CN108051588A - 用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，该方法包括：(1)在微流控芯片的基片表面进行聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理；(2)基片表面抗体的修饰。目前用于抗体固定的最常见的材料是玻璃片，经过简单的两三步化学处理就可以实现对抗体的共价结合固定，成本很低，性质较稳定，但玻璃材料用于芯片的批量生产有一定难度，其加工工艺与条件要求比常见的塑料注塑加工高。而常见的塑料材料不像玻璃易于表面处理，实现抗体固定，两类材料各有优劣势。而本发明实现抗体固定对材料无特定要求，通用性很好，对玻璃、塑料、金属、陶瓷等材料都可实现表面处理，抗体可在基片上保持检测活性90天以上的优点。

Description

用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法
技术领域
本发明涉及流体样品检测技术领域，更确切地说涉及一种用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法。
背景技术
分析血液中的成分以及其含量是现代医学检测中最基础的项目。全血是由液态血浆和血细胞组成，由于血细胞或者血红素对光谱分析造成很大的干扰，通常需要把血浆从血液样品中分离出来，然后用于生化或免疫诊断分析。目前，临床上最常用的分离血浆方法有离心法和过滤法，但两种方法都有一定的不足之处。离心法设备体积庞大，操作复杂；过滤法分离效率低，样品易污染。
目前，POCT(Point Of Care Testing，即时检测)技术得到越来越广泛的应用。POCT要求在采样现场进行快速检测分析，省去样品在实验室中的复杂耗时的处理程序，检测设备和试剂方便携带、操作简单。近年来，微全分析***(μTAS)因微型化、集成化和智能化的特点而备受关注，尤其是分析速度快、样品消耗低等优势，微全分析***为医学检测提供了更好的检测平台。微流控芯片作为微全分析***的核心技术，可以将样品分离、混合、反应、检测等操作集成在数平方厘米的面积上，非常适合用于POCT中。因此，如何在微流控芯片上实现血浆的分离与其中成分的定量检测，是本领域亟待解决的技术问题；免疫检测是微流控芯片技术的一个重要应用方向，本发明中的微流控芯片在全血分离后完成免疫检测，实现一次加样读取结果的方便性。在免疫检测中，抗体与待测抗原发生特异性结合，是检测样本中抗原的关键因素，芯片上抗体的活性和均一性对检测反应性能有着重要影响，所以抗体与底片之间固定的牢固性直接影响芯片性能的好坏；目前，微流芯片的抗体一般是固定在玻璃制备的底片上，抗体固定方式主要有物理吸附和共价键结合两种，物理吸附在抗体固定密度、稳定性和特异性等性能上均不如共价结合，目前的抗体固定方式以共价结合为主；目前用于抗体固定的最常见的材料是玻璃片，经过简单的两三步化学处理就可以实现对抗体的共价结合固定，成本很低，性质较稳定，但玻璃材料用于芯片的批量生产有一定难度，其加工工艺与条件要求(比如成型温度，组件封装等)比常见的塑料注塑加工高；而常见的塑料材料却又不能像玻璃那样易于表面处理、实现抗体固定，因此，两类材料各有优劣势。
找到一种对固相载体材料无特定要求、通用性好的表面修饰方法，且还能与抗体实现牢固固定，保证抗体的活性和均一性成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，该方法使得固相载体材料可以不仅仅局限于玻璃，而且还能保证抗体与底片结合的牢固性和抗体的活性与均一性。
本发明的技术解决方案是，提供一种用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，该方法包括：(1)在微流控芯片的基片表面进行聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理；(2)基片表面抗体的修饰。
作为改进，所述的在微流控芯片的基片表面进行聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理步骤，具体为：
(1.1)将基片材料浸泡到Tris+盐酸多巴胺溶液中，持续缓慢向溶液中通入空气，
室温条件下反应12-24hr(小时)，在基片材料表面形成一层聚多巴胺涂层；
