LAMP를 이용한다면 굳이 실험실 내에서의 환경이 아니더라도 현장에서 특정 유전자의 검출이 가능해진다. 그러나 현재 FDA 승인된 등온증폭방법을 이용한 진단방법으로는 C. trachomatis와 N. gonorrhoeae를 분석하는 BD Microbiology Systems의 SDA (strand displacement amplification), CMV와 HIV 진단을 위한 bioMerieux의 NASBA (nucleic acid sequence based amplification), Gen-Probe의 TMA (transcription mediated amplification), Bayer Healthcare의 bDNA (branched chain DNA signal amplification)등 소수에 불과한 상황이고 국내에서의 관련연구는 보고된 바 없는 실정이다 (전주홍, 핵산진단기술의 연구동향, 보건산업기술동향, (2005)).

이에, 본 발명자들은 전술한 종래 기술들의 문제점을 해결하며 새로운 방법의 등온 핵산 증폭기술의 개발을 위해 예의 노력한 결과, 표적물질과 압타머의 결합에 의한 구조 변화를 DNA 증폭과정에 도입하는 경우, 등온에서 표적 핵산의 증폭을 가능하게 해줄 뿐 아니라, 압타머의 표적물질이 되는 생체 물질 및 화학 물질을 초고감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 DNA 압타머 염기서열이 포함된 프라이머가 표적 물질에 특이적으로 결합하여 구조변화를 일으켜 이중가닥 DNA의 denaturation을 유발하는 등온 핵산 증폭용 조성물 및 등온 핵산 증폭방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 등온 핵산 증폭방법을 이용한 표적물질의 간편하고 신속한 검출 및 정량방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 주형 핵산; (ii) 압타머 특이적 표적물질; (iii) 상기 압타머의 염기서열을 포함하고, 상기 주형 핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iv) 핵산중합효소; (v) 상기 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (vi) 상기 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응(APINA: APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification)용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 등온에서 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 등온 증폭방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 확인하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 정량하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 정량방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 현재의 핵산검사를 현장진단 기술로 구현하는데 가장 큰 걸림돌인 기존 핵산 증폭방법(PCR)의 문제점을 해결함으로서, 체외진단 시장에서 경쟁력을 가지게 되어 막대한 경제, 산업적 가치의 창출을 기대할 수 있고, 상기 개발된 압타머 기반 등온 핵산증폭 기술(APINA)을 면역검사에도 적용하여 표적물질 (DNA, 단백질 및 생리활성물질)을 초고감도로 검출하기에 유용하다.

도 1은 본 발명에 따른 압타머(aptamer) 기반 등온 핵산 증폭방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 표적물질 ATP와 특이적으로 결합하여 구조 변화를 일으키는 압타머의 melting temperature(Tm) 측정을 위한 melting curve 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 표적물질 ATP-DNA 압타머 복합체가 DNA polymerase에 의한 중합반응으로 신장(extension)될 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 표적물질 ATP의 영향 및 부스터 프라이머(booster primer)의 최적화를 수행한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 압타머 기반 등온 핵산 증폭(APINA)의 최적 온도를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 압타머 기반 등온 핵산 증폭을 위한 최적의 표적물질 ATP농도를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 압타머 기반 등온 핵산 증폭기술의 민감도를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.

일관점에서, 본 발명은 (i) 주형 핵산; (ii) 압타머 특이적 표적물질; (iii) 상기 압타머의 염기서열을 포함하고, 상기 주형 핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iv) 핵산중합효소; (v) 상기 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (vi) 상기 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응(APINA: APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification)용 조성물에 관한 것이다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 조성물을 등온에서 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 등온 증폭방법에 관한 것이다.

