KR101634608B1 - 개선된 오프―레이트를 갖는 압타머를 생성하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생산하기 위한 개선된 SELEX 방법 및 표적 분자에 결합 및 공유적으로 교차결합할 수 있는 광반응성 압타머를 생산하기 위한 개선된 광SELEX 방법을 기술한다. 본 발명은 분해 속도가 느린 압타머와 광압타머를 생산하는 방법을 기술한다. 본 발명은 나아가 종래의 방법을 사용하여 수득된 것보다 분해 속도 상수가 느린 압타머와 광압타머를 기술한다. 부가하여, 본 발명은 분열성 요소, 검출성 요소와 캡쳐 혹은 고정화 요소를 포함함으로써 다양한 기능성을 포함하는 압타머 구성을 기술한다.

Description

개선된 오프―레이트를 갖는 압타머를 생성하는 방법{METHOD FOR GENERATING APTAMERS WITH IMPROVED OFF―RATES}
이 출원은 2007년 7월 17일자로 제출된 미국 가출원 번호 60/950,281, 2007년 7월 17일자로 제출된 미국 가출원 번호 60/950,293, 2007년 7월 17일자로 제출된 미국 가출원 번호 60,950,283, 2008년 2월 26일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/031,420, 2008년 5월 8일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/051,594의 이점을 청구한다. 이 출원은 또한 각각 2007년 1월 16일자로 제출된 미국 출원 일련 번호 11/623,580 및 미국 출원 일련 번호 11/623,535의 일부 계속 출원이다. 각각의 이들 참조는 그 자체가 참조로서 본원에 통합된다.
본 발명은 특성이 개선된 압타머와 광압타머의 생성방법 및 그것에 의해 생성된 개선된 압타머와 광압타머에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 관심 표적에 대하여 고도로 특이적인 느린 오프-레이트(off-rate) 압타머에 관한 것이다. 본 발명은 느린 오프-레이트를 가진 압타머의 조성뿐만 아니라 그 선별 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 검출방법을 위한 기능이 개선된 압타머의 구조물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개선된 압타머에 의해 가능한 응용에 관한 것이다.
하기의 기술은 본 발명에 관련된 정보의 개요를 제공하며, 본원에 제공된 임의의 정보 또는 언급된 간행물들은 본 발명에 현재 청구된 것에 대한 종래기술일뿐 특허에 관한 것은 아니다.
SELEX 방법은 표적 분자에 높은 특이성으로 결합할 수 있는 핵산 분자의 선택을 위한 시험관 내(in vitro) 방법이며, 미국특허 제 5,475,096 호("Nucleic Acid Ligands")와 미국특허 제 5,270,163호(WO 91/19813호, "Nucleic Acid Ligands")에 기재되어 있고, 상기 특허는 여기에서 특히 참고한다. 이들 특허는 SELEX 특허로 총체적으로 본 명세서에서 언급하고 있으며, 바람직한 표적 분자에 대한 압타머를 제조하는 방법을 기술하고 있다.
기본 SELEX 방법은 많은 특정의 목적을 달성하기 위하여 수정되어 왔는데, 예를 들어, 미국특허 제 5,707,796 호("Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure,")에는 구부러진 DNA와 같은 명확한 구조적인 특징을 가진 핵산 분자를 선택하기 위해 겔 전기영동법에 의한 콘주게이션에서 SELEX 프로세스의 사용이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,580,737 호("High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine,")에는 카운터(Counter)-SELEX로 명명된, 가깝게 연관된 분자들 사이를 식별할 수 있는 고도의 특이성을 지닌 압타머를 확인할 수 있는 방법이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,567,588 호("Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX,")에는 표적 분자에 대한 높고 낮은 친화성을 가진 올리고뉴클레오티드 사이에 고효율적으로 분리를 하는 SELEX-기초(based) 방법이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,496,938 호("Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev,")에는 SELEX 법이 수행된 후에 개선된 압타머를 얻기 위한 방법이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,705,337 호("Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX,")에는 압타머와 그것의 표적의 전자쌍을 공유결합 하기 위한 방법이 기재되어 있다.
상기 SELEX 프로세스는 개선된 체내(in vivo)의 안정성 또는 개선된 전달 특성과 같은 리간드의 개선된 특징을 지닌 개질된 뉴클레오티드를 포함한 높은 관련성의 압타머의 확인을 아우른다. 예를 들면, 리보스 및/또는 인산염 및/또는 기본기에서의 화학적 치환을 포함한다. 개질된 뉴클레오티드를 포함하는 SELEX 프로세스-아이덴티파이드(identified) 압타머는 미국특허 제 5,660,985호("High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides") 에 피리미딘의 5'- 및 2'- 위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 기재되어 있다. 미국특허 제 5,580,737 호에는 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe)와 함께 개질된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 포함된 고도로 특별한 압타머가 언급되어 있다.
SELEX 프로세스의 다른 변형(modifications)은 미국특허 제 5,580,737 호, 제 6,001,577 호 및 제 6,291,184 호에 각각("Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX;") 기재되어 있으며, 미국특허 제 6,458,539 호("Photoselection of Nucleic Acid Ligands") 에서도 볼 수 있다. 상기 특허들은 표적 분자의 결합 능력 및/또는 광가교화 및/또는 광활성을 지닌 광반응성 기능기를 포함하는 압타머를 선택하기 위한 다양한 SELEX법이 ("the PhotoSELEX Patents")로 광범위하게 언급되었다. 상기 결과물인 광반응 압타머들은 광가교 압타머들 또는 광압타머들로 언급되어 있다.
상기 SELEX와 광SELEX 프로세스는 유용하지만, 실험기구내(in vitro) 실험으로부터의 선택기술은 압타머의 개선된 특성을 이끄는 프로세스가 필요하다. 예를 들면, 압타머를 위한 자연적으로 발생하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드보다 결합하는 친밀도가 좋은 표적 분자가 필요할 뿐만 아니라 상기 압타머의 생산 방법도 필요하다. 예를 들어, 시험관내(in vitro) 분석, 진단, 치료 또는 이미징(imaging) 어플리케이션(application)과 같은 많은 적용을 위해, 압타머/표적 분자 친밀 복합물로부터 느린 분해 속도를 가진 압타머 생산과 관련 있는 것이다. 몇몇 기술은 국제공개특허(WO) 99/27133 호와 미국특허 제 2005/0003362 호에서 볼 수 있는 것과 같이 시약 생산을 위한 방법과 같이 제안되었다. 그러나 상기 선택 프로세스는 표적과 함께 빠른 결합 운동력(fast on-rates)을 가진 시약의 선택과 느린 오프-레이트를 가진 시약의 선택을 구별하지 못한다.
그리하여, 표적에 대한 빠른 결합속도를 가진 압타머를 선택하는 것을 방지하면서 느린 오프-레이트를 선택하는 신규한 방법 및 기술이 요구되고 있다.
마침내, 다른 만들어진 기능들을 포함하는 압타머 구조체가 필요하다. 상기 기능들은 고정을 위한 태그(tag), 탐지를 위한 라벨(label), 분리의 촉진 또는 조절하는 수단 등을 포함할 수 있다.
본 발명은 신규한 압타머, 상기 압타머의 제조방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 느린 오프-레이트(느린 분해속도) 압타머와 C-5가 개질된 피리미딘을 포함하는 느린 오프-레이트 압타머, 및 희석, 경쟁물질의 첨가 또는 이들의 조합에 의한 느린 오프-레이트 압타머의 선별 방법에 관한 것이다. 게다가, 단백질과 펩티드와 같은 다양한 표적에 대한 느린 오프-레이트 압타머가 기술되어 있다. 느린 오프-레이트 압타머는 독특적 구조적 특징과 녹는점을 가진다. 본 발명은 광반응성기를 가진 느린 오프-레이트 압타머, 폴리-음이온 물질의 존재에 대해 불응하는(refractory) 압타머와 상기 압타머들의 선별방법뿐만 아니라 여러 적용분야에서 그들의 유용성이 개선된 다양한 기능을 가진 압타머에 관하여 기재하고 있다.
본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생성하는 개선된 SELEX 방법을 기재한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 종전의 SELEX법에 의해 획득된 압타머와 광압타머보다 각각의 표적 분자로부터 보다 느린 분해속도를 지닌 압타머 및/또는 광압타머의 제조 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 대체물질 혼합물을 표적 분자에 접촉시켜 핵산-표적 복합체가 형성되게 한 후에 느린 오프-레이트 농축 공정이 도입되는데, 여기에서 빠른 분해속도를 가진 핵산-표적 복합체가 분해될 것이며, 재생되지 않는 반면에, 느린 분해속도를 가진 복합체는 온전하게 유지될 것이다. 느린 오프-레이트 농축과정을 도입하는 방법은 핵산 및 표적 분자의 혼합물에 경쟁물질을 첨가하고, 핵산 및 표적 분자의 혼합물을 희석, 또는 이들의 조합하여 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 압타머와 광압타머에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시예에서, 본 방법은 핵산의 내체물질 혼합물을 준비하는 단계; 표적 분자에 대하여 최고의 상대 친화도를 갖는 핵산이 우선적으로 결합된 표적 분자에 대체물질 혼합물을 접촉시키고 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; 상대적으로 빠른 분해 속도를 가진 핵산-표적 분자 복합체의 분해를 유도하는 느린 레이트-오프 농축과정을 도입하는 단계; 대체물질 혼합물에서 자유 핵산으로부터 잔존하는 결합된 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; 및 표적 분자에 결합된 핵산을 식별하는 단계를 포함한다. 상기 프로세스는 낮은 분해 속도를 사진 핵산-표적 분자 조성물을 생산하는, 핵산을 가진 강화된 핵산 복합체를 생산하기 위해 표적 분자를 결합하는 핵산 증폭의 반복 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 핵산의 대체물질 혼합물은 낮은 분해 속도를 가진 변형된 핵산-표적 복합체 형성에 도움을 줄 수 있는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 핵산을 포함한다. SELEX법을 수행하는 개선된 방법은 변형된 뉴클레오티드, 광활성 또는 다른 기능기 또는 광활성기를 위한 플레이스홀더(placeholder)들을 포함하는 뉴클레오티드를 포함하며, 동시에 즉각적으로 출원한 2008년 7월 17일에 출원한 미국출원번호 제 12/175,388 호("Improved SELEX and PHOTOSELEX")에 개시되어 있다. 플레이스홀더(placeholder) 뉴클레오티드는 광반응성이 없는 개질된 뉴클레오티드로 소개 되어진 미드-셀렉스(mid-SELEX) 또는 포스트-셀렉스(POST-SELEX)로 쓰일 수 있다.
압타머를 생성하기 위한 다양한 방법과 단계는 (1) 표적 분자와 결합 또는 (2) 표적 분자와 그 뒤 UV와 가시광선 영역의 빛이 조사된 표적 분자를 가진 전자쌍 공유결합 형태의 결합이다.
또 다른 측면에서, 결합 및/또는 가교결합된 표적 분자를 통해 표적 분자의 생물활성이 변형된 압타머를 생성하기 위한 다양한 방법과 단계가 있다. 하나의 예로 유일한 표적 분자와 관련되거나 특정 질병 프로세스와 관련된 압타머는 확인되었다. 상기 압타머는 실험기구내 또는 체내에서 진단 시약으로 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 압타머는 각각 투여된 질병 상태 및 체내의 질병을 처리하는데 사용된 표적 분자와 관련이 있다. 상기 압타머들과 광압타머들은 진단, 이미징(imaging), 높은 처리량 심사, 또는 표적 검증 기술 또는 진행, 또는 압타머, 올리고뉴클레오티드, 항체 및 리간드의 분석에 제한없이 사용할 수 있음을 확인 할 수 있었다. 예를 들면, 상기 압타머들과 광압타머는 미국출원번호 제 12/175,446호("MμLtiplexed Analyses of Test Samples")에 기재된 것으로 확인되었다.
이전의 압타머들은 다양한 목적을 위한 본 발명의 느린 오프-레이트의 특성을 갖지 못했다. 거의 모든 방법에서, 느린 오프-레이트 압타머는 느린 오프-레이트 특성을 지닌 것을 선택하지 않은 압타머와 비교하여 개선된 성능을 가질 것이다.
압타머(aptamer) Macugen® (예를 들어 미국특허 제 6,168,778 호; 미국특허 제 6,051,698 호; 미국특허 제 6,426,335 호; 및 미국특허 제 6,962,784를 보면 전부 레퍼런스(reference)에 의해 전부 인용됨) 황반 변성(macμLar degeneration)을 치료하는 것으로 승인 되었으며, 그것의 밀접함 때문에 VEGF를 위해 작용하였다. 다른 압타머들은 연구 및/또는 치료제로 사용되기 위한 발전을 해오고 있다. 압타머들은 많은 진단과 이미징(imaging) 응용(예를 들어, 미국특허 제 5,843,653호; 미국특허 제 5,789,163호; 미국특허 제 5,853,984호; 미국특허 제 5,874,218호; 미국특허 제 6,261,783호; 미국특허 제 5,989,823호; 미국특허 제 6,177,555호; 미국특허 제 6,531,286호 각각은 여기에서 참고로 전부 인용됨), 철저한 스크리닝(screening)(예를 들어, 미국특허 제 6,329,145 호; 미국특허 제 6,670,132호; 미국특허 제 7,258,980 호 각각은 여기에서 참고로 전부 인용됨)과 PCR 키트(예를 들어, 미국특허 제 6,183,967 호; 미국특허 제 6,020,130; 미국특허 제 5,763,173; 미국특허 제 5,874,557; 미국특허 제 5,693,502호 각각은 여기에서 참고로 전부 인용됨)에 사용된 느린 오프-레이트 특성을 지닌 것으로 선택되지 않았고, 본 발명의 상기 느린 오프-레이트 압타머들은 진단, 치료, 이미징(imaging) 또는 항체 형성을 위한 방법, 압타머와 사용된 리간드와의 결합에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개선된 방법에 의해 발견된 압타머들과 광압타머들을 제공하는데, 압타머와 광압타머를 포함하는 진단 키트와, 치료, 진단에 사용되는 압타머들과 광압타머들을 제공한다. 상기 참신한 압타머들과 광압타머들은 상기에서 상술한 방법에 의해 발견되며, 다양한 분석에 포함하여 사용되며, 평면 분석, 비드와 기타 고체 지지체 타입의 분석에도 사용된다. 상기 분석은 생활과학 조사 응용, 의료 진단 응용, ALONA와 UPS 분석 및 체내 이미징(imaging) 응용을 포함하는 다양한 분야에서 사용된다.(예를 들면 병 진단 테스트 또는 의료 예방 테스트인 "wellness") 몇몇 응용을 위해 복합 분석에 압타머들과 광압타머들이 사용된다.
몇몇 실시예에서, 상기 느린 오프-레이트 압타머(또는 광압타머)는 정맥주사 또는 CAT 스캔 및 다른 이미징(imaging) 적용을 위한 구강 대조(contrast) 시약으로 사용될 수 있다. CAT 스캔은 근육과 뼈의 장애 진단, 혈전 탐지, 체내 출혈 탐지 및 암 등과 같은 질병의 모니터링하는데 이용된다. 상기 느린 오프-레이트 압타머는 요오드(iodine), 바륨(barium) 또는 가스트로그펜(gastrograffin)과 같은 CAT 스캔 검출성 성분으로 라벨링 될 수 있다. 검출성 성분을 휴대하는 것 이외에 상기 압타머는 특정 조직 또는 원하는 표적에 대한 성분이 되도록 디자인될 수 있다. 상기 압타머는 상기 검출성 성분을 한 곳에 집중시키거나 국소화시켜 이용가능한 신호의 증가에 의한 신호 대 잡음 비율을 향상시킨다. 압타머의 오프-레이트가 충분하게 느릴 수 있기 때문에, 스캔시간이 증가할 수 있고, 스캔의 신호 대 잡음 비율이 개선될 수 있다. 표적에 대한 상기 압타머의 특이성은 이들 이미지 적용에서 신호 대 잡음 비율 또한 개선시킬 수 있다.
한 실시예에서, 느린 오프-레이트 압타머는 반자성 또는 상자성 물질로 라벨링된다. 이 실시예에서, 라벨링된 압타머는 자기 공명 이미징(MRI)의 성능을개선시키는 데에 사용될 수 있다. MRI는 좁고, 선택적인 지역 및 높은 수분량을 포함하는 조직의 이미징(imaging), 및 혈류량을 모니터링하는 데에 특히 아주 적합하다. 이 느린 오프-레이트 압타머의 특이성은 원하는 조직 섹션에 대한 MRI 시약의 국소화를 개선시킬 수 있다. 이와 유사하게 느린 오프-레이트 압타머는 PET 스캔에 사용되는, 예를 들어 플루오린(fluorine), 탄소11, 산소15 또는 질소13과 같은 물질로 개질될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 압타머는 적외선 이미징(imaging)에 사용될 수 있는 IR 활성 물질로 라벨링될 수 있다. 또한 느린 오프-레이트 압타머는 다른 이미징(imaging) 양식의 사용을 위해 라벨링된다는 것이 또한 고려된다.
본 발명의 한 실시예에서, 상기 느린 오프-레이트 압타머는 매우 민감하게 사용되며, 다양한 시험관내(in vitro) 진단 방법 또는 진단키트에 투입되는 구체적인 시약에 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 느린 오프-레이트 압타머는 많은 전염성 항체 또는 다른 타입의 질병 탐지 방법으로 사용되었다. 상기 압타머는 탐지 물질 및 고정화 또는 캡쳐(capture)요소를 포함한 관심있는 표적을 향한다. 상기 실시예에서, 상기 키트로부터의 압타머는 의료 시료와 혼합된 후에 여러 분석물로 이용되었다. 본 발명의 한 실시예에서, 상기 압타머는 형광물질(fluorescence)과 같은 진단 접합물질(label)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 분석물은 형광 해소(fluorescence quenching), 교배(hybridization) 방법, 세포계수의 흐름(flow cytometry), 물질 분광학(spectroscopy), 금지(inhibition) 또는 경쟁(competition) 방법, 올리고뉴클레오티드가 가교된 효소 분석, SPR 및 애버네슨트(evanescent) 웨이브(wave)법 등을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 압타머는 용액에서 키트로 제공되었다. 다른 실시예에서, 상기 키트의 압타머는 시료를 테스트하기 위한 분석에 결합된 고체 지지체에 고정되어 있다. 다양한 실시예에서, 상기 고체 지지체는 하나 또는 그 이상의 관심 표적의 탐지를 위한 것이다. 또 다른 실시예에서, 상기 키트는 관심 표적 추출, 압타머 증폭을 위한 시약, 세척 시약 및 탐지 시약 등의 시약을 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 느린 오프-레이트 압타머들은 치료 이미징(imaging) 연구에 이용되었다. 새로운 치료 복합체가 발전하는 동안, 예를 들어, 바이오분리(biodistribution), 실패율(washout rate), 바이오어빌리티(bioavaility), 인체내(in vivo) 약물/표적의 상호작용과 같은 상기 조성물의 확실한 특성을 평가하기 어려웠다. 만약 알맞은 탐지 물질이 치료용 복합체로 개질되어 사용된다면 이미징(imaging) 연구는 상기 모든 특성을 평가하는데 사용될 수 있을 것이다.
비록 이것의 표적과 함께 상호작용하는 능력을 빈번하게 억제하는 치료복합체의 직접 개질이지만, 복합체의 치료 효능 중 원하지 않는 효과를 최소화하는 동안 효능, 압타머의 소형 사이즈 및 고객의 수요에 맞는 특별함, 치료 복합체(예를 들어, 항체 또는 다른 단백질 기초 치료)로의 가장 적합한 반응이 줄어 든다. 바이오분리(biodistribution), 실패율(washout rate)과 같은 특징의 평가에서, 상기 압타머/치료 복합체는 연장된 기간 동안 생존하게 되었다. 상기 연구들은 치료 복합체가 느린 오프-레이트 압타머인 것으로 단순화할 수 있다. 다양한 실시예에서, 치료, 조영, 및 감지 적용처에 사용되는 압타머는 예를 들어, 2'-플루오로 및 다른 개질과 같은 다양한 개질을 포함하고, 다양한 요소에 노출된 압타머의 안정성이 증가하는데, 이는 현재의 단순한 샘플 또는 예를 들면, 핵산분해효소(nucleases) 및 다른 샘플 또는 체액(bodily fluid)요소와 같은 인체내(in vivo) 요소를 말한다.
본 발명에 따르면 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생산하기 위한 개선된 SELEX 방법 및 표적 분자에 결합 및 공유적으로 교차결합할 수 있는 광반응성 압타머를 생산하기 위한 개선된 광SELEX 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 분해 속도가 느린 압타머와 광압타머를 생산하는 방법을 제공할 수 있고, 나아가 종래의 방법을 사용하여 수득된 것보다 분해 속도 상수가 느린 압타머와 광압타머를 제공할 수 있다.
도 1A는 SELEX법의 모범 예를 나타낸 것이며, 도 1B는 느린 오프-레이트 농축 프로세스 또는 프로세스의 모범 예를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 대표적인 압타머 견본, 프라이머(primer), 및 대체 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 표준 고체상 합성 기술에 의한 것이다. B는 dT-비오틴이다.
도 3은 실시예 2에 나타낸 바와 같이 느린 오프-레이트 압타머 농축 프로세스를 포함하지 않고(도 3A) 그리고 포함하여(도 3B) 선택된 친화 압타머에 대한 분해율 상수의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 4A 및 4B는 실시예 2에 나타낸 선택 프로세스에서 혼합 또는 다양한 단계의 수행을 위해 준비된 올리고뉴클레오티드를 사용한 것을 나타낸 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 표준 고체상 합성 기술에 의한 것이다. BrdU(5-브로모-dDTP), 안트라퀴논(AQ), 및 프솔라렌(Psor) 발색단은 포스포라미네이트로 구매한 것이며, 합성하는 동안 포워드 프라이머의 5' 말단(terminus)을 수용한 것이다. 4-아지도(azido)-2-니트로-아닐린(ANA)은 파라-니트로-페닐-카보네이트 유도체로 준비하였으며, 합성 후에 5'헥실아민 포스포라미다이트와 커플링하였다. 두 대체물질 혼합물 서열은 1 및 2로 지정하여 실시예에서 사용하였다. B=dT-비오틴. (도 4A) 템플레이트 1은 단지 5'-BrdU, AQ, 및 ANA를 포함하는 대체물질 혼합물과만 사용되었으며, (도 4B) 템플레이트 2는 단지 실시예 2를 위한 5'-Psor를 포함하는 대체물질 혼합물과만 사용되었다.
도 5는 도 4A 및 4B에 나타낸 포워드 프라이머(primer)의 5'-말단에 결합된 발색단의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3에 나타난 5'-고정 광SELEX를 사용한 TIMP-3 5'ANA/BndU 농축 라이브러리(library)의 가교결합 활성의 PAGE 분석을 나타낸 것이다. 상기 겔은 자유 압타머(Af), 분자내에 가교결합된 압타머(Af ＊), 가교결합된 단백질:압타머 복합체(P:A)의 분리를 기술하고 있다.
도 7은 압타머가 식별된 500 개가 넘는 표적의 차트이다. 이들 다수의 압타머는 그 각각의 표적으로부터 낮은 분해속도를 가지는 것으로 설계되었다.
도 8A 내지 도 8D는 고정 테그(tags), 라벨(labels), 광가교결합기, 스페이서(spacers) 및 방출가능기(releasable moiety)를 포함하는 다양한 선택적 기능들을 함유하는 압타머 구조물을 나타낸 것이다.
도 9A 내지 도 9F는 분리가능하거나 방출가능한 요소, 태그(예를 들면 비오틴), 스페이서(spacers) 및 라벨(예를 들면 Cy3)을 함유하는 압타머 구조물을 나타낸 것이다.
도 10은 압타머와 프라이머 구조물을 나타낸 것이다. Cy3는 시아닌 3 염료, PC는 광분열성 연결자(linker), ANA는 광반응성 가교결합기, (AB)2는 dA 잔기에 의해 분리된 비오틴 잔기 한 쌍, 및 (T)8은 폴리 dT 연결자(linker)를 나타낸다. 프라이머 구조물은 압타머 구조물의 완전한 3' 고정부위에 대하여 상보적이다.
도 11A 내지 도 11C는 세 종류의 다른 표적에 대한 종래의 압타머에 대한 느린 오프-레이트 압타머의 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다.
도 12A 및 도 12B는 펩티드가 표적인 느린 오프-레이트 압타머의 반응 곡선을 나타낸 것이다.
도 13은 많은 느린 오프-레이트 압타머의 예견된 녹는점에 대한 측정된 녹는점의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 명세서에 포함된 뉴클리오티드의 기본 변형을 나타낸 것이다. R기는 뉴클레오티드 연결점과 R기 사이에 사용될 수 있는 연결자(X)에 더하여 기재되어 사용될 수 있다. 다양한 "R"기의 결합 위치 또한 각각의 R기 상에 나타내었다.
도 15는 트롬빈에 대한 C-5 변형된 피리디민을 포함하는 느린 오프-레이트 압타머의 결합 상수의 결정에 사용된 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명에 기재된 실시는 다른 언급이 없는 한 당업자의 수준 내의 화학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다(Sambrook, et al. MolecμLar Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D.Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition).
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문헌 및 특허 출원서는 발명에 관련된 당업자들의 수준을 나타내는 것이다. 본원에 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문헌 및 특허 출원서는 여기서 각 간행물, 공개된 특허 문헌 또는 특허 출원서가 특별하고 개별적으로 참고로서 통합됨을 나타내는 동일한 정도로 참고로 통합된다.
첨부된 청구항을 포함한 본 명세서에서 사용된 것으로서, 단수 형태인 "하나("a", "an" 및 "the")"는 별다른 명확한 지시가 없는 한 복수를 포함하며, "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 그 이상(one or more)"과 상호교환적으로 사용된다. 따라서, "압타머"는 압타머의 혼합물을 포함하고, "프로브"는 프로브의 혼합물을 포함한다는 것을 참고한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "약(about)"은 수치에 관련된 항목의 기본 함수가 변하지 않게 하기 위한 대수롭지 않은 변형 또는 수치의 변동을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "포함하는("comprises", "comprising", "includes", "including", "contains", "containing")" 및 그것들의 임의의 변화는 예를 들어 프로세스, 방법, 프로세스에 의한 물건, 또는 물건의 조성과 같은 비 배타적인 것들을 포함하는 것을 의도한다. 포함하여 구성(comprises), 포함(includes), 또는 요소 또는 요소들의 포함은 오직 이 요소들만 포함되는 것이 아니라 상세히 진술도지 않거나 내재되지 않은 다른 프로세스, 방법, 프로세스에 의한 물건 등 다른 요소들도 포함된다.
본 발명에서 사용된 것으로서, "용어 핵산 리간드", "압타머" 및 "클론(clone)"은 표적 분자에 바람직한 행동을 하거나 할 수 있는 비자연적으로 발생하는 핵산을 호환하여 일컫는다. 바람직한 행동은 표적의 결합, 촉매적으로 상기 표적의 변화, 표적 또는 표적의 기능적 활성의 개질 또는 변화하는 식으로 표적과 반응, (자멸 억제제(suicide inhibitor)와 같이) 표적에 공유적으로 결합, 표적과 다른 분자 사이의 반응이 용이하게 하는 것이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 한 실시예에서, 상기 활성은 표적 분자를 위한 특정한 결합 친화도이며 이 표적 분자는 폴리뉴클레오티드와 달리 3차원 화학 구조로 되어 있으며, 대부분 독립적인 왓슨-크릭 이중 또는 삼중 나선 결합과 주로 상관 없는 메커니즘을 통하여 압타머에 결합되며, 여기에서 상기 압타머는 표적 분자에 의해 결합된 공지의 생리학적 기능을 가진 핵산은 아니다. 상기 압타머는 (a) 상기 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적에 대한 증가된 친화성을 갖는 핵산이 대체물질 혼합물의 잔부로부터 분할될 수 있도록, 표적과 대체물질 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 상기 대체물질 혼합물의 잔부로부터 증가된 친화성 및/또는 느린 오프-레이트를 갖는 핵산을 분할하는 단계; 및 (c) 증가된 친화도를 갖는 느린 오프-레이트 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드-풍부 혼합물을 수득하고, 그것에 의하여 표적 분자에 대한 압타머가 식별되는 단계; 를 포함하여 이루어지는 방법에 의해 대체물질 혼합물로부터 식별되되, 상기 압타머가 주어진 표적의 리간드인 핵산을 포함한다. 이것은 본 명세서에서 친화도 상호작용 정도의 문제로 인지되지만, 이 표적을 위한 압타머의 "특이적 결합 친화성("specific binding affinity")"의 의미는 혼합물 또는 시료 속의 다른 표적이 아닌 성분들에 결합될 수 있는 것보다 휠씬 높은 친화도를 가진 그것의 표적에 일반적으로 압타머가 결합한다는 것이다. "압타머" 또는 "핵산 리간드"는 특별한 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산 분자의 1 타입 또는 여러 종의 한 세트의 복사본이다. 상기 압타머는 적절한 수의 뉴클리오티드를 포함할 수 있다. "압타머들"은 하니 이상의 이러한 세트의 분자들을 의미한다. 이와 다른 압타머는 동일한 수 또는 다른 수의 뉴클레오티드 중 하나를 가질 수 있다. 압타머들은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있고 또는 이중 가닥 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "느린 오프 레이트(slow off-rate), "느린 분해속도(slow rate of dissociation, slow dissociation rate)"는 압타머/표적 복합체가 분해하기 시작하기까지 걸리는 시간을 의미한다. 이는 반감기(t1/2) 또는 압타머/표적 복합체의 50%가 분해된 시점으로 표시된다. t1/2 값으로 표시되는 상기 오프-레이트 또는 느린 오프-레이트 압타머의 분해속도는 대략 ≥ 약 30분, ≥ 약 60분, ≥ 약 90분, ≥ 약 120분, ≥ 약 150분, ≥ 약 180분, ≥ 약 210분 및 ≥ 약 240분일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예에서, 핵산의 합성 라이브러리(library)를 생산하는 방법은: 1) 핵산의 합성; 2) 핵산의 탈보호화(deprotect); 3) 핵산의 정제; 및 핵산의 분석을 포함한다. 합성 단계에서, 믹스에서 다양한 뉴클레오티드의 비율이, 최종물에서 각각의 뉴클레오티드의 동등한 비율을 생산하기에 최적화된 단량체 혼합물이 준비되었다. 혼합물에서의 하나 또는 그 이상의 단량체들은 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 아미다이트 보호 그룹(amidite protection groups)은 본 방법에 사용되며, 하나의 실시예에서 단량체 농도는 0.1 M이다. 합성 중에, 5 개의 주요한 보호기는 핵산 생산물에서 유지된다. 고체 지지체(포어조절유리, CPG)에서 합성되고, 적어도 약 80사이클이 완료되어야 최종 생성물이 합성된다.
상기 합성 프로세스 후에, 핵산 생산물은 탈보호화(deprotect)된다. 생산물이 지지체(CPG) 상에 함유되는 동안 퓨린 결여 부위(apurinic sites)를 분열시키기 위해 1.0 M의 라이신 완충 수용액(pH 9.0)이 이용된다. 상기 절단된 길이가 짧아진 서열들은 탈이온수(dI)로 2회 세척한다. 탈보호화 단계를 위한 준비에서 2 회 세척한 후 탈이온수 500μL를 첨가한다. 이 단계는 T-부틸아민:메탄올:물이 1:1:2인 용액 1.0mL로 70 ℃에서 5 시간 동안 처리한 후에 냉동, 여과 및 증발하여 건조하는 것을 포함한다. 핵산 생산물은 PRP-3 HPLC 칼럼(Hamilton)에서 보호기의 소수성에 기초하여 정제된다. 적절한 칼럼 분획은 수집되고, 모으고 탈염되며, 휘발성 용리(elution) 완충액를 제거하기 위해 증발된다. 최종 생산물은 원심분리에 의해 물로 세척되고 재현탁된다. 상기 재현탁된 물질은 최종물을 탈보호화하기 위해 처리된다. 최종물은 염기 조성, 프라이머 연장 및 시퀀싱(sequencing) 겔에 의해 특징지워진다.
핵산 또는 핵산 라이브러리의 대체물질 혼합물은 또한 고체상을 사용하는 효소법(enzymatic method)에 의해 생산될 수 있다. 하나의 실시예에서 본 방법은 상기에 기재된 동일한 기초 단계를 포함한다. 본 발명의 목적은 안티센스(antisence) 라리브러리의 합성이며, 이들 라이브러리는 5'-비오틴 변형과 함께 생성된다. 모든 나머지 합성방법은 상기에 기술한 바와 같다. 합성 라이브러리가 준비되면, 의 예로, 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머(primer) 연장 믹스에서 전형적인 프라이머 연장 방법에서의 최종 대체물질 혼합물을 생산하는 데에 핵산이 사용될 수도 있다.
압타머들은 라이브러리의 합성을 위해 사용된 동일한 화학에 의해 합성된다. 그러나, 뉴클레오티드 혼합물 대신에, 하나의 뉴클레오티드는 규칙적 방법에 의해 발생한 최종 서열을 조절하기 위해 합성의 각 단계에서 도입된다. 변형된 뉴클레오티드들은 서열의 바람직한 위치로 합성 공정에서 도입될 수 있다. 다른 기능들은 뉴클레오티드의 공지의 화학적 개질을 이용하여 바람직하게 도입될 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "대체물질 혼합물(candidate mixture)"은 바람직한 리간드의 선택으로 서열이 구별되는 핵산 혼합물이다. 상기 대체물질 혼합물의 소스(source)는 자연적으로 발생하는 핵산 또는 그것의 분절, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 상기 기재된 기술의 조합에 의해 제조된 핵산이다. 광반응성기 또는 다른 변형을 가진 뉴클레오티드와 같은 변형된 핵산은 대체물질 혼합물에 포함될 수 있다. 게다가, SELEX 방법은 대체물질 혼합물 제조에 사용될 수 있는데, 첫 번째 SELEX 방법 실험은 두 번째 SELEX 방법 실험에서 대체물질 혼합물로 사용되는 핵산의 리간드가 농축된 혼합물을 생산하는데 사용될 수 있다. 대체물질 혼합물은 또한 하나 또는 그 이상의 공통적인 구조 모티브(motifs)를 지닌 핵산을 포함할 수 있다. 여기에서 사용되는 것으로, 대체물질 혼합물은 또한 때때로 "풀(pool)" 또는 "라이브러리(library)"라고 언급된다. 예를 들어 "RNA 풀"은 RNA를 포함하는 대체물질 혼합물을 가리킨다.
다양한 실시예에서, 대체물질 혼합물에 있는 각각의 핵산은 증폭 과정이 가능한 임의순서(ramdomized) 구역(region)의 한 쪽 면 위에 고정된 서열을 가질 수 있다. 핵산의 대체물질 혼합물에 있는 핵산은 증폭 과정 동안에 고분자량의 기생자(parasites)가 형성되는 것을 방지하기 위하여 그들의 5' 및 3' 말단에 ㄱ고정 부위 또는 "꼬리(tail)" 서열을 각각 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, "핵산", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 칭하는 것으로 상호호환하여 사용되며, 이러한 뉴클레오티드들은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 유사체 또는 화학적으로 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 이중 또는 단일 가닥 분자뿐만 아니라 삼중 나선 분자를 포함한다.
만약 존재한다면, 뉴클레오티드의 화학적 변형은 2'-위치의 당 변형, 5-위치의 피리미딘 변형(예를 들어, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-트립트아미노카복실아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄)프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 또는 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘), 엑소시클릭 아민(exocyclic amines)에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모- 또는 5-아이오도-우라실(5-iodo-uracil)의 치환, 기본골격(backbone) 변형, 메틸화, 이소베이스 이소시티딘(isobases isocytidine) 및 이소구아니딘(isoguanidine) 등과 같은 비정상적 염기쌍 조합(unusual base-pairing combinations)을 단독 또는 조합하여 포함할 수 있다.
한 실시예에서, 용어 "C-5 변형 피리미딘"은 도 16에 도시된 작용기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 C-5 위치에서 변형된 피리미딘을 가리킨다. C-5 변형 피리미딘의 실시예는 미국특허 5,719,273호 및 5,945,527호에 기재된 것들을 포함한다. C-5 변형의 실시예는 하기에 나타낸 바와 같은 벤질카복실아미드 (벤질아미노카보닐로 대체가능) (Bn), 나프틸메틸카복실아미드 (나프틸메틸아미노카보닐로 대체가능) (Nap), 트립트아미노카복실아미드 (트립트아미노카보닐) (Trp), 및 이소부틸카복실아미드 (이소부틸아미노카보닐로 대체가능) (iBu)로부터 선택된 치환기로 C-5 위치에 데옥시우리딘의 치환을 포함한다.
Figure 112015020734073-pct00032