(1.2)将步骤(1.1)中的基片用清水超声清洗，清洗掉物理吸附在基片表面的聚多巴胺；
(1.3)将清洗过的基片材料浸泡到5％的戊二醛水溶液中，室温条件下反应0.5-1.5hr，在聚多巴胺涂层上形成一层醛基基团；
(1.4)将步骤(1.3)中的基片用清水清洗2-4次，35-40℃干燥0.5-1.5hr待用。
作为改进，所述的基片表面抗体的修饰步骤，具体为：
(2.1)在经过聚多巴胺涂层和戊二醛修饰过的基片表面上涂覆BNP项目(或CRP项目)检测抗体，3-40℃反应1.5-2.5hr，使检测抗体与基片形成共价连接，固定在基片表面；
(2.2)将步骤(2.1)中的基片浸泡到清洗液中，清洗3-6min，再用清水清洗1-3次，清洗掉未结合的多余BNP(脑钠肽)或CRP(C-反应蛋白)检测抗体；
(2.3)将步骤(2.2)中的基片浸泡到BSA封闭液中，室温下封闭1.5-2.5hr，将基片上检测区域以外的活性基团封闭起来，防止非特异性反应产生的干扰；
(2.4)封闭结束后，将基片重复(2.2)的清洗步骤，清洗之后放置在35-40℃干燥0.5-1.5hr；
(2.5)抗体固定到基片表面后，置于湿度小于20％的环境中保存待用。
本发明步骤(1.1)的基片材料为玻璃、塑料、陶瓷、金属等。
本发明步骤(1.1)的Tris+盐酸多巴胺溶液为10mM pH＝8.5Tris+0.2％盐酸多巴胺。
本发明步骤(2.2)的清洗液为10mM pH＝7.4PBS+0.05％Tween20+0.1％NaN3。
本发明步骤(2.3)的BSA封闭液为10mM pH＝7.4PBS+0.3755％Gly+0.1％NaN3+1％BSA。
本发明的室温为20-29℃。
上述各个组分为质量百分比。
采用以上方案后，本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片，与现有技术相比，具有以下优点：
1.目前用于抗体固定的最常见的材料是玻璃片，经过简单的两三步化学处理就可以实现对抗体的共价结合固定，成本很低，性质较稳定，但玻璃材料用于芯片的批量生产有一定难度，其加工工艺与条件要求(比如成型温度，组件封装等)比常见的塑料注塑加工高。而常见的塑料材料不像玻璃易于表面处理，实现抗体固定，两类材料各有优劣势。而本发明在实现抗体固定的同时对材料又无特定要求，因此通用性很好，对玻璃、塑料、金属、陶瓷等材料都可实现表面处理，抗体可在基片上保持检测活性90天以上。
2.本发明抗体固定处理过程在室温下即可实现对基片的涂覆处理，无需加热固化，因此大大减小了对抗体性能的干扰。
附图说明
图1为本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片的***结构示意图。
图2为本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片的流道的结构示意图。
图3为本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片的分离过程图。
图4CRP项目检测条带荧光显微镜图片。
图中所示：1、进样区，2、沉降区，2.1、进样部，2.2、沉降部，3、混合区，4、检测区，5、废液区，6、盖片，7、开口，8、底片，9、检测条，11、清洗液储存区，12、清洗液管道，13、清洗液槽，14、清洗液杯，15、刺破件，16、折线形流道，17、定量加样管。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
如图1至图2所示，本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片包括芯片主体，所述的芯片主体上设有样品流道。所述的样品流道包括依次连接的进样区1、沉降区2、混合区3、检测区4及废液区5。本具体实施例中，所述的芯片主体包括盖片6和底片8。所述的进样区1、沉降区2、混合区3、检测区4及废液区5均设于所述的盖片6上，所述的检测区4的底部设有开口7，所述的底片8连接在所述的盖片6的下侧，所述的底片8与所述的开口7相对应的位置处设有检测条9。所述的检测区4沿盖片6长度方向设置，所述的检测条9沿底片8宽度方向设置。所述的检测条9设有两条，该两条检测条9相互平行设置。所述的盖片6的底部设有用于容置所述的检测条9的凹槽。所述的盖片6与所述的底片8组装后，所述的检测条9容置在所述的凹槽内。本具体实施例中，所述的检测条9的长度为10-30mm，宽度为1-10mm。