단백질이나 생리활성물질 등에 결합할 수 있는 압타머는 대개 표적물질에 대해 높은 친화성을 갖게 되는데, 이는 표적물질과 결합 시 folding하면서 구조적인 변화를 동반하기 때문이다. 이러한 압타머의 표적분자와의 결합을 통해 야기되는 구조적 변화를 이용하여 기존 핵산 증폭 기술 (Polymerase chain reaction, PCR)의 온도 변화에 의한 이중 가닥 DNA의 denaturation을 대체함으로서 등온에서 핵산을 증폭할 수 있는 기술을 개발할 수 있게 된다. 또한, 이 등온 핵산 증폭기술은 표적 물질이 존재하는 경우에만 핵산의 증폭반응이 진행되도록 설계되어 표적 물질 (단백질 및 생리활성물질)의 초고감도 분석에도 활용될 수 있다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법은 하기의 과정으로 수행될 수 있다.

표적핵산의 등온 증폭을 위해서는 총 3 종류의 DNA 프라이머(Inner, Outer, and Booster primer)가 사용된다. 외부 프라이머(Outer primer)는 핵산 증폭 cycle 초반에 내부 프라이머(Inner primer)의 치환(displacement)을 위해 사용되어지는 프라이머로서 내부 프라이머가 표적 핵산과 hybridization이 이루어지는 위치보다 위쪽에서 표적 핵산과 hybridization하도록 설계하는 것이 바람직하다. 이를 통해 핵산 증폭 cycle 초반에 내부 프라이머로부터 신장(extension)된 핵산가닥은 외부 프라이머에 의해 치환되고, 순차적인 증폭 사이클이 진행되게 된다. 내부 프라이머는 5 부분에 표적물질에 특이적으로 결합하여 구조적 변화를 일으키는 DNA 압타머의 염기서열이 포함되어 있으며, 이는 등온 핵산 증폭과정에서 이중가닥 DNA의 denaturation을 유발하여 단일가닥으로 드러난 부분에 부스터 프라이머(Booster primer)가 결합하여 증폭 과정이 이루어지게 한다. 부스터 프라이머는 DNA 압타머 염기서열의 일부분인 프라이머로 표적물질과 압타머의 결합을 통해 유발된 이중 가닥 DNA의 denaturation 부분에 결합하여 핵산의 등온증폭 반응이 진행되는 것을 도와준다.

본 발명에서 사용된 압타머는 1995년에 SELEX 과정을 통해 밝혀진 ATP 특이적 압타머로, 이중가닥 형태에서도 표적물질인 ATP와 반응하여 ATP-압타머 콤플렉스를 형성할 수 있다(Biochemistry, 1995, Vol 34, p656, David E. 등)는 것이 보고되어 있다. 상기 ATP 특이적 압타머는 핵산 등온 증폭용 내부 프라이머의 일부로 사용되었으나, 표적물질과 반응하여 입체구조를 형성하는 압타머라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 압타머의 표적물질은 DNA, 단백질 및 생리활성 물질이며, 특히 ATP인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 주형핵산은 이중가닥인 것을 특징으로 하며, 이중가닥 핵산이라면 그 기원이나 기능에 제한없이 사용될 수 있고, 선정된 주형핵산에 따라 적절한 프라이머를 제작하여 사용하는 것은 당업계의 관용기술이라 하겠다.

중합반응에 사용되는 핵산중합효소는 DNA 주형을 따라서 핵산 프라이머를 확장할 수 있는 효소로서, 엑소뉴클레이즈 기능이 없고 DNA 치환기능을 가져야 한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 효소로는 Vent (exo-) DNA polymerase, Bst polymerase, Klenow fragment 및 Bsu DNA polymerase 등을 예시할 수 있다.