상기에 도시한 바와 같이, 대표적인 C-5 변형 피리미딘은 5-(N-벤질카복실아미드)-2'-데옥시우리딘(BndU), 5-(N-이소부틸카복실아미드)-2'-데옥시우리딘(iBndU), 5-(N-트립트아미노카복실아미드)-2'-데옥시우리딘(TrpdU) 및 5-(N-나프틸메틸카복실아미드)-2'-데옥시우리딘(NapdU)을 포함한다.
변형은 또한 캡핑(capping) 또는 페길화(pegylation)과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 유사체와 함께 하나 또는 그 이상의 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드의 치환, 비전하 결합(uncharged linkage)을 갖는 메틸 포스페이트(methyl phosphonates), 포스포트리에스테르(phosphotriesters), 포스포아미데이트(phosphoamidates), 및 카바메이트(carbamate) 등과, 전하 결합(charged linkage)된 포스포로시오에이트(phosphorothioates), 포스포로디시오에이트(phosphorodithioates) 등과, 인터컬레이터(intercalators)를 포함하는 아크리딘(acridine), 솔라렌(psoralen) 등과, 킬레이터를 포함하는 금속, 방사선 금속, 붕소, 산화금속 등과, 알킬레이터를 포함하는 것 및 개질 결합된 알파 아노머(alpha anomeric) 핵산 등과 같은 뉴클레오티드간 변형을 포함한다. 또한, 당에 보통 존재하는 임의의 하이드록실기는 포스포네이트기(phosphonate group) 또는 포스페이트기(phosphate group)에 의해 치환될 수 있고; 표준 보호기(protecting groups)에 의해 보호될 수 있거나; 추가적인 뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부가적인 결합을 만들기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단의 OH기는 인산화(phosphorylated)될 수 있거나, 아민, 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자로부터의 유기 캡핑기 부분(organic capping group moieties), 또는 약 1 내지 약 20 개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머들 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 폴리머들로부터의 유기 캡핑기 부분으로 치환될 수 있다. 만일 존재한다면, 뉴클레오티드 구조는 폴리머 조합 전 또는 후에 변형될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에 성분의 라벨링과 함께 접합(conjugation)에 의한 것과 같이 더 변형될 수 있다.
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폴리뉴클레오티드는 또한 2'-O-메틸-(2'-O-methyl-), 2'-O-알릴(2'-O-allyl), 2'-플루오로-(2'-fluoro-) 또는 2'-아지도-리보오스(2'-azido-ribose), 카보시클릭 당 유사체(carbocyclic sugar analogs), α-아노메릭 당(α-anomeric sugars), 아라비노스, 자일로스 또는 리소오스(lyxoses)와 같은 에피메릭 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars), 세도헵툴로오스(sedoheptμLoses), 아시클릭 유사체(acyclic analogs) 및 메틸 리보사이드와 같은 염기 결여 뉴클레오티드 유사체(abasic nucleotide analogs)를 포함하는 당업자에게 일반적으로 잘 알려져 있는 리보오스 또는 데옥시리보오스의 유사체 형태를 포함할 수 있다. 상기에 언급한 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 포스포디에스테르 결합들은 대체가능한 연결기(alternative linking group)로 대체될 수 있다. 이러한 대안적 연결기들은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트(thioate)"), P(S)S("디티오에이트(dithioate)"), (O)NR2("아미데이트(amidate)"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈(formacetal)")로 대체되고, 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 이거나 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜(araldyl)을 선택적으로 포함하는 치환되거나 비치환된 알킬(1-20C)이다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 당, 퓨린 및 피리미딘의 유사한 형태의 치환은 예를 들어, 폴리아미드 기본골격과 같은 대체적 기본골격 구조와 같이 최종 생성물을 설계하는데 유리할 수 있다.
한 실시예에서, 압타머의 가변 부위에는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레이티드를 포함한다. 어떤 변형된 압타머를 상기에 언급된 방법, 장치 및 키트 모두에서 사용할 수 있다. 이들 변형된 뉴클레이트디는, 표적에 대하여 높은 친화성을 유지하는 동안 각각의 그 표적으로부터 매우 느린 오프-레이트를 갖는 신규한 압타머를 생성하는 것으로 나타났다. 한 실시예에서, 피리미딘 염기의 C-5 위치에서 변형될 수 있다. 변형된 염기를 가진 뉴클레이티드를 포함하는 압타머는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드(즉, 변형되지 않은 뉴클레오티드)를 포함하는 표준 압타머의 성질과는 많이 다르다. 한 실시예에서, 뉴클레이티드의 변형 방법은 아미드 결합의 사용을 포함한다. 그러나 다른 적절한 변형 방법이 사용될 수 있다. 놀랍게도 식별된 느린 오프-레이트 압타머의 구조가 표준 염기쌍 모델에 의하여 예상된 구조와 전적으로 일치하지 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 현상은 느린 오프-레이트 압타머의 측정된 녹는점이 모델에 의하여 예상된 녹는점과 일치하지 않는다는 사실에 의하여 뒷받침된다(도 13 참조). 보는 바와 같이, 느린 오프-레이트 압타머의 측정된 녹는점과 예상된 녹는점 사이의 연관성이 없다. 평균적으로, 계산된 녹는점(Tm)는 측정된 Tm보다 6℃ 더 낮다. 측정된 녹는 점은 이들 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 느린 오프-레이트 압타머가 보다 더 안정하고, 신규한 2차 구조를 갖는 것으로 예견되며, 그 가능성이 존재한다. 이들 변형된 압타머는 이에 대응하는 변형하지 않은 뉴클레이티드만을 갖는 압타머와는 다른 원형의 다이코리즘 스펙트라를 보인다. 많은 표적의 경우, 변형된 뉴클레이티드를 초기 라이브러리 또는 대체물질 혼합물을 생산하는 데에 사용할 때, 표적에 대한 느린 오프-레이트 압타머이 더 잘 식별되는 것으로 나타난다.
여기에 기재한 바와 같이, "변형된 핵산"은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열을 가리킨다. 어떤 실시예에서, 변형 뉴클레오티드와 SELEX 방법이 양립할 수 있는 것이 바람직하다.
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"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"는 여기에서 교체 사용되는데, 일정 길이의 아미노산의 폴리머를 가리킨다. 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 잇으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 또는 비-아미노산에 의하여 방해될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭에 의하여 변형된 아미노산 폴리머도 포함한다: 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실레이션, 리피데이션(lipidation), 아세틸레이션, 포스포릴레이션, 또는 성분을 라벨링하여 컨쥬게이션하는 것과 같은 다른 조작 또는 변형. 또한 상기 정의에는 예를 들면, 본 분야에서 알려진 다른 변형체 뿐만 아니라 (예를 들면, 비자연 아미노산 등과 같은) 하나 또는 그 이상의 아미노산 유사체를 포함하는 폴리펩티드도 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 회합된 사슬일 수 있다.
여기에 기재된 바와 같이, "광반응성 뉴클레오티드"는 일정한 파장의 빛으로 방사하여 단백질과 같은 표적으로 광가교결합할 수 있는 모든 변형된 뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들면, 광SELEX 방법에 의하여 생성된 광압타머는 하기와 같은 군으로부터 선택된 광반응성기를 포함한다: 5-브로모우라실(5-bromouracil, BrU), 5-아이도우라실(5-iodouracil, IU), 5-브로모비닐우라실(5-bromovinyuracil), 5-아지도우라실(5-azidouracil), 4-티오우라실(4-thiouracil), 5-브로모시토신(5-bromocytosine), 5-아이도시토신(5-iodocytosine), 5-브로모비닐시토신(5-bromovinylcytosine), 5-아이도비닐시토신(5-iodovinylcytosine), 5-아지도시토신(5-azidocytosine), 8-아지도아데닌(8-azidoadenine), 8-브로모아데닌, 8-아이도아네닌, 8-아지도구아닌, 8-브로모구아닌, 8-아이도구아닌, 8-아지도하이포산틴(8-azidohypoxanthine), 8-브로모하이포산틴, 8-아이도하이포산틴, 8-아지도산틴, 8-브로모산틴, 8-아이도산틴, 5-브로모데옥시우리딘(5-bromodeoxyuridine), 8-브로모-2'-데옥시아데닌, 5-아이도-2'-데옥시우라실, 5-아이도-2'-데옥시시토신, 5-[(4-아지도페나실)티오]시토신(5-[(4-azidophnacyl)thio]cytosine), 5-[(4-아지도페나실)티오]우라실, 7-데아자-7-아이도아데닌(7-deaza-7-iodoadenine), 7-데아자-7-아이도구아닌, 7-데아자-7-브로모아데닌, 및 7-데아자-7-브로모구아닌. "광반응성 피리미딘"은 일정한 파장의 방사에 의하여 표적에 광가교결합할 수 있는 변형된 피리미딘을 의미한다. 광반응성 피리미딘의 예로는 5-브로모-우라실(BrdU), 5-브로모-시토신(BrdC), 5-아이도-우라실(IdU), 및 5-아이도-시토신(idC)이 있다. 다양한 실시예에서 광반응성 작용기는 표적 또는 올리고뉴클레오티드의 비변형된 부분에 의하여 흡수되지 않는 파장의 빛을 흡수한다.
"SELEX"는 바람직한 방식(예를 들면, 단백질에 결합)에 의하여 표적과 상호작용하는 핵산을 선별하는 과정과 선별된 핵산의 증폭 과정이 혼합된 방법이다. 선별/증폭 단계의 임의 반복적인 사이클링은 다량의 핵산을 포함하는 풀에서 표적과 가장 강하게 상호작용하는 하나 또는 소수의 핵산을 선별하도록 한다. 선별/증폭 과정이 계속 사이클링되어 선별하는 목적을 달성한다. SELEX 방법론은 SELEX 특허에 기재되어 있다. SELEX 방법의 어떤 실시예에서, 그 표적에 비공유결합에 의하여 결합된 압타머를 생성한다. SELEX 방법의 다른 실시예에서는 그 표적에 공유결합에 의하여 결합된 압타머를 생성한다.
여기에 기재된 용어 "증폭" 또는 "증폭하기"는 분자 또는 분자 클래스의 복사본의 양 또는 수를 증가시키는 과정 또는 단계를 종합한 것을 의미한다.
"SELEX 표적" 혹은 "표적 분자" 혹은 "표적"은 본 명세서에서 바람직한 방식으로 작용할 수 있는 핵산 상에 어떠한 화합물을 의미한다. SELEX 표적 분자는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사 산물, 전이 유사물(transition state analog), 보조인자(cofactor), 저해제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직 및 어떠한 한정없이 앞서 말한 임의의 것들에 대한 임의의 단편 또는 부분을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, SELEX 표적은 예를 들면, 공지된 핵산 결합 단백질(이를테면, 전사 인자)와 같은 핵산에 결합하는 것으로 알려진 물질들만을 포함하는 것은 아니다. 사실상 어떠한 화학적 또는 생물학적 반응기(effector)도 적절한 SELEX 표적이 될 수 있다. 어떠한 사이즈의 분자라도 SELEX 표적으로 공급될 수 있다. 표적은 또한 표적과 핵산 간의 상호작용의 가능성 또는 세기를 강화시키기 위해 어떠한 방식으로든 변경될 수 있다. 표적은 또한 단백질의 경우, 예를 들어, 아미노산 서열에서의 미미한 변화, 이황화 결합 형성, 당화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경하지 않는 표지된 성분을 사용한 표지과 같은 임의의 다른 조작 또는 변경과 같은 특정 화합물 또는 분자의 임의의 미미한 변화를 포함한다. "표적 분자(target molecμLe)" 또는 "표적"은 압타머에 결합할 수 있는 한 형태 또는 종류의 분자 또는 복합 분자 구조의 복제 세트이다. "표적 분자" 또는 "표적" 은 하나 이상의 이같은 분자 세트를 말한다. 표적이 펩티드인 SELEX 방법에 대한 실시예는 본 명세서에 참고문헌으로 전적으로 편입된 미국 특허등록번호 제6,376,190호("Modified SELEX Processes Without Purified Protein")에 기술되어 있다. 도 7은 다양한 느린 오프-레이트 압타머를 포함하여 생성되어지는 압타머에 대한 500개 이상의 표적을 목록화한 것이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "경쟁 분자(competitor molecμLe)" 및 "경쟁자(competitor)"는 비표적 분자와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 분자를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 이같은 맥락에서, 비표적 분자는 예를 들어, 경쟁자가 사용되어 비특이적으로 다른 비표적 분자에 결합(재결합)하는 것으로부터 압타머를 저해할 수 있는 자유 압타머를 포함한다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나의 형태 또는 종류의 분자의 복제 세트이다. "경쟁 분자" 또는 "경쟁자"는 하나 이상의 이러한 분자 세트를 말한다. 경쟁 분자는 이에 한정하는 것은 아니나, 올리고뉴클레오티드, 다중 음이온(예를 들어, 헤파린, 청어 정액 DNA, 연어 정자 DNA, tRNA, 덱스트란 설페이트, 폴리덱스트란, 비염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTPs 및 피로포스페이트)를 포함한다. 다수의 견지에 있어서, 하나 이상의 경쟁자의 결합이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "비특이적 복합체(non-specific complex)"는 압타머와 그것의 표적 분자를 제외한 두개 또는 그 이상의 분자간 비-공유적 결합을 말한다. 비특이적 복합체는 분자의 종류간의 상호작용을 나타낸다. 비특이적 복합체는 압타머와 비표적 분자, 경쟁자와 비표적 분자, 경쟁자와 표적 분자, 및 표적 분자와 비표적 분자간에 형성된 복합체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "느린 오프-레이트 농축 공정(slwo off-rate enrichment process)"은 느린 분해 속도를 갖는 압타머 친화 복합체의 상대적인 농도가 더 신속하고 덜 바람직한 분해 속도를 갖는 압타머 친화 복합체의 농도에 비해 증가되도록 대체 물질 혼합물 중 특정 성분의 상대적 농도를 변경하는 공정을 의미한다. 일 실시예에 있어서, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 용액-기반 느린 오프-레이트 농축 공정이다. 일 실시예에 있어서, 용액-기반 느린 오프-레이트 농축 공정은 혼합물 내에서 압타머 친화 복합체를 형성하는 표적 혹은 핵산이 느린 오프-레이트 농축 공정도중 고체 지지체상으로 이동되지 않도록 용액 내에서 수행된다. 다수의 견지에 있어서, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 경쟁 분자의 첨가 및 배양, 혼합물의 희석, 혹은 이들의 결합(예를 들어, 경쟁 분자의 존재하에 혼합물의 희석)을 포함하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 느린 오프-레이트 농축 공정의 효과는 일반적으로 다른 압타머 친화 복합체(즉, 대체 물질 혼합물 내에서 표적 분자와 다른 핵산 간 형성된 압타머 친화 복합체)의 분해 속도를 변경함에 따라 좌우되기 때문에, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정의 지속 기간은 느린 분해 속도를 갖는 압타머 친화 복합체의 비율을 높게 유지하는 반면 빠른 분해 속도를 갖는 압타머 친화 북합체의 수는 실질적으로 저감시키도록 선택된다. 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 SELEX 공정 도중 1회 이상의 순환 내에서 사용될 수 있다. 희석 및 경쟁자 첨가가 함께 사용될 때, 이들은 동시에 혹은 어떠한 순서로든 순차적으로 수행될 수 있다. 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 혼합물 내 총 표적(단백질) 농도가 낮을 때 사용될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정이 희석을 포함할 때, 상기 혼합물은 있는 만큼 그 자체로 희석될 수 있으며, 상기 압타머 보유 핵산은 SELEX 공정 내 후속 라운드를 통해 회수되므로 실용적임을 명심하라. 일 실시예에 있어서, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 희석뿐 아니라 경쟁자의 사용도 포함하며, 이는 경쟁자를 사용하지 않을 때 필요한 것보다 혼합물을 덜 희석하게끔 할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 경쟁자의 첨가를 포함하며, 상기 경쟁자는 다중 음이온(예를 들면, 헤파린 혹은 덱스트란 설페이트(덱스트란))이다. 헤파린 혹은 덱스트란은 종래 SELEX 선별공정 내에서 특이적 압타머를 식별하는데 사용되어져 왔다. 그러나 이같은 방법에서, 헤파린 혹은 덱스트란은 표적과 압타머가 결합하여 복합체를 형성하는 평형 단계 도중 존재한다. 이같은 방법에서는, 헤파린 혹은 덱스트란의 농도가 증가함에 따라 높은 친화 표적/압타머 복합체 대 낮은 친화 표적/압타머 복합체의 비가 증가된다. 그러나 높은 농도의 헤파린 또는 덱스트란은 핵산과 경쟁자간 결합하는 표적에 대한 경쟁때문에 평형에서 높은 친화 표적/압타머 복합체의 수를 저감시킬 수 있다. 이에 반해, 본 발명의 방법은 표적/압타머 복합체를 형성한 다음 경쟁자를 첨가함으로써 형성된 복합체의 수에 영향을 미치지 않는다. 평형 결합이 표적과 압타머간 형성된 다음 경쟁자를 첨가함으로써 시간이 지나 많지않은 표적/압타머 복합체에 새로운 평형 도달을 포함하는 비-평형 상태를 생성한다. 새로운 평형에 도달하기 전에 표적/압타머 복합체를 모아두는 것은 빠른 오프-레이트 복합체가 먼저 분해될 것이므로 느린 오프-레이트 압타머에 대한 시료를 풍부하게 한다.
또 다른 견지에 있어서, 다중음이온 경쟁자 (예를 들면, 덱스트란 설페이트 혹은 또다른 다중음이온 물질)가 다중음이온의 존재에 불응하는 압타머의 식별을 용이하게 하도록 느린 오프-레이트 농축 공정 내에서 사용된다. 이러한 맥락에서, "다중음이온 불응성 압타머"는 비-다중음이온 불응성 압타머를 포함하는 압타머/표적 복합체보다 다중음이온 불응성 물질을 또한 포함하는 용액 내에서 덜 분해되는 압타머/표적 복합체를 형성할 수 있는 압타머이다. 이같은 방식으로, 다중음이온 불응성 압타머는 시료 내 표적의 존재 혹은 농도 혹은 함량을 검출하는 분석 방법의 수행하에 사용될 수 있고, 여기서 상기 검출 방법은 압타머가 불응성인 다중음이온 물질(예를 들어, 덱스트란 설페이트)의 사용을 포함한다.
따라서, 일 실시예에 있어서, 다중음이온 불응성 압타머를 생산하는 방법이 제공된다. 이같은 견지에 있어서, 핵산의 대체물질 혼합물과 표적을 접촉시킨 다음 표적과 대체물질 혼합물 내 핵산이 평형에 도달하게끔 한다. 다중음이온 경쟁자를 도입하고 용액 내에서 대체물질 혼합물 내 대다수의 빠른 오프 레이트 압타머를 표적 분자로부터 분리하기에 충분한 시간동안 배양하게끔 한다. 또한, 다중음이온 경쟁자의 존재하에 분리될 수 있는 대체물질 혼합물 내 압타머들이 표적 분자로부터 방출될 것이다. 상기 혼합물은 표적 분자에 결합된 채 남아있는 높은 친화, 느린 오프-레이트 압타머를 분리하고, 용액으로부터 어떠한 복합화되지 않은 물질들을 제거하도록 분할된다. 그런 다음 상기 압타머는 표적 분자로부터 방출되고 분리된다. 분리된 압타머는 또한 증폭되어 선별의 추가 라운드에 적용되어 선별된 압타머의 총 성능을 증가시킬 수도 있다. 만약 느린 오프-레이트 압타머의 선별이 특정 적용처에 필요하지 않다면 상기 공정은 또한 최소화된 배양 시간으로 사용될 수도 있다.
따라서, 일 실시예에 있어서, 표적 분자 및 대체 물질 혼합물이 접촉되고 표적 분자와 대체 물질 혼합물 내에 포함된 핵산간 평형 결합이 형성되기 충분한 시간동안 함께 배양되는 느린 (긴) 오프-레이트를 갖는 압타머의 식별 혹은 생성하기 위하여 변형된 SELEX 공정이 제공된다. 평형 결합에 이어 과량의 경쟁 분자, 예를 들어 다중음이온 경쟁자가 혼합물에 첨가되고 상기 혼합물은 소정 시간동안 과량의 경쟁 분자와 함께 배양된다. 이같은 소정의 배양 시간보다 덜 오프 레이트를 갖는 압타머 중 현저한 부분이 소정 배양 시간 도중 표적으로부터 분리될 것이다. 이들 "빠른" 오프-레이트 압타머와 표적과의 재결합은 표적에 비특이적으로 결합하여 표적 상의 압타머 결합 자리를 점유하는 과량의 경쟁 분자로 인하여 최소화된다. 보다 긴 오프 레이트를 갖는 압타머 중 현저한 부분은 소정 배양 시기도중 표적에 복합화된 채 잔류할 것이다. 배양 시기 말단에서, 혼합물의 잔부로부터 핵산-표적 복합체를 분할함으로서 빠른 오프레이트를 갖는 개체군과 느린 오프-레이트 압타머의 개체군을 분리하게끔 한다. 분리 단계는 그 표적으로부터 느린 오프-레이트 압타머를 분리하는데 사용될 수 있으며, 표적 분자에 높은 친화 및 특이성을 갖는 느린 오프-레이트 압타머(개별 압타머중 일종 혹은 느린 오프-레이트 압타머의 그룹 중)의 분리, 식별, 시퀀싱, 합성 및 증폭하게끔 한다. 통상의 SELEX와 마찬가지로, 변형된 SELEX 공정의 일 라운드로부터 식별된 압타머 서열은 새로운 대체 물질 혼합물의 합성에 사용되도록 접촉, 평형 결합, 경쟁 분자의 추가, 경쟁 분자와의 배양, 및 느린 오프-레이트 압타머의 분할 단계가 필요한 만큼 수차례 반복될 수 있다.
경쟁자를 첨가하기에 앞서 표적과 대체물질 혼합물간 평형 결합을 달성하게한 결합물에 과량의 경쟁자를 첨가하고 소정 시간동안 상기 경쟁자로 배양하여 종래 달성되던 것보다 훨씬 과량의 오프레이트를 갖는 압타머 개체군을 선별하게끔 한다.
평형 결합을 달성하기 위해, 상기 대체 물질 혼합물은 적어도 약 5 분, 혹은 적어도 약 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간 또는 약 6 시간 동안 표적에 배양될 수 있다.
표적의 성질과 표적에 대한 공지된 압타머의 오프레이트가 알려져 있다면 이들 요인을 감안하여, 대체 물질 혼합물과 표적 분자로된 혼합물과 경쟁 분자의 소정 배양 시간은 원하는 만큼 선택될 수 있다. 소정 배양 시간은 적어도 약 5 분, 혹은 적어도 약 10 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 5 시간 적어도 약 6 시간 중에서 선택될 수 있다.
다른 견지에 있어서, 희석은 일 오프레이트 농축 공정으로서 사용되며, 희석된 대체 물질 혼합물, 표적 분자/압타머 복합체의 배양은 적어도 약 5 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 5 시간 적어도 약 6 시간 중에서 선택된 소정 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들은 느린 오프-레이트 압타머의 식별, 생산, 합성 및 사용과 관련된다. 종래의 SELEX에 의해 수득된 보통의 압타머보다 비공유 압타머-표적 복합체로부터의 분해 속도(t1 /2)가 높아진 압타머들이 존재한다. 압타머와 표적의 비공유 복합체를 포함하는 혼합물에 대하여, 상기 t1 /2는 압타머-표적 복합체로부터 분해되는 압타머의 반감기를 나타낸다. 본 발명에 따른 느린 분해 속도 압타머의 t1 /2는 약 30 분 이상; 약 30 분 내지 약 240 분; 약 30 분 내지 약 60 분; 약 60 분 내지 약 90 분; 약 90 분 내지 약 120 분; 약 120 분 내지 약 150 분; 약 150 분 내지 약 180 분; 약 180 분 내지 약 210 분; 약 210 분 내지 약 240 분;중 일종으로부터 선택된다.
SELEX 절차에 의해 식별된 압타머의 특징은 그것의 표적에 대한 높은 친화에 있다. 압타머는 그것의 표적에 대한 분해 상수 (Kd)가 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 100 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 1 pM 미만 중 일종으로부터 선택될 것이다.
본 명세서에서 "조직 표적" 혹은 "조직"은 상술된 SELEX 표적의 특정 서브셋을 의미한다. 이같은 정의에 따르면, 조직은 이종(heteroheneous) 환경 내 거대분자(macromolecμLe)이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 조직은 단일 세포 타입, 세포 타입의 집합체(collection), 세포의 응집체(aggregate), 혹은 거대분자의 응집체를 의미한다. 이는 단백질과 같은 전형적으로 분리된 가용성 분자인 보다 단순한 SELEX 표적과는 상이한 것이다. 몇몇 견지에 있어서, 조직은 보다 단순한 SELEX 표적보다 큰 규모 수준인 불용성 거대분자이다. 조직은 다수의 거대분자들로 이루어진 복합체 표적이고, 각 거대분자는 다수의 포텐셜 에피토프(potential epitope)를 갖는다. 다수의 에피토프를 포함하여 이루어지는 다른 거대분자들은 단백질, 지질, 탄수화물 등 혹은 이들의 결합물일 수 있다. 조직들은 일반적으로 구조 및 조성의 모두에 있어서, 유동성 있거나 강성일 수 있는 거대분자의 물리적 어레이일 수 있다. 세포외 기질은 구조적으로 그리고 조성적으로 보다 강성 조직의 예인 반면, 멤브레인 이중층(membrain bilayer)은 구조 및 조성에서 보다 유동적이다. 조직들은 일반적으로는 가용성이지 않으므로 고체상 내에 잔류하며, 따라서 분할은 상대적으로 쉽게 달성될 수 있다. 조직은 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들면, 간 조직, 뇌 조직 등 주어진 조직의 일반적인 세포질 구조(cellμLar fabric)를 나타내는데 통상 사용되는 구조적 물질 중 일종을 형성하는 세포간 물질과 함께 보통은 특정 종류의 세포 응집체를 포함한다. 조직의 4가지 일반적인 종류는 상피 조직, 결합 조직, 신경 조직 및 근육 조직이다.