所述的盖片6的微通道和微结构的加工工艺包括模塑法、热压法、激光刻蚀法和软光刻法等，本发明的实施例中优选软光刻法来制作微流控芯片。即以抛光硅片为基底材料，以SU-8光刻胶为掩膜层，经曝光显影等加工流程制作出盖片的模具；将PDMS(Sylgard 184)浇注在模具上，加热固化，从模具上剥离得到PDMS芯片；在加样口和废液区位置打孔，即得到盖片。
本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片使用前，所述的沉降区2预先挥干促沉降试剂，即预先在沉降区2放入促沉降试剂，静置一段时间，使促沉降试剂的水分挥发掉；所述的混合区3中预先挥干带荧光标记的一抗试剂，即预先在混合区3放入带荧光标记的一抗试剂，静置一段时间，使带荧光标记的一抗试剂的水分挥发掉；在检测区4的检测条上预先固定检测二抗，具体方法为：在醛基片上T线和C线位置分别涂上2mg/mL的包被抗体和兔IgG，在37℃下固定2小时；用清洗液(pH7.4 10mM PBS+0.05％Tween20)清洗3次，纯水清洗1次；将醛基片浸泡到封闭液(pH7.4 10mM PBS+0.3755％Gly+1％BSA+0.1％NaN3)中，室温下封闭2小时；用清洗液清洗3次，纯水清洗1次，置于低湿度环境中干燥过夜。
使用时，在所述微流控芯片的废液区5外接负压泵或蠕动泵，通过空气压力差驱动样本流过整个芯片。
本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片的检测方法，包括如下步骤：
步骤1、定量加样管接触全血样品，全血样品在毛细作用下完成定量进样。
步骤2、将微流控芯片放入配套仪器中，在废液区接口加上负压驱动，样本进入沉降区与挥干的促沉降剂混合并反应，样本中的血细胞快速沉降，经过一段时间后，空气从加样管进入将血细胞与血浆隔开，血浆流入混合区，血细胞全部停留在沉降区。
步骤3、血浆在混合区复溶挥干的荧光一抗，配合混合区的流道结构，二者混合均匀且发生反应，形成抗原-荧光一抗免疫复合物进入检测区。
步骤4、在检测区免疫复合物与固定在检测条上的二抗发生特异性反应，形成二抗-抗原-荧光一抗的夹心结构。
步骤5、待血浆混合物全部流过检测区之后，清洗液分支通道开启，清洗液流入检测区，将未结合的荧光一抗冲洗带入废液区。
步骤6、通过检测荧光强度，实现样品中抗原的定量检测。
图3为本发明的用于全血样品分离检测的微流控芯片的分离过程图。血液在负压驱动下流入沉降区域，由较窄的直管道进入较宽的沉降部之后，流动速度迅速降低，配合沉降剂的作用，血细胞聚团在重力下沉降，血浆在整个流体的前部分离出来。血样全部进入沉降部后，空气随之进入，将血细胞与血浆隔离成完全分开的两部分，血浆继续流动进行后续的反应，血细胞留在沉降区停止前进。
本发明基片进行抗体固定修饰的步骤为：
(一)基片表面聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理步骤：
1.将基片材料浸泡到Tris+盐酸多巴胺溶液(10mM pH＝8.5Tris+0.2％盐酸多巴胺)中，持续缓慢向溶液中通入空气，室温条件下反应12-24hr，在基片材料表面形成一层聚多巴胺涂层；
2.将步骤1中的基片用清水超声清洗3min，清洗掉物理吸附在基片表面的聚多巴胺。
3.将清洗过的基片材料浸泡到5％的戊二醛水溶液中，室温条件下反应1hr，在聚多巴胺涂层上形成一层醛基基团。
4.将步骤3中的基片用清水清洗3次，45℃干燥1hr待用。
(二)基片表面抗体修饰步骤：
1.在经过聚多巴胺涂层和戊二醛修饰过的基片表面上涂覆BNP项目(或CRP项目)检测抗体，37℃反应2hr，使检测抗体与基片形成共价连接，固定在基片表面。
2.将步骤1中的基片浸泡到清洗液(10mM pH＝7.4PBS+0.05％Tween20+0.1％NaN3)中，清洗5min，再用清水清洗1次，清洗掉未结合的多余BNP(或CRP)检测抗体。
3.将步骤2中的基片浸泡到BSA封闭液(10mM pH＝7.4PBS+0.3755％Gly+0.1％NaN3+1％BSA)中，室温(25±5℃)下封闭2hr，将基片上检测区域以外的活性基团封闭起来，防止非特异性反应产生的干扰。
4.封闭结束后，将基片重复步骤2的清洗步骤。清洗之后放置在45℃干燥1hr。