압타머 기반 등온 핵산 증폭과정(APINA)은 크게 두 가지 경로(CASE A 및 B)를 통해 이루어진다. CASE A는 외부 프라이머에 의한 중합 반응에 의해 형성된 이중가닥의 DNA에서 시작되는 증폭 반응으로서 이중가닥 DNA의 한 쪽에만 표적물질(예를 들면, ATP)과 결합하는 압타머 염기서열(Red line)을 가지게 된다. 반면, CASE B는 내부 프라이머에 의한 중합 반응을 통해 형성되는 DNA로서 양쪽 말단에 ATP와 결합하는 압타머 염기서열(Red line)을 가지게 되고, 이를 이용하여 증폭반응이 일어난다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 확인하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 압타머 특이적 표적물질은 혈액, 소변 및 생체조직 등의 시료에 포함된 DNA, 단백질 및 생리활성물질일 수 있으며, 상기 시료 내에 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 표적물질이 존재할 경우에만 핵산 등온 중합반응이 일어나게 되므로, 핵산 등온 중합반응을 통해 수득된 증폭산물을 확인함으로서 표적물질을 검출할 수 있다.

기존 효소 면역 측정법은 혈액 내 존재하는 항원 또는 항체가 일정량 이상 도달하지 못하는 잠복기(window period)에는 감염여부를 진단할 수 없었던 것에 비해, 핵산 증폭 검출방법은 잠복기를 단축시켜 조기에 감염여부를 진단할 수 있는 방법으로, 혈액의 안전성 강화 및 국민보건 향상에 기여할 수 있다.

본 발명에 따른 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법을 통해 표적물질에 결합하는 형광분자(FAM)과 quencher(Dabcyl) 사이에 발생하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)를 기반으로 한 고감도 검출이 가능하다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′ 말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 정량하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 정량방법에 관한 것이다.

본 발명의 압타머 특이적 표적물질은 혈액, 소변 및 생체조직 등의 시료에 포함된 DNA, 단백질 및 생리활성물질일 수 있으며, 상기 시료 내에 상기 압타머와 특이적으로 결합하는 표적물질이 존재할 경우에만 핵산 등온 중합반응이 일어나게 되므로, 본 발명에 따른 핵산 등온 중합반응을 통해 수득된 증폭산물을 농도가 알려진 대조군과 비교하여 상대정량함으로서 표적물질의 농도범위를 가늠할 수 있다.

본 발명에서는 압타머 특이적 표적물질의 검출방법 및 정량방법의 주형핵산으로 Chlamydia trachmatis의 독성 단백질을 발현하는 유전자만을 예시하였으나, 핵산의 등온증폭 반응을 진행시킬 수 있는 이중가닥 핵산이라면 제한없이 사용할 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

하기 실시예에서는 서열번호 1의 압타머만을 예시하였으나, 다른 압타머 염기서열로 대체하여 구현할 수 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 주형핵산으로 Chlamydia trachmatis의 독성 단백질을 발현하는 유전자만을 예시하였으나, 그 외의 핵산을 사용하여도, 본 발명의 핵산 등온 증폭 방법 및 표적물질 검출 및 정량방법을 구현할 수 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 압타머의 melting curve 분석

표적물질 ATP와 특이적으로 결합하여 구조 변화를 일으키는 압타머의 melting temperature(Tm) 측정을 위해 형광 (FAM)과 Quencher (Dabcyl)가 표지된 ATP 압타머를 이용하여 melting curve 분석을 실시하였다(도 2). 이 분석은 서열번호 1로 표시되는 압타머의 5′과 3′에 형광분자(FAM)와 quencher(Dabcyl)를 각각 표지한 압타머를 이용하여, ATP 압타머가 표적물질 ATP와 결합할 경우에만 구조 변화를 일으켜 형광분자 (FAM)와 quencher (Dabcyl)의 거리는 가까워지고 이를 통해 발생하는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)을 기반으로 수행하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, ATP-압타머의 Tm은 60°C임을 알 수 있었다. 이 결과를 통해 표적물질 ATP와 압타머의 결합이 60°C 정도의 고온에서도 유지됨을 확인하였으며, 이는 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법(APINA)이 60°C 정도의 고온에서도 이루어질 수 있음을 의미한다.