이들 정의 내에 포함된 조직의 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 세포질 섬유소 응괴(fibrin clot)와 같은 거대분자의 이종 응집체; 세포의 동종 또는 이종 응집체; 기관, 종양, 임파절(limp nodes), 동맥(arteries) 등과 같은 특이한 작용을 갖는 세포를 포함하는 고등 수준의 구조들; 및 개별 세포;를 포함한다. 조직 또는 세포는 그 자연 환경내에 있거나, 분리되거나 또는 조직 배양 내에 있을 수 있다. 상기 조직은 손상되지 않거나(intact) 혹은 변형될 수 있다. 상기 변형은 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 활성화 및 하부구조 분리, 예를 들면 세포 막, 세포 핵, 세포 소기관(cell organelle) 등과 같은 다수의 변경을 포함할 수 있다.
조직, 세포 혹은 아세포 구조의 공급원은 진핵세포뿐 아니라 원핵세포로부터 수득될 수 있다. 이는 인간, 동물, 식물, 박테리아, 균류 및 바이러스 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "표지 시약(labeling agent)", "표지(label" 혹은 "검출가능한 분획(detectable moiety)", 혹은 "검출가능한 요소(detectable element)" 혹은 "검출가능한 성분(detectable component)"은 표적 분자/압타머 복합체를 검출하는데 사용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 시약을 말한다. 검출가능한 분획 또는 표지는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 일반적으로, 검출 가능한 임의의 리포터 분자(reporter molecμLe)가 표지일 수 있다. 표지들은 예를 들면, (ⅰ) 시그널을 생성함으로써 직접적으로 검출될 수 있는 리포터 분자, (ⅱ) 리포터 분자를 함유하는 동족(cognate)에 후속 결합함으로써 간접적으로 검출될 수 있는 특이적 결합쌍 구성원(binding pair members), (ⅲ) 질량 분석계에 의해 검출가능한 질량 태그(mass tags), (ⅳ) 증폭 또는 연결(ligation)을 위한 주형(template)을 제공할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 (ⅴ) 예를 들어, 억제 단백질(repressor protein)과 같은 리간드로서 작용할 수 있는 특정 폴리뉴클레오티드 서열 또는 인식 서열(recognition sequence)을 포함하며, 이중 후자에서 2가지 경우인 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 억제 단백질은 리포터 분자 등을 갖거나 가질 수도 있다. 상기 리포터 분자는 효소와 같은 촉매, 촉매를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 염료, 형광성 분자, 양자점(quantum dot), 화학발광 분자(chemiluminescent molecμLe), 조효소, 효소 기질(enzyme substrate), 방사성기(radioactive group), 작은 유기 분자, 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드 서열, 라텍스 또는 탄소 입자와 같은 파티클, 금속 졸(metal sol), 미소결정(crystallite), 리포좀, 세포 등일 수 있으며, 이는 염료, 촉매 또는 다른 검출 가능한 기(group), 질량 분석계 목적으로 결합된 분자의 질량을 변경하는 질량 태그 등으로 더 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 상기 표지는 전자기성 또는 전기 화학성 물질로부터 선택될 수 있다. 일 실시예에서, 검출 가능한 표지는 형광성 염료이다. 다른 표지들 및 표지 기법(labeling schemes)들은 본 명세서에 기재된 것에 기초하여 당업자들에게 자명할 것이다.
상기 검출 가능한 분획(요소 혹은 성분)은 상술된 어떠한 리포터 분자 및 검출가능한 신호를 생성하기 위하여 임의의 방식으로 사용될 수 있는 어떠한 다른 화학 제품 또는 성분을 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 분획은 분획의 본질에 따라 형광 신호, 화학발광 신호 또는 임의의 다른 검출 가능한 신호를 통해 검출될 수 있다. 검출 가능한 분획이 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타아제)인 경우, 상기 신호는 효소 기질 및 효소 활성에 필요한 임의의 추가 인자의 존재 하에서 생성될 수 있다. 검출 가능한 분획이 효소 기질인 경우, 상기 신호는 효소 및 효소 활성에 필요한 임의의 추가 인자의 존재 하에서 생성될 수 있다. 표적 분자에 검출 가능한 분획을 결합시키기에 적합한 시약 구성은 표적 분자에 대한 검출 가능한 분획의 공유적 결합, 표적 분자에 공유적으로 결합된 다른 표지 시약 성분을 사용한 검출 가능한 분획의 비공유성 결합, 및 검출 가능한 분획과 표적 분자를 비-공유적으로 결합된 표지 시약 성분을 사용하여 검출한 분획의 공유적 결합을 포함한다. 일반적인 단백질 착색제(UPS)는 2004년 8월 12일에 출원된 미국 특허출원일련번호 제10/504,696("Methods and Reagents for Detecting Target Binding by Nucleic Acid Ligands")에 상세하게 기재되어 있다.
본 명세서에서 "고체 지지체(solid support)"는 분자가 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 갖는 임의의 기질을 말한다. 상기 기질 물질은 자연적으로 생성된 것, 합성물 또는 자연적으로 생성된 물질의 개질물일 수 있다. 적절한 고체 지지체 물질은 실리콘, 그라파이트, 미러 가공 표면(mirrored surface), 라미네이트, 세라믹, 플라스틱(예를 들어, 폴리(비닐 클로라이드), 시클로-올레핀 공중합체, 폴리아크릴아마이드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE 또는 테플론®), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트)와 같은 폴리머를 포함), 게르마늄, 갈륨 비소, 금, 은 등을 포함할 수 있으며, 그것들 자체 또는 다른 물질과 함께 사용된다. 실리카를 포함하고, 예를 들어, 생체 유리(bioglass)로서 이용할 수 있는 유리를 더 포함하는 유리와 같은 부가적인 강성 재료가 고려될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 물질은 예를 들어, 제어된 공극 유리 비드와 같은 다공성 물질을 포함한다. 예를 들어, 표면상에 도입된 어떠한 일종의 아미노, 카르복실, 티올 또는 히드록실 작용기와 같은 하나 또는 그 이상의 작용기를 가질 수 있는 당업계에 공지된 어떠한 다른 물질 또한 고려된다.
상기 고체 지지체는 단순한 것부터 복잡한 것까지 임의의 다양한 구성을 사용할 수 있으며, 비드, 튜브, 웰(well) 등을 포함하는 스트립, 플레이트, 디스크, 봉(rod)을 포함하는 다수의 형태 중 어느 일종일 수 있다. 상기 물질은 상대적으로 평면(예를 들어, 슬라이드), 구형(예를 들어 비드), 원통형(예를 들면, 컬럼) 혹은 홈을 갖을 수도 있다. 대표적인 고체 지지체는 미량역가 웰(microtitre wells), 현미경 슬라이드, 막, 상자성 비드, 대전된 종이(charged paper), 랭뮤어-블러짓 필름(Langmuir-Blodgett films), 실리콘 웨이퍼 칩, 유동 칩(flow through chips) 및 마이크로비드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "분할(partitioning)"은 혼합물의 하나 또는 그 이상의 성분이 혼합물의 다른 성분으로부터 분리되는 어떠한 공정을 말한다. 예를 들면, 표적 분자에 결합된 압타머는 표적 분자에 결합되지 않은 다른 핵산으로부터, 그리고 비-표적 분자로부터 분할될 수 있다. 보다 넓게 기술하자면, 분할은 표적 분자에 대한 상대적 친화 및/또는 분해 속도에 기초하여 최소 2가지 풀(pool) 내로 대체 물질 혼합물내 모든 핵산을 분리하게끔 한다. 분할은 여과, 친화 크로마토그래피, 액-액 분할 등을 포함하는 당업계에 공지된 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 핵산-단백질 쌍은 니트로셀룰로오스 필터에 결합되는 반면, 비결합 핵산은 결합되지 않는다. 핵산-표적 복합체를 분명히 보유하는 컬럼 또한 분할에 사용될 수 있다. 예를 들면, 컬럼 상에서 결합된 표적 분자와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 최고 친화 압타머를 분리 및 고립시키기 위하여 컬럼 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 표적 분자가 표지된 비드 또한 혼합물 내에서 압타머를 분할하는데 사용될 수 있다. 만약 비드가 상자성이라면, 분할은 자기장을 적용하여 달성될 수 있다. 표면 플라즈마 공진 기술은 센서 칩 상에서 표적을 고정하고 상기 칩 위로 혼합물을 흘려보냄으로써 혼합물 내 핵산을 분할하는데 사용할 수 있으며, 여기서 표적에 대한 친화을 갖는 핵산들이 표적에 결합되게 되고 잔여 핵산들은 세척될 것이다. 액-액 분할은 여과 겔 지연법(filtration gel retardation) 및 밀도 구배 원심 분리와 동시에 사용될 수 있다. 표적 분자 상에 친화된 태그는 또한 용액 내에서 자유 압타머로부터 태그된 표적에 결합된 핵산 분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합된 압타머를 따라, 비오틴화 표적 분리는 스트렙타비딘 상자성 비드를 사용하여 비결합 핵산 서열의 용액으로부터 격리될 수 있다. 친화 태그 또한 제조 도중 압타머 내로 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "광SELEX(photoSELEX)"는 지수 농축에 의한 리간드의 광화학 계통적 진화(Photochemical Systmatic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)의 약어로서 광가교 압타머가 생성된 SELEX 공정의 구현예를 의미한다. 광SELEX 공정의 일 실시예에 있어서, 빛의 흡수에 의해 활성화된 광반응성 뉴클레오티드는 RNA- 내 혹은 ssDNA-무작위 추출된 올리고머뉴클레오티드 라이브러리 내에서 천연 염기를 대체하여 도입되고, 핵산 표적분자 혼합물은 조사되어 광반응성 작용기를 매개로 하여 표적 분자에 교차결합된 핵산-표적 분자 복합체 내에 몇몇 핵산을 도입시키고, 선별 단계에서는 광가교 활성을 선별하게 된다. 상기 광SELEX 공정은 PhotoSELEX 특허내에 아주 상세히 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "광압타머(photoaptamer)" 및 "광반응성 압타머(photoreactive aptamer)"는 표적 분자와 공유적으로 결합할 수 있거나 "교차결합(crosslink)"할 수 있는 하나 또는 그 이상의 광반응성 작용기를 포함하는 압타머를 말하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 자연적으로 생성되는 핵산 잔기는 적절한 파장의 방사선 공급원에 노출시키면 핵산 잔기에 광 활성을 제공하는 화학적 작용기를 포함하도록 개질될 수 있다. 어떤 실시예에서, 광반응성 압타머는 초기에 식별된다. 다른 실시예에서는, 압타머가 우선 식별된 다음 하나 또는 그 이상의 광반응성 작용기를 도입하도록 개질됨으로써 광압타머가 생성된다. 이들 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 광반응성 핵산 잔기들은 예를 들어, 압타머 내의 하나 또는 그 이상의 티미딘 및/또는 시티딘 뉴클레오티드와 같은 하나 또는 그 이상의 다른 뉴클레오티드를 대신하여 광반응성 핵산 잔기로 치환시키거나, 혹은 광반응성 작용기를 포함하도록 하나 또는 그 이상의 핵산 잔기를 개질시킴으로써 압타머 내로 도입될 수 있다.
광압타머에 도입될 수 있는 대표적인 광반응성 작용기로는 5-브로모우라실, 5-요오도우라실, 5-브로모비닐우라실, 5-요오도비닐우라실, 5-아지도우라실, 4-티오우라실, 5-티오우라실, 4-티오시토신, 5-브로모시토신, 5-요오도시토신, 5-브로모비닐시토신, 5-요오도비닐시토신, 5-아지도시토신, 8-아지도아데닌, 8-브로모아데닌, 8-요오도아데닌, 8-아지도구아닌, 8-브로모구아닌, 8-요오도구아닌, 8-아지도하이포크산틴, 8-브로모하이포크산틴, 8-요오도하이포크산틴, 8-아지도크산틴, 8-브로모크산틴, 8-요오도크산틴, 5-[(4-아지도페나실)티오]시토신, 5-[(4-아지도페나실)티오]우라실, 7-데아자-7-요오도아데닌, 7-데아자-7-요오도구아닌, 7-데아자-7-브로모아데닌 및 7-데아자-7-브로모구아닌을 포함한다.
이러한 대표적인 뉴클레오시드-기반 광반응성 작용기 이외에도, 적절한 연결 분자를 사용하여 압타머의 말단에 첨가될 수 있는 다른 광반응성 작용기 또한 사용될 수 있다. 이러한 광반응성 작용기로는 벤조페논, 안트라퀴논, 4-아지도-2-니트로-아닐린, 소랄렌 (psoralen), 이들의 유도체 등을 포함한다.
광압타머에 의해 도입되는 광반응성 작용기는 어떠한 적절한 방법에 의해 활성화될 수 있다. 일 실시예에서, 광반응성 작용기를 포함하는 광압타머 및 그것의 결합된 표적 분자를 전자기 방사선 공급원에 노출시킴으로써 표적에 교차결합될 수 있다. 적절한 전자기 방사선의 타입으로는 자외선, 가시광선, X-레이 및 감마선을 포함한다. 적절한 방사선 공급원은 단색광 또는 여과된 다색광 중 일종을 이용하는 광원을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "친화 SELEX 공정"은 표적에 대한 비-광가교 압타머가 생성되는 SELEX 공정의 구현예를 의미한다. 친화 SELEX 공정의 몇몇 견지에 있어서, 표적은 핵산의 대체 물질 혼합물과 접촉하기 전 또는 접촉 후 고체 지지체 상에 고정화된다. 표적과 고체 지지체의 결합은 대체 물질 혼합물 내에 결합되어져 있다가, 느린 오프-레이트 농축 공정이 사용되는 경우에 표적에 결합된 채 잔류하는 대체 물질 혼합물 내 핵산이 대체 물질 혼합물의 잔부로부터 분할되게끔 한다. 용어 "비드 친화 SELEX 공정"은 예를 들어, 핵산의 대체 물질 혼합물과 접촉하기 전에 표적이 비드 상에 고정화되는 친화 SELEX 공정의 특정 구현예를 의미한다. 몇몇 실시예에서 상기 비드는 상자성 비드이다. 용어 "필터 친화 SELEX 공정"은 니트로셀룰로오스 필터와 같은 필터와 접촉함에 의해 대체 물질 혼합물로부터 핵산 표적 복합체가 분할되는 구현예를 의미한다. 이는 표적과 핵산이 용액내 초기에 접촉하고 필터에 접촉한 구현예를 포함하며, 또한 핵산이 필터 상에 미리 고정화된 표적에 접촉하는 구현예를 포함한다. 용어 "플레이트 친화 SELEX 공정"은 표적이 예를 들어, 다중벽 미량역가 플레이트와 같은 플레이트 표면상에 고정화되는 구현예를 의미한다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 표적은 소수성 상호작용을 통하여 플레이트 친화 SELEX 공정 내에서 플레이트에 결합된다.
본 발명은 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생성하기 위한 개선된 SELEX 방법을 기술한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 종래 SELEX 방법으로 수득된 압타머보다 각각의 표적화된 분자로부터 분해 속도가 느린 압타머 및/또는 광압타머를 식별하기 위한 방법을 기술한다. 본 발명은 나아가 본 명세서에서 기술된 방법 및 이들의 사용 방법을 사용하여 수득된 압타머 및/또는 광압타머를 기술한다.
일 실시예에 있어서, 그것의 표적 분자로부터 느린 분해 속도를 갖는 압타머를 식별하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산 서열의 대체 물질 혼합물을 준비하는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 최대 친화력을 갖는 핵산을 표적 분자에 우선적으로 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 느린 오프-레이트 농축 공정을 적용하여 상대적으로 빠른 분해 속도를 갖는 핵산-표적 분자 복합체를 분리하는 단계; (d) 대체 물질 혼합물 내 자유 핵산과 비-표적 분자 모두로부터 잔부 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; 및 (e) 표적 분자에 대한 압타머를 식별하는 단계;를 포함하여 이루어진다. 상기 방법은 나아가 표적 분자에 결합할 수 있는 서열 내 풍부한 핵산의 혼합물을 수득하면서도 느린 분해 속도를 갖는 핵산-표적 분자 복합체를 생산하도록 표적 분자에 결합하는 핵산을 증폭하는 단계를 반복하여 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 느린 오프-레이트 농축 공정은 (a) 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물을 희석하는 단계; (b) 최소 1종의 경쟁자를 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물에 첨가하는 단계, 및 상기 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물을 희석하고; (c) 최소 1종의 경쟁자를 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물에 첨가하는 단계, 중 선택될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도가 느린 압타머의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산 서열의 대체 물질 혼합물을 준비하는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 대체 물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자와의 증가된 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자와 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 주기 동안 함께 대체 물질 혼합물과 표적 분자를 배양하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 혼합물에, 비교적 빠른 분해속도를 가진 핵산-표적 분자 복합체의 분해가 일어나도록 느린 오프-레이트 농축 과정을 실시하는 단계; (e) 상기 (d) 단계로부터의 대체 물질 혼합물, 핵산-표적 분자 복합체 및 경쟁 분자로된 혼합물을 소정의 시간 주기 동안 배양하는 단계; (f) 대체 물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; (g) 자유 핵산을 생성하기 위해 핵산-표적 분자 복합체를 분리하는 단계; 및 (h) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열에서 높아진 핵산의 혼합물을 수득하도록 자유 핵산을 증폭하되, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머인지 식별할 수 있는 단계; 를 포함하여 이루어진다.
또 다른 견지에 있어서, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도가 느린 압타머의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산의 대체 물질 혼합물을 준비하는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 대체 물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자와의 증가된 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자와 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 평형 결합을 달성하기에 충분한 시간 주기 동안 함께 대체 물질 혼합물과 표적 분자를 배양하는 단계; (d) 상기 (c) 단계의 혼합물에 최소한 하나의 경쟁 분자를 과량 첨가하는 단계; (e) 상기 (d) 단계로부터의 대체 물질 혼합물, 핵산-표적 분자 복합체 및 경쟁 분자로된 혼합물을 소정의 시간 주기 동안 배양하는 단계; (f) 대체 물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; (g) 자유 핵산을 생성하기 위해 핵산-표적 분자 복합체를 분리하는 단계; 및 (h) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열에서 높아진 핵산의 혼합물을 수득하도록 자유 핵산을 증폭하되, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머인지를 식별할 수 있는 단계; 를 포함하여 이루어진다.
또 한 견지에 있어서, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도가 느린 압타머의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산 서열의 대체 물질 혼합물을 준비하는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 표적 분자에 대하여 상대적으로 가장 높은 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자와 우선적으로 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 느린 오프-레이트 농축 과정을 실시하여 상대적으로 빠른 분해 속도를 가진 핵산-표적 분자 복합체가 분해되도록 하는 단계; (d) 대체 물질 혼합물 내의 자유 핵산과 비-표적 분자로부터 잔여의 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; 및 (e) 상기 표적 분자에 압타머를 생산하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 표적 분자에 결합하여 표적 분자에 결합가능하나, 느린 분해 속도를 가진 핵산-표적 분자 복합체를 생산하는 서열 내에 핵산이 증폭된 혼합물을 생성하는 핵산을 증폭시키는 반복 단계를 더욱 포함할 수 있다. 상기에 정의된 바와 같이, 느린 오프-레이트 농축 공정은 (a) 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물을 희석시키는 단계; (b) 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 상기 대체 물질 혼합물에 대한 적어도 하나의 경쟁 물질을 첨가하는 단계; 및 핵산-표적 분자 복합체를 희석시키는 단계; (c) 상기 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물에 대한 적어도 하나의 경쟁 물질을 첨가하는 단계에서 선택될 수 있다.
또 다른 견지에 있어서, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도가 느린 압타머의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산의 대체 물질 혼합물을 준비하는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 대체 물질 혼합물 내의 다른 핵산에 비하여 표적 분자에 대한 증가된 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자와 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 상기 대체 물질 혼합물과 표적 분자를 함께 일정 시간동안 배양하여 평형 결합을 이루는 단계; (d) 느린 오프-레이트 농축 과정을 실시하여 (c)의 혼합물에 대하여 상대적으로 빠른 분해 속도를 가진 핵산-표적 분자 복합체가 분해되도록 하는 단계; (e) 상기 대체 물질 혼합물, 핵산-표적 분자 복합체 및 (d)의 상기 경쟁 분자의 혼합물을 일정 시간 동안 배양시키는 단계; (f) 상기 대체 물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; 및 (e) 핵산-표적 분자 복합체를 분해시켜 자유 핵산을 생성하는 단계; (h) 상기 자유 핵산을 증폭시켜 친화력이 증가된 표적 분자에 결합 가능한 핵산 서열 내에 핵산이 농축된 혼합물을 생산함으로써 표적 분자에 압타머가 생산될 수 있는 단계를 포함한다. 상기에 정의된 바와 가 x이 느린 오프-레이트 농축 공정은 (a) 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물을 희석시키는 단계; (b) 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 상기 대체 물질 혼합물에 대한 적어도 하나의 경쟁 물질을 첨가하는 단계; 및 핵산-표적 분자 복합체를 희석시키는 단계; (c) 상기 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체 물질 혼합물에 대한 적어도 하나의 경쟁 물질을 첨가하는 단계에서 선택될 수 있다.
또 다른 견지에 있어서, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도가 느린 압타머의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하되, 상기 대체 물질 혼합물은 대체 물질 혼합물의 최소한 하나 혹은 각각의 핵산에 있는 1종, 다수 혹은 모든 피리미딘이 5-위치에서 화학적으로 변형된, 개질된 핵산을 포함하여 이루어지는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 대체 물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자와 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계: (c) 대체 물질 혼합물의 잔부로부터 증가된 친화 핵산을 분할하는 단계;및 (d) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열 내에서 높아진 핵산의 혼합물을 수득하도록 증가된 친화 핵산을 증폭하되, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머인지를 식별할 수 있는 단계; 를 포함하여 이루어진다.
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또 다른 견지에 있어서, 그것의 표적 분자로부터 분해 속도가 느린 압타머의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 핵산의 대체 물질 혼합물을 준비하되, 상기 대체 물질 혼합물은 대체 물질 혼합물의 최소한 하나, 혹은 각각의 핵산에 있는 모든 피리미딘이 5-위치에서 화학적으로 변형된, 개질된 핵산을 포함하여 이루어지는 단계; (b) 표적 분자와 대체 물질 혼합물을 접촉시키되, 대체 물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산이 표적 분자에 결합되어 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계; (c) 대체 물질 혼합물의 잔부로부터 증가된 친화 핵산을 분할하는 단계; 및 (d) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열에서 높아진 핵산의 혼합물을 수득하도록 증가된 친화 핵산을 증폭하되, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머인지 식별되는 단계; 를 포함하는 공정에 의해 식별된 핵산 서열을 포함하는 압타머를 합성하는 단계를 포함하여 이루어진다.