5.抗体固定到基片表面后，置于湿度小于20％的环境中保存待用，抗体可在基片上保持检测活性90天以上。
(三)抗体固定基片使用方法：
1.配合之前申请的芯片结构专利，在芯片盖片的混合区前段涂抹CRP荧光微球复合物，置于干燥处，挥发干燥后待用。
2.将芯片盖片与底片贴合组装起来，在进样口加入待检测样本；废液口施加负压，样本在芯片中依次流过沉降区(血细胞沉降，血浆分离后继续流动)、混合区(步骤1中挥干的荧光复合物在血浆中溶解，并与待测抗原反应)和检测区(检测区的检测条带处固定有检测抗体)，最终通过荧光强度值推算样本中抗原的浓度。
如附图4所示：检测条带的实验效果，红色的条带(专利附图不允许彩色，因此此处红色条带在附图中是两条相对较白的长方形条带)是抗体固定的区域，条带荧光信号边界清晰、均匀性好，其他未固定抗体的区域无荧光信号，噪声很低；荧光条带亮度越高，表明样本中待测抗原浓度越高，所以从该附图显示的效果充分说明本发明实施例制备的抗体与基片结合牢固。本专利中提到的方法与微阵列芯片技术中使用的方法很相似，免疫检测或者DNA检测领域的技术人员可以明确图中显示的信息和结论。

Claims (8)

1.一种用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：该方法包括：(1)在微流控芯片的基片表面进行聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理；(2)基片表面抗体的修饰。
2.根据权利要求1所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：所述的在微流控芯片的基片表面进行聚多巴胺涂层修饰与戊二醛活化处理步骤，具体为：
(1.1)将基片材料浸泡到Tris+盐酸多巴胺溶液中，持续缓慢向溶液中通入空气，室温条件下反应12-24hr，在基片材料表面形成一层聚多巴胺涂层；
(1.2)将步骤(1.1)中的基片用清水超声清洗，清洗掉物理吸附在基片表面的聚多巴胺；
(1.3)将清洗过的基片材料浸泡到5％的戊二醛水溶液中，室温条件下反应0.5-1.5hr，在聚多巴胺涂层上形成一层醛基基团；
(1.4)将步骤(1.3)中的基片用清水清洗2-4次，35-40℃干燥0.5-1.5hr待用。
3.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：步骤(1.1)的基片材料为玻璃、塑料、陶瓷或金属。
4.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：步骤(1.1)的Tris+盐酸多巴胺溶液为10mM pH＝8.5Tris+0.2％盐酸多巴胺。
5.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：所述的基片表面抗体的修饰步骤，具体为：
(2.1)在经过聚多巴胺涂层和戊二醛修饰过的基片表面上涂覆BNP项目或CRP项目检测抗体，3-40℃反应1.5-2.5hr，使检测抗体与基片形成共价连接，固定在基片表面；
(2.2)将步骤(2.1)中的基片浸泡到清洗液中，清洗3-6min，再用清水清洗1-3次，清洗掉未结合的多余BNP或CRP检测抗体；
(2.3)将步骤(2.2)中的基片浸泡到BSA封闭液中，室温下封闭1.5-2.5hr，将基片上检测区域以外的活性基团封闭起来，防止非特异性反应产生的干扰；
(2.4)封闭结束后，将基片重复(2.2)的清洗步骤，清洗之后放置在35-40℃干燥0.5-1.5hr；
(2.5)抗体固定到基片表面后，置于湿度小于20％的环境中保存待用。
6.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：步骤(2.2)的清洗液为10mM pH＝7.4PBS+0.05％Tween20+0.1％NaN3。
7.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：步骤(2.3)的BSA封闭液为10mM pH＝7.4PBS+0.3755％Gly+0.1％NaN3+1％BSA。
8.根据权利要求2所述的用于全血样品分离检测的微流控芯片上的抗体固定方法，其特征在于：所述的室温为20-29℃。
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