실시예 2: DNA polymerase 의 중합반응에 의한 ATP - DNA 압타머 복합체의 신장

표적물질 ATP와 DNA 압타머(서열번호 1)가 결합하여 형성된 ATP-DNA 압타머 복합체가 DNA 중합효소(polymerase)의 중합반응에 의해 신장될 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 실시하였다(도 3). 상기의 실험에 사용된 주형핵산(서열번호 2)은 임상적으로 유용한 비뇨생식기 감염균 중의 하나인 Chlamydia trachmatis의 독성 단백질을 발현하는 유전자의 염기서열을 기반으로 디자인하였다. 내부 프라이머(서열번호 3 및 4)와 외부 프라이머(서열번호 5 및 6)의 염기서열은 primer-dimer 및 hairpin 구조의 형성을 최소화하기 위하여, Primer 3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) 프로그램을 사용하여 디자인하였다. 서열번호 1 내지 4에는 표적물질 ATP에 결합하는 압타머 염기서열(ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT)이 포함되도록 제작하였다.

서열번호 1 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT - 3′

서열번호 2 :

5′- ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT AGCTGCCTCAGAATATACTCAGTAGAGTATCTTGCATGCGATTTTCTA - 3′

서열번호 3 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT TAGAAAATCGCATGCAAGATA - 3′

서열번호 4 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT AGCTGCCTCAGAATATACTCA - 3′

서열번호 5 : 5′ - TAAACATGAAAACTCGTTCCG - 3′

서열번호 6 : 5′ - AGTCTACAGTTATAGGTAATCC - 3′

이 과정은 압타머 기반 등온 핵산 증폭 (APINA)을 위해 필수적으로 확인되어야 하는 과정으로, 표적물질 ATP와의 결합을 통해 구조적인 변화를 일으킨 압타머 염기서열이 계속적인 증폭반응을 유발하기 위해서는 DNA 중합효소에 의한 extension 반응을 통해 이중가닥의 형태로 돌아가야만 한다. 도 3에 나타난 바와 같이, CASE A 와 B의 상황을 모사하는 oligonucleotides를 이용하여 실험을 해보았을 때, DNA 중합효소가 존재하지 않는 경우(1,3 lane)와 비교하여, 존재하는 경우(2,4 lane)에만 중합반응(extension 반응)이 이루어져 이중가닥의 extension product가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 ATP-DNA 압타머 복합체가 DNA 중합효소의 진행경로를 방해 하지 않고 APINA 증폭과정을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이 결과는 ATP 압타머 염기서열을 포함하여 길이가 길어진 내부 프라이머가 DNA 중합효소에 의한 extension 반응에서 문제없이 잘 작동할 수 있음을 의미한다.

실시예 3: 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법( APINA )에서 표적물질 ATP 의 영향 및 Booster primer 의 최적화

CASE A 증폭 반응의 초기 상황을 모사하는 oligonucleotides를 이용하여 표적물질 ATP의 영향 및 올리고머 수에 따른 부스터 프라이머(Booster primer, 15mer, 18mer, 21mer, 24mer, 27mer, 서열번호 7 내지 11)의 최적화를 수행하였다(도 4). 서열번호 11에는 표적물질 ATP에 결합하는 압타머 염기서열( ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT )이 포함되도록 제작하였다.