또 다른 견지에 있어서, 압타머 및 그것의 표적의 비공유 결합 복합체가 제공되며, 여기서 상기 표적으로부터의 압타머의 분해 속도 (t1/2)는 약 30 분 이상; 약 30 분 내지 약 240 분; 약 30 분 내지 약 60 분; 약 60 분 내지 약 90 분; 약 90 분 내지 약 120 분; 약 120 분 내지 약 150 분; 약 150 분 내지 약 180 분; 약 180 분 내지 약 210 분; 약 210 분 내지 약 240 분; 중 1종으로부터 선택된다.
또 다른 견지에 있어서, 압타머와 표적의 비공유결합 복합체가 제공되며, 여기서 상기 압타머는 표적에 대한 Kd가 약 10O nM 이하이고, 표적으로부터의 압타머의 분해 속도 (t1/2)는 약 30 분 이상이며, 상기 압타머의 핵산 서열 내 1종, 다수 또는 모든 피리미딘이 5-위치에서 개질된다. 상기 개질은 도 14에 도시된 화합물 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 이같은 개질을 "염기 변형된 뉴클레오티드"라 말한다. 압타머는 원하는 염기 개질된 피리미딘과 어떠한 결합으로든지 디자인될 수 있다.
광반응성기를 포함하는 뉴클레오티드, 혹은 광반응성 기에 대한 플레이스홀더(placeholder)를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드로 SELEX를 수행하는 개선된 방법은 본 명세서에 참고문헌으로 전적으로 편입되며, 본 출원과 동시 출원된 미국 특허출원 일련번호 제12/175,388호 ("Improved SELE PHOTOSELEX")에 개시되어 있다. 또다른 견지에 있어서, 핵산 분자의 대체 물질 혼합물은 상대적으로 느린 분해 속도를 갖는 변형된 핵산-표적 복합체의 형성을 도울 수 있는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 핵산을 포함한다.
본 명세서에 기술된 다수의 방법 및 단계들은 (1) 표적 분자에 결합하거나, 혹은 (2) 표적 분자에 결합하고 후속적으로 조사시 표적 분자에 공유결합 연결을 형성할 수 있는 압타머를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법들에 따라 식별된 압타머는 진단 및 치료 방법 범주내에서 유용하다. 느린 오프-레이트 압타머는 보다 긴 지속 기간동안 표적에 결합할 것이다. 이는 표적에 대한 압타머의 결합이 표적 분자 및 압타머의 연장된 상호작용의 존재, 부재, 함량 혹은 농도를 검출하고, 표적을 검출하는데 용이하도록 하는데 사용될 수 있는 진단 방법에 유용한 것이다. 유사한 이점이 느린 오프-레이트 압타머가 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 조영 방법에 사용될 경우 제공될 수 있다. 압타머와 표적의 연장된 상호관계 또한 상기 연장된 상호관계가 예를 들어 표적 분자 또는 하위 신호전달 단계반응(downstream signaling cascade)을 보다 길게 활성화 혹은 억제함으로써 개선된 치료 효과를 제공한다.
따라서, 다수의 실시예에 있어서, 상술한 방법에 의해 수득된, 식별된 또는 생산된 느린 오프-레이트 압타머들은 다수의 의학적 치료 방법 혹은 진단 방법(시험관내 또는 생체내)에 사용될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 느린 오프-레이트 압타머가 질환의 치료 방법에 사용될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 느린 오프-레이트 압타머들은 생체 내 질환의 진단 방법에 사용될 수 있다. 또다른 실시예에 있어서, 느린 오프-레이트 압타머들은 질환의 진단을 위하여 시험관내에서 사용될 수 있다. 또다른 견지에 있어서, 느린 오프-레이트 압타머는 치료제(예를 들어, 약제학적 조성물의 제조) 혹은 질환의 치료 혹은 진단 방법에 사용하기 위한 진단 제제의 제조에 사용될 수 있다. 느린 오프-레이트 압타머의 진단 또는 치료 적용처들은 그것의 표적에 대하여 느린 오프-레이트 압타머의 특이적 및/또는 높은 친화 결합에 따른 진단 또는 치료 결과를 포함할 수 있다. 느린 오프-레이트 압타머들은 또한 약제 개발 공정 내에서 표적 타당성 및 높은 처리량 스크린 검정에도 사용될 수 있다.
한 실시예에서 느린 오프-레이트 압타머는 생체 내 분자 영상에 적합한 시약이다. 상기 실시예에서 느린 오프-레이트 압타머는 생체 내에 사용되어 병리의 존재, 질병의 과정 또는 개별(예를 들면, 인간 또는 동물)의 신체의 다른 조건을 감지할 수 있는데, 여기에서 압타머의 표적에 대한 결합이 질병의 과정 또는 다른 조건이 존재하는 것을 나타낸다. 예를 들면, VEGF 수용체가 종양 및 그 신생혈관구조 내에서 과도하게 발현되기 때문에 VEGF 수용체에 대한 압타머는 생체 내에 사용되어 개별의 신체의 특정한 영역(예를 들면, 조직, 기관 등)에 존재하는 암을 감지할 수 있거나, EGF 수용체가 흔히 종양 세포 상에서 높은 레벨로 발현되므로 EGF 수용체에 대한 압타머가 생체 내에 사용되어 개별의 신체의 특정한 영역(예를 들면, 조직, 기관 등)에 암이 존재하는 것을 감지할 수 있다. 다시 말하면 표적 분자는 유도된 수용체의 세포외 도메인(ECD)이 될 것인데, 이러한 표적은 세포의 외부에 위치하며 혈관을 통하여 접근할 수 있기 때문이다. 또한, 특정 ECD의 작은 부분이 세포사(cell death)를 포함한 생물학적 과정을 통하여 없어질 수 있다고 할지라도 ECD는 병리 부위에 국한되는 경향이 있다.
분자 영상에 대한 자명한 대체 물질인 고친화도의 단클론성 항체는 본 출원에 대한 시약으로 선별되지 않았다. 분자 영상 시약은 정확성이 요구된다. 그들은 인간 또는 동물에서 의도된 표적에 대해 높은 결합성을 가져야 하며, 다른 표적에 대해서는 낮은 결합성을 가져야 한다. 느린 오프-레이트 압타머는 생체내의 분자 영상에 바람직하게 이용될 수 있는 유일한 장점을 가진다. 다른 한편으로는 그들은 작은 분해속도상수를 가지도록 선별되어 실질적인 시간 동안(적어도 약 30분 이상) 의도된 표적 상에서 생체 내 체류가 가능하도록 한다. 다른 한편으로는 느린 오프-레이트 압타머는 혈관으로부터 매우 빠른 청정을 가질 것으로 예상된다. 작은 분해속도상수 및 혈관의 빠른 청정은 생체 내 분자 영상에 있어서 두 개의 바람직한 성질이다. 키네틱적으로 예상해 보면, 우수한 생체 내 분자 영상 시약은 주위의 혈관 내의 자유 시약의 농도가 낮은 동안에 병리 부위에 국부적으로 체류해야 한다. 이는 신호-대-잡음 제약이다. 적절한 신호대 잡음비는 혈관 내의 과도한 신호 내에서 병리 부위의 신호를 축적시키거나 혈관 농도가 감소하는 동안 병리 부위의 신호를 보존시킴으로써 얻을 수 있다.
느린 오프-레이트 압타머와 거의 동일한 분자량과 총 전하를 갖는, 느린 오프-레이트 성질을 가지지 않은 압타머는 10년 이상 동물 및 인간에서 연구되어 왔다. 일반적으로, 이들 압타머는 신장 및/또는 간으로 들어가서 더욱 분비를 위해 더욱 신진대사됨으로써 혈관으로부터 재빨리 제거되는 것으로 알려졌다. 이러한 압타머는 (예를 들면, PEC와 같은) 고분자량 부가물이 상기 압타머와 연결되어 있지 않으면 소위 "우선 통과(first pass)"라는 청정을 보여준다. 어떤 종양에서 높은 농도를 보이는 세포외 단백질(ECD이 아닌)인 테나신 C (tenascin C)가 표적인 압타머를 이용하여 실험이 진행되었다. 이들 실험에서, 테나신 C에 특이성을 보이는 압타머는 재빨리 청정되고 테나신 C의 세포외 국소 농도가 매우 높기 때문에 종양 부위에 유지될 수 있었다. 이와 대조적으로 느린 오프-레이트 압타머는 압타머의 빠른 청정율을 유지할 것이나, 늦은 분해속도로 인하여 키네틱적인 장점을 제공하여 관심 부위(예를 들면, 병리 부위)에 다소 희박하게 존재할 수 있는 표적(예를 들면, 종양 상의 ECDs)에 적절하게 이용할 수있게 한다.
분자 영상에 대한 대체적인 시약은 두 가지의 느린 오프-레이트 압타머 성질(곧, 늦은 분해속도 및 빠른 신체로부터의 청정)을 공유하지 않는다. 단클론성 항체는 흔히 높은 친화성 및 특이성을 가지며, 작은 분해속도 상수를 가질 수 있으나 단클론성 항체는 매우 낮은 혈관 청정율을 가진다. 예를 들면 파지 디스플레이를 통해 식별된 짧은 펩티드는 빠르게 청정될 것이나, 그들의 의도된 표적으로부터 열등한 친화성 및 특이성 및 빠른 분해속도를 가진다. 항체의 특정한 펩티드 모방물인 에피바디(affibodies)는 합리적인 친화성 및 특이성을 가질 것이나, 그들의 표적으로부터 느린 분해속도를 달성하기 위하여 단클론성 항체보다 빠르게 청정될 것이며, 에피바디는 흔히 다이머 및 보다 높은 차수의 다중체로 제조되어 분해속도가 향상됨과 동시에 청정된다.
느린 오프-레이트 압타머는 하나 또는 그 이상의 저분자량 부가물과 함께 생체 내 분자 영상을 위해 사용되어 느린 오프-레이트 압타머가 신체 내의 뉴클레아제로부터 보호하고 느린 오프-레이트 압타머에 의하여 일단 결합된 의도된 표적을 감지한다. 예를 들면, 느린 오프-레이트 압타머는 혈액 내에서 뉴클레아제, 전형적으로는 (DNA에 대해서는) 느린 오프-레이트 압타머의 5' 및 3' 말단 위치에서 엑소큐늘레아제 굴절성 부가물을 사용함으로써 용이하게 차단되는 엑소뉴클레아제, 또는 느린 오프-레이트 압타머에서 (예를 들면 2'-플루오로 뉴클레이티드와 같은) 엔도뉴클레아제 굴절성 피리미딘을 투입함으로써 용이하게 차단되는 엔도뉴클레아제에 의하여 공격받을 수 있다. 느린 오프-레이트 압타머-표적 복합체는 느린 오프-레이트 압타머에 검출기를 부착시킴으로써 감지할 수 있다. 어떤 실시예에서는 이들 목적을 위한 검출기로는 방사성 분자(예를 들면, 테크네튬 99)용 케이지, 자기공명검출용 철 클러스터, PET 영상용 불소 동위원소 등이 포함될 수 있다. 느린 오프-레이트 압타머를 신체 내에서 느린 오프-레이트 압타머가 완전하게 방어하고 의도한 표적과의 느린 오프-레이트 압타머와의 상호작용에 방해가 되지 않도록 고안되어 의도된 표적의 검출이 가능하고 혈관으로부터 너무 늦게 느린 오프-레이트 압타머가 청정되지 않도록 변경된다.
진단 또는 검정 장치, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 그 장치의 고상 표면에 점착된 느린 오프-레이트 압타머를 가진 칼럼, 테스트 스트립 또는 바이오칩 또한 제공된다. 상기 장치의 표면에 점착 유지된 압타머-표적 복합체를 형성하는 고상 표면과 접촉하는 표적 분자에 압타머가 결합되도록 위치할 수 있어서 표적을 포획하고 검출하도록 해 주며, 선별적으로 표적을 정량할 수 있다. (동일하거나 다를 수 있는) 일렬의 느린 오프-레이트 압타머는 상기한 장치에 제공될 수 있다.
다른 한 실시예에서, 느린 오프-레이트 압타머 및 표적 분자를 포함하는 복합체가 제공된다. 또 다른 실시예에서, 그 대응하는 표적 분자에 높은 친화성을 가지며 압타머 및 표적의 비공유 복합체로부터 느린 분해속도(t1 /2)를 가지는 것을 특징으로 하는 한 그룹의 압타머가 제공된다.
도 1A를 보면, 기본 SELEX 방법은 다른 서열의 대체 핵산 혼합물의 제조와 함께 시작된다. 일반적으로 대체물질 혼합물 은 두 개의 혼합 부위 (즉, 상기 대체물질 혼합물 의 각 부분은 동일한 위치에서 동일한 서열을 포함한다) 및 가변 부위를 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 흔히, 혼합 서열 부위는 아래 기술된 증폭 단계를 도와 주거나 대체물질 혼합물 의 핵산의 주어진 구조적 서열의 잠재력을 증강시키도록 선별된다. 가변 부위는 흔히 대체물질 혼합물 에서 각 핵산의 표적 결합 부위를 제공하고, 이 가변 부위는 상보적으로 랜덤화되거나 (곧, 어떤 위치에서 염기를 찾을 확률이 1/4 되도록) 또는 부분적으로만 랜덤화된다 (예를 들면, 어떤 위치에서 염기를 찾을 확률이 0 내지 100퍼센트 내에서 선별될 수 있다). 표적과 대체물질 혼합물 의 구성성분 사이의 결합이 유리하게 일어나는 조건에서 제조된 대체물질 혼합물 은 선별된 표적과 접촉된다. 이러한 조건에서, 일반적으로 표적과 대체물질 혼합물의 핵산 사이의 상호작용은 한 쌍의 구성성분 사이에서 가장 강한 상대적인 친화력을 갖는 핵산-표적쌍을 형성한다. 표적에 대하여 최고의 친화력을 갖는 핵산은 표적에 보다 낮은 친화력을 갖즌 핵산에서 분할된다. 이 분할 과정은 최대 수의 높은 친화력의 대체물질을 유지하도록 실시된다. 분할하는 동안 표적에 비교적 높은 친화력을 갖도록 선별된이들 핵산은 증폭되어 표적에 대하여 비교적 높은 친화력을 갖는 핵산이 풍부한 새로운 대체물질 혼합물을 생성한다. 상기에서와 같이 분할과 증폭 단계를 반복함으로써 새로 형성된 대체물질 혼합물은 보다 적은 독특한 서열을 포함하고, 평표적에 대한 핵산의 평균 친화도는 일반적으로 증가할 것이다. 극단적인 측면을 보면, SELEX 방법은 표적 분자에 대하여 최고의 친화력을 가진 원본 대체물질 혼합물로부터 이들 핵산을 대표하는 하나 또는 매우 적은 수의 유일한 핵산을 포함하는 대체물질 혼합물을 생성할 것이다. 그러나 이 기본 SELEX 방법은 그 표적으로부터 느린 오프-레이트를 갖는 압타머를 위해서 선별하지는 않는다.
SELEX 특허 및 광SELEX 특허는 자세하게 이 방법을 기술하고 연구한다. 이들 특허는 이 방법에 사용될 수 있는 다양한 표적에 대하여 기술한다; 초기 대체물질 혼합물의 제조방법; 대체물질 혼합물 내에서 핵산을 분할하는 방법; 및 다량의 대체물질 혼합물을 생성하는 분할된 핵산을 증폭하는 방법. 또한 SELEX 특허는 단백질이 핵산 결합 단백질이거나 핵산 결합 단백질이 아닌 단백질 표적을 포함하는 많은 수의 다른 타입의 표적 분자로 얻어진 압타머 용액에 대하여 기술한다.
도 1B를 보면, 여기에 개시된 변형된 SELEX 방법은 느린 오프-레이트 증폭 공정의 도입하고 SELEX 방법에서 다음 단계 전에 대체물질 혼합물의 핵산을 표적 또는 표적들로의 평형 및 분할 단계를 포함한다. 느린 오프-레이트 증폭 공정을 기본 SELEX 방법에 도입하는 것은 다양한 분해속도를 포함하는 한 세트의 핵산-표적 복합체로부터 느린 분해속도를 갖는 압타머 친화성 복합체의 증폭를 위한 수단을 제공한다. 그리하여 변형된 SELEX 방법은 표적 분자에 결합하고, 일단 결합되었으면 표적 분자로부터 비교적 낮은 분해속도(이를 또한 "오프-레이트"라고 함)를 가지는 압타머를 식별하는 방법을 제공한다.
여기에서 "결합"이라 하는 것은 반드시 가역적이지는 않더라도 리간드와 표적 사이의 비공유성 결합의 형성을 가리킨다. "핵산-표적 복합체" 또는 "복합체" 또는 "친화성 복합체"는 이러한 비공유성 결합으로 결합된 물질을 일컫는다.
다양한 실시예에서, 오프-레이트 압타머는 단일 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 압타머는 비표준 또는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 또한 압타머는 모든 타입의 변형체를 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 "변형된 염기"는 천연 핵산 잔기에 대하여 비교적 간단한 변형을 포함할 수 있는데, 여기에서 변형은 핵산 잔기의 물리적인 성질에 변화를 준다. 이러한 변형은 피리미딘의 5-위치에서 변형, 벤질카복시아미드(Bn), 이소부틸카복시아미드(iBu), 트립트아미노카복시아미드(Trp), 또는 나프틸메틸카복시아미드(Nap) 또는 소수성기로 치환, 또는 4차 아민 또는 구아니디늄와 같은 친수성기 또는 이미다졸 등과 같은 "중성"기로 치환되는 것을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 2'-아미노(2'-NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)와 같은 2'-위치의 리보오스 링, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸 포스포네이트와 같은 포스포디에스테르 백본에서 부가의 변형이 일어날 수 있다.
다양한 실시예에서, 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 랜덤화된 한 세트의 핵산 서열을 포함하는 대체물질 혼합물은 다량의 표적 분자와 혼합되고 상기 표적 분자와 결합 평형이 이루어진다. 일반적으로 표적 분자에 높은 친화성을 가지면서 결합된 이들 핵산의 몇몇 만이 표적과 효율적으로 분할될 것이다.
다양한 실시예에서, 표적물질 혼합물은 변형된 그룹을 포함하는 가변 부위를 갖는 핵산 서열을 포함한다. 변형된 그룹은 변형된 뉴클레오티드 염기일 수 있다. 가변 부위는 완전하거나 부분적으로 랜던화된 서열을 포함할 수 있다; 또한 가변 부위 내에 투입된 고정 서열의 하부 부위를 포함한다. 고정 부위 내의 뉴클레오티드는 또한 변형된 뉴클레이티드 염기를 포함하거나 또는 자연적으로 발생하는 염기의 표준 세트를 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서는, 테스트 혼합물의 구성 성분이 분할된 후에 증폭이 일어나며, 증폭되는 것은 핵산이다. 예를 들면, 다음 세 개의 일련의 반응에 의하여 RNA 분자가 증폭될 수 있다: 선별된 RNAs의 cDNA 복사본 제조, 중합효소연쇄반응을 이용한 각 cDNA의 복사본 구성성분의 증가, cDNA 복사본을 전사하여 선별된 RNAs와 동일한 서열을 갖는 RNA 분자의 생성. 본 분야의 당업자에게 이미 알려진 바와 같이, 직접적 DNA 복제, 직접적 RNA 증폭 등과 같은 본 분야에서 알려진 모든 반응 또는 반응을 조합하여 적절하게 사용할 수 있다. 증폭 방법은 증폭된 혼합물의 비율이 증폭 전에 혼합물의 다른 서열의 비율이 대표적인 비율이 되도록 할 수 있다. 핵산에 대한 많은 변형은 효소적 증폭과 호환가능한 것으로 알려져 있다. 증폭과 호환가능하지 않은 변형은 필요시 증폭의 각 회 후에 이루어질 수 있다.
핵산 대체물질 혼합물은 다양한 방법으로 변형되어 핵산이 활용가능한 성질 또는 다른 바람직한 성질을 갖는 확률을 증가시키고, 특히 핵산과 표적과의 상호작용을 증가시킬 수 있다. 정확한 전하, 편재성, 수소결합 또는 바람직한 리간드-표적 상호작용을 증가시키는 정전기적 상호작용을 갖는 다른 화학적 작용기를 도입하는 변형이 고려된다. 변형에 의하여 핵산의 친화성 및/또는 분해속도를 포함한 결합성질을 증가시킬 수 있는데, 예를 들면, 이미다졸과 같은 단백질, 1차 알코올, 카복실레이트, 구아니디늄기, 아미노기, 티올 등에서 발견되는 친수성기, 소수성기, 단단한 구조, 작용기를 포함한다. 또한 넓은 범위의 표적에 대한 느린 오프-레이트 압타머를 생성하기 위하여 적용될 수 있는 엄격한 선별 압력하에서 압타머-표적 복합체의 생존력을 증가시키기 위하여 변형을 실시할 수 있다. 다른 변형된 뉴클레이티드가 이러한 압타머의 생성에 매우 적합하다고 해도 한 실시예에서 BndU가 느린 오프-레이트 압타머를 생성하기 위한 대체물질 혼합물의 생성에 사용된다. 다른 변형된 뉴클레오티드는 도 14에 나타내었다.
본 출원의 목적을 위한 변형된 뉴클레이티드 대체물질 혼합물은 둘 다 자연적으로 발생하거나 둘 다 자연적으로 발생하는 뉴클레이티드 이외의 것을 포함하는 모든 RNA 또는 DNA 대체물질 혼합물이다. 핵산의 매 잔기에서의 변형, 핵산의 단일 잔기에서의, 무작위 잔기에서의 변형, 모든 리피미딘에서의 또는 모든 퓨린에서의 변형, 핵산의 특정 염기(곧, G, C, A, T 또는 U)에서의 변형 또는 본 출원에서 적절할 수 있는 모든 다른 구조의 변형이 적절하게 포함된다. 변형은 압타머의 활성 또는 결합능력을 활용하기 위한 전제조건은 아닌 것으로 인식된다. 압타머는 변형된 dUTP 및 dCTP 잔기를 포함할 수 있다.
느린 오프-레이트 압타머의 대체물질 혼합물은 C-5 염기 위치에서 다른 변형을 갖는 한 세트의 피리미딘을 포함할 수 있다. C-5 변형은 직접 아미드 결합을 통하거나 간접적으로 또는 다른 형태의 결합을 통하여 도입될 수 있다. 이들 대체물질 혼합물은 SELEX 방법에 사용되어 느린 오프-레이트 압타머를 식별한다. 상기 방법은 또한 느린 오프-레이트 증폭 공정을 이용할 수 있다. 대체물질 혼합물은 효소적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 뉴클레오티드는 리보오스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치의 변형을 포함하여 다양한 방식으로 변형될 수 있다. "변형된 뉴클레오티드를 포함하는 고친화성의 핵산 리간드"로 명명된 미국특허 5,660,985호, "팔라듐 촉매의 탄소-탄소 커플링 및 생성물의 제조방법"으로 명명된 미국특허 5,428,149호, "팔라듐 촉매에 의한 퓨린 뉴클레오시드 변형 방법"으로 명명된 미국특허 5,580,972호에서 변형에 대해서 기술하고 있는데, 이들 모두는 여기에서 참고로 한다. 한 실시예에서, 화학적 작용기가 피리미딘의 5-위치 또는 당질의 2'-위치에 연결된 변형이 기재되어 있다. 개개의 뉴클레이티드 상에 투입될 수 있는 다른 화학적 작용기의 타입에는 제한이 없다. 어떤 실시예에서는 결과로 변형된 뉴클레오티드는 증폭가능하거나 증폭 단계 다음으로 변형될 수 있다("시험관 증폭 선별법(Systematic evolution of ligands by exponential enrcichment: Chemi-SELEX)"로 명명된 미국특허 6.300,074호 참조).
그러나 다른 실시예에서는, 어떤 뉴클레오티드는 친화성 복합체의 광활성화로 인하여 그것들의 표적 분자에 공유가교결합을 형성하는 압타머를 생성하도록 변형된다. 이 방법은 표적 분자를 결합, 광가교결합 및/또는 광활성시키는 압타머를 포함한다. 다양한 실시예에서 상기 압타머는 빛으로 조사하여 표적 분자에 광가교결합할 수 있는 광반응성기를 포함한다. 다른 실시예에서는 압타머는 광조사 없이도 표적과 결합을 형성할 수 있다.
광반응성기는 광발색단을 포함하며 표적 분자에 광가교결합할 수 있는 모든 화학적 구조일 수 있다. 여기에서는 광반응성기로 칭하였지만, 어떤 경우에는 하기에서 기재한 바와 같이, 압타머와 표적 사이에 발생하는 공유결합에 조사가 반드시 필요한 것은 아니다. 어떤 실시예에서는 광반응성기는 표적 또는 올리고뉴클레오티드의 비변형 부분에 의하여 흡수되지 않는 파장의 빛을 흡수할 것이다. 광반응성기는 5-할로-우리딘, 5-할로-시토신, 7-할로-아데노신, 2-니트로-5-아지도벤졸릴, 디아지린, 아릴 아자이드, 불소화된 아릴 아자이드, 벤조페논, 아미노-벤조페논, 소랄렌(psoralens), 안트라퀴논 등을 포함한다.
광반응성기는 일반적으로 회합된 핵산-표적쌍을 방사하여 표적과의 결합을 형성한다. 어떤 경우에는 결합이 형성되는 데에 방사가 요구되지 않는다. 전형적으로 일어나는 광가교결합은 회합된 압타머와 표적 사이의 공유결합을 형성할 것이다. 그러나 압타머와 표적 사이의 견고한 이온성 상호결합 또한 방사에 의하여 발생할 것이다.
한 실시예에서, 전자기적 방사에 노출됨으로써 광가교결합이 일어난다. 전자기적 방사는 자외선, 가시광선, X선 및 감사선을 포함한다.
다른 다양한 실시예에서, SELEX 방법을 이용한 올리고뉴클레오티드를 제한적으로 선별한 이후에 광-SELEX 방법을 이용한 선별이 실시된다. 초기 SELEX 선별이 광반응성기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 실시된다. 수 회의 SELEX가 진행된 후에, 광-SELEX가 실시되어 표적 분자에 결합가능한 올리고뉴클레오티드를 선별한다.
다른 실시예에서, 압타머 서열에서 분열가능하거나 방출가능한 섹션 (요소 또는 성분으로도 기재)을 포함하는 압타머의 생산에 대하여 기재하고 있다. 이들 부가의 성분 또는 요소는 압타머로 부가의 기능을 도입하여 기능적인 요소 또는 성분인 구조적인 요소 또는 성분이다. 압타머는 하나 또는 그 이상의 하기의 부가 성분(이들 용어를 조합하여 기능적 또는 구조적 요소 또는 성분 또는 작용기로도 기재)을 포함하여 더욱 제조된다.: 표식되거나 검출가능한 성분, 스페이서 성분, 및 특이적인 결합 테크 또는 고정화 요소 또는 성분.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명은 표적 분자에 결합하고 일단 결합했으면 느린 분해속도 또는 오프-레이트를 갖는 압타머를 식별하는 방법을 제공한다. 이 방법으로 얻은 느린 오프-레이트는 약 1시간의 반감기를 초과하고 약 240분일 수 있는데, 즉 한 세트의 핵산-표적 복합체가 생성되면, 1시간 후에는 절반의 복합체가 세트에 결합된 채로 남아있다. 느린 오프-레이트 증폭 과정의 효과는 압타머 친화성 복합체의 분해상수를 달리하는 것에 달려 있기 때문에, 빠른 분해속도를 갖는 압타머 친화성 복합체의 수를 실질적으로 감소시키는 동안 느린 분해속도를 갖는 압타머 친화성 복합체가 높은 비율을 유지하도록 느린 오프-레이트 증폭 과정의 지속시간이 선별된다. 예를 들면, 느린 오프-레이트 증폭 과정을 실시한 후에 비교적 장시간동안 혼합물을 배양하는 것은 더 짧은 배양 시간을 갖는 느린 오프-레이트 증폭 과정을 이용하여 선별된 압타머 보다 더 긴 분해속도를 갖는 압타머가 선별될 것이다.
다양한 실시예에서, 대체물질 혼합물은 다량의 표적 분자와 혼합되고, 표적 분자와의 결합 평형이 이루어지도록 한다. 용액 내에서 자유로운 것으로부터 핵산에 결합된 표적을 분할하기 전에, 느린 오프-레이트 증폭 과정이 실시되어 결느린 분해 속도를 위해 결합된 부분을 증폭한다. 상기에서 기재된 바와 같이, 경쟁 분자의 첨가, 시료 희석, 경쟁 분자의 존재하에 시료 희석을 조합함으로써 느린 오프-레이트 증폭 과정이 적용될 수 있다. 그리하여 한 실시예에서, 느린 오프-레이트 증폭 과정은 경쟁 분자를 핵산-표적 복합체를 포함하는 혼합물에 유입시키고 일정시간 동안 혼합물을 배양시키고 결합된 핵산으로부터 자유롭게 분할시킴으로써 적용될 수 있다. 경쟁 분자의 양은 일반적으로 핵산 분자의 차수보다 1 차수 이상이며, 2 이상의 차수 일 수 있다. 다른 실시예에서는, 느린 오프-레이트 증폭 과정은 핵산-표적 복합체의 시료 혼합물을 부피 몇 배(예를 들면, 2X, 3X, 4X, 5X 중 적어도 하나)로 희석시키고 일정한 시간 동안 혼합물을 배양하고 결합된 핵산으로부터 자유롭게 분할시킴으로써 적용된다. 희석 부피는 일반적으로 원래 부피보다 적어도 1 차수 이상 높으며, 약 2 또는 그 이상의 차수 일 수 있다. 그러나 다른 실시예에서는 경쟁 분자와 희석을 조합하여 느린 오프-레이트 증폭 과정에 적용한다. 다른 실시예에서는 느린 분해 압타머의 진동수가 증가되었던 대체물질 혼합물은 다수의 대체물질 압타머를 선별하는 데에 사용될 수 있다. 이들 압타머는 스크리닝하여 느린 분해속도 압타머를 식별한다.
다른 실시예에서는 압타머의 고정 부위에 분열가능하거나 방출가능한 섹션을 포함하는 느린 오프-레이트 압타머를 제조한다. 또한 압타머는 하기의 부가적인 성분을 하나 또는 그 이상 가지도록 제조될 수 있다: 표식된 성분, 스페이서 성분 및 특이적 결합 태그. 이들 중 어떤 요소 또는 모든 요소는 단일 가닥의 압타머로 유입될 수 있다. 한 실시예에서, 압타머의 5'-말단에 유입될 수 있다. 다른 실시예에서 부분적으로 이중 가닥의 압타머를 생성시킴으로써 이들 요소 중 하나 또는 그 이상이 포함될 수 있는데, 여기에서 한 가닥이 바람직한 다양한 요소를뿐만 아니라 가변적인 표적 결합 부위를 포함하는 두 번째 가닥의 고정된 서열 섹션 중의 하나에 상보적인 서열을 포함한다.
"방출가능한" 또는 "분열가능한" 요소 또는 작용기 또는 성분은 작용기 내에 어떤 결합이 깨져 2개의 별개의 성분을 생성할 수 있는 작용기를 일컫는다. 다양한 실시예에서, 작용기(광분열가능한)를 적절한 파장으로 방사시키거나 적절한 화학적 또는 효소적 시약으로 처리함으로써 쪼개질 수 있다. 다른 실싱PDp서, 방출가능한 요소는 결합을 방해하는 환원제로 처리될 수 있는 이황화 결합일 수 있다. 이 방출가능한 요소는 복합체의 용출에 의하여 고상 지지체에 부착된 압타머/표적 친화성 복합체가 상기 고상 지지체로부터 분리되도록 한다. 방출가능한 요소는 나머지 검사의 조건에 안정적일 수 있으며, 압타머/표적 복합체를 방해하지 않을 조건하에서 방출가능할 수 있다.
여기 기재한 바와 같이, 압타머는 "태그(tag)" 또는 "고정화 성분 또는 요소" 또는 "특이적 결합 성분 또는 요소"를 더욱 포함할 수 있는데, 이들은 압타머 (및 이에 결합된 모든 표적 분자)를 고상 지지체에 부착 또는 고정화시키는 수단을 제공하는 성분을 일컫는다. "태그(tag)"는 프로브와 결합가능한 한 타입 및 1종의 성분의 1 세트의 복사본이다. "태그들(tags)"는 이러한 1 세트 초과의 성분을 일컫는다. 태그는 적절한 방법에 의하여 압타머에 부착되거나 포함될 수 있다. 일반적으로, 태크는 압타머가 직접 또는 간적적으로 고상 지지체에 부착된 프로브 또는 수용체와 결합되도록 한다. 프로브는 태그와의 상호작용에 있어서 매우 특이할 수 있으며, 모든 후속의 가공 단계 또는 과정 동안 결합을 유지할 수 있다. 태그는 압타머 친화성 복합체 (또는 선별적 공유결합의 압타머 친화성 복합체)가 고상 지지체 상에서 공간적으로 정의된 주소로 편재화되도록 한다. 그러므로 이와 다른 태그들은 다른 압타머와 공유결합된 복합체가 고상 지지체 상에서 공간적으로 다른 정의된 주소로 편재화되도록 한다. 태그는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 항체 미믹, 세포 수용체, 리간드, 지질, 비오틴, 이들 구조의 분절 또는 유도체, 이들의 조합 또는 특이성으로 결합되거나 이와는 다르게 회합되도록 고안되거나 배열될 수 있는 프로브 (또는 하기에 언급된 연결자 분자)를 가진 모든 구조물일 수 있다. 일반적으로 태그는 그 자체 또는 결합되거나 그 부분인 압타머 중의 하나와 분자내 상호작용을 하지 않도록 배열된다. SELEX를 사용하여 압타머를 식별한다면, 태그는 프리- 또는 포스트-SELEX 과정에서 압타머에 추가될 수 있다. 태그는 포스트-SELEX 과정에서 압타머의 5'-말단상에 포함되거나 태그는 포스트-SELEX 과정에서 압타머의 3'-말단에 포함되거나 또는 태그는 포스트-SELEX 과정에서 압타머의 3' 및 5'-말단 모두 상에 포함될 수 있다.
도면 8D에 도시된 바와 같이, 형광염료(Cy3과 같은), 광분해성 부분들 및 비오틴 부분들(moieties)은 모두 압타머의 끝에 더해진다. 광분해성 부분들 및 형광염료 사이에 잠재적인 상호작용들(potential interactions) 때문에 하나의 스페이서가 이들 두 부분들 사이에 삽입된다. 모든 구조체(construct)들은 표준 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 대표적인 압타머 구조들은 도면 9A 내지 9F에 도시되어 있다. 그 기능성은 5' 및 3' 말단 사이에서 쪼개질 수 있고, 또는 양 말단에서 결합될 수 있다. 광분해성 부분들에 더해서, 화학적으로 효소적으로 분해될수 있는 부분들을 포함하는 다른 분해성 부분들이 사용될 수 있다. 다양한 스페이서 부분들은 사용될 수 있고, 그리고 1 이상의 비오틴 부분들이 포함될 수 있다. 비오틴 이외에 태그(Tag)들(또한 불이동성화 또는 특정 바인딩 요소들이나 성분들로서 언급된) 또한 편입시킬 수 있다. 적절한 구조 시약들은 비오틴 포스포라미다이트, PC 연결자(글랜 리서치 PN 10-4920-02); PC 비오틴 포스포라미다이트(글랜 리서치 PN 10-4950-02); d스테이서 CE 포스포라미다이트(글랜 리서치 PN 10-1914-02); Cy3 포스포라미다이트(글랜 리서치 PN 10-5913-02); 그리고 Arm26-Ach 스페이서 아미다이트(피델러티 시스템스 PN SP26Ach-05).
일 구현예에서, 그 뉴클레오타이드들의 베이스 변이들은 압타머의 다양한 영역의 생산 안에서 사용된다. 이들 변이된 뉴클레오타이드들을 이용하여 그들의 표적으로부터 매우 느린 오프-레이트를 가지는 압타머를 생산한다.
본 개시의 방법들안에서 그 후보 혼합물은 변이된 핵산들을 포함하여 이루어질 수 있는데, 상기 변이된 핵산들 안에서 하나, 몇몇(예를 들어, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 중에 하나, 또는 중에 적어도 하나) 또는 모든 피리미딘들, 적어도 하나, 또는 각각, 그 후보 혼합물의 핵산 안에서, 그 5-위치에서 화학적으로 변이가 일어난다. 선별적으로, 그 후보 혼합물의 그 핵산들 안에 모든 T 잔기들은 그 5-위치에서 화학적으로 변이가 일어난다. 선별적으로, 그 후보 혼합물의 그 핵산들 안에 모든 U 잔기들은 그 5-위치에서 화학적으로 변이가 일어난다.
또 다른 구현예에서, 그 느린 오프-레이트 압타머들은 어떤 샘플에 혼합되거나 노출된다. 그 느린 오프-레이트 압타머는 한 복합체를 형성하기 위해 그 샘플 안에서 그것의 특정된 타겟에 결합되거나 반응이 허락된다. 다양한 방법들은 그 타겟 또는 그 압타머를 감지하기 위해 사용될 수 있다. 그 타겟은 그 복합체 안에서 또는 그 복합체로부터의 해방 하에 감지될 수 있다. 그 압타머/타겟 복합체는 그 특정의 타겟을 그 테스트 샘플 안의 다른 성분들로부터 분리하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 압타머들은 다양한 타겟의 감지를 위한 다중 시금(mμLtiplexed assay)이 요구될 때 사용될 수 있다.
현 개시 안에서의 방법은 실시예 1-8 안에 기술되어 있다. 실시예 1은 변이된 뉴클레오타이드들을 포함하여 이루어진 한 후보 혼합물을 사용하는 일반적인 친화성(affinity) SELEX 방법을 기술하고 있다. 실시예 2는 변이된 뉴클레오타이드들 및 한 5' 말단 광반응성 기를 포함하여 이루어진 한 후보 혼합물을 사용하는 한 광(photo) SELEX 방법, 그리고 향상된 SELEX 방법(그것 안에서 희석은 그 느린 오프-레이트 농축과정를 평형상태가 된 압타머:타겟 혼합물에 제공하는데 사용된다)을 기술하고 있다. 실시예 3은 실시예 2에서 기술된 방법을 그 희석 단계에 컴페티터(competitor)를 첨가하는 것에 의해서 더 확장시킨다. 실시예 4는 그 느린 오프-레이트 농축과정의 유효성을 기술하고 있다. 그 변이된 뉴클레오타이드들(5-벤질카복시아미드-dUTP (BndUTP), 5-이소부틸카복시아미드-dUTP (iBudUTP), 또는 어떤 느린 오프-레이트 농축과정의 부존재에서 선별된 5-트립트아미노카복시아미드-dUTP (TrpdUTP)을 사용하는 압타머들로서 그 평균 해리(dissociation) 반감기 값(t1/2)은 1 시간까지의 어떤 t1/2 값을 가지는 몇 압타머들과 함께 20 분이었다(도 3A). 이것은 앞서서 내츄럴 베이스들 또는 다른 변이된 뉴클레오타이드들을 가지고 서술된 것 보다 상당히 더 길다. 어떤 느린 오프-레이트 농축과정를 가지고 선별된 압타머들의 그 평균은 85 분을 넘어섰다. 더 특정되게, 도면 3B와 관련하여, 그것은 어떤 느린 오프-레이트 농축과정의 도입은 ≥ 약 30분, ≥ 약 60분, ≥ 약 90분, ≥ 약 120분, ≥ 약 150분, ≥ 약 180분, ≥ 약 210분, ≥ 약 240분의 t1/2 값을 가지는 압타머들을 만들어냈다는 것을 보일 수 있다. 압타머:타겟 복합체들로서 이들 해리 속도는 전례 없는 것이다.
실시예 5는 한 NapdU (나프틸메틸카복시아미드-dU) 대체 물질 혼합물을 사용하는 느린 오프-레이트 압타머들의 발생을 기술하고 있다.
실시예 6은 한 펩티드 타겟에 한 느린 오프-레이트 압타머의 발생을 기술하고 있다.
실시예 7은 종래 압타머에 대한 느린 오프-레이트 압타머의 유용성을 나타낸다.
실시예 8은 BndU 대체 물질 혼합물을 이용하여 느린 오프-레이트 압타머를 생산하는 것을 추가로 나타낸다.
실시예
하기의 실시예는 기술하기 위하여 제공하는 것일 뿐 후에 첨부된 청구항에 정의된 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. 핵산 라이브러리 변형 뉴클레이티드의 도입으로 친화성 SELEX 내에 고친화성 증폭된 라이브러리 유도
A. 대체물질 혼합물 제조
dATP, dGTP, 5-메틸-dCTP(MeDCTP) 및, dTTP 또는 세 개의 dUTP 유사체(5-벤질카복시아미드-dUTP (BndUTP), 5-이소부틸카복시아미드-dUTP (iBudUTP), 또는 5-트립트아미노카복시아미드-dUPT (TrpdUTP)) 중 하나를 이용하여 대체물질 혼합물을 제조하였다. 비오티닐레이팅화된 템플레이트에 어닐링된 프라이머를 폴리머라제 연장함으로써 대체물질 혼합물을 제조하였다(도 2). 각 대체물질 혼합물 조성물에 대하여, 4.8nmol의 전방 PCT 프라이머 및 4nmmol의 템플레이트를 100μL 1X KOD DNA 폴리머아제 완충액에서 혼합하고, 8분 동안 95℃에서 가열한 후에 얼음 위에서 냉각하였다. 각각의 100μL의 프라이머:템플레이트 혼합물을 1X KOD DNA 폴리머라제 완충액, 0.125 U/μL KOD XL DNA 폴리머라제, 및 0.5mM의 각각의 dATP, MedCTP, dGTP, 및 dTTP 또는 dUTP 유사체를 포함하는 400μL의 연장용액에 첨가하고 70℃에서 30분 동안 배양하였다. 이중-가닥의 생성물은 1mL의 스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드(MagnaBind Streptavidin, Pierce, 5mg/mL in 1M NaCl + 0.05% TWEEN-20)를 첨가하고 25℃에서 10분 동안 혼합하면서 배양함으로써 템플레이트 가닥 비오틴을 통하여 캡쳐되었다. 비드를 3회에 걸쳐서 0.75mL의 SBIT 완충액(40mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 1mM CaCl2, 0.05% TWEEN-20)으로 세척하였다. 압타머 가닥을 12mL의 20mM NaOH을 이용하여 비드로부터 용출시키고, 0.3mL80mM HCl로 중성화 시킨 후에 15μL의 1M HEPES, pH 7.5로 완충시켰다. 대체물질 혼합물을 센트리콘-30(Centricon-30)으로 약 0.2mL까지 농축시킨 후에 UV 흡광도 분광기로 정량하였다.
B. 표적 단백질의 고정화
표적 단백질을 (His)6 태그 (R&D 시스템)과 같은 폴리 His 태그로 구입하고, Co+2-NTA 상자성 비드(MyOne TALON, Invitrogen, 이후 Talon beads라고 칭함) 상에 고정하였다. 표적 단백질을 0.5mL B/W 완충액(50mM Na-포스페이트, pH 8.0, 300mM NaCl, 0.01% TWEEN-20)을 이용하여 0.2mg/mL로 희석시키고, 0.5mL TALON 비드(B/W 완충액으로 3회 미리 세척하고 B/W 완충액 10mg/mL로 재현탁시킴)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 25℃에서 회전시키고, 4℃에 보관한 후에 사용하였다. (His)6 펩티드로 코팅한 TALON 비드를 또한 제조하고 상기와 같이 보관하였다. 사용하기 전에, 비드를 B/W 완충액으로 3회에 걸쳐서 세척하고, SBIT로 1회 세척한 후에 SBIT로 재현탁시켰다.
C. 압타머 선별 과정
표적 단백질 비드(시그날, S) 및 (His)6 비드(배경, B)와의 결합을 비교하여 각 대체물질 혼합물에 대하여 별도로 친화성 선별을 실시하였다. 각 시료에 대하여 0.5μM 대체물질 DNA 혼합물을 40μL의 SBIT에서 준비하였다. 1μL의 (His)6-보체 올리고 (1μM)(도 2)를 상기 DNA에 첨가하고, 10μL의 단백질 경쟁 혼합물(0.1% HSA, 10μM 카제인, 및 SBIT에서의 10μM 프로트롬빈)을 첨가하였다.
50μL의 표적 μ단백질이 코팅된 비드 또는 (His)6이 코팅된 비드 (SBIT에서 5mg/mL)를 DNA 혼합물에 첨가하고, 15분 동안 37℃에서 배양하여 결합 반응을 실시하였다. DNA 용액을 제거하고 비드를 37℃에서 0.1mg/mL의 청어 정액 DNA (시그마-알드리치사)를 포함하는 SBIT로 5회에 걸쳐서 세척하였다. 상기와 같이 하지 않으면, 비드를 100μL의 세척용액에서 재현탁시키고, 30초간 혼합, 비드를 자석으로 분리시킨 후에 세척용액을 제거함으로써 모든 세척을 실시하였다. 결합된 압타머에 100μL SBIT + 2M 구아니딘-HCl를 첨가하고 37℃에서 5분동안 혼합시키면서 배양함으로써 비드로부터 용출시켰다. 자력선별(magnetic separation) 후에 압타머 용출액을 새로운 튜브로 옮겼다. 처음 2회의 선별 후에 5 번의 표적 비드 세척분 중 마지막 2번은 30초 대신 5분 동안 진행되었다.
비오티닐레이팅된 리버스 PCR 프라이머를 스트렙타비딘이 코팅된 상자성비드(MyOne-Streptavidin C1 (SA beads), Invitrogen)에 고정시킴으로써 프라이머 비드를 제조하였다. 5mL SA 비드(10mg/mL)를 NaCIT(5M NaCl, 0.01% TWEEN-20)로 1회 세척하고 5mL의 비오티닐레이팅된 리버스 PCT 프라이머(NACIT에서 5μM)에서 재현탁시켰다. 시료를 25℃에서 15분 동안 배양시키고 5mL의 NACIT로 2회 세척하고 12.5mL의 NaCIT(4mg/mL)에서 재현탁시킨 후에 4℃에서 보관하였다.
25μL의 프라이머 비드(NaCIT에서 4mg/mL)를 100μL의 구아니딘 완충용액의 압타머 용액에 첨가하고 혼합하면서 50℃에서 15분 동안 배양하였다. 압타머 용액을 제거하고 비드를 SBIT로 5회 세척하였다. 85μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 압타머를 용출시켰다. 자력선별 후에 80μL의 압타머 용출액을 새로운 튜브에 옮기고, 20μL의 80mM HCl로 중화시키고, 1μL의 0.5M Tris-HCl, pH 7.5로 완충시켰다.
D. 압타머 증폭 및 정제
선별된 압타머 DNA를 증폭시키고 QPCR로 정량하였다. 12μL의 QPCR 믹스(5X KOD DNA 폴리머라제 완충액, 25mM MgCl2, 10μM의 포워드 PCR 프라이머, 10μM의 비이오티닐레이팅된 리버스 PCR 프라이머, 5X SYBR 그린 I, 0.125U/μL KOD XL DNA 폴리머라제, 및 1mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각)에 40μL의 DNA를 첨가하고, 하기의 프로토콜에 따라서 ABI5700 QPCR 기구에서 열사이클을 하였다: 99.9℃, 15초, 55℃, 10초, 70℃, 30분(1사이클); 99.9℃, 15초, 72℃, 1분(30사이클). 기구 소프트웨어를 이용하여 정량하고, 표적 비드와 (His)6 비드에 선별된 DNA 복사본의 수를 비교하여 시그날/배경의 비율을 결정하였다.
증폭 이후에, 비오티닐레이팅된 안티센스 가닥을 통해 SA 비드 상에서 PCR 생성물을 캡처하였다. 1.25mL의 SA 비드(10mg/mL)를 0.5mL의 20mM NaOH로 2회, 0.5mL의 SBIT로 1회 세척하고 2.5mL의 3M NaCl에서 재현탁시키고, 4℃에서 보관하였다. 25μL의 MyOne-SA 비드(3M NaCl에서 4mg/mL)를 50μL의 이중-가닥의 QPCR 생성물에 첨가하고 혼합하면서 25℃에서 5분 동안 배양시켰다. 비드를 SBIT로 1회 세척하고, 200μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 "센스(sense)" 가닥을 비드로부터 용출시켰다. 용출된 가닥을 버리고 비드를 SBIT로 3회 16mM NaCl로 1회 세척하였다.
적절한 뉴클레오티드 조성이 고정된 안티센스 가닥에서 프라이머 연장을 하여 압타머 센스 가닥을 제조하였다. 20μL의 프라이머 연장반응 믹스(1X 프라이머 연장 완충액 (120mM Tris-HCl, pH 7.8 @20, 10mM KCl, 7mM MgSO4, 6mM (NH4)2SO4, 0.001% BSA 및 0.01% Triton X100), 5μM 포워드 PCR 프라이머, 0.125U/μL KOD XL DNA 폴리머라제, 0.5mM의 dATP, MedCTP, dGTP 각각 및 dTTP 또는 dUTP 유사체 중 하나)에서 비드를 재현탁시키고, 혼합하면서 68℃에서 30분 동안 배양시켰다. 비드를 SBIT로 3회에 걸쳐서 세척하고, 85μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 비드로부터 압타머 가닥을 용출시켰다. 자력선별 후에 80μL의 압타머 용출액을 새로운 튜브로 옮기고, 20μL의 80mM HCl로 중화시키고, 5μL의 0.1M HEPES, pH 7.5로 완충시켰다.
E. 선별 절박성 및 피드백
선별 단계의 상대적인 표적 단백질 농도를 S/B 비율에 대하여 각 회에서 낮추었는데, 여기에서 시그날 S 및 배경 B는 상기 C에서 정의하였다:
S/B < 10이면, [P](i+l) = [P]i
10 ≤ S/B < 100이면, [P](i+l) = [P]i/3.2
S/B ≥ 100이면, [P](i+l) = [P]i/10
여기에서 [P]는 단백질 농도이고, i는 현재 회(round)수이다.
선별 단계에서 첨가된 표적 단백질 비드 (및 배경 결정을 위한 (His) 6비드)의 질량을 조절함으로써 표적 단백질 농도를 낮추었다.
선별의 각 라운드 후에 농축된 DNA 혼합물의 융합 상태를 결정하였다. 5μL의 이중-가닥의 QPCR 생성물을 1X SYBR 그린 I를 포함하는 4mM MgCl2를 이용하여 200μL로 희석시켰다. 시료를 75μL의 실리콘 오일로 덮어씌우고, 이중 가닥의 올리고뉴클레이티드의 복합체 혼합물에 대한 하이브리디제이션 시간을 측정하는 C0t 분석법을 이용하여 융합을 분석하였다. 다음의 프로토콜로 시료를 열사이클을 실시하였다: 98℃, 1분, 85℃, 1분(3사이클); 93℃, 1분, 85℃, 15분(1사이클). 85℃에서 15분 동안,형광 이미지를 5-초 간격으로 측정하였다. 서열의 다양성을 평강하기 위하여 log(시간)의 함수로서 형광 강도는 그래프를 도시하였다.
F. 평형 결합 상수(Kd) 측정
TALON 비드 분할을 이용하여 농축된 라이브러리의 평형 결합 상수를 측정하였다. 95℃에서 가열하고 37℃에서 서서히 냉각시킴으로써 DNA를 재변성시켰다. 저농도의 방사성 표지된 DNA(~1X10-11M)를 일정한 범위의 농도인 표적 단백질(1X10-7 M 에서 1X10-12M 최종)로 SB1 완충용액에서 혼합시키고, 37℃에서 배양시킴으로써 복합체를 형성하였다. 각 반응액의 일부를 나일론 멤브레인으로 이동시키고, 각 반응액의 총 카운트를 결정하기 위하여 건조시켰다. 소량의 5mg/mL의 TALON 비드를 각 반응액의 여분에 첨가하고, 37℃에서 1분 동안 혼합하였다. 일부를 진공하에서 멀티스크린 HV 플레이트(Millipore)를 통과시켜 단백질이 결합된 복합체를 결합하지 않은 DNA에서 분리시키고, 100μL의 SB1 완충용액으로 세척하였다. 나일론 멤브레인과 멀티스크린 HV 플레이트를 포스포리미징(phosphorimaged)하고 각 시료에서 방사능의 양을 FUJI FLA-3000를 이용하여 측정하였다. 캡쳐된 DNA의 분획을 단백질 농도의 함수로 그래프에 도시하고, 비선형 곡선-정합 알고리즘을 사용하여 상기 데이타로부터 평형 결합 상수(Kd 값)를 구했다. 표 1은 한 세트의 표적에 대한 농축된 각각의 대체물질 혼합물에 대하여 결정된 Kd값을 나타낸다. NT는 C0t 분석법에 의하여 결정된 바와 같이, 특정 염기 조성에 대한 농축된 라이브러리가 원래의 대체물질 혼합물로부터 변한 것으로 보이지 않으며, 그러므로 테스팅되지 않는 것(Not Tested, NT)이라는 것을 보여준다.
표 1은 15개의 다른 단백질 표적 및 4개의 다른 DNA 라이브러리에 대한 농축된 풀의 평형 결합 상수(Kd)를 나타낸다: 자연적으로 발생하는 염기(dT), 벤질(BzdU), 이소부틸(iBdU) 또는 트립토판(TrpdU). 1X10-8 미만의 Kd를 갖는 압타머가 바람직하다. 변형된 염기를 SELEX 방법에 사용하여 매우 높은 퍼센트의 바람직한 고친화성 압타머를 제조한다. 정상 뉴클레오티드로 제조된 14개의 압타머 중에서 2개 만이 느린 분해속도를 가진 것으로 관찰되었다. 변형된 뉴클레오티드로 제조된 느린 오프레이트 압타머는 BndUTP, iBudUTP 및 TrpdUTP에 대하여 각각 14 중 9, 14 중 7 및 14 중 14인 것으로 확인되었다.
다른 변형 뉴클레오티드로 선별된 농축된 라이브러리의 평형 결합상수 (Kd), 단위: 몰농도, NT=Not Tested
표적 단백질 dTTP BndUTP iBudUTP TrpdUTP
4-1BB >1.0E-07 5.6E-09 >1.0E-07 3.9E-09
B7 >1.0E-07 1.1E-08 NT 7.2E-09
B7-2 >1.0E-07 NT >1.0E-07 5.7E-09
CLTA-4 >1.0E-07 NT NT 1.4E-09
E-셀렉틴(E-Slectin) >1.0E-07 >1.0E-07 >1.0E-07 1.9E-09
프락타킨(Fractakine) NT >1.0E-07 NT 5.1E-11
GA733-1 단백질 8.9E-09 2.8E-09 4.7E-09 4.5E-10
Gp130 >1.0E-07 5.9E-09 2.2E-08 1.2E-09
HMG-1 >1.0E-07 NT 2.2E-08 4.9E-09
IR >1.0E-07 1.9E-09 1.2E-08 2.2E-10
OPG 307E-08 4.6E-09 9.5E-09 1.7E-10
PAI-1 >1.0E-07 3.7E-09 9.1E-10 4.3E-10
P-카드헤린(P-Cadherin) >1.0E-07 3.5E-09 5.2E-09 2.7E-09
S렙틴 R >1.0E-07 2.3E-09 NT 4.6E-10
실시예 2. 5'-고정 광 SELEX 및 희석에 의한 느린 오프 - 레이트 농축 과정을 이용한 광압타머의 생성
A. 대체물질 혼합물의 제조
비오티닐레이팅된 플레이트에 어닐링된 프라이머의 폴리머라제 연장에 의하여 dATP, dCTP, dGTP 및 BndUTP를 포함하는 대체물질 혼합물을 제조하엿다(도 4A-B). 각각의 템플레이트에 대하여 4개의 다른 포워드 프라이머를 사용하여, 각각 5-말단에 독특한 발색단을 갖도록 하였다(도 5, 발색단 구조). 각각의 대체물질 혼합물에 대하여, 11nmol의 (5' 발색단을 갖는) 포워드 프라이머 및 10nmol의 템플레이트를 250μL의 프라이머 연장 완충용액(120mM Tris-HCl, pH 7.8, 10mM KCl, 6mM (NH4)2SO4, 7mM MgSO4, 0.1mg/mL BSA, 0.1% Triton X-100)에서 혼합하고 95℃에서 5분 동안 가열시키고, 얼음 위에서 냉각시켰다. 125μL의 각각의 프라이머:템프레이트 혼합물을 1mL의 프라이머 연장 완충용액, 0.125U/μL KOD XL DNA 폴리머라제, 및 0.5mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 BndUTP를 포함하는 연장 반응액에 첨가하고 70℃에서 30분 동안 배양시켰다. 각각의 1mL의 반응액을 4 개의 250μL의 부분 표본으로 나누고, 얼음 위에서 냉각시켰다. 각각의 250μL의 부분 표본에 1mL의 스트렙타비딘이 코팅된 자성 비드(MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5mg/mL in NaCl + 0.05% TWEEN-20)를 첨가하고 혼합하면서 25℃에서 60분 동안 배양시킴으로써 템플레이트 가닥 비오틴을 통하여 이중-가닥의 생성물을 캡쳐하였다. 0.5mL의 SB17T 완충액(40mM HEPES, pH 7.5, 125mM NaCl, 5mM KCl, 5mM NgCl2, 1mM EDTA, 0.05% TWEEN-20)으로 3회에 걸쳐서 비드를 세척하였다. 1mL의 20mM NaOH를 이용하여 비드로부터 압타머를 가닥을 용출시키고, 0.25mL의 80mM HCl로 중화시키고, 10μL의 1M HEPES, pH 7.5로 완충시켰다. 대체물질 혼합물을 센트리콘-30을 이용하여 약 0.2mL로 농축시키고 UV 흡광 분광기로 정량하였다.
B. 표적 단백질의 제조
태그되지 않은 표적 단백질을 리신 잔기에 NHS-PEO4-비오틴의 공유결합 커플링에 의하여 비오티닐레이팅시켰다. 단백질(50μL에서 300pmol)을 세파덱스 G-25 마이크로스핀 칼럼으로 SB17T로 교환하였다. NHS-PEO4-비오틴을 1.5mM로 첨가하고 반응액을 4℃에서 16시간 동안 배양시켰다. 반응하지 않은 NHS-PEO4-비오틴을 세파덱스 G-25 마이크로스핀 칼럼으로 제거하였다.
C. 느린 오프-레이트 농축 과정 및 광가교결합으로 압타머 선별
표적 단백질을 포함하는 시료 (시그날 S) 및 표적 단백질을 포함하지 않는 시료 (배경 B) 사이의 결합을 포함하는 각 대체물질 혼합물에 대하여 별도로 선별이 실시되었다. 친화성(광가교결합 없음)에 대한 선별이 처음 3회 실시되었고, 2번째 및 3번째에서는 느린 오프-레이트 농축 과정이 포함되었다. 4회에서 8회 동안에는 느린 오프-레이트 농축 과정과 광가교결합이 모두 포함되었다.
각 시료에 대하여 90μL의 DNA 혼합물을 10-20pmols의 대체물질 혼합물(1회에서 100pmoles) 및 100pmoles의 리버스 프라이머를 포함하는 SB17T에서 제조되었다. 시료를 95℃에서 3분 동안 가열하고 37℃에서 0.1C/초의 속도로 냉각시켰다. 시료를 10μL의 단백질 경쟁 혼합물(0.1% HSA, 10μM 카제인, 및 SB17T에서의 10μM 프로트롬빈)과 혼합시키고, (20mM NaOH로 2회, SB17T로 1회 미리 세척한) 0.5mg의 SA 비드에 첨가하고 37℃에서 5분 동안 혼합하면서 배양시켰다. 자력선별 후에 비드를 제거하였다.
10μL의 표적 단백질(SB17T에서 0.5μM) 또는 SB17T을 40μL의 단백질 혼합물에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양시킴으로써 결합 반응을 실시하였다.
느린 오프-레이트 농축 과정을 적용할 때, (37℃에서 미리 가열된) 950μL의 SB17Tfmf 첨가함으로써 시료를 20X로 희석시키고, 복합체를 캡쳐하기 전에 37℃에서 30분 동안 배양시켰다.
0.25mg의 MyOne-SA 비드(Invitrogen)를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 15분 동안 배양시킴으로써 단백질 비오틴을 통해 SA 비드 상에서 복합체를 캡쳐하였다. 비드를 SB17T로 5회에 걸쳐서 세척하여 자유 DNA를 제거하였다. 상기와 같이 하지 않으면, 100μL의 세척용액에서 비드를 재현탁시키고, 25℃에서 30분 동안 혼합하고, 비드를 자석으로 분리시키고 난 후에 세척용액을 제거함으로써 모든 세척과정을 실시하였다. 85μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 압타머 가닥을 비드로부터 용출시켰다. 자력 선별을 한 후에 80μL의 압타머 용출액을 새로운 튜브로 옮기고, 20μL의 80mM HCl로 중화시키고, 1μL의 0.5M Tris-HCl, pH 7.5로 완충시켰다.