서열번호 7 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATT - 3′

서열번호 8 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCG - 3′

서열번호 9 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAG - 3′

서열번호 10 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAA - 3′

서열번호 11 : 5′ - ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT - 3′

등온 핵산 중합반응을 실시한 결과, DNA 압타머의 표적물질 ATP가 존재하지 않는 경우, 초반에 넣어준 oligonucleotide 이외에 DNA 중합효소에 의해 형성된 증폭산물이 확인되지 않았다. 표적물질 ATP가 존재하는 경우, 초반에 넣어준 oligonucleotides 외에 등온 증폭 과정을 통해 형성된 DNA product가 존재함을 확인하였다. 이를 통해, DNA 압타머의 표적물질인 ATP가 존재하여 구조변화를 일으키는 과정이 DNA 증폭에 중요한 영향을 미침을 확인할 수 있었다. 또한, 효과적인 등온증폭을 위한 최적의 부스터 프라이머의 길이를 결정하기 위해 15, 18, 21, 24, 및 27mer의 부스터 프라이머를 제작하여 증폭반응을 실시한 결과, 18mer 길이의 부스터 프라이머를 사용한 경우 DNA 증폭이 가장 효과적으로 이루어짐을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법( APINA )에서 온도의 최적화

압타머 기반 등온 핵산 증폭반응(APINA)의 최적 온도를 알아보기 위한 실험으로, 실시예 3에서 사용되어진 oligonucleotides와 동일한 실험조건을 이용하여 60 °C 이외에 ATP 압타머가 표적물질 ATP와 가장 잘 결합한다고 알려진 37°C에서도 등온 핵산 증폭을 수행하였다. 그 결과, 60°C에서 실험을 수행한 경우와 달리, 37°C에서는 표적물질 ATP의 존재에도 불구하고 DNA 증폭 산물이 형성되지 않음을 확인할 수 있었다(도 5). 이는 낮은 온도에서는 이중가닥 DNA의 hybridization이 너무 강하여 이중 가닥 DNA 말단 부분의 DNA 압타머가 표적 물질인 ATP와 결합하지 못하여 이중 가닥 DNA의 말단 부분이 denaturation이 이루어지지 않음을 의미한다. 결과적으로 부스터 프라이머가 이중 가닥 DNA 말단 부분에 hybridization을 방해하게 되고 등온 핵산 증폭과정은 이루어지지 않게 된다. 또한, 낮은 온도 (37°C)에서는 DNA의 self-dimer 및 hairpin 구조의 형성 확률이 높아져 표적 핵산의 효과적인 증폭을 힘들게 할 수 있다.

실시예 5: 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법( APINA )의 초고감도 검출 가능성

실시예 3 및 실시예 4의 과정을 통해 최적화된 조건 (반응 온도 : 60°C 및 Booster primer 2)을 이용하여 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법(APINA)이 표적물질의 초고감도 검출로 응용될 수 있는지 유/무를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 그 결과, 압타머의 표적물질 ATP의 농도 변화에 따라 핵산의 증폭 패턴이 달라짐을 확인할 수 있었다(도 6). 이는 압타머 기반 등온 핵산 증폭방법이 표적 물질(바이오 및 화학물질)의 검출로도 응용될 수 있음을 나타내는 결과이다. 또한, 등온 핵산 증폭(APINA)을 위한 최적의 표적물질 ATP 농도는 1 mM임을 확인 할 수 있었다. 또한, 압타머 기반 등온 핵산 증폭 기술(APINA)이 주형핵산(APINA template)의 농도(20fM ~ 20nM) 변화에 따른 증폭패턴의 변화 및 우수한 민감도의 등온핵산 증폭기술 개발 가능성 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 20fM의 낮은 주형핵산의 농도에서도 APINA 증폭과정이 이루어졌으며, 이를 통해 민감도가 우수한 표적 물질의 검출이 가능함을 확인 할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification (APINA) method and its use for ultra-high sensitive detection of biomolecules <130> P12-B189 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 1 acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 2 acctggggga gtattgcgga ggaaggtagc tgcctcagaa tatactcagt agagtatctt 60 gcatgcgatt ttcta 75 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 3 acctggggga gtattgcgga ggaaggttag aaaatcgcat gcaagata 48 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 4 acctggggga gtattgcgga ggaaggtagc tgcctcagaa tatactca 48 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 5 taaacatgaa aactcgttcc g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 6 agtctacagt tataggtaat cc 22 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 7 acctggggga gtatt 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 8 acctggggga gtattgcg 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 9 acctggggga gtattgcgga g 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 10 acctggggga gtattgcgga ggaa 24 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 11 acctggggga gtattgcgga ggaaggt 27