광-선별법을 적용할 때, 50μL의 결합 반응액 (또는 희석에 의한 선택적인 느린 오프-레이트 농축 공정 후에 1mL의 결합 반응액)을 고압 수은등(Optical Associates, Inc. model 0131-0003, 500W, 310nm 거울세트 구비)으로 위쪽에서 조사시켰다. BrdU 발색단을 포함하는 대체물질 혼합물을 37초 동안 방사시키고, ANA 발색단을 포함하는 대체물질 혼합물은 60초 동안, AQ 또는 소랄렌 발색단을 포함하는 것은 10분 동안 조사시켰다. ANA, AQ 및 소랄렌 발색단에 대해서는 불필요한 것을 제거하기 위하여 부가의 필터(5mm 플레이트 글래스)를 사용하되, 320nm 미만의 파장에서는 손상을 입을 가능성이 있었다. 상기에서와 같이 복합체를 캡쳐하고, 비드를 50℃에서 10분 동안 4M 구아니딘-HCl + 0.05% TWEEN-20으로 1회, SB17T로 2회 및 16mM HCl로 1회 세척하여 가교결합되지 않은 DNA를 제거하였다. 가교결합된 DNA는 증폭 단계를 위하여 비드 표면에서 제거하지 않았다.
D. 압타머 증폭 및 정제
선별된 압타머 DNA를 QPCR로 증폭 및 정량하였다. 12μL의 QPCR 믹스(5X KOD DNA 폴리머라제 완충액, 25mM MgCl2, 10μM의 포워드 PCR 프라이머, 10μM의 비이오티닐레이팅된 리버스 PCR 프라이머, 5X SYBR 그린 I, 0.125U/μL KOD DNA 폴리머라제, 및 1mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각)에 48μL의 DNA를 첨가하고, 하기의 프로토콜에 따라서 Bio-Rad MyIQ QPCR 기구에서 열사이클을 하였다: 99.9℃, 15초, 55℃, 10초, 68℃, 30분(1사이클); 99.9℃, 15초, 72℃, 1분(30사이클). 기구 소프트웨어를 이용하여 정량하고, 표적 단백질을 포함하거나 미포함하는 선별된 DNA 복사본의 수를 비교하여 시그날/배경의 비율을 결정하였다.
광-선별법을 적용할 때, 비드 표면 상에 프라이머를 연장하여 선별된 DNA의 cDNA 복사본을 제조하였다. 세척된 비드를 20μL의 cDNA 연장 믹스(5μM 리버스 PCR 프라이머, 0.5mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각, 및 0.125μL의 KOD XL DNA 폴리머라제를 포함하는 프라이머 연장 완충용액) 내에서 재현탁시키고, 혼합하면서 68℃에서 30분 동안 배양시켰다. 비드를 SB17T로 3회 세척하고, 85μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 비드로부터 압타머 가닥을 용출시켰다. 자력선별 후에 80μL의 압타머 용출액을 새로운 튜브로 옮기고 20μL의 80mM HCl로 중화시키고 1μL의 0.5M Tris-HCl, pH 7.5로 완충시켰다. QPCR를 이용하여 상기와 같이 99.9℃, 15초, 72℃, 1분의 30사이클을 실시하여 cDNA를 증폭시키고 정량하였다.
증폭 이후에, 비오티닐레이팅된 안티센스 가닥을 통해 SA 비드 상에서 PCR 생성물을 캡처하였다. 1.25mL의 SA 비드(10mg/mL)를 0.5mL의 20mM NaOH로 2회, 0.5mL의 SBIT로 1회 세척하고 1.25mL의 3M NaCl + 0.05% Tween에서 재현탁시키고, 4℃에서 보관하였다. 25μL의 SA 비드(3M NaCl에서 4mg/mL)를 50μL의 이중-가닥의 QPCR 생성물에 첨가하고 혼합하면서 25℃에서 5분 동안 배양시켰다. 비드를 SBIT로 1회 세척하고, 200μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 "센스(sense)" 가닥을 비드로부터 용출시켰다. 용출된 가닥을 버리고 비드를 SBIT로 3회 16mM NaCl로 1회 세척하였다.
적절한 발색단을 이용하여 고정된 안티센스 가닥에서 프라이머 연장을 하여 압타머 센스 가닥을 제조하였다. 20μL의 프라이머 연장반응 혼합물(1X 프라이머 연장 완충액, 1.5mM MgCl2, 적절한 5' 발색단을 포함하는 5μM 포워드 프라이머, 0.5mM의 dATP, dCTP, dGTP, 및 BndUTP 각각 및 0.125U/μL의 KOD XL DNA 폴리머라제)에서 비드를 재현탁시키고, 혼합하면서 68℃에서 30분 동안 배양시켰다. 비드를 SB17T로 3회에 걸쳐서 세척하고, 85μL의 20mM NaOH를 첨가하고 혼합하면서 37℃에서 1분 동안 배양시킴으로써 비드로부터 압타머 가닥을 용출시켰다. 자력선별 후에 80μL의 압타머 용출액을 새로운 튜브로 옮기고, 20μL의 80mM HCl로 중화시키고, 5μL의 0.1M HEPES, pH 7.5로 완충시켰다.
E. 선별 절박성 및 피드백
상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이 각 라운드에서 표적 단백질을 조절하였다. 실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각 라운드의 선별 후에, 농축된 풀의 융합 상태를 결정하였다.
F. 농축된 라이브러리의 평형 결합 상수
상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이 결합 친화성을 결정하되, SA 캡쳐 비드를 포함하는 것에 대하여 실시하였다. 하기의 표 2는 느린 오프-레이트 농축 과정에 광SELEX 프로토콜을 이용하여 얻은 평형 결합 상수(Kd)를 요약한 것이다.
다른 발색단으로 선별된 농축된 라이브러리의 평형 결합상수 (Kd), 단위: 몰농도, 융합에 실패한 라이브러리에 대해서는 측정하지 않음(x로 표시)
표적 단백질 AQ ANA Psor
β-카테닌 2.7x10-8 3.6x10-9 1.1x10-9 1.6x10-9
nFGF 3.1x10-8 5.7x10-10 7.1x10-10 5.1x10-10
CMP-SAS x 6.2x10-9 7.3x10-9 4.9x10-8
엔도스타틴 1.3x10-9 8.7x10-10 8.8x10-10 1.3x10-9
IL-6 1.0x10-9 5.4x10-10 4.0x10-10 x
미엘로퍼록시다제 6.0x10-10 2.8x10-10 5.0x10-10 1.5x10-10
SDF-1β 8.1x10-10 5.7x10-10 3.8x10-10 x
TMP-1 5.2x10-9 7.3x10-9 8.9x10-9 x
VEGF 7.2x10-10 4.2x10-9 5.5x10-10 x
γWF 2.6x10-8 8.8x10-9 8.1x10-9 x
G. 가교결합 활성 에세이
단백질을 포화시키고 빛이 존재하는 조건에서 단백질에 가교결합된 DNA의 퍼센트를 측정함으로써 농축된 라이브러리의 가교결합 수율을 결정하였다. 방사성 표지된 DNA(50pM)을 SB17T에서 리버스 프라이머(16nM)로 혼합하고, 95℃에서 3분 동안 가열한 후에 37℃에서 0.1℃/초의 속도로 냉각시켰다. 표적 단백질을 DNA 믹스에 첨가하여 최종농도가 10nM가 되도록 하고 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. 단백질이 포함되지 않은 대조군 시료를 동시에 준비하였다. 상기에 기재한 바와 같이 발색단 특이 조건으로 시료를 가교결합하되, 포화량(BrdU에 대해서는 6분, ANA에 대해서는 10분, AQ 및 Psor에 대해서는 30분)으로 실시하였다. PAGE를 변성시켜 시료를 분석하고(도 6), 정량하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
표적 단백질 BrdU AQ ANA Psor
β-카테닌 15 9 8 1
bFGF 4 9 15 4
CMP-SAS x 3 5 2
엔도스타틴 2 1 18 3
IL-6 0 5 9
Myeloperoxidase 4 13 9 8
SDF-1β 8 10 17 x
TIMP-1 1 4 2 x
VEGF 1 1 4 x
vWF 2 2 7 x
다른 발색단들로 선별된 농축된 라이브러리 가교율(단위: 단백질에 가교된 총 DNA%). 수렴에 실패한 라이브러리 상에서는 측정되지 않았다(x 표기).
실시예 3. 경쟁자와 느린 오프 - 레이트 농축 공정을 사용한 느린 오프 - 레이트 압타머 생성
A. 대체 물질 혼합물의 준비
dATP, dCTP, dGTP, 및 BndUTP를 포함하는 대체물질 혼합물을 94개의 단백질 표적에 대하여 비오틴화된 주형에 단련시킨 프라이머의 폴리머라제 확장에 의해 준비하였다. 정방향 프라이머 55 nmol (5' ANA 발색단을 갖음)과 주형 55 nmol을 프라이머 확장 버퍼 0.5 mL(120 mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10 mM KCl, 6 mM (NH4)2SO4, 7 mM MgSO4, 0.1 mg/mL BSA, 0.1% Triton X-IOO) 내에 혼합하고, 95 ℃로 5분간 가열하고, 70℃로 5분간 가열하고, 48℃로 5분간 가열한 다음 얼음에 냉각하였다. 프라이머: 주형 혼합물에 프라이머 확장 버퍼를 포함하는 확장 반응액 5.5 mL, KOD XL DNA 폴리머라제 0.125 U/μL , 및 dATP, dCTP, dGTP, 및 BndUTP 각 0.5 mM를 첨가하고, 70℃에서 60분간 배양하였다. 확장 반응이 종료된 다음 용액을 얼음 상에서 급냉시켰다. 상기 프라이머 확장 생성물에 25 mL 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드 (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 1 M NaCl + 0.05% TWEEN-20 내 5 mg/mL)를 첨가하고 주형 스트랜드 비오틴을 매개로 하여 이중 가닥 생성물을 포획하고, 회전하면서 25℃에서 15분간 배양하였다. 비드는 SB17T 버퍼 40 mL(40 mM HEPES, pH 7.5, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.05% TWEEN-20)로 3회 세척하였다. 상기 압타머 스트랜드는 20 mM NaOH 35.2 mL로 5분간 흔들면서 비드로부터 용리시켰다. 용리된 스트랜드는 80 mM HCl 8.8 mL로 중화하고, 1 M HEPES 400 μL, pH 7.3로 완충시켰다. 대체 물질 혼합물을 Centricon-30로 대략 0.7 mL까지 농축시키고, UV 흡수 분광계로 정량화시켰다.
B. 표적 단백질의 준비
미태그 표적 단백질을 상기 실시예 2에 기술한 바와 같이, 비오틴화시켰다.
C. 느린 오프-레이트 농축 공정으로 압타머 선별 및 광가교
선별은 느린 오프-레이트 농축 공정 도중 압타머 재결합을 위한 경쟁자로서덱스트란 설페이트 10 mM를 첨가하면서 상기 실시예 2에 기술된 방식에 따라 별도로 6-9차례 수행하였다.
상기 느린 오프-레이트 농축 공정은 3가지 다른 방식으로 공급되었다. 2번째 및 3번째 라운드에서, 시료는 SB17T 950 μL(37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 복합체를 포획하기에 앞서 30분간 37 ℃로 배양하였다. 4번째 및 5번째 라운드에서, 시료는 SB17T 950 μL(37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 가교하기에 앞서 30분간 37 ℃로 배양하였다. 6번째 및 7번째 라운드에서, 시료는 SB17T 950 μL (37℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하였다. 각 희석 시료 50 μL를 SB17T 950 μL+ 10 mM 5000K 덱스트란 설페이트 (37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 전체 400 배 희석물을 얻은 다음 가교에 앞서 37 ℃에서 60분간 배양하였다. 8번째 및 9번째 라운드에서, 시료를 SB17T 950 μL(37 ℃로 예열)를 첨가하여 20배 희석하고, 각 시료 50 μL 를 SB17T 950 μL(37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 400 배 희석물을 수득하였다. 최종적으로 각 400 배 희석된 시료 50 μL를 950 μL SB17T + 10 mM 5000K 덱스트란 설페이트 (37℃로 예열)에 이동시켜 재희석하고 전체 8000배 희석물을 수득하고 가교에 앞서 37 ℃에서 60분간 배양하였다. 복합체를 상기 실시예 2에 기술된 것과 동일한 방식으로 포획하고 세척하였다. 광 가교를 제공할 경우, 느린 오프-레이트 농축 공정 후 결합 반응물 1 mL 에 상기 실시예 2에서와 같은 복합체 포획에 앞서 470 nm LED의 어레이로 60초간 상부로부터 조사하였다.
D. 압타머 증폭 및 정제
증폭 및 정제 공정을 상기 실시예 2에서와 동일하게 수행하였다.
E. 선별 충실도(Stringency) 및 피드백
6번째 및 8번째 라운드를 제외하고는 상기 실시예 1에 기술된 각 라운드에서와 같이 표적 단백질을 조정하였다. 이들 대량 희석후 신호를 극대화하도록, 표적 단백질을 6번째 및 8번째 라운드에서 100 nM까지 증가시켰다. 선별의 각 라운드마다, 농축된 풀(pool)의 융합 상태를 상기 실시예 1에 기술된 바에 따라 측정하였다.
F. 분해 속도 상수 결정 프로토콜
압타머에 대한 속도 상수: 단백질 복합체 분리(koff)는 각 압타머에 대하여 시간 함수로서 미리 형성된 압타머:희석 후 결합된 채 잔류하는 단백질 복합체의 분율을 측정하여 결정하였다: 방사선표지된 압타머(50 pM)은 측정된 Kd 값보다 10배 큰 농도에서 단백질로 37 ℃에서 SB17T-0.002 (TWEEN-20으로 0.002%까지 저감된 SB17T)로 평형화하였다. 시료는 37 ℃에서 SB17T-0.002로 100 배 희석하였으며 분획은 여러 시점에서 제거하고 분리하여 단백질:압타머 복합체로부터 자유 압타머를 분리하였다. 상기 시료에 ZORBAX 수지 (Agilent)를 첨가하고, 수지로부터 복합체를 포획하고, 시료를 진공하에 듀라포어(DuraPore) 막을 통과시키고 상기 수지를 SB17T-0.002로 세척하여 분할시켰다. ZORBAX 수지로 효율적으로 포획되지 않은 단백질에 대하여는 SB17T 내 비오틴화 단백질로 검정을 수행하고, 비드로 복합체를 포획하여 분할을 달성하였다. 각 시점에서 잔류하는 복합체의 함량은 후지 에프엘에이(FUJI FLA)-3000 형광체영상기(phosphorimager)로 수지 상에 방사선표지된 압타머를 정량화하여 결정하였다. 복합체의 분율은 시간 함수로 도표화하고 분해 속도 상수 (koff)와 분리 반감기 값 (t1/2)은 이중분자 분리 운동에 대한 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터를 끼워맞춰 결정하였다.
G. 몇몇 압타머의 운동 특성
하기 표 4는 이들 프로토콜을 사용하여 10개의 표적에 대한 선별된 압타머에 대해 수득된 분리 반감기 값 (t1 /2)을 요약한 것이다.
표적 단백질 t1 /2(분)
bFGFR 66
C3 164
카탈라제 58
FGF-17 91
그룹 IB 포스포리파제 A2 40
HB-EGF 49
HCC-4 143
IL-6 sRα 114
SAP 186
uPA 85
경쟁자 느린 오프-레이트 농축 단계 프로토콜을 사용한 압타머의 분리 반감기 값 (t1/2)
실시예 4: 느린 오프 - 레이트 농축 공정은 선별된 압타머의 분리 반감기를 증가시킨다.
상기 실시예 1에 기술된 친화 SELEX 방법 혹은 느린 오프-레이트 농축 공정없는 미국 특허 제6,458,539호("Photoselection of Nucleic Acid Ligands")에 기술된 광SELEX 방법에 의해 선별된 65개의 압타머에 대하여 분리 반감기 값 (t1/2)을 측정하고 도표화하였다 (도 3A 참조). 희석 또는 경쟁자로 희석에 의해 느린 오프-레이트 농축 공정을 갖는 상기 실시예 2에 기술된 느린 오프-레이트 농축 공정에 의해 선별된 72개의 압타머에 대하여 t1/2 값을 또한 측정하여 도표화하였다 (도 3B 참조). 느린 오프-레이트 농축 공정 부재시 선별된 변형 뉴클레오티드들인 5-벤질카복시아미드-dUTP (BndUTP), 5-이소부틸카복시아미드-dUTP (iBudUTP), 또는 5-트립트아미노카복시아미드-dUTP(TrpdUTP)를 사용한 압타머에 대한 평균 t1/2 값은 최대 1시간의 t1/2 값을 갖는 몇몇 압타머를 포함하여 20분이었다. 이는 천연 염기 혹은 다른 변형된 뉴클레오티드로서 종래 기술된 것보다 실질적으로 긴 것이다. 느린 오프-레이트 농축 공정으로 선별된 압타머의 평균은 85분 이상이었으며, 몇몇 압타머는 t1/2 값이 4 시간을 초과하였다.
실시예 5: NapdU 랜덤 라이브러리로부터 압타머 생성
A. 대체 물질 혼합물의 준비
dATP, dCTP, dGTP, 및 NapdUTP를 포함하는 대체 물질 혼합물을 5'-ANA 광반응성 기를 제외하고는 실시예 3에 기술된 것과 동일한 방법으로 준비하였다.
B. 표적 단백질의 고정화
표적 단백질은 (His)6 태그를 포함하고, 상기 실시예 1에 기술된 방식으로 탈론 비드로 포획되었다.
C. 느린 오프-레이트 농축 공정으로 압타머 선별
압타머 선별은 광가교를 제외하고는 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행되었다.
D. 압타머 증폭 및 정제
증폭 및 정제는 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행되었다.
E. 선별 충실도 및 피드백
선별 충실도 및 피드백은 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행되었다.
F. 압타머 속성
이같은 선별로부터 4개의 압타머의 평형 결합 상수 (Kd)를 하기표 5에 열거하였다.
NapdU 압타머의 평형 결합 상수(Kd)
표적 단백질 Kd(M)
bFGF
 1.1 x 10-9
엔도스타틴
 2.0 x 10-9
TIMP-3
 1.5 x 10-10
VEGF
 7.2 x 10-10
실시예 6. 경쟁자와 느린 오프 - 레이트 농축 공정을 사용하여 펩티드 표적에 대한 느린 오프 - 레이트 압타머 생성
A. 대체 물질 혼합물의 준비
dATP, dCTP, dGTP, 및 BndUTP를 포함하는 대체 물질 혼합물을 5' ANA 발색단을 갖는 프라이머의 폴리머라제 확장에 의해 준비하고 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 정제하였다.
B. 느린 오프-레이트 농축 공정으로 압타머 선별 및 광가교
압타머 선별은 29개의 아미노산 비오틴화된 표적 펩티드 SMAP29 (양 골수성 항균 펩티드 MAP-29, Anaspec)로 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행되었다.
C. 압타머 증폭 및 정제
증폭 및 정제는 상기 실시예 3에 기술된 것과 동일한 방식으로 수행하였다.
D. 선별 충실도 및 피드백
선별 충실도 및 피드백은 상기 실시예 3에 기술된 것과 동일한 방식으로 수행하였다.
E. 압타머 속성
이같은 선별로부터 압타머의 평형 결합 상수 (Kd)는 1.2 x 10-8 (상기 실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라 측정) 이었다. 이들 압타머의 분리 반감기 (tl/2)는 69 분 (상기 실시예 3에 기술된 프로토콜에 따라 측정)이었다. 결과를 도 12 A 및 12 B에 도시하였다.
실시예 7: 느린 오프-레이트 압타머에 의하여 가능한 테스트 시료 내의 단백질 측정
A : 압타머/프라이머 혼합물 및 시료 준비
삭제
비오틴 Cy3 검출 라벨을 갖는 압타머 (각각 4 nM)를 IX SB17T 내 3배 과량의 포획 프로브 (비오틴 태그와 광분열성 요소를 포함하는 압타머의 3' 고정 영역에서 상보적인 올리고뉴클레오티드)와 혼합하고 95℃에서 4분간 가열한 다음 37 ℃에서 13분간 가열하고 Ix SB17T 내에서 1:4로 희석하였다. 압타머/프라이머 혼합물 55 μL를 미량역가 플레이트 (Hybaid # AB-0407)에 첨가하고 호일로 감쌌다. SB17T 내에 공지된 농도의 단백질 분석체를 혼합하고 SB17T로 연속 희석하여 미량역가 플레이트 내에서 시료를 제조하였다.
B : 시료 평형
압타머/프라이머 혼합물 55 μL를 시료 55 μL에 첨가하고 호일로 감싼 미량역가 플레이트 내에서 37 ℃에서 15분간 배양하였다. 평형 혼합물내 각 압타머의 최종 농도는 0.5 nM 이었다. 평형화 후, 이 방법의 모든 후속 공정은 달리 언급되지 않는 한 실온에서 수행하였다.
C : 압타머 포획 및 자유 단백질 제거
듀라포어 여과 플레이트 (Millipore HV cat# MAHVN4550)를 진공 여과에 의해 IX SB17T 100 μL로 1회 세척하고, 7.5% 스트렙타비딘-아가로스 수지 (Pierce) 133.3 μL를 각 웰마다 첨가하고 IX SB17T 200 μL로 2회 세척하였다. 평형화된 시료 100 μL를 스트렙타비딘-아가로스 수지를 포함하는 듀라포어 플레이트에 이동시키고 써모믹서 (Eppendorf) 상에서 800 rpm에서 5 분간 배양하였다. 수지를 200 μL 1X SB17T + 100 μM 비오틴으로 1회 세척하고 1X SB17T 200 μL로 1회 세척하였다.
D : 비오틴으로 단백질 태그화
사용 직전 준비된 SB 17T내 1.2 mM NHS-PEO4-비오틴 100 μL에 포획된 압타머 및 압타머:단백질 복합체에 첨가하고 써모믹서 상에서 800 rpm에서 20 분간 배양하였다. 상기 수지는 진공 여과에 의해 IX SB 17T 200 μL로 5회 세척하였다.
E : 느린 오프-레이트 농축 공정 및 광분열화
듀라포어 플레이트 밑면에서 드립 디렉터(drip director)를 제거하고 플레이트를 1 mL 미량역가 수집 플레이트 상에 재치하였다. 수지를 IX SB17T 200 μL로 1000 x g에서 30 초간 원심분리하면서 1회 세척하였다. 80 μL의 IX SB17T + 10 mM 덱스트란 설페이트를 상기 수지에 첨가하고 써모믹서상에서 블랙레이(BlackRay) 수은 램프로 800 rpm에서 10 분간 조사하였다. 상기 듀라포어 플레이트를 새로운 I mL 딥(deep) 웰 플레이트에 이동시키고 1000 x g에서 30 초간 원심분리하여 광분열된 압타머 및 단백질:압타머 복합체를 수집하였다.
F : 단백질 포획 및 프리 압타머 제거
마이원-스트렙타비딘 Cl 상자성 비드 (Invitrogen) (IX SB 17T 10 mg/mL) 50 μL를 미량역가 플레이트에 첨가하였다. 상기 비드를 자석으로 60 초간 분리하고 상청액을 제거하였다. 광분열 혼합물 225 μL를 상기 비드에 첨가하고 5분간 혼합하였다. 자성 비드를 분리하고 세척 버퍼를 교체하면서 IX SB17T 200 μL로 상기 비드를 4회 세척하였다. 최종 세척 버퍼는 제거하였다.
G : 압타머 용리
소디움 포스페이트 용리 버퍼(10 mM Na2HPO4, pH 11) 100 μL 를 상기 비드에 첨가하고 5 분간 혼합하였다. 용리액 90 μL를 미량역가에 이동시키고 소디움 포스페이트 중화 버퍼 (10 mM NaH2PO4, pH 5) 10 μL로 중화시켰다.
H : 마이크로어레이로 압타머 혼성화
DNA 어레이를 실체현미경 슬라이드 지지체 상에 고정된 각 압타머의 가변 영역의 상보적 서열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브로 준비하였다. 다중 어레이(서브어레이)가 각 슬라이드 상에 존재하고, 서브어레이는 샘플 적용처에 가스켓(Grace)를 부착하여 물리적으로 분리되었다. 어레이는 블록킹 버퍼 100 μL로 전처리되고 써모믹서 상에서 15 분간 65 ℃에서 배양하였다. 고농도 염(high salt) 혼성화 버퍼 30 μL를 미량역가 플레이트 내에서 중화된 압타머 용리액 90 μL에 첨가하고, 써멀 사이클러 (thermalcylcer) 내에서 95 ℃에서 5분간 배양하고, 0.1℃/초의 속도로 65℃까지 냉각시켰다. 블록킹 버퍼를 어레이로부터 제거하고 압타머 샘플 110 μL를 어레이에 첨가하고 항습기 내에서 65℃에서 20 시간 동안 배양하였다.
I : 어레이 세척
압타머 샘플을 어레이로부터 제거하고 어레이를 소디움 포스페이트 Tween-20 세척 버퍼 200 μL로 65 ℃에서 가스켓으로 1회 세척하고, 소디움 포스페이트 Tween-20 세척 버퍼 25 mL로 65℃에서 가스켓이 제거된 팹모양 병(pap jar) 내에서 3회 세척하였다. 어레이는 질소 총(gun)으로 건조시켰다.
J : 어레이 상에서 시그널을 정량화
Cy3 감지용 적당한 채널 내에서 어레이 슬라이드를 TECAN LS300상에서 스캔하고 각 어레이 피쳐(array feature)상에서 정량화하였다.
결과 :
3가지 다른 표적 (bFGF, VEGF, 및 마이엘로퍼옥시다제(Myeloperoxidase))에 특이적인 압타머들을 전통적인 SELEX 방법과 물질을 사용하여 생산하였다. 동일한 셋트의 표적에 대하여 특이적인 제2 압타머 셋트를 5-위치 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 제작하고 각각의 표적에 대하여 매우 느린 오프-레이트로 선별하였다. 전통적인 공정으로 제작된 압타머는 5분 이하의 수준으로 오프 레이트가 측정되었다. 변형된 뉴클레오티드로 제작되고 선별도중 느린 오프-레이트 농축 공정을 사용한 압타머는 오프 레이트가 20 분 이상이었다. 각 표적에 대하여 4가지 다른 압타머 개체군 전체에 대하여 상기 2가지 다른 방식으로 각 표적에 대하여 2가지 셋트의 압타머를 제작하였다. 시료 내 분석체 농도를 측정함에 있어 이들 압타머 개체군의 성능은 상술한 바와 같이 표적 농도 범위를 초과하여 평가되었다. DNA 칩 검출로부터 상대적인 신호가 입력 표적 농도에 대해 감지되었다. 도 11A 내지 11C를 참조하라. 전통적인 압타머의 반응 곡선은 매우 편평하고 검출 민감도가 매우 낮다. 느린 오프-레이트 압타머를 갖는 표적의 검출 민감도는 탁월하였다. 데이터는 최대 분석체 성능을 위하여 느린 오프-레이트 압타머를 사용할 필요성을 뒷받침한다.
실시예 8. 인간 트롬빈에 대한 높은 친화 BndUTP 압타머의 생성
A. 대체 물질 혼합물의 준비
dATP, dCTP, dGTP, 및 BndUTP를 포함하는 대체 물질 혼합물을 5' ANA 발색단을 갖는 프라이머의 폴리머라제 확장에 의해 준비하고 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 정제하였다.
B. 표적 단백질의 준비
인간 트롬빈은 상기 실시예 2에 기술된 방식으로 비오틴으로 태그화하였다.
C. 느린 오프-레이트 농축으로 압타머 선별 및 광가교
압타머 선별은 표적으로서 비오틴화된 인간 트롬빈으로 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행하였다.
D. 압타머 증폭 및 정제
증폭 및 정제는 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행하였다.
E. 선별 충실도 및 피드백
선별 충실도 및 피드백은 상기 실시예 3에 기술된 방식으로 수행하였다.
F. 압타머 특성
변형된 BndU로 이 선별로부터 얻은 압타머 2336-17의 평형 결합 상수 (Kd)는 도 15에서 입증된 바와 같이, 4.4 x 10-11 M (상기 실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라 측정)이었다.
인간 트롬빈에 대한 단일 가닥 DNA 압타머는 천연 dA, dC, dG, 및 dT 뉴클레오티드 (Bock et al., Selection of Single-Stranded DNA MolecμLes that Bind and Inhibit Human Thrombin, Nature 1992, 355; 564-566)로 이루어진 라이브러리로부터 선택되었다. 압타머의 결합 친화력은 Kd 상수가 2.5 x 10-8 M 내지 2.0 x 10-7 M 범위 내이었다. 천연 dA, dC, dG, 및 변형된 5-(l-펜틴일)-dUTP로 이루어지는 라이브러리와 유사한 프로토콜을 사용하면, 압타머는 Kd 값으로서 4 x 10-7 M 내지 1 x 10-6M 범위 (Latham et al., The Application of a Modified Nucleotide in Aptamer Selection: Novel Thrombin Aptamers Containing 5-(1-Pentynyl)-2'-Deoxyuridine, Nucleic Acid Research 1994 22(14): 2817-2822)내에서 선택되었다.

다수의 특허, 특허출원 및 과학적 간행물들이 상세한 설명을 통해 인용되고 및/또는 말미에 목록화하였다. 이뿐 아니라 도입된 간행물 내 언급된 모든 간행물도 전적으로 참고문헌으로 도입된다. 인용된 간행물 내 실시예 및 이와 관련된 한정은 예시적인 것으로 이에 한정하는 것은 아니다. 인용문헌 내 다른 제한은 상세한 설명 및 도면에 기초하여 당업계에서 숙련된 자에게 명백할 것이다.
삭제
용어 "포함하는("comprise", "comprises" 및 "comprising")은 한정보다는 내포하는 쪽으로 해석된다.
<110> Somalogic, Inc. <120> METHOD FOR GENERATING APTAMERS WITH IMPROVED OFF-RATES <130> PI10-0103 <150> PCT/US2008/070383 <151> 2008-07-17 <150> US60/950,283 <151> 2007-07-17 <150> US60/950,281 <151> 2007-07-17 <150> US61/031,420 <151> 2008-02-26 <150> US61/051,594 <151> 2008-05-08 <150> US60/950,293 <151> 2007-07-17 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic; misc_feature (23)..(62) n is a, c, g, or t <400> 1 ababgtcttc ttgtcgtttc gcnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnggtggagt gtggtgagg 79 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer 1 <400> 2 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer 1 <400> 3 ababtttttt ttgtcttctt gtcgtttcgc 30 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic; misc_fearure (22)..(61) n is a, c, g, or t <400> 4 ababccgtcc tcctctccgt cnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 ngggacactg ggtgcagg 78 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer 2 <400> 5 atatatatcc tgcacccagt gtccc 25 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer 2 <400> 6 ababtttttt ttccgtcctc ctctccgtc 29 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> (His)6-complement Oligonucleotide <400> 7 gtcttcttgt cgtttcgc 18 <210> 8 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic; misc_feature (20)..(59) n is a, c, g, or t <400> 8 ababcccgct cgtcgtctgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 60 aggcagacgg tcactc 76 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward BruD Primer 1 <400> 9 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward ANA Primer 1 <400> 10 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward AQ Primer 1 <400> 11 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Psor Primer 1 <400> 12 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer 1 <400> 13 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer 1 <400> 14 ttttttttcc cgctcgtcgt ctg 23 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer 1 <400> 15 ababtttttt ttcccgctcg tcgtctg 27 <210> 16 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic; misc_feature (23)..(62) n is a, c, g, or t <400> 16 ababgtgtct gtctgtgtcc tcnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnggtggagt gtggtgagg 79 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward BrdU Primer 2 <400> 17 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward ANA Primer 2 <400> 18 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward AQ Primer 2 <400> 19 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Psor Primer 2 <400> 20 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR Primer 2 <400> 21 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer 2 <400> 22 ttttttttgt gtctgtctgt gtcctc 26 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR Primer 2 <400> 23 ababtttttt ttgtgtctgt ctgtgtcctc 30