Claims

(i) 주형 핵산; (ii) 압타머 특이적 표적물질; (iii) 상기 압타머의 염기서열을 포함하고, 상기 주형 핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iv) 핵산중합효소; (v) 상기 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (vi) 상기 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응(APINA: APtamer-based Isothermal Nucleic acid Amplification)용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 표적물질은 DNA, 단백질 및 생리활성 물질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 표적물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 주형핵산은 이중가닥인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 엑소뉴클레이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 Vent (exo-) DNA polymerase, Bst polymerase, Klenow fragment 및 Bsu DNA polymerase로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 등온 중합반응 온도는 55∼65℃인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 등온에서 증폭시키는 것을 특징으로 하는 핵산의 등온 증폭방법.
제8항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산의 등온 증폭방법:
(a) 등온 상태에서, (i) 주형 핵산과 (ii) 표적 물질과 결합하는 압타머의 염기서열을 포함하고 상기 주형 핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer)를 어닐링시키고, (iii) 압타머 특이적 표적물질과 압타머의 결합에 의해 내부 프라이머를 변형시키고, (iv) 핵산중합효소로 신장시키는 단계;
(b) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′말단에 가깝게 디자인된 (v) 외부 프라이머(outer primer)를 주형핵산의 5′에 결합시켜 내부 프라이머에 의해 신장(extension)된 핵산을 치환하며, 신장시키는 단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계를 반복하여 순차적으로 등온 증폭하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 핵산 중 ATP-압타머 결합체에 의해 단일가닥으로 분리된 부분에 (vi) 부스터 프라이머(booster primer)를 어닐링시켜 중합반응시키는 단계.
제9항에 있어서, 상기 표적물질은 DNA, 단백질 및 생리활성 물질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 표적물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 주형핵산은 이중가닥인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 엑소뉴클레이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 Vent (exo-) DNA polymerase, Bst polymerase, Klenow fragment 및 Bsu DNA polymerase로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 등온 중합반응 온도는 55∼65℃인 것을 특징으로 하는 방법
압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 확인하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 검출방법.
제15항에 있어서, 상기 압타머의 표적물질은 DNA, 단백질 및 생리활성 물질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 압타머의 표적물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 검출대상 시료는 이중가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 엑소뉴클레이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 Vent (exo-) DNA polymerase, Bst polymerase, Klenow fragment 및 Bsu DNA polymerase로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 중합반응 온도는 55∼65℃인 것을 특징으로 하는 방법.
압타머 특이적 표적물질을 함유하는 것으로 추정되는 검출대상 시료와 (i) 주형 핵산; (ii) 상기 표적물질과 결합하는 압타머의 염기서열이 포함되고, 상기 주형핵산에 특이적으로 결합하는 내부 프라이머(inner primer); (iii) 핵산중합효소; (iv) 내부 프라이머보다 주형핵산의 5′말단에 가깝게 디자인된 외부 프라이머(outer primer); 및 (v) 압타머의 염기서열로 디자인된 부스터 프라이머(booster primer)를 포함하는 핵산 등온 중합 반응용 조성물을 등온에서 중합반응시켜 증폭산물을 정량하는 것을 특징으로 하는 압타머 특이적 표적물질의 정량방법.
제23항에 있어서, 상기 압타머의 표적물질은 DNA, 단백질 및 생리활성 물질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 압타머의 표적물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 검출대상 시료는 이중가닥 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 엑소뉴클레이즈 기능이 없고 DNA 치환 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 핵산중합효소는 Vent (exo-) DNA polymerase, Bst polymerase, Klenow fragment 및 Bsu DNA polymerase로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 중합반응 온도는 55∼65℃인 것을 특징으로 하는 방법.