Claims (162)

  1. 하기의 구조로 표시되는 화합물:
    Figure 112016048428221-pct00077

    여기에서, X는
    Figure 112016048428221-pct00078
    이고, Z는 R + (CH2)n 연결기이고,
    여기에서 n = 1, 2 또는 3이고, R은
    Figure 112016048428221-pct00079
    이며,
    여기에서 *는 하이드록실기(OH), 포스페이트기(phosphate group) 및 아미다이트 보호기(amidite protecting group) 중에서 각각 독립적으로 선택된 것.
  2. 하기의 구조:
    Figure 112013064577456-pct00042

    여기에서, X는
    Figure 112013064577456-pct00043
    이고, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서 n = 1, 2 또는 3이고,
    Figure 112013064577456-pct00044

    를 가지는 화합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 적어도 하나의 염기-변형된(base-modified) 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 염기-변형된 뉴클레오티드는 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00045
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00046
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00047

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 표적에 특이적으로 결합하는 압타머.
  4. 제3항에 따른 압타머 및 표적 분자의 비공유(non-covalent) 결합된 복합체.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    표적 분자로부터 압타머의 분해 속도 (t1/2)는 30 분 이상인 것을 특징으로 하는 비공유 결합된 복합체.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 표적은 하기로부터 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 비공유 결합된 복합체.
    Figure 112015104738531-pct00048

    Figure 112015104738531-pct00049

    Figure 112015104738531-pct00050

    Figure 112015104738531-pct00051

    Figure 112015104738531-pct00052
  8. 제3항에 있어서,
    상기 압타머는
    (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00053
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00054
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00055

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 대체 물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계;
    (d) 자유 핵산을 생성하기 위해 핵산-표적 분자 복합체를 해리하는 단계;
    (e) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위해 자유 핵산을 증폭하고, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계;
    (f) 1회 또는 1회 이상 상기 (b) 단계부터 (e) 단계까지를 반복하는 단계;
    (g) 표적 분자에 대한 최소한 하나의 압타머를 식별하는 단계, 여기에서 상기 압타머는 최소 하나의 염기-변형된 피리미딘을 포함하고; 및
    (h) 압타머를 식별하기 위하여 (g) 단계에서 식별된 압타머를 선별하는 단계, 여기에서 상기 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도 (t1/2)는 30분 이상이고;
    를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 압타머.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 압타머는
    (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00056
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00057
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00058

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물의 잔여물로부터 증가된 친화력을 갖는 핵산을 분할하는 단계;
    (d) 상기 대체물질 혼합물의 잔여물로부터 핵산을 분할하는 단계, 여기에서 표적 분자로부터의 상기 핵산의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상이고; 및
    (e) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있으며 표적 분자로부터의 상기 핵산의 분해 속도(t1/2)가 30분 이상인, 핵산 서열이 풍부한 핵산의 혼합물을 수득하기 위해 분할된 핵산을 증폭하고, 그것에 의해 (a) 에서의 적어도 하나의 상기 염기-변형된 피리미딘을 포함하는 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 압타머.
  10. 삭제
  11. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00059
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00060
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00061

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물의 잔여물로부터 증가된 친화력을 갖는 핵산을 분할하는 단계; 및
    (d) 증가된 친화력으로 표적 분자를 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위해 증가된 친화력의 핵산을 증폭하고, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계;
    를 포함하는 공정에 의해 식별되는 핵산 서열에 기초하여 압타머를 제조하거나 합성하는 단계를 포함하고, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 생산하는 방법.
  12. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00062
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00063
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00064

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고 느린 오프 레이트 농축 공정에 상기 대체물질 혼합물을 노출시키는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물에 경쟁자를 첨가하고 상기 대체물질 혼합물을 희석하거나, 상기 대체물질 혼합물에 경쟁자를 첨가하거나 상기 대체물질 혼합물을 희석하고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자로부터 느린 분해 속도를 가지는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물로부터 느린 오프 레이트 핵산을 분할하는 단계; 및
    (d) 느린 오프 레이트를 가지는 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 느린 오프 레이트 핵산을 증폭하고, 이로 인하여 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)가 30분 이상인 압타머가 식별될 수 있는 단계;를 포함하고, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 식별하거나 생산하는 방법.
  13. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00065
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00066
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00067

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고 느린 오프 레이트 농축 공정에 상기 대체물질 혼합물을 노출시키는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물에 경쟁자를 첨가하고 상기 대체물질 혼합물을 희석하거나, 상기 대체물질 혼합물에 경쟁자를 첨가하거나 상기 대체물질 혼합물을 희석하고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자로부터 느린 분해 속도를 가지는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물로부터 핵산을 분할하는 단계; 및
    (d) 느린 오프 레이트를 가지는 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 느린 오프 레이트 핵산을 증폭하고, 이로 인하여 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)가 30분 이상인 압타머가 식별되는 단계,를 포함하는 공정에 의해 식별된 핵산 서열에 기초하여 압타머를 제조하거나 합성하는 단계를 포함하고, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 생산하는 방법.
  14. (a) 표적에 대한 압타머를 포함하는 용액과 조직 또는 세포 샘플을 접촉시키는 것, 여기에서 상기 압타머는 적어도 하나의 하기의 구조:
    Figure 112015104738531-pct00068
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015104738531-pct00069
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015104738531-pct00070

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘을 포함하고,
    (b) 단계 (a)에서와 같이 용액과 상기 압타머가 결여된 제2 조직 또는 세포 샘플을 반응시킴으로써 제조된 음성 대조군과 단계 (a)에서 얻어진 결과를 비교하는 것; 및
    (c) 상기 표적의 존재 여부를 나타내는 것으로서 상기 압타머를 검출하는 것
    을 포함하는 조직 또는 세포 샘플에서 표적을 검출하기 위한 방법.
  15. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 제조하는 것;
    (b) 표적 분자와 상기 대체물질 혼합물을 접촉시키는 것, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 대해 증가된 친화력을 가지는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 것;
    (c) 느린 오프 레이트 공정에 핵산-표적 분자 복합체를 노출시키는 것, 여기에서 상기 느린 오프 레이트 농축 공정은
    (i) 상기 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체물질 혼합물을 배양하는 단계;
    (ii) 상기 (i) 단계 후, 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체물질 혼합물과 최소한 하나의 경쟁 분자를 혼합하는 단계, 여기에서 상기 경쟁 분자는 자유 압타머와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 분자 또는 표적에 비특이적으로 결합할 수 있고 표적 결합 부위를 차지할 수 있는 분자이고;
    (iii) 상기 (ii) 단계 후, 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 대체물질 혼합물을 희석하는 단계; 및
    (iv) 경쟁자 및 핵산-표적 분자 복합체를 포함하는 희석된 대체물질 혼합물을 배양하는 단계를 포함하고;
    (d) 상기 대체물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 것;
    (e) 자유 핵산을 생성하기 위하여 핵산-표적 분자 복합체를 해리하는 것;
    (f) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 자유 핵산을 증폭하는 것, 그것에 의해 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있고;
    (g) 1회 또는 1회 이상 상기 (b) 단계부터 (f) 단계까지를 반복하는 것; 및
    (h) 표적 분자에 대한 적어도 하나의 압타머를 식별하는 것
    을 포함하는, 압타머를 식별하기 위한 방법.
  16. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 제조하는 단계;
    (b) 표적 분자와 상기 대체물질 혼합물을 접촉시키는 단계, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 증가된 친화력을 갖는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물과 표적 분자를 배양하는 단계;
    (d) (c)의 혼합물에 적어도 하나의 경쟁 분자를 과잉 첨가하는 단계;
    (e) 미리 결정된 시간 동안 (d)로부터의 대체물질 혼합물, 표적 분자/압타머 복합체 및 경쟁 분자의 혼합물을 배양하는 단계;
    (f) 대체물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계;
    (g) 자유 핵산을 생성하기 위하여 핵산-표적 분자 복합체를 해리하는 단계; 및
    (h) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 자유 핵산을 증폭하고, 이것에 의해 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계;
    를 포함하고, 그것의 표적 분자로부터의 분해 속도(t1/2)가 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 식별하거나 생산하기 위한 방법.
  17. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00071
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00072
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00073

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 대해 증가된 친화력을 가지는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물로부터 핵산-표적 분자 복합체를 분할하는 단계; 및
    (d) 자유 핵산을 생성하기 위하여 핵산-표적 분자 복합체를 해리하는 단계; 및
    (e) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 자유 핵산을 증폭하고, 이것에 의해 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계;
    (f) 1회 또는 1회 이상 상기 (b) 단계부터 (e) 단계까지를 반복하는 단계;
    (g) 표적 분자에 대한 적어도 하나의 압타머를 식별하는 단계, 여기에서 상기 압타머는 (a)에서의 적어도 하나의 상기 염기-변형된 피리미딘을 포함하고; 및
    (h) 압타머를 식별하기 위하여 (g)에서 식별된 압타머를 선별하는 단계, 여기에서 상기 압타머는 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)가 30분 이상이고;를 포함하고, 여기에서 상기 압타머는 적어도 하나의 염기-변형된 피리미딘을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 식별하기 위한 방법.
  18. (a) 핵산의 대체물질 혼합물을 준비하는 단계, 여기에서 상기 대체물질 혼합물은 상기 대체물질 혼합물의 적어도 하나 또는 각각의 핵산에서 하나, 여러 개 또는 모든 피리미딘이 하기의 구조:
    Figure 112015020734073-pct00074
    를 가지며,
    여기에서, X는
    Figure 112015020734073-pct00075
    이고,
    여기에서, Z는 R 플러스 (CH2)n 연결기이고,
    여기에서, n = 1, 2 또는 3이고, 그리고
    추가적으로 여기에서, R은
    Figure 112015020734073-pct00076

    를 포함하는 군으로부터 선택되는 염기-변형된 피리미딘인, 변형된 핵산을 포함하고;
    (b) 표적 분자와 대체물질 혼합물을 접촉시키고, 여기에서 대체물질 혼합물 내 다른 핵산보다 표적 분자에 대해 증가된 친화력을 가지는 핵산을 표적 분자에 결합하여 핵산-표적 분자 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 대체물질 혼합물의 잔여물로부터 증가된 친화력의 핵산을 분할하는 단계; 및
    (d) 상기 대체물질 혼합물의 잔여물로부터 핵산을 분할하는 단계, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 핵산의 분할 속도 (t1/2)는 30분 이상이고; 및
    (e) 증가된 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있고 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도는 30분 이상인 핵산 서열로 농축된 핵산의 혼합물을 수득하기 위하여 분할된 핵산을 증폭하고, 이것에 의해 (a)에서의 적어도 하나의 상기 염기-변형된 피리미딘을 포함하는 표적 분자에 대한 압타머가 식별될 수 있는 단계;
    를 포함하고, 여기에서 상기 압타머는 적어도 하나의 염기-변형된 피리미딘을 포함하고, 여기에서 그것의 표적 분자로부터의 압타머의 분해 속도(t1/2)는 30분 이상인 것을 특징으로 하는, 압타머를 식별하거나 생산하기 위한 방법.
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  20. 제12항, 제13항, 제14항, 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 압타머는 적어도 하나의 추가적인 화학적 변형을 더 포함하며, 여기에서 상기 적어도 하나의 추가적인 화학적 변형은 리보스 위치, 디옥시리보스 위치, 포스페이트 위치 및 염기 위치로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 위치에서의 화학적 치환인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 제20항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 추가적인 화학적 변형은 2'-위치 당질 변화, 2'-아미노 ( 2'-NH2), 2'- 플루오로 (2'-F), 2'- O-메틸 (2'-OMe), 시토신 엑소사이클릭 아민에 있는 변형, 5-브로모우라실의 치환, 5-브로모데옥시우리딘의 치환, 5-브로모데옥시시티딘의 치환, 골격 변형, 메틸화, 3 ' 캡 및 5 ' 캡으로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 삭제
  24. 제11항, 제12항, 제13항, 제15항, 제16항, 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 표적 분자는 단백질, 탄수화물, 과당, 글리코당, 호르몬, 수용체, 펩티드, 항원, 항체, 바이러스, 기질, 대사물질, 전이상태 유사물, 보조인자, 저해제, 약물, 염료, 영양분, 성장 인자, 조직 및 규제 약물로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 삭제
  26. 제12항, 제13항, 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 분해 속도(t1/2)는 30 분 내지 240 분 내인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제12항, 제13항, 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 분해 속도 (t1/2)는 ≥ 30 분, ≥ 60 분, ≥ 90 분, ≥ 120 분, ≥ 150 분, ≥ 180 분, ≥ 210 분, 및 ≥ 240 분의 시간으로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제12항, 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 압타머는 검출가능한 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 검출가능한 부분은 염료, 양자점, 방사성 표지, 전기화학적 작용기, 효소, 효소 기질, 리간드 및 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 방법.
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